專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用pcr方法檢測(cè)水體中藍(lán)藻種類(lèi)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)水體環(huán)境中藍(lán)藻進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)價(jià)方法。
背景技術(shù)：
藍(lán)藻是一類(lèi)原核光合自養(yǎng)生物，具有細(xì)菌的一些特征，因此又常常把藍(lán)藻稱(chēng)為藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)，廣泛分布于地球上各種類(lèi)型的水環(huán)境和一些陸生環(huán)境，是海洋和內(nèi)陸水體中最重要的原初生產(chǎn)者。藍(lán)藻分子遺傳學(xué)在上個(gè)世紀(jì)八十年代奠定基礎(chǔ)，在許多方面借鑒其他類(lèi)群微生物分子遺傳學(xué)已發(fā)展的技術(shù)和方法，取得了諸多成績(jī)。隨著人類(lèi)經(jīng)濟(jì)活動(dòng)日益頻繁，大量未經(jīng)處理或處理不達(dá)標(biāo)的生活污水和工農(nóng)業(yè)廢水排入湖泊和江河，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)環(huán)境自身降解的容量，造成水體的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)鹽的積累，促使藍(lán)藻的大量繁殖，形成所謂的“有害藻類(lèi)水華” (HAB)。HAB有規(guī)律地爆發(fā)在富營(yíng)養(yǎng)化水體中，并且全球范圍爆發(fā)頻率有逐年增加的趨勢(shì)。當(dāng)藍(lán)藻大量爆發(fā)時(shí)，會(huì)在水面上富集， 高密度的藍(lán)藻細(xì)胞通過(guò)呼吸作用大大減少水體中氧氣和有機(jī)物的含量，同時(shí)使光線無(wú)法達(dá)到較深的水層水體透明度下降，導(dǎo)致水體生物大量死亡影響生態(tài)平衡。在水華發(fā)生的富營(yíng)養(yǎng)化水體中，占主導(dǎo)地位的微囊藻屬(Microcystis)會(huì)產(chǎn)生大量藻毒素和其它代謝產(chǎn)物對(duì)湖泊、河流的生態(tài)，牲畜和人類(lèi)水源供給帶來(lái)負(fù)面影響。微囊藻毒素(Microcystins，MC) 是一類(lèi)在藍(lán)藻水華中出現(xiàn)頻率最高、造成危害最嚴(yán)重的藻毒素。經(jīng)常接觸含有毒素的水體， 會(huì)弓I發(fā)皮膚癌、肝炎及肝癌。因此建立一套有效的藍(lán)藻檢測(cè)方法很有必要。常見(jiàn)水華藍(lán)藻種類(lèi)有微囊藻(Microcys tis)、魚(yú)腥藻(Anabaena)、鞘絲藻 {tyngbya)、螺旋藻、Spirulina)、平裂藻(Merismopedia)、節(jié)球藻(Nodularia)、項(xiàng)圈藻{Anabaenopsis)、擬柱胞藻(PyIindrospermopsis)、束絲藻(Aphanizomenon)、亶員藻 (AsciWaioria)、微鞘藻iMicrocoleus)及浮游顫藻ipianktothrix)等。許多水華藍(lán)藻形態(tài)結(jié)構(gòu)極其相似，光從形態(tài)學(xué)上進(jìn)行分類(lèi)十分困難，制約了相關(guān)研究的深入。分子生物學(xué)方法無(wú)需培養(yǎng)未知微生物就可以對(duì)生物類(lèi)別、活性進(jìn)行分析和檢測(cè)。對(duì)特定的藍(lán)藻基因區(qū)域經(jīng)PCR擴(kuò)增后，凝膠電泳分離得到產(chǎn)物，序列測(cè)定后進(jìn)行基因分型，最終完成分子水平上的藍(lán)藻鑒定。IBSrRNA序列被廣泛用于微生物種類(lèi)鑒定。16SrRNA在原核生物中相對(duì)高保守性和廣泛存在性使其成為研究不同原核生物相互關(guān)系的最佳方法，根據(jù)16SrRNA保守區(qū)與高變區(qū)鑲嵌的特點(diǎn)，在研究不同生物類(lèi)群時(shí)，可采用不同區(qū)域作為分析比較的分子指標(biāo)。已經(jīng)有一系列通用引物設(shè)計(jì)出來(lái)用以擴(kuò)增16SrRNA基因片段，但屬以下不能用這種方法區(qū)分。相對(duì)而言，位于16SrRNA和23SrRNA之間的ITS區(qū)由于具有高變區(qū)域的特點(diǎn)，不但能區(qū)分屬，而且屬以下的類(lèi)別也能被區(qū)分開(kāi)來(lái)。總之，利用rRNA基因的特點(diǎn)能對(duì)藍(lán)藻從分子水平上進(jìn)行較為系統(tǒng)的分類(lèi)和鑒定研究。藍(lán)藻屬于原核類(lèi)微生物，其中16SrRNA、23SrRNA、 5SrRNA的順序依次被間隔基因(Internally Transcribed spacers, ITS)序列隔開(kāi)。其中，16SrRNA和23SrRNA的ITS序列長(zhǎng)度和組成變化多樣，比較適合于藍(lán)藻的屬種以下分類(lèi)學(xué)研究。16SrRNA在藍(lán)藻中保守性較高、存在廣泛，是藍(lán)藻分子鑒定的最佳基因區(qū)，可用此序列核苷酸相似值或差異值作為形態(tài)相似的屬種界定鑒定屬間的判別標(biāo)準(zhǔn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的旨在利用藍(lán)藻16-23S rRNA ITS基因片段設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物ITSF / ITSR。利用PCR特異擴(kuò)增的方法對(duì)藍(lán)藻進(jìn)行分類(lèi)鑒定。本方法從分子生物學(xué)層面，對(duì)待檢水體中藍(lán)藻數(shù)量及其時(shí)空分布、分子進(jìn)化與遺傳多樣性、藍(lán)藻的生物學(xué)功能基因研究有重要作用。水體環(huán)境中藍(lán)藻PCR檢測(cè)方法，包括基于藍(lán)藻16-23S rRNA ITS基因片段，設(shè)計(jì) PCR引物；提取待檢濃縮液中藍(lán)藻DNA基因片段；利用引物對(duì)該基因片段進(jìn)行PCR引物擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序；進(jìn)行多重序列比對(duì)分析。本發(fā)明是通過(guò)下述的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的
(1)基于藍(lán)藻16-23SrRNA ITS基因片段，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)如下，特異性擴(kuò)增藍(lán)藻16-23S rRNA ITS基因寡聚核苷酸的PCR引物
ITSF :5，- TGTACACACCGCCCGTCACACCA 一 3' ITSR :5’ - GTGGATACCTAGGCACACAGAG 一 3’
(2)提取待檢水樣中藍(lán)藻DNA基因片段；
(3)以藍(lán)藻DNA為模板，采用(1)中設(shè)計(jì)的引物，經(jīng)PCR獲得特異擴(kuò)增藍(lán)藻16-23SrRNA ITS基因片段；
(4)PCR產(chǎn)物的純化和純化產(chǎn)物TA克隆及測(cè)序，在NCBI中用Blast對(duì)所測(cè)定的核苷酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)分析。本方法PCR產(chǎn)物的純化是用DNA Gel Extraction Kit將產(chǎn)物片段純化并測(cè)定核苷酸序列。本發(fā)明意義旨在利用分子生物學(xué)的方法，經(jīng)濟(jì)快速準(zhǔn)確地檢測(cè)水體中藻類(lèi)的種類(lèi)及時(shí)空分布情況，為研究人員對(duì)水體環(huán)境的評(píng)估提供很好的依據(jù)。為將來(lái)控制和治理藻類(lèi)的大量爆發(fā)提供理論基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式
用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但并不以此來(lái)限定本發(fā)明。實(shí)施例1
下列方法中未注明具體實(shí)驗(yàn)方法的，按照常規(guī)條件如Sambrook等人的分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)，藍(lán)藻基因序列來(lái)自數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)。1. PCR引物設(shè)計(jì)
PCR引物是根據(jù)NCBI中下載的藍(lán)藻16-23S rRNA ITS基因序列，通過(guò)序列比對(duì)后得到保守序列后利用I^imer Express2. O軟件設(shè)計(jì)獲得PCR反應(yīng)的一對(duì)引物，分別在目的基因片段處擴(kuò)增約600bp，之后進(jìn)行合成。2.藍(lán)藻DNA的提取
使用天根公司離心柱型植物基因組DNA試劑盒提取水樣中藻類(lèi)的基因組DNA，操作如
下(1).將Iml水樣12，000rpm，離心;3min，棄上清后，加入700ul，65°C預(yù)熱過(guò)的緩沖液 GP1，然后加入0. 70ul巰基乙醇顛倒混勻，65°C水浴20min ；
(2).水浴后液體加入等體積氯仿混勻，12，OOOrpm，離心5min ；
(3).將水相轉(zhuǎn)入新離心管，加入700ul緩沖液GP2混勻；
(4).將混勻液體加入CB3吸附柱中，CB3吸附柱放入收集管中，12，000rpm離心30s，
棄液；
(5).向CB3中加500ul緩沖液⑶，CB3吸附柱放入收集管中，12，OOOrpm，離心30s，棄
液；
(6).向CB3柱加700ul漂洗液PW，將CB3吸附柱放入收集管中，12，OOOrpm，離心30s，
棄液；
(7).再向CB3柱加500ul漂洗液PW，將CB3吸附柱放入收集管中，12，OOOrpm，離心30
s，棄液；
(8).將CB3柱放回收集管中，12，000rpm，離心anin，棄液，CB3吸附柱置于室溫放置 5min ；
(9).將CB3柱轉(zhuǎn)入新離心管中，加50-200ul洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12， OOOrpm,離心 2min，保存于 _80°C。3. PCR 擴(kuò)增:
用ITSF和ITSR作為引物擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系組分見(jiàn)表1，PCR反應(yīng)程序?yàn)?0°C 30min、94°C 2min ；然后進(jìn)行；35 個(gè)循環(huán)擴(kuò)增 94°C 30sec、57°C 30sec ,72°C 1. 45min ；72°C 7min，反應(yīng)完成后于-80°C冰箱保存?zhèn)溆茫粩U(kuò)增產(chǎn)物大小約為600bp。
權(quán)利要求
1.一種利用PCR方法檢測(cè)水體中藍(lán)藻種類(lèi)的方法，包括下列步驟(1)基于藍(lán)藻16-23SrRNA ITS基因片段，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)如下，特異性擴(kuò)增藍(lán)藻16-23S rRNA ITS基因寡聚核苷酸的PCR引物ITSF :5，- TGTACACACCGCCCGTCACACCA 一 3' ITSR :5’ - GTGGATACCTAGGCACACAGAG 一 3’ ；(2)提取待檢水樣中藍(lán)藻DNA基因片段；(3)以藍(lán)藻DNA為模板，采用(1)中設(shè)計(jì)的引物，經(jīng)PCR獲得特異擴(kuò)增藍(lán)藻16-23SrRNA ITS基因片段；(4)PCR產(chǎn)物的純化和純化產(chǎn)物TA克隆及測(cè)序，在NCBI中用Blast對(duì)所測(cè)定的核苷酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于PCR產(chǎn)物的純化是用DNAGel Extraction Kit將產(chǎn)物片段純化。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用PCR方法檢測(cè)水體中藍(lán)藻種類(lèi)的方法，該方法基于藍(lán)藻16-23SrRNAITS基因片段，利用軟件設(shè)計(jì)合理的PCR引物；對(duì)待檢濃縮液中提取的藍(lán)藻DNA基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序；利用NCBI中的Blast軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)分析；對(duì)滇池不同時(shí)期3個(gè)代表性水樣進(jìn)行了檢測(cè)分析1223號(hào)水樣序列與集胞藻(Synechocysitssp.)同源相關(guān)性達(dá)97%；722號(hào)水樣與惠氏微囊藻(Microcystiswesenbergii)的同源相關(guān)性高達(dá)99%；另外，319號(hào)水樣與浮游魚(yú)腥藻(Anabaenaplanktonica)同源性高達(dá)99%。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102286619SQ201110206430
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者馮悅, 劉麗, 向安, 夏雪山, 彭玉輔, 魏大巧 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)