專利名稱：一種檢測黃牛fgf21基因單核苷酸多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測成纖維細胞生長因子 21 (fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21)基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的 RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)方法，具體地說，是一種利用限制性內(nèi)切酶對包含該單核苷酸多態(tài)性位點的基因序列進行酶切，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳對其進行片段大小分離，利用凝膠成像系統(tǒng)分析其片段大小，從而確定其SNP。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性(SNP)就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。近年來，人們發(fā)展了許多用于探尋分子遺傳標記的方法，最常見的有單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)(SSCP)、直接測序技術(shù)和PCR-RFLP等，但SSCP操作繁瑣、耗時長，結(jié)果易造成誤判； 而直接測序技術(shù)成本又較高。PCR-RFLP方法是一種檢測SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點后使用限制性內(nèi)切酶進行切割，然后進行瓊脂糖凝膠電泳分析，就能準確地鑒別SNP位點。 PCR-RFLP方法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點，而且所檢測的序列位點無特殊性要求。成纖維細胞生長因子21 (fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21)是一種主要的脂肪代謝調(diào)節(jié)因子，具有調(diào)控能量代謝的作用，在動物模型中作為一個代謝調(diào)控子的發(fā)現(xiàn)引起了研究者的關(guān)注。FGF21在肝臟中特異的表達，可通過作用于脂肪組織及胰腺來降低血糖和甘油三酯含量，從而預防飲食誘導的肥胖及胰島素抵抗。對于黃牛育種來講，分析FGF21 基因在牛脂肪代謝及能量平衡中的機制，對于提高黃牛的育肥效率、提高肉品質(zhì)具有重要的理論意義。國內(nèi)外未見關(guān)于FGF21基因遺傳變異的研究，該基因位點的功能研究及其遺傳變異與經(jīng)濟性狀(如體重等)關(guān)聯(lián)的研究仍是空白。由于FGF21基因功能涉及體重等生長性狀，本發(fā)明提供的檢測方法為FGF21基因的SNP與中國黃牛生長性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國黃牛生長性狀的標記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于利用PCR-RFLP方法檢測黃牛FGF21基因的多態(tài)性，并將其與生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析，驗證其是否可以作為黃牛分子育種中輔助選擇的分子標記，從而加快良種選育速度。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種快速檢測黃牛FGF21基因SNP的RFLP方法，以包含F(xiàn)GF21基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P1、P2、P3為引物，PCR擴增黃牛TOF21基因(全長1459bp，含 3個外顯子和2個內(nèi)含子)，發(fā)現(xiàn)4個SNP位點；針對這4個SNP位點分別設計引物對F159、 F297、F940、Fl 151，依次人為引入Sal I、XhoI、XbaI、MspI酶切位點，進行PCR擴增，用限制性內(nèi)切酶SalI、XhoI、XbaI、MspI分別酶切該四對引物的PCR擴增產(chǎn)物，再用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切后的片段，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛FGF21基因第159位、第297位、 第940位、第1151位的單核苷酸多態(tài)性。所述的引物對Pl為上游引物5'ATGGGCTGGGACGAGGCCAAGTTC 3'，下游引物5‘ CAAACCAAGCCTGACCAACATCAAA 3 ‘；所述的引物對P2為上游引物5‘ GGAAGCTGTACGGATCGGTGAG 3 ‘，下游引物5,CTCCTTTCTCAGCTTTATCGTCTAGG 3'；所述的引物對P3為上游引物5'CCTGCCTCCGTGGTTTTGAG 3'，下游引物5‘ TCAAGAAGTGTAGCTGGGGCTTCG 3 ‘。將該三對引物的PCR產(chǎn)物送測序，根據(jù)測序結(jié)果及突變情況，在黃牛FGF21基因第 159位、第297位、第940位和第1151位處重新設計引物，并依次人為引入SalI、XhoI、XbaI、 MspI酶切位點，以引物對F159、F297、F940、F1151為引物，PCR擴增黃牛FGF21基因所述的引物對F159為上游F159-Sall :5' CCGCCAGCGGTACCTCTACACGGTCGA 3'，下游Rl59:5' TCCAAGAGACCTGAGGGGAGAAAGTGGG 3'；所述的引物對F297為上游F262-XhoI :5' CCTGAAGCAGTAGGGAATTGGGGCCTCG 3'，下游R262:5' CACCGATCCGTACAGCTTCCCATCTGGC 3'；所述的引物對F940為上游F940:5' CCTGGCTCATGCTGGGCGAAGGGTC 3'，下游R940-Xbal :5' CGGAGGCAGGTCCCTCCTTAACCTCTAG 3'；所述的引物對Fl 151為上游Fl 151:5' AGACCTAGACGATAAAGCTGAGAAAGGAGG 3'，下游R1151-Mspl :5' AAAGTGCAGCTGCGGGGATGAGAGCC 3'。 用限制性內(nèi)切酶Sail、XhoI, XbaI、MspI分別酶切上述四對引物的PCR擴增產(chǎn)物， 再用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切后的片段，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定中國黃牛FGF21基因第159位、第297位、第940位和第1151位的單核苷酸多態(tài)性。所述的PCR擴增反應程序為95°C 預變性 5min ；30 34 個循環(huán) 94°C變性 30s，66. 8°C 退火 30s，72°C 延伸 40s ； 72°C延伸 IOmin ；4°C保存。所述的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為3.5%。所述的根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛FGF21基因第159位的單核苷酸多態(tài)性為TT基因型表現(xiàn)為244bp條帶；TC基因型表現(xiàn)為244bp、221bp和23bp條帶；CC基因型表現(xiàn)為221bp和23bp條帶。第297位的單核苷酸多態(tài)性為CC基因型表現(xiàn)為205bp條帶；CG 基因型表現(xiàn)為205bp、180bp和25bp條帶；GG基因型表現(xiàn)為180bp和25bp。第940位的單核苷酸多態(tài)性為CC基因型表現(xiàn)為207bp條帶；CT基因型表現(xiàn)為207bp、179bp和28bp條帶；TT基因型表現(xiàn)為179bp和28bp。第1151位的單核苷酸多態(tài)性為CC基因型表現(xiàn)為151bp 和27bp條帶；CT基因型表現(xiàn)為178bp、151bp和27bp條帶；TT基因型表現(xiàn)為178bp。本發(fā)明根據(jù)FGF21基因的序列設計引物，分別以5種黃牛品種的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，并對PCR產(chǎn)物進行測序，測序后得到黃牛FGF21基因的完整序列。與NCBI 公布的序列進行比較，發(fā)現(xiàn)在第159位、第297位、第940位和第1151位存在SNP多態(tài)性。針對上述4處SNP多態(tài)性，本發(fā)明還公開了其篩查和檢測方法，通過設計特定的引物PCR擴增，特定的限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，能夠簡單、快速、成本低、精確的檢測其單核苷酸的多態(tài)性。本發(fā)明對5個黃牛品種的SNP基因型進行了檢測和基因頻率分析，對上述SNP位點與黃牛部分生長性狀(如體重等)進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明該位點能夠作為提高黃牛生長性狀的分子標記。


圖1為牛FGF21基因的結(jié)構(gòu)圖及突變位點所在的位置。圖2為黃牛FGF21基因SNP多態(tài)性測序圖，其中圖2a、2b、2c、2d中雙峰分別為黃牛FGF21基因第159位、第297位、第940位、第1151位SNP位點。 圖3為黃牛FGF21基因包含F(xiàn)159位點的PCR產(chǎn)物電泳圖及酶切結(jié)果圖，其中圖3a 為PCR產(chǎn)物電泳圖，3b為酶切結(jié)果圖。圖4為黃牛FGF21基因包含F(xiàn)297位點的PCR產(chǎn)物電泳圖及酶切結(jié)果圖，其中圖4a 為PCR產(chǎn)物電泳圖，4b為酶切結(jié)果圖。圖5為黃牛FGF21基因包含F(xiàn)940位點的PCR產(chǎn)物電泳圖及酶切結(jié)果圖，其中圖5a 為PCR產(chǎn)物電泳圖，5b為酶切結(jié)果圖。圖6為黃牛FGF21基因包含F(xiàn)1151位點的PCR產(chǎn)物電泳圖及酶切結(jié)果圖，其中圖 6a為PCR產(chǎn)物電泳圖，6b為酶切結(jié)果圖。圖7為本發(fā)明用來檢測SNP多態(tài)性的PCR引物設計示意圖，圖7a、7b、7c、7d分別檢測是黃牛FGF21基因包含第159位、第297位、第940位、第1151位多態(tài)位點的PCR引物設計方案。其中大寫部分為引物序列，斜體部分為引入突變，黑體加粗部分為SNP位點，方框部分為形成的酶切位點。
具體實施例方式本發(fā)明利用PCR-RFLP方法對黃牛TOF21基因第159位、第297位、第940位、第 1151位的單核苷酸多態(tài)性進行檢測，下面結(jié)合對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。A、設計黃牛FGF21基因的PCR引物黃牛FGF21基因全長1459bp，包含3個外顯子和2個內(nèi)含子。以NCBI所公布的牛 (NC_007316)序列為參考，利用Primer 5. 0設計3對引物將FGF21基因全長(含3個外顯子和2個內(nèi)含子，共11459bp)分3段擴增，引物如下所述的引物對Pl為上游引物5'ATGGGCTGGGACGAGGCCAAGTTC 3'，
下游引物5 ‘ CAAACCAAGCCTGACCAACATCAAA 3 ‘；所述的引物對P2為上游引物5'GGAAGCTGTACGGATCGGTGAG 3'，下游引物5,CTCCTTTCTCAGCTTTATCGTCTAGG 3'；所述的引物對P3為上游引物5'CCTGCCTCCGTGGTTTTGAG 3‘，下游引物5'TCAAGAAGTGTAGCTGGGGCTTCG 3'。以黃?；蚪M為模板，用上述3對引物擴增牛FGF21基因的全長(含3個外顯子和 2個內(nèi)含子，共1459bp)，將PCR產(chǎn)物送測序，結(jié)合測序結(jié)果和NCBI所公布的牛(NC_007316) 序列發(fā)現(xiàn)4處突變第一外顯子存在一處同義突變(NC_007316 :159T > C)，第一內(nèi)含子存在一處突變(NC_007316 :297C > G)，第二內(nèi)含子存在二處突變(NC_007316 :940C > Τ, 1151C>T)。經(jīng)過分析，以上4處SNP均不存在天然酶切位點，因此，通過設計引物對F159、 F297、F940、F1151在四個SNP處依次人為引入Sail、XhoI、XbaI、MspI酶切位點。B、以引物對F159、F297、F940、F1151進行PCR擴增待測黃牛的FGF21基因片段1、黃牛樣本的采集本發(fā)明具體以5個中國地方黃牛品種的種群作為檢測對象，具體采集樣本見表1 表1黃牛樣本的采集
權(quán)利要求
1.一種快速檢測黃牛FGF21基因SNP的RFLP方法，其特征在于以包含F(xiàn)GF21基因的待測黃?；蚪MDNA為模板，PCR擴增黃牛FGF21基因，發(fā)現(xiàn)4個SNP位點；針對這4個SNP 位點分別設計弓I物對Fl59、F297、F940、Fl 151，進行PCR擴增，用限制性內(nèi)切酶SalI、XhoI、 XbaI,Msp I分別酶切該PCR擴增產(chǎn)物，再用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，根據(jù)電泳結(jié)果鑒定黃牛FGF21基因第159位、第297位、第940位、第1151位的單核苷酸多態(tài)性。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛FGF21基因SNP的RFLP方法，其特征在于，以包含 FGF21基因的黃?；蚪MDNA為模板，PCR擴增黃牛FGF21基因。將PCR產(chǎn)物送測序，根據(jù)突變情況重新設計引物對F159、F297、F940、F1151，依次引入Sail、XhoI、XbaI、MspI酶切位點，PCR擴增黃牛FGF21基因；所述的引物對F159為上游 F159-Sall :5' CCGCCAGCGGTACCTCTACACGGTCGA 3'， 下游 Rl59:5' TCCAAGAGACCTGAGGGGAGAAAGTGGG 3'； 所述的引物對F297為上游 F262-XhoI :5' CCTGAAGCAGTAGGGAATTGGGGCCTCG 3'， 下游 R262:5' CACCGATCCGTACAGCTTCCCATCTGGC 3'； 所述的引物對F940為上游 F940:5' CCTGGCTCATGCTGGGCGAAGGGTC 3'， 下游 R940-Xbal :5' CGGAGGCAGGTCCCTCCTTAACCTCTAG 3'； 所述的引物對F1151為上游 F1151 5 ‘ AGACCTAGACGATAAAGCTGAGAAAGGAGG 3 ‘， 下游 R1151-Mspl :5' AAAGTGCAGCTGCGGGGATGAGAGCC 3'。用限制性內(nèi)切酶SalI、XhoI、XbaI、MSpI分別酶切該四對引物的PCR擴增產(chǎn)物，再用瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)電泳結(jié)果鑒定黃牛FGF21基因第159位、第297位、第940位和第 1151位的單核苷酸多態(tài)性。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛FGF21基因SNP的RFLP方法，其特征在于所述的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為3. 5%。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛FGF21基因SNP的RFLP方法，其特征在于，第159位的單核苷酸多態(tài)性為TT基因型表現(xiàn)為244bp條帶，TC基因型表現(xiàn)為244bp、221bp和23bp條帶，CC基因型表現(xiàn)為221bp和23bp條帶；第297位的單核苷酸多態(tài)性為CC基因型表現(xiàn)為 205bp條帶，CG基因型表現(xiàn)為205bp、180bp和25bp條帶，GG基因型表現(xiàn)為180bp和25bp ； 第940位的單核苷酸多態(tài)性為CC基因型表現(xiàn)為207bp條帶，CT基因型表現(xiàn)為207bp、179bp 和28bp條帶，TT基因型表現(xiàn)為179bp和28bp ；第1151位的單核苷酸多態(tài)性為CC基因型表現(xiàn)為151bp和27bp條帶，CT基因型表現(xiàn)為178bp、151bp和27bp條帶，TT基因型表現(xiàn)為 178bp。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測黃牛FGF21基因SNP的RFLP方法，以包含F(xiàn)GF21基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P1、P2、P3為引物，PCR擴增黃牛FGF21基因，發(fā)現(xiàn)4個SNP位點；針對這4個SNP位點分別設計引物對F159、F297、F940、F1151，依次人為引入SalI、XhoI、XbaI、MspI酶切位點，進行PCR擴增，用上述四種限制性內(nèi)切酶分別酶切該PCR擴增產(chǎn)物，再用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切后的片段，根據(jù)電泳結(jié)果鑒定黃牛FGF21基因第159位、第297位、第940位、第1151位的單核苷酸多態(tài)性。由于FGF21基因功能涉及體重等生長性狀，本發(fā)明提供的檢測方法為FGF21基因的SNP與生長性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國黃牛生長性狀的標記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。
文檔編號C12Q1/68GK102296110SQ201110201228
公開日2011年12月28日 申請日期2011年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月18日
發(fā)明者孫曉梅, 李明勛, 滑留帥, 王璟, 藍賢勇, 陳宏 , 馬偉 申請人:西北農(nóng)林科技大學