專利名稱：前列腺癌靶向基因的寡核苷酸適配體、遞釋載體、遞釋系統(tǒng)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種前列腺癌靶向基因前列腺癌靶向基因的寡核苷酸適配體、遞釋載體、遞釋系統(tǒng)及其制備方法。
背景技術(shù)：
前列腺癌(prostatic cancer,PCa)是男性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率隨年齡的增長而提高，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的惡性疾病。在2010年美國癌癥學(xué)會公布的統(tǒng)計(jì)報告中，前列腺癌在男性的發(fā)病率中排名第一，死亡率排名第二，僅次于肺癌。對于 PCa的治療，早期完整手術(shù)切除前列腺是首選的治療方案，但是手術(shù)治療會伴有嚴(yán)重的并發(fā)癥及醫(yī)源性損傷，而且對已發(fā)生轉(zhuǎn)移的PCa無效。目前臨床上治療中晚期PCa主要采用放療、化療(包括內(nèi)分泌治療)等手段，這些治療方法存在用藥順應(yīng)性差、組織選擇性差、毒性反應(yīng)大及耐藥性等問題?；蛑委熛鄬τ谏鲜龇椒▉碚f具有許多無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，如靶向性好、毒副作用小及可特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞等，但是外源基因自己不能主動進(jìn)入細(xì)胞，因此基因治療應(yīng)用于臨床還需要一種安全、高效的傳遞載體進(jìn)行遞送。目前報道較多的基因載體主要包括病毒載體和非病毒載體，病毒載體雖然具有很高的轉(zhuǎn)染率，但病毒載體的制備復(fù)雜且昂貴，需要重整病毒，更重要的是人們對于其可能引起免疫反應(yīng)和基因突變引起致癌性轉(zhuǎn)化的安全隱患。而非病毒載體設(shè)計(jì)靈活，制備方便，價格低廉，無毒，無免疫反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特異性和長期基因表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)。常見的非病毒載體主要有聚乙烯亞胺(PEI)，聚精氨酸(PLR)，聚酰胺-胺(PAMAM)樹枝狀高分子等聚陽離子高分子材料，其中聚乙烯亞胺，聚精氨酸毒性較大，但通過特定的親水性聚合物修飾，可以降低其毒性。而PAMAM的粒徑大小、電泳性質(zhì)和其他一些擬生態(tài)性質(zhì)與球狀蛋白質(zhì)非常相似，被稱為“人工蛋白”。但是上述陽離子聚合物載體還存在一個嚴(yán)重缺陷-靶向性差。目前用于解決前列腺癌靶向性差的方法，主要是通過在載體上連接可以特異識別前列腺癌組織的靶向頭基， 來完成對癌細(xì)胞的主動靶向作用。然而，目前主要使用的靶向頭基是單克隆抗體，單克隆抗體存在合成困難、造價高昂、穩(wěn)定性差等缺陷，成為制約其作為進(jìn)一步向臨床大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)展的瓶頸。因此，有必要研發(fā)一種新型的前列腺癌靶向頭基來替代單克隆抗體，以及開發(fā)一種新型的適用于前列腺癌的靶向治療的前列腺癌靶向基因遞釋載體和相應(yīng)的前列腺癌靶向基因遞釋系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題之一是提供一種前列腺癌靶向基因的寡核苷酸適配體，這種寡核苷酸適配體制備方便、穩(wěn)定性高。本發(fā)明需要解決的另一技術(shù)問題是提供一種前列腺癌靶向基因遞釋載體，該基因遞釋系統(tǒng)將上述寡核苷酸適配體作為靶向頭基，除了制備方便、穩(wěn)定性高，而且能顯著提高
3基因遞釋系統(tǒng)的前列腺癌靶向性和基因在前列腺癌組織的表達(dá)。本發(fā)明需要解決的另一技術(shù)問題是提供一種前列腺癌靶向基因遞釋系統(tǒng)，其能顯著提高治療基因在前列腺癌組織的轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)水平此外，本發(fā)明需要解決的另一技術(shù)問題是提供一種前列腺癌靶向基因遞釋載體和系統(tǒng)的制備方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一種前列腺癌靶向基因的寡核苷酸適配體，該寡核苷酸適配體的序列組成為5 ‘ -GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUAC⑶CACUCCU- (CH2) 6-S_S-(CH2) 6-0H-3'，且具有2'-氟修飾。 本發(fā)明通過對第一代適體AlO進(jìn)行修飾，將原有適體AlO的79個核苷酸長度裁剪到具有39個核苷酸長度的新型第二代適體A10-3. 2，降低了合成難度，通過與前列腺癌表面特異性膜抗原結(jié)合作用發(fā)現(xiàn)，結(jié)合效率有所提高，并且對A10-3. 2的每個核苷酸進(jìn)行了 2’_氟修飾，增加了穩(wěn)定性。因此，證明A10-3. 2寡核苷酸適配體是一種有效的前列腺癌靶向頭基。在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種前列腺癌靶向基因遞釋載體，其由聚陽離子高分子材料、親水性聚合物和A10-3. 2寡核苷酸適配體為基礎(chǔ)，三者以共價方式鏈接構(gòu)成， 其中，親水性聚合物與聚陽離子高分子的摩爾比是1 25 1，A10-3.2寡核苷酸適配體與聚陽離子高分子材料的摩爾比為1 5 1 ；所述A10-3.2寡核苷酸適配體的序列組成為5 ‘ -GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUAC⑶CACUCCU- (CH2) 6-S-S- (CH2) 6-0H-3 ‘，且具有2'-氟修飾。優(yōu)選地，所述親水性聚合物與聚陽離子高分子的摩爾比是1 4 1 ；所述寡核苷酸適配體與聚陽離子高分子材料的摩爾比為3 5 1。在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種前列腺癌靶向基因遞釋系統(tǒng)，其由上述前列腺癌靶向基因遞釋載體與miRNA、siRNA或質(zhì)粒DNA形成納米級基因遞釋系統(tǒng)，其中，所述聚陽離子高分子材料與miRNA、siRNA或質(zhì)粒DNA的N/P比是10 15 1在本發(fā)明的另一方面，還提供了前列腺癌靶向基因遞釋載體的制備方法，包括以下步驟A.聚陽離子高分子材料和親水性聚合物以1 1 25的摩爾比溶于pH值7. 7 8.3的磷酸緩沖液(PBS)，室溫攪拌反應(yīng)1 池，生成聚陽離子高分子材料-親水性聚合物； 超濾法除去未反應(yīng)的親水性聚合物并更換為pH值6. 7 7. 3磷酸緩沖液；B.所述的寡核苷酸適配體溶于pH值7. 4的PBS中，加入二硫蘇糖醇(DTT)，室溫攪拌反應(yīng)后，除去剩余DTT，生成巰基修飾的寡核苷酸適配體；C.上述A10-3. 2寡核苷酸適配體與聚陽離子高分子材料以摩爾比為1 5 1， 室溫下攪拌反應(yīng)M 3 后生成聚陽離子高分子材料-親水性聚合物-A10-3. 2寡核苷酸適配體，透析除去未反應(yīng)的A10-3. 2寡核苷酸適配體，得到前列腺癌靶向基因遞釋載體。在本發(fā)明的另一方面，還提供了前列腺癌靶向基因遞釋系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟將上述制備的前列腺癌靶向基因遞釋載體溶于pH值7. 4-7. 7磷酸緩沖液(PBS) 中，配制成所需濃度的溶液，將miRNA、siRNA或質(zhì)粒DNA溶于PBS中配置成所需濃度溶液，室溫下兩者等體積混合后，渦旋20-40s后，靜置20-40min，制成前列腺癌靶向基因遞釋系統(tǒng)，其中，所述聚陽離子高分子材料與miRNA、siRNA或質(zhì)粒DNA的N/P比是10 15 1。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的陽離子高分子材料選自聚酰胺-胺型樹狀分支物(PAMAM)、 聚精氨酸(PLR)、聚乙烯亞胺(PEI)、多聚賴氨酸。優(yōu)選地，所述的親水性聚合物選自聚乙二醇(PEG)。本發(fā)明所述的miRNA、siRAN是指任何可合成的RNA序列，質(zhì)粒DNA是任何可在真核細(xì)胞表達(dá)的質(zhì)粒DNA。本發(fā)明所述的前列腺癌靶向基因遞釋載體和系統(tǒng)，其以所述A10-3. 2寡核苷酸適配體為靶向頭基，增加了基因在前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)水平，特別是通過無創(chuàng)傷的靜脈注射方式給藥后，能顯著提高基因遞釋系統(tǒng)的前列腺癌靶向性和基因在前列腺癌組織的表達(dá)。與現(xiàn)有的單克隆抗體作為靶向頭基構(gòu)建的基因遞釋系統(tǒng)相比，本發(fā)明的前列腺癌靶向作用和外來基因的表達(dá)效率均能顯著提高，且穩(wěn)定性更強(qiáng)。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1是本發(fā)明前列腺癌靶向基因遞釋載體的合成線路圖；圖2是實(shí)施例1中PAMAM-PEG-A10-3. 2核磁共振圖譜；圖3是實(shí)施例7中瓊脂糖凝膠電泳考察不同不同N/P比，PAMAM-PEG-A10-3. 2包裹基因效果示意圖；圖4是實(shí)施例8中熒光顯微鏡下觀察不同N/P比下，PAMAM-PEG-A10-3. 2/pEGFP、 PLR-PEG-A10-3. 2/pEGFP和 PEI-PEG-A10-3. 2/pEGFP轉(zhuǎn)染的前列腺癌細(xì)胞中 pEGFP_N2 綠色熒光蛋白質(zhì)粒的表達(dá)情況示意圖；圖5是實(shí)施例9中PAMAM-PEG-A10-3. 2/DNA作用在LNCaP細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)量示意圖；圖6是實(shí)施例10中前列腺癌裸鼠移植瘤小鼠尾靜脈注射DyLight-688標(biāo)記的 PAMAM-PEG-A10-3. 2、PLR-PEG-A10-3. 2 和 PEI-PEG-A10-3. 2 活體成像儀觀察結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式本研究發(fā)明了一種新型前列腺癌靶向頭基-A10-3. 2寡核苷酸適配體，來替代單克隆抗體，有效的解決合成難，造價高，穩(wěn)定性差，等缺陷。A10-3. 2寡核苷酸適配體，簡稱適體，是一種能與特異性地表達(dá)于前列腺上皮細(xì)胞表面的前列腺特異性膜抗原(PSMA，prostate specific membrane antigen)特異高效結(jié)合的單鏈寡核苷酸。適體與靶細(xì)胞結(jié)合的特異性和單克隆抗體相似，甚至更高，但適體分子體積較小，比單克隆抗體更易穿透組織和器官。當(dāng)適體連接到藥物載體表面時，系統(tǒng)的體積不會有很大地增加，使藥物載體粒徑更容易控制。而且，適體并沒有明顯的免疫原性，其介導(dǎo)的靶向藥物注入人體內(nèi)不會引發(fā)免疫反應(yīng)，同時，適體制備方便，且比單克隆抗體有更高的穩(wěn)定性，可以在許多緩沖溶液中保存，所以在生產(chǎn)、儲存和運(yùn)輸當(dāng)中有很大的優(yōu)勢。A10-3. 2 適體是針對PSMA細(xì)胞膜外部分的重組蛋白的第二代適體，相對于第一代AlO適體，結(jié)構(gòu)更加簡單，不僅降低了合成難度，而且又提高了靶向性。含有A10-3.2適體的納米?？梢燥@著
5性地增加藥物對前列腺癌細(xì)胞的毒性，因而適用于前列腺癌的靶向治療。本 發(fā)明采用核磁共振技術(shù)對所制備的基因遞釋載體及其制備過程的中間產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果顯示，PAMAM與含有雙功能基團(tuán)的PEG (琥珀酰亞胺-PEG3500-馬來酰亞胺)反應(yīng)后，在3. 5ppm處出現(xiàn)PEG的特征吸收峰，并在6. 7ppm處出現(xiàn)馬來酰亞胺的特征吸收峰。說明PEG已經(jīng)修飾到PAMAM上，再和A10-3. 2寡核苷酸適配體反應(yīng)后，該馬來酰亞胺的特征吸收峰消失，說明PAMAM-PEG-A10-3. 2合成成功。本發(fā)明采用0. 7%瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)考察所制備的基因遞釋系統(tǒng)的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，在N/P > 2時，基因遞釋系統(tǒng)中的DNA可以被完全包裹，并保持穩(wěn)定。同時可以推斷載基因遞釋系統(tǒng)中在相同條件下，可以保持siRNA或miRNA穩(wěn)定。本發(fā)明所制備的基因遞釋系統(tǒng)轉(zhuǎn)染高表達(dá)PSMA的前列腺癌細(xì)胞LNCaP(PSMA+)， 定性和定量結(jié)果均顯示，PAMAM-PEG-A10-3. 2/DNA基因遞釋系統(tǒng)表達(dá)效果最高，其中，蟲熒光素酶定量結(jié)果顯示，PAMAM-PEG-A10-3. 2/DNA基因遞釋系統(tǒng)的基因產(chǎn)物表達(dá)量是 PAMAM-PEG/DNA 的 6 倍左右。本發(fā)明所制備的基因遞釋系統(tǒng)通過前列腺癌LNCaP(PSMA+)接種的裸鼠模型尾靜脈注射方式，考察體內(nèi)靶向性和基因表達(dá)效果，動物活體成像定性結(jié)果顯示，經(jīng)A10-3. 2寡核苷酸適配體修飾后的基因遞釋系統(tǒng)在小鼠皮下移植瘤區(qū)域表達(dá)量顯著高于其他組織。以下通過實(shí)施例，進(jìn)一步具體、詳細(xì)地描述本發(fā)明。實(shí)施例1本發(fā)明通過對第一代適體AlO進(jìn)行修飾，將原有適體AlO的79個核苷酸長度裁剪到具有39個核苷酸長度的新型第二代適體A10-3. 2。本實(shí)施例所述的前列腺癌靶向基因以 A10-3. 2寡核苷酸適配體為靶向頭基，A10-3. 2寡核苷酸適配體的堿基組成為5' -GGGAGG ACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUAC⑶CACUCCU(SEQ. ID. NO. 1)。該寡核苷酸適配具體組成為5' -G GGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUAC⑶CACUCCU- (CH2) 6_S_S- (CH2) 6_0Η_3 ‘，且具有 2 ‘-氟修飾，且具有2'-氟修飾。本實(shí)施例所述的前列腺癌靶向基因遞釋載體，其由PAMAM、PEG和上述A10-3. 2寡核苷酸適配體為基礎(chǔ)，三者以共價方式鏈接構(gòu)成，其中，PEG與PAMAM的摩爾比是2 1， A10-3. 2寡核苷酸適配體與聚陽離子高分子材料的摩爾比為4 1 ；本實(shí)施例所述的前列腺癌靶向基因遞釋載體的制備方法，包括如下步驟A.聚陽離子高分子材料和親水性聚合物以1 1 25的摩爾比溶于pH值7. 7 8. 3的磷酸緩沖液(PBS)，室溫攪拌反應(yīng)1 2h，生成聚陽離子高分子材料-親水性聚合物； 超濾法除去未反應(yīng)的親水性聚合物并更換為pH值6. 7 7. 3磷酸緩沖液；B.所述的寡核苷酸適配體溶于pH值7. 4的PBS中，加入二硫蘇糖醇(DTT)，室溫攪拌反應(yīng)后，除去剩余DTT，生成巰基修飾的寡核苷酸適配體；C. A10-3. 2寡核苷酸適配體與聚陽離子高分子材料以摩爾比為4 1，室溫下攪拌反應(yīng)24 36h后生成聚陽離子高分子材料-親水性聚合物-A10-3. 2寡核苷酸適配體，透析除去未反應(yīng)的A10-3. 2寡核苷酸適配體，得到前列腺癌靶向基因遞釋載體。合成路線如圖1。將上述PAMAM-PEG-A10-3.2 基因遞釋載體 1. Omg，溶于 0. 5ml 重水中，NMR(300MHz) 鑒定基因遞釋載體的結(jié)構(gòu)，獲得理想的核磁共振圖譜(附圖2)，說明PAMAM-PEG-A10-3. 2合成成功。實(shí)施例2本實(shí)施例所述的前列腺癌靶向基因的寡核苷酸適配體如實(shí)施例1所述。本實(shí)施例所述的前列腺癌靶向基因遞釋載體，其由PLR、PEG和上述A10-3. 2寡核苷酸適配體為基礎(chǔ)，三者以共價方式鏈接構(gòu)成，其中，PEG與PLR的摩爾比是2 LA10-3.2 寡核苷酸適配體與聚陽離子高分子材料的摩爾比為4 1。本實(shí)施例所述的前列腺癌靶向基因遞釋載體的制備方法，包括如下步驟 A. PLR和含有雙功能基團(tuán)的PEG按照摩爾比1 2溶于pH8. 0的磷酸緩沖液(PBS) 中，室溫攪拌反應(yīng)2h，生成PLR-PEG，超濾除去未反應(yīng)的PEG并更換緩沖液為pH7. 0的PBS ；B.合成好的A10-3. 2寡核苷酸適配體溶于pH值7. 4的PBS中，加入DTT，室溫攪拌30分鐘，除去剩余DTT，生成巰基修飾的A10-3. 2寡核苷酸適配體SH-A10-3. 2 ；C. A10-3. 2寡核苷酸適配體與聚陽離子高分子材料以摩爾比為4 1比混合，室溫攪拌反應(yīng)24小時后生成PLR-PEG-A10-3. 2 ；超濾離心除去未反應(yīng)的SH-A10-3. 2后，即得 PLR-PEG-A10-3. 2構(gòu)成的前列腺癌靶向基因遞釋載體。將PLR-PEG-A10-3. 2 基因遞釋載體 1. Omg，溶于 0. 5ml 重水中，NMR(300MHz)鑒定基因遞釋載體的結(jié)構(gòu)，獲得理想的核磁共振圖譜(具體附圖省略)，說明PLR-PEG-A10-3. 2 合成成功。實(shí)施例3本實(shí)施例所述的前列腺癌靶向基因的寡核苷酸適配體如實(shí)施例1所述。本實(shí)施例所述的前列腺癌靶向基因遞釋載體，其由PEI、PEG和上述A10-3. 2寡核苷酸適配體為基礎(chǔ)，三者以共價方式鏈接構(gòu)成，其中，PEG與PLR的摩爾比是2 LA10-3.2 寡核苷酸適配體與聚陽離子高分子材料的摩爾比為4 1。本實(shí)施例所述的前列腺癌靶向基因遞釋載體的制備方法，包括如下步驟A. PEI和含有雙功能基團(tuán)的PEG按照摩爾比1 2溶于pH8. O的磷酸緩沖液(PBS) 中，室溫攪拌反應(yīng)2h，生成PEI-PEG，超濾除去未反應(yīng)的PEG并更換緩沖液為pH7. O的PBS ；B.將合成好的A10-3. 2寡核苷酸適配體溶于pH值7. 4的PBS中，加入定量DTT， 室溫攪拌30分鐘，除去剩余DTT，生成巰基修飾的A10-3. 2寡核苷酸適配體SH-A10-3. 2 ；C. A10-3. 2寡核苷酸適配體與聚陽離子高分子材料以摩爾比為4 1，室溫攪拌反應(yīng)24小時后生成PEI-PEG-A10-3. 2 ；超濾離心除去未反應(yīng)的SH-A10-3. 2后，即得 PEI-PEG-A10-3. 2構(gòu)成的前列腺癌靶向基因遞釋載體。將PEI-PEG-A10-3. 2 基因遞釋載體 1. Omg，溶于 0. 5ml 重水中，NMR(300MHz)鑒定基因遞釋載體的結(jié)構(gòu)，獲得理想的核磁共振圖譜(具體附圖省略)，說明PEI-PEG-A10-3. 2 合成成功。實(shí)施例4 本實(shí)施例所述的前列腺癌靶向基因遞釋系統(tǒng)，其由實(shí)施例1所述的遞釋載體和 PEGFP-N2制備而成。具體制備如下將實(shí)施例1中制備的PAMAM-PEG-A10-3. 2基因遞釋載體和pEGFP_N2分別溶于適量的PH值7. 4的PBS中，按照N/P為1 15混合，渦旋30s后，室溫孵育30分鐘，制成 PAMAM-PEG-A10-3. 2/DNA基因遞釋系統(tǒng)。并使用粒徑zeta電位儀測定，結(jié)果顯示，納米復(fù)合物粒徑控制在200nm以下，zata電位在25 30之間，證明PAMAM-PEG-A10-3. 2可以與DNA 形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物顆粒。實(shí)施例5本實(shí)施例所述的前列腺癌靶向基因遞釋系統(tǒng)，其由實(shí)施例2所述的遞釋載體和 PEGFP-N2制備而成。具體制備如下將實(shí)施例2中制備的PLR-PEG-A10-3. 2基因遞釋系統(tǒng)溶基因遞釋載體和pEGFP_N2 分別溶于適量的PH值7. 4的PBS中，按照Ν/Ρ為1 15混合，渦旋30s后，室溫孵育30 分鐘，制成PLR-PEG-A10-3. 2/DNA,基因遞釋系統(tǒng)?；蜻f釋系統(tǒng)。并使用粒徑zeta電位儀測定，結(jié)果顯示，納米復(fù)合物粒徑控制在200nm以下，zata電位在25 30之間，證明 PLR-PEG-A10-3. 2可以與DNA形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物顆粒。實(shí)施例6本實(shí)施例所述的前列腺癌靶向基因遞釋系統(tǒng)，其由實(shí)施例3所述的遞釋載體和 PEGFP-N2制備而成。具體制備如下將實(shí)施例3中制備的PEI-PEG-A10-3. 2基因遞釋系統(tǒng)基因遞釋載體和pEGFP_N2 分別溶于適量的PH值7. 4的PBS中，按照Ν/Ρ為1 15混合，渦旋30s后，室溫孵育30 分鐘，制成PEI-PEG-A10-3. 2/DNA，基因遞釋系統(tǒng)?；蜻f釋系統(tǒng)。并使用粒徑zeta電位儀測定，結(jié)果顯示，納米復(fù)合物粒徑控制在200nm以下，zata電位在25 30之間，證明 PAMAM-PEG-A10-3. 2可以與DNA形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物顆粒。實(shí)施例7使用實(shí)施例4制備的PAMAM-PEG-A10-3. 2/DNA基因遞釋系統(tǒng)，在不同N/P比下， 100V電壓、0. 7瓊脂糖凝膠電泳25分鐘，考察基因遞釋系統(tǒng)包裹DNA的能力，結(jié)果顯示該系統(tǒng)可以有效的保護(hù)DNA免受DNase I的降解，見附圖3。實(shí)施例8使用實(shí)施例4制備的PAMAM-PEG-A10-3. 2/DNA基因遞釋系統(tǒng)和前列腺癌細(xì)胞 LNCaP,于37°C。5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1小時，采用pH7. 4的PBS溶液潤潤洗細(xì)胞，48小時后采用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果并拍照O00倍放大)，結(jié)果顯示，細(xì)胞中有綠色熒光蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，PAMAM-PEG-A10-3. 2可以將DNA遞送至細(xì)胞內(nèi)，并有效表達(dá)。見附圖4。使用實(shí)施例5制備的PLR-PEG-A10-3. 2/DNA基因遞釋系統(tǒng)和前列腺癌細(xì)胞LNCaP， 于37°C。5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1小時，采用pH7. 4的PBS溶液潤潤洗細(xì)胞，48小時后采用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果并拍照O00倍放大)，結(jié)果顯示，細(xì)胞中有綠色熒光蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，PLR-PEG-A10-3. 2可以將DNA遞送至細(xì)胞內(nèi)，并有效表達(dá)。見附圖4。使用實(shí)施例6制備的PEI-PEG-A10-3. 2/DNA基因遞釋系統(tǒng)和前列腺癌細(xì)胞LNCaP， 于37°C。5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1小時，采用pH7. 4的PBS溶液潤潤洗細(xì)胞，48小時后采用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果并拍照O00倍放大)，結(jié)果顯示，細(xì)胞中有綠色熒光蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，PLR-PEG-A10-3. 2可以將DNA遞送至細(xì)胞內(nèi)，并有效表達(dá)。見附圖4。實(shí)施例9將實(shí)施例1中制備的PAMAM-PEG-A10-3. 2基因遞釋載體溶于適量的pH7. 4 的PBS中，配制成一系列濃度。將pGL3-Control Vector溶于適量的PBS中，與 PAMAM-PEG-A10-3. 2 按照 N/P 比 1、5、10、15、20、25 混合，渦旋 30s 后，室溫孵育 30 分鐘，制成PAMAM-PEG-A10-3. 2/DNA，基因遞釋系統(tǒng)。PAMAM-PEG/DNA作為對照。分別與前列腺癌細(xì)胞LNCaP，于37°C。5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1小時，采用pH7. 4的PBS溶液潤潤洗細(xì)胞，48小時后采用熒光素酶分析系統(tǒng)分析LNCaP細(xì)胞中，熒光素酶的表達(dá)量，結(jié)果顯示，與 PAMAM-PEG-A10-3. 2/DNA作用的細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)量均大于PAMAM-PEG/DNA，且在N/P > 15后，均有顯著性差異。見附圖5。
實(shí)施例10 使用實(shí)施例1制備的PAMAM-PEG-A10-3. 2基因遞釋載體，標(biāo)記紅色熒光 DyLight-688，制備具有紅色熒光的DyLight-688-PAMAM-PEG-A10_3. 2基因遞釋載體，前列腺癌移植瘤裸鼠尾靜脈注射4小時后，活體成像儀觀察，結(jié)果顯示，基因遞釋載體在移植瘤處聚集明顯高于其余組織，見附圖6A。說明PAMAM-PEG-A10-3. 2可以在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)主動靶向作用，將DNA有效遞送至前列腺癌靶組織，是一種有效的基因遞釋載體。使用實(shí)施例2制備的PEI-PEG-A10-3. 2基因遞釋載體，標(biāo)記紅色熒光 DyLight-688，制備具有紅色熒光的DyLight-688-PEI-PEG-A10_3. 2基因遞釋載體，前列腺癌移植瘤裸鼠尾靜脈注射4小時后，活體成像儀觀察，結(jié)果顯示，基因遞釋載體在移植瘤處聚集明顯高于其余組織，見附圖6C。說明PEI-PEG-A10-3. 2可以在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)主動靶向作用， 將DNA有效遞送至前列腺癌靶組織，是一種有效的基因遞釋載體。使用實(shí)施例3制備的PLR-PEG-A10-3. 2基因遞釋載體，標(biāo)記紅色熒光 DyLight-688，制備具有紅色熒光的DyLight-688-PLR-PEG-A10_3. 2基因遞釋載體，前列腺癌移植瘤裸鼠尾靜脈注射4小時后，活體成像儀觀察，結(jié)果顯示，基因遞釋載體在移植瘤處聚集明顯高于其余組織，見附圖6B。說明PLR-PEG-A10-3. 2可以在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)主動靶向作用， 將DNA有效遞送至前列腺癌靶組織，是一種有效的基因遞釋載體。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說， 在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種前列腺癌靶向基因的寡核苷酸適配體，其特征在于，該寡核苷酸適配體的組成為5 ‘ -GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUAC⑶CACUCCU- (CH2) 6_S_S- (CH2) 6_0Η_3 ‘，且具有2'-氟修飾。
2.一種前列腺癌靶向基因遞釋載體，其特征在于，其由聚陽離子高分子材料、親水性聚合物和權(quán)利要求1所述的寡核苷酸適配體為基礎(chǔ)，三者以共價方式鏈接構(gòu)成，其中，親水性聚合物與聚陽離子高分子的摩爾比是1 25 1，所述寡核苷酸適配體與聚陽離子高分子材料的摩爾比為1 5 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的前列腺癌靶向基因遞釋載體，其特征在于，所述親水性聚合物與聚陽離子高分子的摩爾比是1 4 1 ；所述寡核苷酸適配體與聚陽離子高分子材料的摩爾比為3 5 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的前列腺癌靶向基因遞釋載體，其特征在于，所述陽離子高分子材料為聚酰胺-胺型樹狀分支物、聚精氨酸、聚乙烯亞胺或多聚賴氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的前列腺癌靶向基因遞釋載體，其特征在于，所述的親水性聚合物為聚乙二醇。
6.一種前列腺癌靶向基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，其是由權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)所述的前列腺癌靶向基因遞釋載體與miRNA、siRNA或質(zhì)粒DNA形成的納米級基因遞釋系統(tǒng)，其中， 所述聚陽離子高分子材料與miRNA、siRNA或質(zhì)粒DNA的N/P比是10 15 1。
7.一種制備權(quán)利要求2所述前列腺癌靶向基因遞釋載體的方法，其特征在于，包括以下步驟A.聚陽離子高分子材料和親水性聚合物以1 1 25的摩爾比溶于pH值7. 7 8. 3 的磷酸緩沖液，室溫攪拌反應(yīng)1 2h，生成聚陽離子高分子材料-親水性聚合物；超濾法除去未反應(yīng)的親水性聚合物并更換為pH值6. 7 7. 3的PBS ；B.權(quán)利要求1所述的寡核苷酸適配體溶于PBS中，加入二硫蘇糖醇，室溫攪拌反應(yīng)后， 除去剩余二硫蘇糖醇，生成巰基修飾的寡核苷酸適配體；C.權(quán)利要求1所述的寡核苷酸適配體與聚陽離子高分子材料以摩爾比為1 5 1， 室溫下攪拌反應(yīng)M 3 后生成聚陽離子高分子材料-親水性聚合物-寡核苷酸適配體， 透析除去未反應(yīng)的寡核苷酸適配體，得到前列腺癌靶向基因遞釋載體。
8.一種制備權(quán)利要求6所述前列腺癌靶向基因遞釋系統(tǒng)的方法，其特征在于，包括以下步驟將權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)所述前列腺癌靶向基因遞釋載體溶于pH值7. 4-7. 7的磷酸緩沖液中，配制成所需濃度的溶液，將miRNA、siRNA或質(zhì)粒DNA溶于pH值7. 4的PBS中配置成所需濃度溶液，室溫下兩者等體積混合后，渦旋20-40s后，靜置20-40min，制成前列腺癌靶向基因遞釋系統(tǒng)，其中，所述聚陽離子高分子材料與miRNA、siRNA或質(zhì)粒DNA的N/P比是 10 15 1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種前列腺癌靶向基因的寡核苷酸適配體、遞釋載體、遞釋系統(tǒng)及其制備方法，所述遞釋載體由聚陽離子高分子材料、親水性聚合物和的寡核苷酸適配體為基礎(chǔ)，三者以共價方式鏈接構(gòu)成，其中，親水性聚合物與聚陽離子高分子的摩爾比是1～25∶1，所述寡核苷酸適配體與聚陽離子高分子材料的摩爾比為1～5∶1；所述遞釋系統(tǒng)由遞釋載體與miRNA、siRNA或質(zhì)粒DNA形成的納米級基因遞釋系統(tǒng)。本發(fā)明所述遞釋載體和遞釋系統(tǒng)可有效提高表達(dá)前列腺特異性膜抗原的前列腺癌細(xì)胞上基因轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)效率，與現(xiàn)有的技術(shù)采用的靶向頭基構(gòu)筑的基因傳遞系統(tǒng)比較，具有穩(wěn)定性更強(qiáng)，靶向效果顯著提高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N15/87GK102268436SQ20111020121
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月18日
發(fā)明者丁寶月, 丁雪鷹, 葉麗華, 張敏, 張瑋, 朱全剛, 武鑫, 王曉宇, 王翔, 范偉, 韓雁, 高申, 高靜 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)