專利名稱：水稻rad51c基因在育性控制中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一個(gè)育性控制基因RAD51C的分離克隆和功能驗(yàn)證。RAD51C通過參與水稻減數(shù)分裂的調(diào)控，控制水稻花粉育性和胚囊育性。對(duì)該基因的生物學(xué)功能驗(yàn)證結(jié)果表明，該基因可以作為不育基因，用于水稻雜交種子生產(chǎn)和育性控制。
背景技術(shù)：
水稻生產(chǎn)在我國糧食生產(chǎn)上有著舉足輕重的地位。自二十世紀(jì)七十年代以來，一系列雜交水稻的推廣，使得單產(chǎn)有了大幅度提高，在一定程度上緩解了我國人口迅速增長(zhǎng)對(duì)糧食的需求急劇增長(zhǎng)的壓力。雜交水稻選用在遺傳上有一定差異的優(yōu)良水稻品種，用三系法(不育系，保持系和恢復(fù)系)、一些衍生出來的兩系法和一系法生產(chǎn)具有雜種優(yōu)勢(shì)的雜交種。雜種優(yōu)勢(shì)是兩個(gè)遺傳背景不同的親本雜交產(chǎn)生的雜種一代在生長(zhǎng)勢(shì)，生活力，繁殖·力，產(chǎn)量等方面優(yōu)于雙親的現(xiàn)象。三系法中，不育系是不能自花授粉結(jié)實(shí)的，主要為雌蕊發(fā)育正常，而雄蕊的發(fā)育退化或者敗育。保持系的雌雄蕊都發(fā)育正常。將保持系的花粉授予不育系可以成功獲得種子，但是由該種子產(chǎn)生的植株仍然為雄性不育。用恢復(fù)系的花粉授予不育系所產(chǎn)生的種子長(zhǎng)出的植株又恢復(fù)了育性。雄性不育系的利用是制備雜交種的重要環(huán)節(jié)，但是從自然界尋找不育系并不多，而且選育雄性不育系和恢復(fù)系也存在一定的困難，利用基因工程的方法獲得不育系和恢復(fù)系前景誘人。花粉發(fā)育是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，需要多個(gè)基因按照一定的時(shí)空表達(dá)模式共同參與，才能順利完成，任何一個(gè)過程出現(xiàn)異常都會(huì)導(dǎo)致花粉不育。通過基因工程的方法創(chuàng)造雄性不育系的途徑包括(I)利用花藥或者花粉特異的啟動(dòng)子表達(dá)細(xì)胞毒素基因，選擇性破壞花粉發(fā)育的某些組織；(2)通過基因沉默可以阻斷花粉發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致花粉敗育；(3)改變花粉發(fā)育過程中關(guān)鍵酶或者功能蛋白的時(shí)空表達(dá)可以獲得雄性不育材料；(4)通過導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因或者擾亂線粒體功能創(chuàng)造細(xì)胞質(zhì)雄性不育系等(繆穎等2000 ;宋江華等2008);對(duì)應(yīng)雄性不育系的保持系可以是沒有轉(zhuǎn)化的對(duì)照植株，也可以是通過基因工程改造得到的保持系；另外，還可以通過無性繁殖來保持不育系。在真核生物的生活史中，要經(jīng)歷二倍體的孢子體時(shí)代和單倍體的配子體時(shí)代。在孢子體時(shí)代，真核生物進(jìn)行減數(shù)分裂形成單倍體配子；來自父母本的雌雄配子發(fā)生融合使后代恢復(fù)到二倍體的水平。減數(shù)分裂在真核生物的有性生殖形成單倍體的過程中扮演著重要的角色，此過程中染色體出現(xiàn)的聯(lián)會(huì)交換，大大增加了遺傳的多樣性。近十多年來，通過對(duì)模式生物酵母的減數(shù)分裂的研究，鑒定了許多控制減數(shù)分裂的基因。此外，人們通過反向或正向遺傳學(xué)的方法在模式植物擬南芥中克隆了幾十個(gè)控制減數(shù)分裂的基因(Schwarzacher, 2003 ；Ma, 2005 ；Mercier 和 Grelon, 2008)。比較酵母和植物的減數(shù)分裂發(fā)現(xiàn)，減數(shù)分裂的機(jī)制在真核生物中相對(duì)保守。真核生物的RAD51是一類與大腸桿菌(Escherichia coli)重組蛋白R(shí)ecA結(jié)構(gòu)和功能上很相似的蛋白，在有絲分裂和減數(shù)分裂過程中起到重要作用(Shinohara等，1992)。在對(duì)recA/RAD51基因家族的研究中發(fā)現(xiàn)RAD51基因家族由于基因重復(fù)和基因水平轉(zhuǎn)移，而形成 RAD51，RAD51B, RAD51C, RAD51D, DMCl, XRCC2, XRCC3, RecA 等多個(gè)成員(Lin 等，2006)。真核生物酵母基因組中包含多個(gè)RecA和RAD51同源蛋白，而在哺乳動(dòng)物中包含五個(gè)同源蛋白(RAD51B，RAD51C, RAD51D, XRCC2和XRCC3)，這些蛋白與RAD51或者相互之間有20%至30%的序列同源性(Lovett, 1994 ;Sonoda等,2001)。水稻中至少有13個(gè)同源蛋白，其中包括RAD51A1，RAD51A2, RAD51B, RAD51C, RAD51D, DMC1A, DMC1B, XRCC2, XRCC 3 以及四個(gè) RecA 同源蛋白(http://rice, plantbiology. msu. edu/)。RAD51基因家族成員大多數(shù)在減數(shù)分裂中扮演重要角色，突變以后減數(shù)分裂可能會(huì)出現(xiàn)不同程度的異常。酵母DMCl基因是一個(gè)在減數(shù)分裂前期I表達(dá)的減數(shù)分裂特異基因，編碼的蛋白是減數(shù)分裂同源染色體配對(duì)所必需的。在中國小鼠細(xì)胞系CL-V4B、irsUirslSF中，RAD51C, XRCC2和XRCC3突變后對(duì)DNA交聯(lián)劑敏感，染色體自發(fā)異常頻率明顯增加(Cui等，1999 ;Godthelp等，2002)。小鼠RAD51B，RAD51D以及XRCC2突變后在胚胎發(fā)育階段致死(Shu 等，1999 ;Deans 等，2000 ;Pittman 和 Schimenti，2000)。線蟲 RAD51C，XRCC3 突變后減數(shù)分裂重組異常導(dǎo)致部分不育，并且對(duì)DNA雙鏈損傷劑敏感(Abdu等，2003)。在擬南芥中，AtRAD51突變以后營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和有絲分裂沒有明顯的異常，而減數(shù)分裂受到嚴(yán)重的影響(Mercier等，2003)。在AtRAD51的突變體中，偶線期染色體不能正常的聯(lián)會(huì)，無法形成聯(lián)會(huì)復(fù)合體以及減數(shù)分裂前期I出現(xiàn)染色體斷裂(Mercier等，2003)。AtRAD51C和AtXRCC3突變以后與AtRAD51的突變體有著類似的表型營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)正常；減數(shù)分裂異常，不能形成正常的雌雄配子從而導(dǎo)致敗育(Bleuyard等，2006)。AtRAD51B、AtRAD51D和AtXRCC2突變以后提高了對(duì)絲鏈霉素COnitomycin C)的敏感性，但減數(shù)分裂沒有明顯的異常(Bleuyard等,2005 ；Durrant等,2007)。AtDMCl突變以后減數(shù)分裂過程中不能形成二價(jià)體,但是可以修復(fù)雙鏈斷裂(Couteau等，1999)。玉米R(shí)AD51A1和RAD51A2參與同源染色體聯(lián)會(huì)配對(duì)以及雙鏈斷裂修復(fù)過程，雙突變體中能夠看到非同源染色體的配對(duì)，聯(lián)會(huì)和交換。水稻中有兩個(gè)拷貝的DMCl，分別是DMClA和DMC1B，DMCl基因控制水稻細(xì)胞減數(shù)分裂過程中同源染色體的配對(duì)，該基因受抑制后營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)正常，但是減數(shù)分裂過程中染色體進(jìn)行不均等分離和孢子形成無規(guī)則，從而使花粉不育，結(jié)實(shí)率降低(Ding等,2001 ;Deng和Wang, 2007)。目前還沒有關(guān)于水稻RAD51C基因的功能的報(bào)道。本發(fā)明利用RAD51C的T-DNA插入突變體詳細(xì)研究了該基因在減數(shù)分裂過程中的作用，為植物育性的控制提供了新的途徑，也為我們深入了解減數(shù)分裂的機(jī)制提供了幫助。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是分離克隆一個(gè)控制水稻減數(shù)分裂的基因，涉及分離一種包含RAD51C基因的DNA片段，通過該片段的T-DNA插入突變體以及遺傳互補(bǔ)鑒定表明該片段控制水稻減數(shù)分裂、影響雌雄配子的發(fā)育從而控制水稻的育性。該基因的克隆有利于了解水稻減數(shù)分裂的過程，并為人工控制水稻花粉育性或胚囊育性以生產(chǎn)雜交種子提供理論基礎(chǔ)。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO: I所示，或者基本上相當(dāng)于SEQ ID N0:1所示的DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQ ID NO :1所示序列的亞片段。本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過控制水稻減數(shù)分裂基因RAD51C的表達(dá)來獲得不育轉(zhuǎn)基因水稻，進(jìn)而利用不育水稻生產(chǎn)雜交種，為增加水稻產(chǎn)量，改善水稻品質(zhì)，提高抗性和適應(yīng)性提供重要資源，因此在水稻育種上具有重要價(jià)值，尤其在水稻雜種優(yōu)勢(shì)利用上據(jù)有重要的實(shí)踐意義。具體的說就是利用基因改造的方法，利用器官或組織特異表達(dá)的啟動(dòng)子，特異性的抑制該基因在雌配子或/和雄配子的表達(dá)從而得到雌性不育或雄性不育或雌雄都不育的植株，創(chuàng)造新的雌性或/和雄性不育系，這些不育系可以用于雜交水稻的生產(chǎn)，如水稻雜交種的培育。也可以用于控制其他植物的育性。另外，這些不育系還可以使轉(zhuǎn)基因植物的花粉不育，消除轉(zhuǎn)基因植物中外源基因逃逸的風(fēng)險(xiǎn)。


序列表SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2是水稻RAD51C基因的序列和它編碼的蛋白
質(zhì)的氨基酸序列。圖I :本發(fā)明鑒定、分離克隆和功能分析水稻RAD51C基因的流程圖。 圖2 :水稻RAD51C基因的T-DNA插入突變體4D-50016的鑒定。(A)RAD51C基因結(jié)構(gòu)和T-DNA插入位置示意圖。其中RAD51C基因的非翻譯區(qū)的結(jié)構(gòu)和RAD51C基因兩側(cè)的基因組結(jié)構(gòu)是根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)中粳稻品種日本晴的相對(duì)應(yīng)區(qū)段的DNA和cDNA(AK060971)序列確定的。(B)RAD51C基因T-DNA插入突變體T1植株的基因型檢測(cè)。WT :野生型Dongjin (對(duì)照)。(C)RAD51C基因在野生型Dongjin(WT)、T-DNA插入突變體(M)和陰性植株(N)中的表達(dá)分析。以Actin基因的表達(dá)量作為樣品量的參照。轉(zhuǎn)基因家系為T2代。圖3 :RAD51C敲除株系的表型觀察。圖中標(biāo)尺為150μΜ。(A) Dongjin (野生型)和RAD51C敲除植株在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期沒有明顯差異。(B) Dongjin (野生型)和RAD51C敲除植株的小花在外觀上沒有明顯差別。(C)Dongjin (野生型)植株的花藥飽滿，而RAD51C敲除植株的花藥相對(duì)瘦癟。(D) Dongjin (野生型)植株的花藥中充滿圓形花粉粒，而RAD51C敲除植株的花藥中花粉粒干癟。(E) Dongjin (野生型)植株能正常散粉，而RAD51C敲除植株不能正常散粉。(F) Dongjin (野生型)植株的花粉粒正常，而RAD51C敲除植株的花粉粒敗育。圖4 :T-DNA插入與不育性狀的共分離分析。結(jié)實(shí)率為3個(gè)穗子結(jié)實(shí)率的平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤。(A) —個(gè)RAD51C T-DNA插入突變體(4D-50016，Dongjin背景)與Dongjin雜交的BC1F2群體的基因型以及結(jié)實(shí)率分析。對(duì)照為Dongjin。(B)另一個(gè)RAD51C T-DNA插入突變體(4D-50016，Dongjin背景)與中花11雜交的BC1F2群體的基因型以及結(jié)實(shí)率分析。對(duì)照為中花11。圖5 :遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA2301的結(jié)構(gòu)。圖6 D2030r遺傳轉(zhuǎn)化植株(Dongjin遺傳背景)Tl家系的RAD51C基因與育性共分離分析。用PCR引物39630-m-F和VectorR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的受體材料中RAD51C基因中插入了 T-DNA。用PCR引物2301-F和rad51_com-R擴(kuò)增pCAMBIA2301載體的一部分區(qū)段以及RAD51C的啟動(dòng)子區(qū)域的一部分來檢測(cè)互補(bǔ)片段的導(dǎo)入情況。結(jié)實(shí)率為3個(gè)穗子結(jié)實(shí)率的平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤。對(duì)照為粳稻Dongjin。(A)D2030r-52Tl家系的結(jié)實(shí)率和基因型分析。(B)D2030r-55 Tl家系的結(jié)實(shí)率和基因型分析。圖7 :野生型(Dongjin)和RAD51C敲除植株的胚囊發(fā)育與形成過程。圖中標(biāo)尺為50 μ M0 (A)野生型植株的胚囊發(fā)育與形成過程。在野生型植株中，孢原細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育形成大孢子母細(xì)胞(箭頭所示)；大孢子母細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂形成四分體(箭頭所示)，近珠孔端的三個(gè)大孢子(箭頭所示)相繼退化，只留下合點(diǎn)端的一個(gè)大孢子；胚囊中的功能大孢子(箭頭所示)繼續(xù)發(fā)育形成單核胚囊。之后逐步形成二核(箭頭所示)胚囊發(fā)育期，四核(箭頭所示)胚囊發(fā)育期，八核胚囊發(fā)育期[三個(gè)箭頭所示分別為極核(PN)，反足細(xì)胞(AN)和助細(xì)胞(SY)]。在胚囊成熟期，成熟的胚囊中可見極核(PN)，反足細(xì)胞(AN)和助細(xì)胞(SY)。(B)RAD51C敲除植株的胚囊發(fā)育與形成過程。在RAD51C敲除植株能中，發(fā)育形成正常大孢子母細(xì)胞(箭頭所示)；在大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期，大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂形成的四分體的核不清晰，而且四分體的核全部開始降解(不能看到完全的四個(gè)核)；在功能大孢子形成期，四個(gè)大孢子全部退化，不能形成功能大孢子；在成熟胚囊中沒有形成正常的極核，反足細(xì)胞和助細(xì)胞，只有一些降解的核的痕跡。圖8 :野生型(Dongjin)和RAD51C敲除植株中花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂過程。圖中標(biāo)尺為25μΜ。(A)野生型植株的花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂過程。在野生型植株中，進(jìn)入減數(shù)分裂的細(xì)胞在細(xì)線期，染色質(zhì)濃縮為細(xì)而長(zhǎng)的細(xì)線；在偶線期，同源染色體靠近并開始聯(lián)會(huì)；到粗線期，染色質(zhì)進(jìn)一步縮短變粗，同源染色體完成聯(lián)會(huì)，呈較粗的線狀結(jié)構(gòu)，染色質(zhì) 進(jìn)一步縮短形成雙價(jià)體；進(jìn)入雙線期，可在染色單體間看到交叉結(jié)；到終變期，染色體螺旋化程度更高，可以清晰的看到12個(gè)雙價(jià)體；隨后減數(shù)分裂I進(jìn)入中期I，各個(gè)雙價(jià)體排列在赤道板上；在后期I，同源染色體彼此分開移向兩極；在末期I，同源染色體各自到達(dá)兩極，細(xì)胞質(zhì)分裂，形成二分體；二分體中的每個(gè)細(xì)胞再進(jìn)行一次分裂，形成四分體，其中在末期II，姐妹染色單體分開移向兩極。(B)RAD51C敲除植株的花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂過程。在RAD51C敲除植株中，減數(shù)分裂細(xì)線期以及偶線期沒有明顯的異常；在粗線期，同源染色體并沒有完全緊密相貼；在雙線期，可以看到明顯的染色體片段；在終變期，出現(xiàn)染色體片段，沒有形成明顯的12個(gè)雙價(jià)體；在后期I轉(zhuǎn)換期，細(xì)胞中有染色體片段，并有染色體橋出現(xiàn)；在后期II，同樣出現(xiàn)染色體片段，最后形成四分體。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，圖I描述了鑒定和分離克隆RAD51C基因以及驗(yàn)證RAD51C基因功能的流程。根據(jù)以上的描述和下面的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實(shí)施例I :分離克隆RAD51C基因和基因結(jié)構(gòu)分析I.從水稻品種Dongjin中分離克隆RAD51C基因的全長(zhǎng)DNA片段根據(jù)水稻全基因組序列數(shù)據(jù)庫[RGAP(Rice Genome Annotation Project http://rice, plantbiology. msu. edu/)]中提供的 RAD51C 基因(RGAP 數(shù)據(jù)庫位點(diǎn)名L0C_0s01g39630)的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì) PCR 引物 OsRADSlC-FC -ATGGAGATCGCCGACCTC-3 ')和 OsRAD5IC-R(5; -CATTACCCGGACTCGCTTG-3')，采用反轉(zhuǎn)錄-PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)技術(shù)，從粳稻品種 Dongjin(Oryza sativa ssp. japonica)中擴(kuò)增 RAD51C 的全長(zhǎng)cDNA。具體操作方法是從Dongjin葉組織中抽提總RNA (Zhou等，2002)。取1_5 μ g總RNA用DNaseI (美國Invitrogen公司)處理15分鐘以去除基因組DNA污染,然后參照Zhou等(Zhou等,2002)的方法,使用oligo (dT) 15寡聚引物和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得總cDNA。以總cDNA為模板，用PCR引物OsRAD51C_F和OsRAD51C_R擴(kuò)增獲得RAD51C基因的cDNA。利用OsRAD51C_F和OsRAD51C_R引物和上述測(cè)序方法對(duì)RAD51C基因的cDNA進(jìn)行測(cè)序。比較分析RAD51C基因的基因組序列和cDNA序列，發(fā)現(xiàn)Dongjin中的 RAD51C 基因 cDNA 序列與 GenBank 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中粳稻品種日本晴的cDNA序列AK060971的對(duì)應(yīng)區(qū)段完全一致。粳稻Dongjin中的RAD51C基因編碼區(qū)的基因組片段由4600個(gè)核苷酸組成，被插入的8個(gè)內(nèi)含子分成9段(圖2A)。第一段編碼區(qū)由112個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQID N0:1的l-112bp處)；第一個(gè)內(nèi)含子由248個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID N0:1的113-360bp處)；第二段編碼區(qū)由105個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO :I的361_465bp處)；第二個(gè)內(nèi)含子由283個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO 1的466_748bp處)；第三段編碼區(qū)由123個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO 1的749_871bp處)；第三個(gè)內(nèi)含子由240個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID N0:1的872-llllbp處)；第四段編碼區(qū)由34個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO :1的1112-1145bp處)；第四個(gè)內(nèi)含子由70個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO :1的1146_1215bp處)；第五段編碼區(qū)由71個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO 1的1216_1286bp處)；第五個(gè)內(nèi)含子由79個(gè)核苷酸·組成(位于序列表SEQ ID NO 1的1287-1365bp處)；第六段編碼區(qū)由227個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO :1的1366_1592bp處)，第六個(gè)內(nèi)含子由196個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO 1的1593-1788bp處)；第七段編碼區(qū)由132個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO 1的1789-1920bp處)；第七個(gè)內(nèi)含子由709個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID N0:1的1921-2629bp處)；第八段編碼區(qū)由67個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ IDNO :1的2630-2696bp處)；第八個(gè)內(nèi)含子由1728個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO I的2697-4424bp處)；第九段編碼區(qū)由176個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO 1的4425-4600bp 處)。序列表 SEQ ID NO 1 的 4601_4603bp 處終止密碼。2. RAD51C基因編碼產(chǎn)物的分析RAD51C基因的編碼區(qū)由1047個(gè)核苷酸組成，編碼一個(gè)長(zhǎng)度為349個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。根據(jù)Lin等(2006)的RecA/RAD51蛋白質(zhì)家族進(jìn)化分析，RAD51C屬于RADii亞類，包含由230個(gè)氨基酸組成的RecA/RAD51A結(jié)構(gòu)域；RecA/RAD51結(jié)構(gòu)域包含保守的由GXXXXGK (T/S) ( “X”代表任意氨基酸)組成的Walker A模體和由hhhhDE( “h”代表疏水氨基酸)組成的 Walker B 模體(Hanson 等，2005)。實(shí)施例2 RAD51C基因T-DNA插入突變體的驗(yàn)證I. T-DNA插入突變體的獲得及驗(yàn)證利用RAD51C基因的啟動(dòng)子和編碼區(qū)序列檢索水稻突變體數(shù)據(jù)庫RiceGE (http://siRnal. salk. edu/cRi-bin/RiceGE),發(fā)現(xiàn)這個(gè)突變體庫中存在一個(gè)T-DNA插入的突變體，其插入位點(diǎn)位于RAD51C基因的第三段編碼區(qū)中(圖2A);該突變體編號(hào)為4D-50016，遺傳轉(zhuǎn)化載體為PGA2772,遺傳轉(zhuǎn)化受體水稻品種是Dongjin (Jeong等,2006)。通過商業(yè)途徑，我們從這個(gè)水稻突變體庫購得4D-50016突變體T1代種子。種子經(jīng)發(fā)芽后，獲得5棵突變體植株。為了驗(yàn)證所獲得突變體的正確性，本發(fā)明研究人員根據(jù)RAD51C基因的序列設(shè)計(jì)了一對(duì)位于T-DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)的RAD51C基因的PCR引物(圖2A) 39630-m-F(5; -GCTCCCCAAGAAACTTTTCC-3')和 396301-1^(5' -CCACTGTTCTTGGCATGTTG-3')。另外，根據(jù) T-DNA序列設(shè)計(jì)了 PCR 引物 vectorR(5' -ACCTGTAAGATTTAGCACCC-3' ) (Jeong等，2002)。利用這3條PCR引物分析所獲得突變體的T-DNA是否插入在RAD51C基因中。這一分析的基本原理是在4D-50016的純合突變體(一對(duì)同源染色體中都有T-DNA的插入)植株中，由于插入的T-DNA片段大約14kb (Wu等，2003)，利用RAD51C基因的引物39630-m-F和39630_m-R、采用常規(guī)PCR方法無法擴(kuò)增如此大的DNA片段，而用引物vectorR和39630_m-R可以擴(kuò)增出一段大小已知的水稻基因組和T-DNA的雜合DNA片段；在40-50016的雜合突變體(一對(duì)同源染色體中只有一條染色體中有T-DNA插入)植株中，用引物39630-m-F和39630_m-R可以擴(kuò)增一段大小已知的水稻基因組的DNA片段，用引物vectorR和39630_m-R也可以擴(kuò)增一段大小已知的水稻基因組和T-DNA的雜合DNA片段；在40-50016的陰性(突變體家系中分離出的沒有T-DNA插入的)植株中，用引物39630-m-F和39630_m-R可以擴(kuò)增一段大小已知的水稻基因組DNA片段，但是用引物vectorR和39630_m-R不能夠擴(kuò)增DNA片段。對(duì)5株4D-50016家系的T1植株進(jìn)行了上述PCR分析。檢測(cè)結(jié)果表明這5株中有4株為雜合植株(4D-50016-2、3、4、5)，1株為陰性植株(4D-50016-1);這些4D-50016雜合植株的后代
用于其他實(shí)施例中的分析。2. T-DNA插入突變體中RAD51C基因表達(dá)量分析在4D-50016雜合植株的后代(T2)中篩選純合突變體株系。用RT-PCR的方法分析RAD51C基因在突變體中的表達(dá)量。采用實(shí)施例I中的方法獲得總cDNA，PCR分析的引物是0sRAD51c-rt-f(5; -TATGGTGGACTTGGTGGGAA-3')和0sRAD51C-rt_r (5' -TCCGGCTGGAGCCTTGT-3')。用肌動(dòng)蛋白(actin)基因的表達(dá)量作為樣品量的參照；肌動(dòng)蛋白基因(GenBank注冊(cè)號(hào)X15865)的 PCR 引物是 Actin-F^ -TGTATGCCAGTGGTCGTACCA-3')和 Actin_R(5' -CCAGCAAGGTCGAGACGAA-3')。在 4D-50016 純合株系(M)中，沒有檢測(cè)到 RAD51C基因的表達(dá)，說明這些株系中的RAD51C基因表達(dá)被敲除(圖2C)，下文中稱4D-50016純合株系為RAD51C敲除株系。實(shí)施例3 RAD51C敲除植株的表型分析對(duì)RAD51C敲除株系表型進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期與野生型(Dongjin，對(duì)照)沒有明顯區(qū)別(圖3A)。在生殖生長(zhǎng)的抽穗期，RAD51C敲除株系與對(duì)照在穗型和小花形態(tài)方面也沒有明顯差別(圖3B)。但是野生型花藥飽滿，而RAD51C敲除植株的花藥相對(duì)瘦癟(圖3C)。取抽穗期的花藥通過整體染色透明激光掃描共聚焦顯微術(shù)方法(郭海濱等，2006)觀察，野生型花藥中的花粉粒呈正常的圓形，而RAD51C敲除植株的花粉粒干癟(圖3D)。另夕卜，RAD51C敲除植株不能正常散粉，表現(xiàn)為完全不育，而野生型植株能正常散粉(圖3E)。取花藥用1%的碘一碘化鉀染色測(cè)定法(李自超等，1992)，顯微觀察顯示，與野生型對(duì)照相t匕，RAD51C敲除植株花藥中是敗育的花粉(圖3F)。為證實(shí)RAD5IC敲除植株除了雄性不育外，是否還存在雌性不育。本發(fā)明的研究人員用粳稻Dongjin (野生型對(duì)照)和RAD51C敲除(純合4D-50016突變體)植株進(jìn)行正反交。同時(shí)用4D-50016突變體家系中分離出的陰性植株與Dongjin雜交作為對(duì)照。結(jié)果顯示(表I)，無論RAD51C敲除植株是作為父本還是母本，與Dongjin雜交后的雜種都表現(xiàn)為不育，而作為對(duì)照的雜種的結(jié)實(shí)率為42% -60%。這些結(jié)果說明RAD51C敲除植株的雌雄都不育。
表I. Dongjin (野生型)和RAD51C敲除植株正反交雜種的結(jié)實(shí)率
權(quán)利要求
1.一種分離的RAD51C基因在控制水稻育性中的應(yīng)用，其特征在于該基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示。
2.一種分離的RAD51C基因在控制水稻育性中的應(yīng)用，其特征在于該基因的蛋白質(zhì)的序列如序列表SEQ ID N0:2所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及包含水稻育性控制基因RAD51C的分離克隆、功能驗(yàn)證。RAD51C基因?qū)儆赗ecA/RAD51蛋白質(zhì)家族，它能夠控制水稻花粉以及胚囊的育性。敲除該基因使水稻減數(shù)分裂異常導(dǎo)致花粉不育和胚囊不育?？梢酝ㄟ^組織特異性地抑制RAD51C基因表達(dá)創(chuàng)建雄性不育或者雌雄不育水稻材料。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102888408SQ201110200808
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2011年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月18日
發(fā)明者王石平, 寇艷君 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)