專利名稱：一種體外酶反應(yīng)生成的類胡蘿卜素的快速提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外酶反應(yīng)生成的類胡蘿卜素的快速提取方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
類胡蘿卜素是一類食用天然色素，既是常用的著色劑，又具有多種生物活性。該類化合物為鏈狀或環(huán)狀含有8個(gè)異戊間二烯單位、四萜烯類頭尾連接而成的多異戊間二烯化合物，不溶于水。類胡蘿卜素作為天然色素在色素的種類、資源和色素的化學(xué)性質(zhì)等方面不受制約，并且類胡蘿卜素是非常強(qiáng)的抗氧化劑，能有效的清除氧自由基，具有一定防治疾病的作用。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人們對(duì)食品安全的重視，天然色素開發(fā)成為研究熱點(diǎn)，微生物特別是光合細(xì)菌的類胡蘿卜素代謝途徑得到深入研究，可利用其類胡蘿卜素代謝基因構(gòu)建重組工程菌株，體外生產(chǎn)番茄紅素等類胡蘿卜素。由于類胡蘿卜素不溶于水，體外酶反應(yīng)的產(chǎn)物需要用有機(jī)溶劑萃取，主要用甲醇-石油醚萃取或丙酮-石油醚萃取。由于番茄紅素等非極性類胡蘿卜素難溶于甲醇，甲醇-石油醚萃取方法對(duì)于非極性類胡蘿卜素萃取效果很差；丙酮-石油醚萃取方法則由于丙酮可溶于水和石油醚的特性，易產(chǎn)生乳濁液，影響類胡蘿卜素的提取。另外，上述兩種萃取方法第一步是將甲醇或丙酮與反應(yīng)液混合于陽 60°C保溫15 20分鐘，再加石油醚進(jìn)行萃取，耗時(shí)較長，易造成產(chǎn)物的損失，因而迫切需要對(duì)現(xiàn)有方法進(jìn)行改進(jìn)，提高色素提取的效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有體外酶反應(yīng)生成的類胡蘿卜素產(chǎn)物提取方法耗時(shí)長，提取量低的缺陷，提供一種快速高效的體外酶反應(yīng)生成的類胡蘿卜素的提取方法，即變性蛋白沉淀法， 縮短產(chǎn)物提取的時(shí)間，減少產(chǎn)物損失，大幅提高產(chǎn)物提取量。術(shù)語說明本發(fā)明中所述類胡蘿卜素是指不溶于水的含有8個(gè)異戊間二烯單位頭尾連接而成的色素物質(zhì)，具體為鏈孢紅素及其衍生物和番茄紅素及其衍生物。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)一種體外酶反應(yīng)生成的類胡蘿卜素的快速提取方法，步驟如下(1)將表達(dá)類胡蘿卜素代謝相關(guān)酶的重組大腸桿菌菌體超聲波破壁，制得類胡蘿卜素代謝相關(guān)酶粗酶液；(2)向步驟(1)制得的類胡蘿卜素代謝相關(guān)酶粗酶液中加入相應(yīng)的反應(yīng)物質(zhì)，反應(yīng)體系用緩沖液定容后，超聲波混勻，30°C避光密閉振蕩反應(yīng)1小時(shí)，得混合液；(3)向步驟⑵制得的混合液中加入1/15 1/10體積2mol/L NaOH和1/15 1/10體積10% SDS溶液，混合均勻；再加入混合液1/2體積3mol/L NaAc溶液，振蕩5 10 秒，離心，棄上清液，得蛋白質(zhì)沉淀；(4)向步驟C3)制得的蛋白質(zhì)沉淀中加入丙酮，攪拌1 2分鐘，使沉淀均勻分散，得到含類胡蘿卜素產(chǎn)物的丙酮溶液；(5)將步驟(4)制得的含類胡蘿卜素產(chǎn)物的丙酮溶液經(jīng)離心后，取上清液，濾膜過濾后，經(jīng)檢測(cè)，即得類胡蘿卜素的丙酮溶液。所述步驟(1)中超聲波破壁的條件為22kHz，150W, 30分鐘。所述步驟(1)中類胡蘿卜素代謝相關(guān)酶為八氫番茄紅素脫氫酶、羥基鏈孢紅素合成酶、羥甲基鏈孢紅素合成酶、球形烯加氧酶、番茄紅素環(huán)化酶之一。上述八氫番茄紅素脫氫酶的反應(yīng)物質(zhì)為八氫番茄紅素和其他除氧反應(yīng)物、羥基鏈孢紅素合成酶的反應(yīng)物質(zhì)為鏈孢紅素、羥甲基鏈孢紅素合成酶的反應(yīng)物質(zhì)為羥基鏈孢紅素和其他除氧反應(yīng)物、球形烯加氧酶的反應(yīng)物質(zhì)為球形烯、番茄紅素環(huán)化酶的反應(yīng)物質(zhì)為番茄紅素和其他除氧反應(yīng)物。優(yōu)選的，上述八氫番茄紅素、鏈孢紅素、羥基鏈孢紅素、球形烯或番茄紅素的反應(yīng)濃度為10ymol/Lo優(yōu)選的，上述其他除氧反應(yīng)物為葡萄糖、葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶，葡萄糖的反應(yīng)濃度為2mmol/L，葡萄糖氧化酶的反應(yīng)濃度為20U/mL，過氧化氫酶的反應(yīng)濃度為20000U/ mL ；其中U為國際標(biāo)準(zhǔn)活力單位。所述步驟(2)中超聲波混勻條件為22kHz，50 150W，10 60秒。所述步驟C3)中離心條件為12000rpm離心1分鐘。類胡蘿卜素隨蛋白質(zhì)共沉淀。所述步驟(5)中離心條件為12000rpm離心1分鐘。所述步驟(5)中的檢測(cè)采用HPLC進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)，色譜柱為美國Agilent公司出售的TC-C18，流動(dòng)相甲醇/乙腈(體積比為4/6)，流速ImL/分鐘，柱溫30°C，檢測(cè)波長474nm。所述步驟(5)中的濾膜為22 μ m濾膜。以上操作步驟、實(shí)驗(yàn)條件及試劑如無特別說明，均采用本領(lǐng)域常規(guī)操作和常用試劑。表達(dá)類胡蘿卜素代謝相關(guān)酶的重組大腸桿菌菌體的制備方法，可參見文獻(xiàn) [Zhenjian Xu, Bing Tian, Zongtao Sun, Jun Lin and Yuejin Hua. Identification and Functional analysis of a phytoene desaturase gene from the extremely radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans. Microbiology,2007, 153 1642-1652]。本發(fā)明所述類胡蘿卜素代謝相關(guān)酶(八氫番茄紅素脫氫酶，羥基鏈孢紅素合成酶，羥甲基鏈孢紅素合成酶，球形烯加氧酶，番茄紅素環(huán)化酶)的表達(dá)基因登錄號(hào)為 GenBank No. CP000661。本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明通過對(duì)反應(yīng)體系中的蛋白質(zhì)進(jìn)行變性處理，使類胡蘿卜素與蛋白質(zhì)共沉淀，將類胡蘿卜素從大體積的體外反應(yīng)溶液中濃縮到少量蛋白質(zhì)沉淀中，從而減少了后續(xù)分離純化過程。本發(fā)明通過對(duì)實(shí)驗(yàn)流程的改進(jìn)，大幅縮短了操作時(shí)間，減少了產(chǎn)物損失，提高了產(chǎn)物提取量。


圖 1 是本發(fā)明所述球形紅細(xì)菌(Rhodobacter sphearoides) No. ATCC 17025 重組八氫番茄紅素脫氫酶體外反應(yīng)產(chǎn)物HPLC圖譜；其中，1、番茄紅素；2、鏈孢紅素。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不受這些內(nèi)容所限制。實(shí)施例中所用八氫番茄紅素脫氫酶為球形紅細(xì)菌(Iihodobacter sphearoides) No. ATCC17025的類胡蘿卜素代謝相關(guān)的多種酶基因(GenBank No. CP000661)連接到大腸桿菌表達(dá)載體pET-22b(NOVagen，Germany)上轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)；得到的陽性克隆培養(yǎng)至OD600為0. 5 0. 9，加IPTG使終濃度為0. 5mmol/L，25°C誘導(dǎo)培養(yǎng)30小時(shí)獲得。實(shí)施例中HPLC流動(dòng)相為色譜純，其余化學(xué)試劑均為分析純。實(shí)施例1 球形紅細(xì)菌(Rhodobacter sphearoides) No. ATCC 17025 重組八氫番茄紅素脫氫酶體外反應(yīng)產(chǎn)物提取一種體外酶反應(yīng)生成類胡蘿卜素的快速提取方法，步驟如下(1)取200mL表達(dá)球形紅細(xì)菌重組八氫番茄紅素脫氫酶的大腸桿菌培養(yǎng)液， 12000rpm離心5分鐘，收集菌體細(xì)胞；將收集到的大腸桿菌細(xì)胞重懸于IOmL IOOmmol/L Tris 'HCl (pH7. 9)緩沖液中，美國Sonics公司的超聲波破碎儀破碎30分鐘(22kHz，150W)， 制得八氫番茄紅素脫氫酶粗酶液；(2)取步驟(1)制得的八氫番茄紅素脫氫酶粗酶液400yL于1.5mL離心管中，加入八氫番茄紅素丙酮溶液、葡萄糖、葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶，使終濃度分別為ΙΟμπιοΙ/ L(八氫番茄紅素)、2mmol/L(葡萄糖)、20U/mL(葡萄糖氧化酶)和20000U/mL(過氧化氫酶)，反應(yīng)體系用緩沖液定容至500 μ L ；用美國Sonics公司的超聲波破碎儀混勻30秒 (22kHz, 100W) ；30°C避光密閉振蕩反應(yīng)1小時(shí)，得混合液；(3)向步驟(2)制得的混合液中加入30 μ L 2mol/L NaOH和30 μ L 10% SDS溶液， 混合均勻；加入300 μ L 3mol/L NaAc (ρΗ4· 8)溶液，振蕩5秒；12000rpm離心1分鐘，棄掉
上清，得蛋白質(zhì)沉淀；(4)向步驟(3)制得的蛋白質(zhì)沉淀中加入200 μ L丙酮提取類胡蘿卜素，攪拌2分鐘，使沉淀均勻分散，得到含類胡蘿卜素的丙酮溶液；(5)將步驟(4)制得的含類胡蘿卜素的丙酮溶液經(jīng)12000rpm離心1分鐘，取丙酮溶液，22 μπι濾膜過濾后，用美國Agilent公司的HPLC檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物，色譜柱為 TC-C18 (Agilent, USA)，流動(dòng)相甲醇/乙腈(體積比為4/6)，流速ImL/分鐘，柱溫30°C，檢測(cè)波長474nm，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。上述的所有操作沒有特殊說明要求弱光條件下進(jìn)行。上述球形紅細(xì)菌重組八氫番茄紅素脫氫酶體外反應(yīng)主產(chǎn)物為鏈孢紅素，提取量為 1.086yg(附圖 1)。實(shí)施例2 球形紅細(xì)菌(Rhodobacter sphearoides) No. ATCC 17025 重組羥基鏈孢紅素合成酶體外反應(yīng)產(chǎn)物提取取200mL表達(dá)球形紅細(xì)菌重組羥基鏈孢紅素合成酶的大腸桿菌培養(yǎng)液12000rpm 離心5分鐘，收集菌體細(xì)胞；菌體重懸、破碎同實(shí)施例1，取400 μ L破碎液加入鏈孢紅素丙酮溶液，使鏈孢紅素終濃度為10 μ mol/L，反應(yīng)體系用緩沖液定容至500 μ L。其余操作、步驟同實(shí)施例1。上述球形紅細(xì)菌重組羥基鏈孢紅素合成酶體外反應(yīng)產(chǎn)物為羥基鏈孢紅素，提取量為 1. 748 μ g。實(shí)驗(yàn)例體外酶反應(yīng)體系中番茄紅素提取方法比較取實(shí)施例1中所述細(xì)胞破碎液4mL，加入20 μ g/mL番茄紅素丙酮溶液100 μ L，用緩沖液定容至5mL，混勻后按500 μ L/份分成9份，3份為1組，共3組；分別采用甲醇-石油醚萃取、丙酮-石油醚萃取和實(shí)施例1所述變性蛋白沉淀提取方法進(jìn)行產(chǎn)物提取。(1)甲醇-石油醚500 μ L混合液中加2. 5mL甲醇55°C溫浴15分鐘，加入300 μ L 石油醚(沸程30°C 60°C)振蕩5分鐘萃取番茄紅素，離心收集上層石油醚層。(2)丙酮-石油醚500 μ L混合液中加2. 5mL丙酮55°C溫浴15分鐘，加入300 μ L 石油醚(沸程30°C 60°C)振蕩5分鐘萃取番茄紅素，離心收集上層石油醚層。(3)本發(fā)明方法(變性蛋白共沉淀-丙酮提取)500 μ L混合液中加30 μ L 2mol/ L NaOH禾口 30 μ L 10% SDS溶液，混合均勻后加入300 μ L 3mol/L NaAc (ρΗ4· 8)溶液，充分振蕩；12000rpm離心1分鐘，棄掉上清；在沉淀中加200 μ L丙酮攪勻沉淀提取番茄紅素。產(chǎn)物用紫外-可見分光光度計(jì)(Thermo，USA)檢測(cè)474nm吸收值。根據(jù)番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算500 μ L反應(yīng)液中提取到的番茄紅素總量(ng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，變性蛋白沉淀提取法耗時(shí)僅為另外兩種方法的1/5，番茄紅素提取量約為甲醇-石油醚法的3倍、丙酮-石油醚法的2倍；番茄紅素提取率由甲醇-石油醚的27. 6%和丙酮-石油醚的39. 9%提高到76. 8%，大幅提高了提取效率。表 1
甲醇-石油醚法丙酮-石油醚法變性蛋白沉淀法番茄紅素提取量(ng) 番茄紅素提取率提取耗時(shí)(分鐘)55. 2 士 2. 46 27. 6% 2579. 8 士 13. 53 153. 6 士 12. 3 39. 9% 76. 8% 25 權(quán)利要求
1.一種體外酶反應(yīng)生成的類胡蘿卜素的快速提取方法，步驟如下(1)將表達(dá)類胡蘿卜素代謝相關(guān)酶的重組大腸桿菌菌體超聲波破壁，制得類胡蘿卜素代謝相關(guān)酶粗酶液；(2)向步驟(1)制得的類胡蘿卜素代謝相關(guān)酶粗酶液中加入相應(yīng)的反應(yīng)物質(zhì)，反應(yīng)體系用緩沖液定容后，超聲波混勻，30°C避光密閉振蕩反應(yīng)1小時(shí)，得混合液；(3)向步驟O)制得的混合液中加入1/15 1/10體積2mol/LNaOH和1/15 1/10 體積10% SDS溶液，混合均勻；再加入混合液1/2體積3mol/L NaAc溶液，振蕩5 10秒， 離心，棄上清液，得蛋白質(zhì)沉淀；(4)向步驟C3)制得的蛋白質(zhì)沉淀中加入丙酮，攪拌1 2分鐘，使沉淀均勻分散，得到含類胡蘿卜素產(chǎn)物的丙酮溶液；(5)將步驟(4)制得的含類胡蘿卜素產(chǎn)物的丙酮溶液經(jīng)離心后，取上清液，濾膜過濾后，經(jīng)檢測(cè)，即得類胡蘿卜素的丙酮溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(1)中超聲波破壁的條件為 22kHz, 150ff,30 分鐘。
3.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(1)中類胡蘿卜素代謝相關(guān)酶為八氫番茄紅素脫氫酶、羥基鏈孢紅素合成酶、羥甲基鏈孢紅素合成酶、球形烯加氧酶、番茄紅素環(huán)化酶之一。
4.如權(quán)利要求3所述的提取方法，其特征在于，八氫番茄紅素脫氫酶的反應(yīng)物質(zhì)為八氫番茄紅素和其他除氧反應(yīng)物、羥基鏈孢紅素合成酶的反應(yīng)物質(zhì)為鏈孢紅素、羥甲基鏈孢紅素合成酶的反應(yīng)物質(zhì)為羥基鏈孢紅素和其他除氧反應(yīng)物、球形烯加氧酶的反應(yīng)物質(zhì)為球形烯、番茄紅素環(huán)化酶的反應(yīng)物質(zhì)為番茄紅素和其他除氧反應(yīng)物。優(yōu)選的，上述八氫番茄紅素、鏈孢紅素、羥基鏈孢紅素、球形烯或番茄紅素的反應(yīng)濃度為 10 μ mol/L0
5.如權(quán)利要求4所述的提取方法，其特征在于，上述其他除氧反應(yīng)物為葡萄糖、葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶，葡萄糖的反應(yīng)濃度為2mmol/L，葡萄糖氧化酶的反應(yīng)濃度為20U/mL， 過氧化氫酶的反應(yīng)濃度為20000U/mL。
6.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟O)中超聲波混勻條件為 22kHz, 50 150W, 10 60 秒。
7.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(3)中離心條件為12000rpm 離心1分鐘。類胡蘿卜素隨蛋白質(zhì)共沉淀。
8.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(5)中離心條件為12000rpm 離心1分鐘。
9.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(5)中的檢測(cè)采用HPLC進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)，色譜柱為美國Agilent公司出售的TC-C18，流動(dòng)相甲醇/乙腈(體積比為4/6)， 流速ImL/分鐘，柱溫30°C，檢測(cè)波長474nm。
10.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(5)中的濾膜為22μπι濾膜。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種體外酶反應(yīng)生成的類胡蘿卜素的快速提取方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。該方法步驟如下將表達(dá)類胡蘿卜素代謝相關(guān)酶的重組大腸桿菌菌體超聲波破壁，然后加入相應(yīng)的反應(yīng)物質(zhì)，超聲波混勻，避光密閉振蕩反應(yīng)；再向混合液中加入10％SDS溶液，加入NaAc溶液，振蕩離心，棄上清液，得蛋白質(zhì)沉淀；向蛋白質(zhì)沉淀中加入丙酮，攪拌，使沉淀均勻分散，然后經(jīng)離心后，取上清液，濾膜過濾后，經(jīng)檢測(cè)，即得類胡蘿卜素的丙酮溶液。本發(fā)明通過使類胡蘿卜素與蛋白質(zhì)共沉淀，將類胡蘿卜素從大體積的體外反應(yīng)溶液中濃縮到少量蛋白質(zhì)沉淀中，從而減少了后續(xù)分離純化過程。
文檔編號(hào)C12P5/02GK102250958SQ201110190960
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月8日
發(fā)明者盧麗麗, 張金華, 肖敏 申請(qǐng)人:山東大學(xué)