專利名稱：利用固體培養(yǎng)基富集微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及利用固體培養(yǎng)基富集不同底物利用的微生物的方法，以及利用上述方法的海藻酸鈉分解菌，纖維素分解菌及酵母菌的富集分離的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微生物的篩選是指在多種微生物中按預(yù)定目標(biāo)就某種具有特定性質(zhì)的菌種進(jìn)行精選的操作過程。其操作步驟一般分為，初篩，復(fù)篩，分離，純化幾步。初篩的目的是刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)形狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良菌株不致于漏網(wǎng)。但是，初篩過程中可能會(huì)由于目的菌株的數(shù)量少而失敗，所以在初篩前一般先進(jìn)行富集，尋找一種快速，高效的富集方法將有利于下一步的篩選。采用固體培養(yǎng)基富集，不僅會(huì)使微生物快速的在固體培養(yǎng)基表面富集，而且還可以在同一富集環(huán)境中富集不同類型的微生物?，F(xiàn)有技術(shù)中未見有此方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用固體培養(yǎng)基富集不同微生物的方法，涉及固體培養(yǎng)基塊的制作，富集方法以及利用上述方法的富集分離的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案利用固體培養(yǎng)基富集微生物的方法，包括下述步驟(1)配制不同底物培養(yǎng)基，加入凝固劑1. 5-2% phytagel或任何不會(huì)為底物利用的凝固劑，滅菌，倒平板后，用打孔器打出不同形狀的固體塊；(2)把固體塊加入到滅菌水中，接入10%的菌液；(3) 42 0C，150rpm,搖床培養(yǎng)；或 55°C，靜止培養(yǎng)；(4)培養(yǎng)l-2d，把固體塊取出，依次對(duì)應(yīng)放入不同底物的平板上培養(yǎng)l-2d，或放入
液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。


圖1和圖2為羧甲基纖維素鈉分解菌的一組平行實(shí)驗(yàn)，從兩組圖中可以看出在富集塊周圍以及表面生長出菌落(菌I羧甲基纖維素鈉分解菌)且無其它雜菌生長；圖3和圖4為一組平行實(shí)驗(yàn)，在YPD培養(yǎng)基上只有酵母菌生長(菌II酵母菌)，且生長比較密集，幾乎看不出單菌落。圖5為海藻酸鈉分解菌的實(shí)驗(yàn)，平板上只有海藻酸鈉利用菌的生長(菌III海藻酸鈉分解菌)，由圖5可以看出，海藻酸鈉分解菌不只在富集塊表面有生長且在富集塊周圍生長也比較好。圖6為未接入富集培養(yǎng)塊前的0. 5% AVicel培養(yǎng)基；圖7和圖8為一組平行試驗(yàn)，在接入結(jié)晶纖維素AVicel富集塊培養(yǎng)基24h后，從圖中可以看出24h后，液體中AVicel已經(jīng)變黃，且富集培養(yǎng)基塊也已經(jīng)變黃，說明AVicel 已經(jīng)被利用，AVicel富集塊培養(yǎng)基富集成功；圖9為富集篩選后得到的纖維素分解菌M116srDNA序列。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖，用以下所舉實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明的內(nèi)容及其效果，但不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例1:不同培養(yǎng)基，不同底物固體塊富集三種不同微生物菌種的實(shí)驗(yàn)所用菌種描述如下菌I 海藻酸鈉分解菌，可以在海藻酸鈉為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，且不利用 CMC或AVicel以及蔗糖，此菌株屬于Cellvibio屬；菌II 纖維素分解菌，可以在CMC或AVicel上生長，不能利用海藻酸鈉和蔗糖；此菌株屬于Geobacillus屬；菌III 酵母菌，可以利用葡萄糖，蔗糖等多種糖類，但是由于菌I和菌II也能利用葡萄糖，因此實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇蔗糖為底物。此菌株與Oqataea polymorpha strainATCC66057 的相似度為99%。培養(yǎng)基配方如下海藻酸鈉培養(yǎng)基=K2HPO41. Og ；NaH2PO4 4. Og ；Mg SO4 ·6Η20 ；NH4Cl 1. Og，海藻酸鈉；PH 7. O纖維素培養(yǎng)基KH2PO40. 75g ；K2HPO4. 3H20 :1. 50g ；CaCl2 :0. 15g ；MgCl2. 6H20 0. 4g ；NH4Cl :0. 9g ；NaCl :0. 9g ；FeSO4 · 7H20 :3mg，；0. 5% CMC 或 0· 5% AVicel ；0. 10%刃天青；Wolf，s solution :lmL ；定容至 IL ；pH 7. 0酵母菌YPD 培養(yǎng)基:yeast extract 1% ；peptone 2% ；蔗糖2%。分別配制海藻酸鈉分解菌培養(yǎng)基，纖維素分解菌培養(yǎng)基以及酵母菌YPD培養(yǎng)基， 加入2% phytagel，滅菌，倒平板后，用打孔器打出不同形狀的固體塊；把固體塊加入到滅菌水中，分別對(duì)應(yīng)接入10%的菌液(菌I 海藻酸鈉分解菌；菌II 纖維素分解菌；菌III 酵母菌)，421，15011)111，搖床培養(yǎng)，或551，靜止培養(yǎng)；培養(yǎng)l_2d，把固體塊取出，依次對(duì)應(yīng)放入上述不同培養(yǎng)基底物的平板上培養(yǎng)l-2d，觀察菌種生長情況。菌的生長情況如圖所示，圖(1) (2)為羧甲基纖維素鈉分解菌的一組平行實(shí)驗(yàn)，從兩組圖中可以看出在富集塊周圍以及表面生長出菌落(菌I羧甲基纖維素鈉分解菌)且無其它雜菌生長；圖C3) (4)為一組平行實(shí)驗(yàn)，在YPD培養(yǎng)基上只有酵母菌生長(菌III酵母菌)，且生長比較密集，幾乎看不出單菌落。圖( 為海藻酸鈉分解菌的實(shí)驗(yàn)，平板上只有海藻酸鈉利用菌的生長(菌II海藻酸鈉分解菌)，由圖5可以看出，海藻酸鈉分解菌不只在富集塊表面有生長且在富集塊周圍生長也比較好。結(jié)果顯示在纖維素分解菌的培養(yǎng)基上(圖1和圖幻只有纖維素分解菌生長(菌 I)；在海藻酸鈉平板上只有海藻酸鈉利用菌的生長(菌II)(圖幻；在YPD培養(yǎng)基上只有酵母菌的生長(菌III)，(圖3和圖4)。由此實(shí)驗(yàn)可以看出，利用不同的培養(yǎng)基，根據(jù)不同底物利用的特異性可以富集，并在一定程度上分離不同菌種。實(shí)施例2:在堆肥樣品中富集纖維素分解菌實(shí)施方案與例1相似，區(qū)別在于所用培養(yǎng)基固體塊的底物為0. 5% Avicel (圖 (6))，富集后把固體培養(yǎng)基塊接入液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)一天后，液體中Avicel逐漸變黃，說明Avicel已被利用，培養(yǎng)兩天后，Avicel富集塊也開始變黃，說明在富集塊表面Avicel分解菌也有生長(圖7和圖8)。分離測(cè)序(測(cè)序結(jié)果見圖9)后篩選的菌株經(jīng)過blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)此菌株與Geobacillus sp. Y4. IMCl的相似度達(dá)到99%，M1為55°C下篩選出的一株纖維素分解菌，可以利用葡萄糖，CMC等多種底物。此實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了固體培養(yǎng)基塊富集目的菌種的可行性。接入富集塊后菌的生長情況如圖6、7、8。接入富集塊前后培養(yǎng)基對(duì)比圖(6)為未接入富集培養(yǎng)塊前的0. 5% AVicel培養(yǎng)基，圖(7) (8)為一組平行試驗(yàn)，在接入結(jié)晶纖維素AVicel富集塊培養(yǎng)基24h后，從圖中可以看出24h后，液體中AVicel已經(jīng)變黃，且富集培養(yǎng)基塊也已經(jīng)變黃，說明AVicel已經(jīng)被利用，AVicel富集塊培養(yǎng)基富集成功。富集篩選后得到的纖維素分解菌Ml 16srDNA序列GGTTACCTTGTTACGACTTCACCCCAATCACTTGCCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCCTTGCGGGTTAC CTCACCGACTTCGGGTGTTGCAAGCTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCG GCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAGCGGC TTTTTGGGATTCGCTCCCCCTCGCGGGTTCGCAGCCCTTTGTACCGCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCAT AAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGACTTTTAGCCGGCAGTCCCCCTAGAGTGCCCAACTGA ATGCTGGCAACTAGTGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAA CCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAA CCATGCACCACCTGTCACCCTGTCCTCCCGCAAGGGAGGAACGCCCTGTCTCCAGGGTTGTCAGGGGATGTCAAGAC CTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGA GTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAACGCGTTAGCTACAGCACTAAAGGGAATAACCCCTCT AACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTC AGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGT GGAATTCCGCTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTCCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTAAGCCGTGGGCTTTCAC ATCAGACTTAAGGGACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTCGCCCCCTATGTATTACCGC GGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGGGCTTTCTCGTTAGGTACCGTCACCGCGCCGCCCTGTTCGAACGGCACTTCTT CTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAGACCTTCTTCGCTCACGCGGCGTCGCTCCGTCAGACTTTCGTCCAT TGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCACCCTCTC AGGCCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGCCCATCCGTAAGT GGCAGCCGGAGCCGCCTTTCAACCGAAGACCATGCGGTCTTCGGTGTTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGT TATCCCGGTCTTACGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACCAAGCGGAAGCAAGCTCCCGCC CGGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCAGGATCAAACTCT 。
權(quán)利要求
1.利用固體培養(yǎng)基富集微生物的方法，其特征在于包括下述步驟(1)配制不同底物培養(yǎng)基，加入凝固劑1.5-2% Phytagel或任何不會(huì)為底物利用的凝固劑，滅菌，倒平板后，用打孔器打出不同形狀的固體塊；(2)把固體塊加入到滅菌水中，接入10%的菌液；(3)42 0C，150rpm,搖床培養(yǎng)；或55°C，靜止培養(yǎng)；(4)培養(yǎng)l-2d，把固體塊取出，依次對(duì)應(yīng)放入不同底物的平板上培養(yǎng)l-2d，或放入液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)ο
全文摘要
本發(fā)明公開一種固體培養(yǎng)基富集利用不同底物的微生物的方法，配制不同底物培養(yǎng)基，加入凝固劑，凝固劑采用1.5-2％phytagel或任何不會(huì)為底物利用的凝固劑，進(jìn)一步分離，純化得到目的菌株。在不同的培養(yǎng)基上，利用不同的底物在同一液體環(huán)境中富集不同的微生物，為微生物的篩選提供了一種快速，高效的富集方法。
文檔編號(hào)C12N1/16GK102286380SQ20111019093
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月8日
發(fā)明者嚴(yán)金平, 伊日布斯, 孫煥民 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)