專利名稱：一種基于p32基因山羊痘dna疫苗及制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基于P32基因山羊痘DNA疫苗及制備方法。
背景技術：
山羊痘是由羊痘病毒屬山羊痘病毒引起山羊和綿羊的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，具有較高的發(fā)病率和死亡率，為國際獸疫局(ΟΙΕ) A類動物疫病和我國一類動物疫病。山羊痘在我國普遍流行，幾乎遍布了所有養(yǎng)羊地區(qū)，給養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展造成了極大的損失，特別是對西部地區(qū)蓬勃興起的山羊養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴峻的威脅。目前，我國對山羊痘的控制主要采取疫苗接種為主，但不論是滅活疫苗還是弱毒疫苗，都存在一定的不足，如滅活疫苗免疫效果不佳，需用劑量較大，只能提供短暫保護；弱毒疫苗免疫效果好于滅活疫苗，但接種后會刺激痘疹反應，嚴重時還導致繼發(fā)感染，且有毒力返強的風險。而DNA疫苗又稱裸疫苗，是繼滅活疫苗、減毒活疫苗和基因工程重組蛋白疫苗之后的第三代疫苗，目前已用于HIV、流感病毒、惡性瘧原蟲等多種病原體感染性疾病的防控，并取得了積極的進展。據(jù)研究資料顯示，山羊痘病毒P32基因所編碼的P32蛋白是目前世界各地所有分離鑒定的山羊痘病毒共有且特異性強的結(jié)構(gòu)蛋白，具有較強的抗原性，能誘導山羊細胞免疫和體液免疫應答反應，產(chǎn)生特異性中和抗體和各種細胞因子，在山羊痘的預防與控制上發(fā)揮重要作用。關于基于P32基因的山羊痘DNA疫苗未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題在于，提供一種基于P32山羊痘DNA疫苗及制備方法，該疫苗能誘導山羊產(chǎn)生良好的體液免疫和細胞免疫應答，且不引起山羊產(chǎn)生不良反應，具有良好的生物安全性。本發(fā)明的技術方案含山羊痘病毒P32基因的真核表達質(zhì)粒pVAXl-P32，質(zhì)粒濃度為 3mg lOmg/mL。其制備方法包括以下步驟
第一，采用PCR方法從pMD-18T-P32質(zhì)粒中擴增出P32基因，用Hiz7i/III+ Ba H I進行酶切，同法處理真核表達載體PVAX1，然后電泳分離和分別回收目的基因；
第二，采用T4 DNA連接酶將P32基因插入真核表達質(zhì)粒pVAXl中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia， 藍白斑篩選，挑取可疑菌落于LB液體培養(yǎng)基于36°C 38°C培養(yǎng)12 18h，收集菌液采用DNA 提取試劑盒提取質(zhì)粒，用PCR和雙酶切鑒定；
第三，取含鑒定為陽性重組質(zhì)粒的重組大腸桿菌DH5a，于LB液體培養(yǎng)基36°C 38°C培養(yǎng)12 1 后，采用質(zhì)粒提取試劑盒提取得到PVAX1-P32，即為基于P32基因山羊痘DNA疫
田ο本發(fā)明有益效果本發(fā)明適用于山羊痘的免疫接種，防制山羊痘的發(fā)生與流行，同
3時具有良好的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下的技術優(yōu)勢和積極效果
(1)免疫效果良好本發(fā)明所采用真核表達載體PVAXl構(gòu)建的山羊痘DNA疫苗，肌肉注射動物后能誘導山羊產(chǎn)生良好的體液免疫和細胞免疫應答；
(2)制備成本較低本發(fā)明的DNA疫苗在需要時，只需將含重組質(zhì)粒pVAXl-P32的大腸桿菌DH5 α進行大量培養(yǎng)后，提取重組質(zhì)粒pVAXl-P32即可；
(3)免疫接種方便本發(fā)明的DNA疫苗采用肌肉注射進行接種，操作方便，不像山羊痘弱毒疫苗要求皮內(nèi)或皮下注射；
(4)安全無副作用本發(fā)明的DNA疫苗不會引起毒力增強或?qū)е禄蛘?，也不會引起山羊發(fā)生水腫、化膿或全身性發(fā)痘等癥狀。


圖1為本發(fā)明的山羊痘DNA疫苗的制備流程圖。
具體實施例方式
具體實施例方式本發(fā)明的山羊痘DNA疫苗的主要原料是由含山羊痘病毒Ρ32基因的克隆質(zhì)粒PMD-18T-P32、真核表達載體pVAXl和大腸桿菌Dffia構(gòu)成。如圖1所示意，本發(fā)明的山羊痘DNA疫苗的制備方法，包括以下步驟
第一，山羊痘病毒P32基因的獲取采用含Η /ΙΙΙ和Ba H I酶切位點的山羊痘病毒 P32基因特異性引物，從克隆質(zhì)粒PMD-18T-P32中擴增出山羊痘病毒P32基因，瓊脂糖回收試劑盒回收純化；
第二，重組真核表達載體PVAX1-P32的構(gòu)建采用T4 DNA連接酶將步驟一獲取的山羊痘病毒P32基因，與同樣酶切處理的真核表達質(zhì)載體pVAXl進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia 感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選，挑取可疑菌落于LB液體培養(yǎng)基于37°C培養(yǎng)12h，收集菌液采用 DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒進行PCR和雙酶切鑒定；
第三，重組真核表達載體PVAX1-P32的大量提取取含陽性重組真核表達載體 PVAX1-P32的大腸桿菌DH5a，于LB液體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)1 后，離心收集菌液采用質(zhì)粒提取試劑盒，提取重組真核表達載體PVAX1-P32，調(diào)整其濃度為4. 85mg/mL,即為基于P32基因山羊痘DNA疫苗。
權利要求
1.一種基于P32基因山羊痘DNA疫苗，其特征在于含山羊痘病毒P32基因的真核表達質(zhì)粒pVAXl-P32，質(zhì)粒濃度為;3mg 10mg/mL。
2.一種如權利要求1所述的一種基于P32基因山羊痘DNA疫苗的制備方法，其特征在于它包括以下步驟第一，采用PCR方法從pMD-18T-P32質(zhì)粒中擴增出P32基因，用Η /ΙΙΙ+ Ba H I進行酶切，同法處理真核表達載體PVAX1，然后電泳分離和分別回收目的基因；第二，采用T4 DNA連接酶將P32基因插入真核表達質(zhì)粒pVAXl中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia， 藍白斑篩選，挑取可疑菌落于LB液體培養(yǎng)基于36°C 38°C培養(yǎng)12 18h，收集菌液采用DNA 提取試劑盒提取質(zhì)粒，用PCR和雙酶切鑒定；第三，取含鑒定為陽性重組質(zhì)粒的重組大腸桿菌DH5a，于LB液體培養(yǎng)基36°C 38°C培養(yǎng)12 1 后，采用質(zhì)粒提取試劑盒提取得到PVAX1-P32，即為基于P32基因山羊痘DNA疫田ο
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于P32基因山羊痘DNA疫苗及制備方法，含山羊痘病毒P32基因的真核表達質(zhì)粒pVAX1-P32，質(zhì)粒濃度為3mg~10mg/mL。本發(fā)明山羊痘口服疫苗安全有效，可誘導山羊產(chǎn)生機體產(chǎn)生特異性的體液免疫、細胞免疫和粘膜免疫應答，能有效預防山羊痘的發(fā)生與流行。
文檔編號C12N15/79GK102266556SQ201110189090
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月7日 優(yōu)先權日2011年7月7日
發(fā)明者周碧君, 文明, 朱時杰, 殷俊磊, 王開功, 程振濤 申請人:貴州大學