專利名稱：一種胃癌細(xì)胞的核酸適配體序列及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬細(xì)胞生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種胃癌細(xì)胞的核酸適配體序列及用途。
背景技術(shù)：
胃癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì)，胃癌在我國(guó)的患病率位居各類腫瘤的第二位；在所有胃的惡性腫瘤中，腺癌占到95%。臨床上大多數(shù)胃癌病人確診時(shí)往往已經(jīng)處于晚期，其5年生存率不超過(guò)10%，因此早期診斷是提高胃癌生存率的關(guān)鍵，而尋找早期診斷的腫瘤標(biāo)志物對(duì)于胃癌的診斷和治療則具有十分重要的意義。目前，已知核酸適配體(aptamer)是經(jīng)體外篩選技術(shù)篩選出的能特異結(jié)合金屬離子、多肽、蛋白質(zhì)乃至整個(gè)細(xì)胞的寡聚核苷酸(DNA或RNA)片段；其特異性如同抗體一樣，對(duì) 可結(jié)合的配體有嚴(yán)格的識(shí)別能力和高度的親和力。核酸適配體的體外篩選技術(shù)被稱為指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技術(shù)；所述的SELEX技術(shù)模擬自然進(jìn)化過(guò)程，對(duì)隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)施加選擇壓力(結(jié)合靶目標(biāo))，淘選與靶目標(biāo)高度特異結(jié)合片段(如圖I所示)；相比抗體等多肽類的適配體(peptide aptamer),核酸適配體的優(yōu)勢(shì)相當(dāng)明顯,如制備簡(jiǎn)單快捷、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、至今未見(jiàn)報(bào)道存在免疫原性或毒性、靶分子范圍廣、親和力高、特異性強(qiáng)、易于進(jìn)行改造修飾。核酸適配體的諸多優(yōu)勢(shì)令其在基礎(chǔ)研究、臨床檢測(cè)、新藥開(kāi)發(fā)等方面有著廣泛的用途。在臨床檢測(cè)方面，目前能用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)幾乎都可用核酸適配體
替代，如Archemix公司開(kāi)發(fā)的一種適配體分子傳感器-RiboReporter 即可將檢測(cè)到
的蛋白信號(hào)直接轉(zhuǎn)化成光信號(hào)記錄并分析，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)生物混合液(如血清、細(xì)胞提取物)中的大分子蛋白的直接快速檢測(cè)。在新藥開(kāi)發(fā)方面，最典型的例子便是第一個(gè)通過(guò)美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的核酸適配體藥物Macugen，其為抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的核酸適配體，被用于治療濕性老年性黃斑變性(wet AMD)。另一個(gè)核酸適配體藥物的例子是由Aptamera公司研制的AGRO100，臨床前試驗(yàn)表明，AGR0100對(duì)多種癌細(xì)胞均有抑制作用。目前，國(guó)際上大部分從事核酸適配體研究的科學(xué)家和生物技術(shù)公司主要針對(duì)心血管疾病，而較少關(guān)注中國(guó)人的常見(jiàn)疾病，如肝炎、肝癌、胃癌等，因此本發(fā)明優(yōu)先考慮核酸適配體如何應(yīng)用于上述嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康的重大疾病，開(kāi)發(fā)針對(duì)胃癌細(xì)胞的核酸適配體作為特征性標(biāo)志物，為胃癌的分子診斷和靶向治療提供有力支持，具有重要的臨床價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種胃癌細(xì)胞的核酸適配體序列，具體涉及一種胃癌細(xì)胞株HGC27的核酸適配體中具有特異結(jié)合HGC27的特征序列。本發(fā)明中，所述的胃癌細(xì)胞株HGC27的核酸適配體(序列I)中含有特異結(jié)合HGC27的特征序列，所述的特征序列為GGTTT。本發(fā)明中，所述的胃癌細(xì)胞選自胃癌細(xì)胞株HGC27。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供所述核酸適配體序列的用途。本發(fā)明中根據(jù)對(duì)該序列分析，可進(jìn)一步設(shè)計(jì)抗胃癌的藥物或制品，并制備抗胃癌的藥物或其他制品。本發(fā)明采用核酸適配體的體外篩選(SELEX)技術(shù)，以胃癌細(xì)胞株HGC27為正篩靶標(biāo)，以胃粘膜上皮細(xì)胞株GES-I為反篩靶標(biāo)，篩選與HGC27特異結(jié)合的核酸適配體，制得具有特異結(jié)合HGC27的特征序列GGTTT，本發(fā) 明中命名為華山適配體2號(hào)，簡(jiǎn)稱HSST02。本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)采用已知的核酸適配體的體外篩選技術(shù)即SELEX技術(shù)，以胃癌細(xì)胞株HGC27(購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù))為正篩靶標(biāo)，以胃粘膜上皮細(xì)胞株GES-I (購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù))為反篩靶標(biāo)，從體外合成的隨機(jī)寡聚 DNA 文庫(kù)(5’_acgctcggatgccactacagNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNctcatggacgtgctggtgac-3’)中篩選出與HGC27特異結(jié)合的核酸適配體；將篩選出的序列用引物 Aptamer_L(5’ -FAM-acgctcggatgccactacag-3’ )和 Aptamer_R(5’ -biotin-gtcaccagcacgtccatgag-3’)進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行TA克隆入pMD19_T載體(購(gòu)自上海博光生物公司)，轉(zhuǎn)化DH5a細(xì)菌(購(gòu)自北京天根生物公司);挑去白色菌落以引物RV-M(5’-GAGCGGATAACAATITCACACAGG-3’ )和 M13(_47) (5，-CGCCAGGGITITCCCAGTCACGAC-3 ’ )進(jìn)行 PCR確定陽(yáng)性克隆后，抽提質(zhì)粒并用M13(-47) (5’ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’ )為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，上測(cè)序儀測(cè)序；根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析特征序列。本發(fā)明中，所述的序列選自天然存在或人工合成的序列，或任何其他來(lái)源的同樣的序列；所述的核酸適配體的序列含有與所述特征序列的核苷酸的全部相同的序列，即所有核酸適配體均含有所述的特征序列。本發(fā)明以胃癌細(xì)胞株HGC27為正篩靶標(biāo)，以胃粘膜上皮細(xì)胞株GES-I為反篩靶標(biāo)，經(jīng)體外篩選技術(shù)，獲得具有特異結(jié)合HGC27的核酸適配體的特征序列GGTTT，以該特征序列為核酸適配體與HGC27特異性結(jié)合的基礎(chǔ)，進(jìn)一步用于抗胃癌的藥物設(shè)計(jì)、制備藥物或其他制品；所述的含該特征序列的核酸適配體，可作為抗胃癌的分子探針或藥物靶點(diǎn)。


圖I為核酸適配體的體外篩選技術(shù)即SELEX技術(shù)的一般流程圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :核酸適配體篩選(一輪)首輪寡聚DNA 文庫(kù)序列5’ -acgctcggatgccactacagNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNc t cat ggac gt gc t ggt gac-3，富集所用引物Aptamer_L :5，-FAM-acgctcggatgccactacag-3 Aptamer_R :5，-biotin-gtcaccagcacgtccatgag-3，將寡聚DNA文庫(kù)測(cè)定0D260后，離心干燥；用300ul結(jié)合緩沖液(PBS中含4. 5g/L 葡萄糖，5mM MgCl2, 2mg/mL BSA,0. 2mg/mL 酵母 tRNA)溶解文庫(kù)，取 250pmol (第一輪IOnmol),95°C 5min,迅速置冰上，稍后快速離心。反篩將250pmol的文庫(kù)吸入GES-1生長(zhǎng)覆蓋度達(dá)到70 80%的直徑6cm培養(yǎng)皿中，用結(jié)合緩沖液補(bǔ)足到ImL ;4°C搖床振蕩Ih ;取上清液。正篩將反篩上清液加入HGC27生長(zhǎng)覆蓋度達(dá)到70 80%的直徑6cm培養(yǎng)皿中中，4°C搖床振蕩Ih ;棄上清液；用洗滌緩沖液(PBS中含4. 5g/L葡萄糖，5mM MgC12)洗滌HGC27細(xì)胞三遍；用細(xì)胞刮刮下HGC27細(xì)胞，用ImL洗滌緩沖液將HGC27細(xì)胞轉(zhuǎn)移到EP管中，95°C 5min，迅速置冰上。待變冷后，IOOOOrpm離心5min ;上清轉(zhuǎn)移到一干凈的EP管中。富集配置PCR 體系(總體積 IOOOul) =H2O 740ul, 10XPCR 緩沖液 IOOul, dNTP80ul，引物混合物 25ul(H20 100uMAptamer_L 100uMAptamer_R = 4 0. 5 0. 5), DNA模板(正篩上清)50ul, Taq HS酶5ul。按如下條件在PCR儀上擴(kuò)增94°C加熱預(yù)變性2min后，94°C變性30s，58°C退火20s，72。。延伸 20s, 20 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 4min，4°C保溫< Ih0純化純化柱用MilliQ水洗一遍，PBS洗兩遍,加入150ul GE的StreptavidinSepharose后PBS洗兩遍,加入PCR產(chǎn)物,搖床振蕩20min,放出液體,PBS洗兩遍后,加0. 5mL·NaOH靜置2-3min后放出液體，放出液上脫鹽柱，待液體從脫鹽柱幾乎流盡時(shí)加ImL MilliQ水洗脫，同時(shí)開(kāi)始接洗脫液lmL，該洗脫液即為富集了的寡聚DNA文庫(kù)，可進(jìn)行下一輪篩選。實(shí)施例2 :核酸適配體TA克隆在微量離心管中配制下列溶液，全量為5ul :pMD19_T Vector lul，適配體PCR產(chǎn)物 lul, dH20 3ul ;加入 5ul 的 Solution I ;16°C反應(yīng) 30 分鐘。全量(IOul)加入至 IOOulDH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘；42°C加熱45秒鐘后，再在冰中放置I分鐘；加入890ulLB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)60分鐘；在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。實(shí)施例3 :核酸適配體克隆的菌落PCR與測(cè)序pMD19-T菌落PCR和測(cè)序引物RV-M 5' -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'M13(-47) :5' -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'用滅菌牙簽挑取白色單克隆菌落加入到4ml LB(Amp 50ng/L)液體培養(yǎng)基內(nèi)，180rpm，37°C搖菌過(guò)夜(< 16h);取Iul菌液作PCR模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以水作為陰性對(duì)照。配置PCR 體系菌液 Iul，引物 RV-M(IOuM)O. 5ul，引物 M13 (-47) 0. 5ul，2XTaqMix7. 5ul，水5. 5ul(總體系15ul);按如下條件，在PCR儀上擴(kuò)增95°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，55。。退火30s，72。。延伸45s，共33個(gè)循環(huán)；72°C總延伸IOmin0反應(yīng)結(jié)束后取3_6ul菌液PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，140V電泳20min ;若出現(xiàn)明亮的目的大小條帶而陰性對(duì)照沒(méi)有條帶，表明該菌液為陽(yáng)性克隆。隨后行質(zhì)粒提取取4ml過(guò)夜培養(yǎng)的新鮮菌液，收集菌體，按照Omega的質(zhì)粒提取試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行質(zhì)粒提取；最后加水溶解；采用Nanodrop對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行濃度和純度測(cè)定。測(cè)序反應(yīng)BDTv3. I 0. 5ul，質(zhì)粒 lOOng，引物M13 (-47) 0. 5ul，加水至 5ul。96°C加熱預(yù)變性Imin后，96°C變性10s，50°C退火10s，60°C延伸4min，33個(gè)循環(huán)，4°C保溫。反應(yīng)結(jié)束后將5ul測(cè)序產(chǎn)物+1. 25ul EDTA (125mM，pH 8. 0) +15ul無(wú)水乙醇封好，震蕩4次，室溫放置15min,立即3860rpm,室溫(25°C )離心40min后立即倒扣在紙巾上，離心到900rpm,立刻停；加60ul 70%乙醇，(不需震蕩)封好；隨后室溫下3860rpm,離心15min。立即倒扣在紙巾上，離心到900rpm，立刻停。避光室溫干燥15min，加IOul Hi_Di，封好蓋；95°C變性4min，立刻冰上靜置4min，短暫離心，上3730x1測(cè)序儀。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)18個(gè)克隆中都存 在同一個(gè)特征序列GGTTT。因此，獲得了具有特異結(jié)合HBV核心抗原的特征序列，該段特征序列為GGTTT。
權(quán)利要求
1.一種胃癌細(xì)胞的核酸適配體序列，其特征在于，具有序列I的結(jié)構(gòu)，其含有特異結(jié)合胃癌細(xì)胞株HGC27HGC27的特征序列GGTTT。
2.按權(quán)利要求I所述的胃癌細(xì)胞的核酸適配體序列，其特征在于，通過(guò)下述方法制得采用核酸適配體的體外SELEX篩選技術(shù)，以胃癌細(xì)胞株HGC27為正篩靶標(biāo)，以胃粘膜上皮細(xì)胞株GES-I為反篩靶標(biāo)，篩選與胃癌細(xì)胞株HGC27特異結(jié)合的核酸適配體，制得具有特異結(jié)合HGC27的特征序列GGTTT。
3.按權(quán)利要求I所述的胃癌細(xì)胞的核酸適配體序列，其特征在于，所述的序列選自天然存在或人工合成的序列，或任何其他來(lái)源的同樣的序列。
4.按權(quán)利要求I所述的胃癌細(xì)胞的核酸適配體序列，其特征在于，所述的核酸適配體的序列含有與所述特征序列的核苷酸的全部相同的序列。
5.按權(quán)利要求I所述的胃癌細(xì)胞的核酸適配體序列，其特征在于，所述的特征序列GGTTT在設(shè)計(jì)藥物或制品中的用途。
6.按權(quán)利要求I所述的胃癌細(xì)胞的核酸適配體序列，其特征在于，所述的特征序列GGTTT在制備藥物或其他制品中的用途。
7.按權(quán)利要求4或5所述的胃癌細(xì)胞的核酸適配體序列，其特征在于，所述的藥物或制品為抗胃癌的藥物或制品。
8.權(quán)利要求I的胃癌細(xì)胞的核酸適配體的序列在制備檢測(cè)胃癌的分子探針中的用途。
9.權(quán)利要求I的胃癌細(xì)胞的核酸適配體的序列在制備檢測(cè)胃癌的藥物靶點(diǎn)中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬細(xì)胞生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種胃癌細(xì)胞的核酸適配體序列及用途。本發(fā)明采用核酸適配體的體外SELEX篩選技術(shù)，以胃癌細(xì)胞株HGC27為正篩靶標(biāo)，以胃粘膜上皮細(xì)胞株GES-1為反篩靶標(biāo)，并篩選與HGC27特異結(jié)合的核酸適配體，獲得具有特異結(jié)合HGC27的特征序列GGTTT。本發(fā)明所述的特征序列是核酸適配體與HGC27特異性結(jié)合的基礎(chǔ)，可用于抗胃癌的藥物設(shè)計(jì)、制備藥物或其他制品；所述的含該特征序列的核酸適配體，可作為抗胃癌的分子探針或藥物靶點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/115GK102839181SQ20111017252
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2011年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月23日
發(fā)明者劉杰, 張駿 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院