專利名稱：一種碳鋼腐蝕細(xì)菌的定量檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種浸海碳鋼腐蝕細(xì)菌-海洋玫瑰桿菌族 (Roseobacter clade)細(xì)菌定量檢測方法。
背景技術(shù)：
微生物腐蝕是一個(gè)非常嚴(yán)重的環(huán)境和工程問題。在美國，腐蝕直接造成的經(jīng)濟(jì)損失每年高達(dá)近3千億美元，英國、日本、澳大利亞、德國、科威特、芬蘭、瑞典和印度等國的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)也表明，腐蝕損失約占國家生產(chǎn)總值(GDP)的 5%，依此推算我國每年腐蝕所造成的經(jīng)濟(jì)損失已超過6千億元。近年來，我國海洋石油平臺、海港碼頭和跨海大橋等重大海洋工程設(shè)施建設(shè)呈現(xiàn)急劇上升趨勢，海洋腐蝕的危害和損失日益加劇，腐蝕微生物檢測和防護(hù)技術(shù)已成為海洋設(shè)施安全和長期有效使用的關(guān)鍵。前期研究發(fā)現(xiàn)，海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌是海洋中的一類重要菌群，在浸海物體表面及海水懸浮顆粒物中構(gòu)成了關(guān)鍵初級附著菌，即所謂的“附著拓殖種”(Dang and Lovell, 2000, 2002a, 2002b ；黃進(jìn)強(qiáng)等，2008)。并且大部分海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌在浸海固體表面易產(chǎn)生生物膜(Biofilm)，對附著微生物群落的形成、發(fā)育和功能熟化及海洋污損和金屬腐蝕生物群落的發(fā)生起到至關(guān)重要作用(Lau, et al. ,2003 ；Roa et al. ,2007 ；Dang et al.， 2008)。同時(shí)，一些海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌還可以在一定環(huán)境條件下產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物(包括一些抗菌藥物等)(Slightom and Buchan，2009)。因此，海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌不但可誘發(fā)海洋環(huán)境中金屬腐蝕的發(fā)生，同時(shí)其中的一些產(chǎn)抗菌素菌種還可以作為抑制生物污損和金屬腐蝕的海洋益生菌而被開發(fā)利用，從而用以生產(chǎn)抗污損和抗腐蝕的生物制劑。因此，浸海金屬表面海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌的附著動(dòng)態(tài)和數(shù)量檢測構(gòu)成了海洋生物污損和金屬腐蝕防護(hù)的一個(gè)關(guān)鍵。以前對海水中碳鋼腐蝕微生物的檢測方法大多依賴微生物的培養(yǎng)，費(fèi)時(shí)耗力，且因?yàn)楹芏喾N類的海洋微生物目前尚無法培養(yǎng)，培養(yǎng)法很難達(dá)到檢測準(zhǔn)確性的要求。黨宏月和黃進(jìn)強(qiáng)等人(Dangand Lovell, 2000, 2002a, 2002b ；Dang et al.，2008 ； 黃進(jìn)強(qiáng)等，2008)曾通過細(xì)菌16S rRNA基因克隆文庫定性研究方法和DNA分子探針熒光原位雜交(FISH)定量研究技術(shù)，對該類細(xì)菌在非金屬浸海材料上進(jìn)行了種類、分布、動(dòng)態(tài)變化等定性和定量研究。FISH細(xì)菌定量法在腐蝕微生物檢測應(yīng)用中存在實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣、操作復(fù)雜、所用儀器(激光共聚焦顯微鏡)昂貴并需專業(yè)技術(shù)人員操作、定量結(jié)果誤差大等種種弊端，不適合常規(guī)金屬腐蝕微生物檢測和監(jiān)測這一應(yīng)用目標(biāo)。并且，以前的文獻(xiàn)報(bào)道大多沒有涉及與碳鋼腐蝕相關(guān)的研究。針對海水碳鋼腐蝕微生物群落中海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌的定量檢測方法目前尚未見科技文獻(xiàn)或?qū)＠麍?bào)道。為了實(shí)現(xiàn)該目的，本發(fā)明針對浸海碳鋼腐蝕微生物關(guān)鍵菌群_海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌，設(shè)計(jì)一種不依賴微生物培養(yǎng)的以現(xiàn)代分子生物技術(shù)為手段的海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌定量檢測技術(shù)，可以快速準(zhǔn)確地檢測該類細(xì)菌在浸海碳鋼表面的附著和生長狀況及其隨碳鋼腐蝕程度變化的數(shù)量動(dòng)態(tài)變化特征，為海水碳鋼腐蝕微生物的研究和檢測提供了新技術(shù)，大大提高了檢測效率和準(zhǔn)確率。該方法快速、高效、準(zhǔn)確，并成功地應(yīng)用于青島沿岸海水碳鋼腐蝕微生物的檢測中，獲得了理想檢測數(shù)據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種海洋玫瑰桿菌族(Roseobacter clade)細(xì)菌定量檢測方法，包括以下步驟針對海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌16S rRNA基因，設(shè)計(jì)特異性引物， 提取樣品中微生物基因組DNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測樣品中海洋玫瑰桿菌族(Roseobacter clade)細(xì)菌。優(yōu)選的，所述的特異性引物為以 Rose_F :5，-CCGAACAACGCTAACCCC—3，(SEQ ID NO 1)禾口Rose_R 5' -GGCCTACCAAGTCTACGATC-3，(SEQ ID NO :2)。優(yōu)選的，本發(fā)明實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件為95°C變性50秒，之后進(jìn)行40個(gè)PCR循環(huán)，每一循環(huán)包括95°C變性5秒；56°C退火30秒；72°C延伸45秒，熒光讀值設(shè)定為72°C。本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述定量檢測方法用于定量檢測浸海碳鋼表面海洋玫瑰桿菌族(Roseobacter clade)細(xì)菌的用途。本發(fā)明提供的一種以實(shí)時(shí)熒光定量PCR (fluorescent quantitative real-time PCR，簡稱FQ-PCR)為技術(shù)基礎(chǔ)的碳鋼海水腐蝕細(xì)菌群落海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌的定量檢測方法，通過自行設(shè)計(jì)的用以該檢測技術(shù)的FQ-PCR引物對，實(shí)現(xiàn)了快速、準(zhǔn)確、并且檢測成本低的目標(biāo)，易于推廣應(yīng)用。該引物對特異性非常好，并且FQ-PCR反應(yīng)條件易于優(yōu)化，該引物對是實(shí)現(xiàn)海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌定量檢測的關(guān)鍵技術(shù)，特別適用于碳鋼海水腐蝕微生物群落中海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌定量檢測。


圖1.青島海水中碳鋼腐蝕細(xì)菌群落中海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌的定量檢測及其數(shù)量變動(dòng)特征(3 5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差)，圖中帶“*”號的條柱為應(yīng)用本發(fā)明自行設(shè)計(jì)的FQ-PCR引物對(Rose_F* Rose_R)得到的定量檢測結(jié)果。該圖還說明，類似的FQ-PCR檢查方法也可用于海水中碳鋼腐蝕細(xì)菌群落中其它菌群的定量檢測(只是不同的菌群需用不同的FQ-PCR引物對)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供的一種浸海碳鋼腐蝕細(xì)菌-海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌定量檢測方法，基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)這一基因定量檢測技術(shù)原理，通過自行設(shè)計(jì)針對海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌的特異FQ-PCR引物對(即一對引物)，在碳鋼海水腐蝕微生物群落中特異性地定量檢測海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌的16S rRNA基因的豐度，從而實(shí)現(xiàn)對碳鋼海水腐蝕微生物群落中海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌的定量檢測。該檢測技術(shù)中，F(xiàn)Q-PCR引物對是實(shí)現(xiàn)碳鋼海水腐蝕微生物群落中海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌定量檢測的關(guān)鍵，F(xiàn)Q-PCR引物對的作用是特異性地識別目標(biāo)細(xì)菌的目標(biāo)基因，這種識別特異性的實(shí)現(xiàn)歸功于FQ-PCR引物對DNA序列的設(shè)計(jì)上。針對碳鋼海水腐蝕微生物群落中海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌的16S rRNA基因，本發(fā)明提供了特異性FQ-PCR引物對Rose_F 5' -CCGAACAACGCTAACCCC—3，(SEQ ID NO 1)Rose_R 5' -GGCCTACCAAGTCTACGATC-3，(SEQ ID NO 2)該FQ-PCR引物對保證了本發(fā)明的檢測方法是特異性地針對海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌 (而不是其他不相干細(xì)菌)，從而實(shí)現(xiàn)了該發(fā)明檢測方法的檢測有效性和特異性。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明優(yōu)化了 FQ-PCR檢測條件，從而實(shí)現(xiàn)了該發(fā)明檢測方法的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。優(yōu)化后的FQ-PCR實(shí)驗(yàn)條件具體如下應(yīng)用寶生物公司(Takara，Japan)的 SYBR Premix Ex Taq II (Perfect Real Time)熒光定量試劑盒(Takara code :DRR081A ；除以下特別說明，試劑盒按照廠商提供的說明書使用)，對其反應(yīng)條件優(yōu)化為95°C變性50秒，之后進(jìn)行40個(gè)PCR循環(huán)，每循環(huán)條件為(95°C變性5秒；56°C退火30秒；72°C延伸45秒)，熒光讀值設(shè)定為72°C。為了獲得解鏈曲線(Melting curves)以檢驗(yàn)FQ-PCR檢測反應(yīng)的特異性和工作質(zhì)量，本發(fā)明在60°C到95°C之間，溫度每升高1°C進(jìn)行一次熒光讀值。該FQ-PCR檢測反應(yīng)在一臺 ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems，USA)焚光定量PCR儀進(jìn)行，在其它類似的不同商業(yè)品牌的熒光定量PCR儀上，該反應(yīng)條件可得到相似結(jié)果。因此，只要有了該FQ-PCR引物對(R0Se_F*R0Se_R)，該碳鋼腐蝕微生物定量檢測技術(shù)的應(yīng)用就可以得以實(shí)現(xiàn)，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和檢測效率將不受影響。因此，該發(fā)明檢測技術(shù)不但優(yōu)于以往技術(shù)，并且便于推廣應(yīng)用。實(shí)施例1.對實(shí)驗(yàn)室人工構(gòu)建的模擬菌株目標(biāo)基因的檢測為驗(yàn)證應(yīng)用該FQ-PCR引物對(Rose_F和Rose_R)對海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌的定量檢測可行性及準(zhǔn)確率，本發(fā)明利用在以前研究中構(gòu)建的海洋細(xì)菌16S rRNA基因文庫(Dang et al.，2008)，從中選取了攜帶海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌16S rRNA基因的克隆，應(yīng)用Qiagen 公司(Qiagen, USA)的質(zhì)粒提取試劑盒(Mini Plasmid Kit, Qiagen Catalog no. 12125， 試劑盒按照廠商提供的說明書使用)進(jìn)行了海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌16S rRNA基因質(zhì)粒的提取，并應(yīng)用定量焚光儀(Modulus Single Tube Multimode Reader fluorometer, Turner Biosystems, USA)和 PicoGreen 核酸熒光染料(Molecular Probes, USA)進(jìn)行了質(zhì)粒濃度定量測定并建立了質(zhì)粒濃度梯度系列溶液。依照上述具體實(shí)施方式
，應(yīng)用引物對(Rose_F和Rose_R)，本發(fā)明對不同濃度的質(zhì)粒溶液進(jìn)行了海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌16S rRNA基因的FQ-PCR定量檢測(3 5個(gè)重復(fù))，同時(shí)使用不含海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌16S rRNA基因的質(zhì)粒溶液作為負(fù)對照(陰性對照)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該FQ-PCR定量檢測方法對所有的目標(biāo)樣品皆檢測到海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌16S rRNA基因，對不含海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌16S rRNA基因的負(fù)對照(陰性對照)樣品檢測結(jié)果皆為0，表明該檢測技術(shù)具有非常高的特異性和準(zhǔn)確度，應(yīng)用該技術(shù)的定量檢測結(jié)果表明， 該方法同時(shí)還具有非常高的檢查效率和檢測靈敏度(表1)。表1.海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌16S rRNA基因FQ-PCR定量檢測的檢測效率和檢測靈敏度
權(quán)利要求
1.一種海洋玫瑰桿菌族(Roseobacter clade)細(xì)菌定量檢測方法，其特征在于包括以下步驟針對海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌16S rRNA基因，設(shè)計(jì)特異性引物，提取樣品中微生物基因組DNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測樣品中海洋玫瑰桿菌族(Roseobacter clade)細(xì)菌；所述的特異性引物如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件為95°C變性 50秒，之后進(jìn)行40個(gè)PCR循環(huán)；每一循環(huán)為95°C變性5秒，56 V退火30秒，72°C延伸45秒； 熒光讀值設(shè)定為72°C。
3.如權(quán)利要求1或2任一所述的方法用于定量檢測浸海碳鋼表面海洋玫瑰桿菌族 (Roseobacter clade)細(xì)菌的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種海洋玫瑰桿菌族(Roseobacter clade)細(xì)菌定量檢測方法，該方法包括以下步驟針對海洋玫瑰桿菌族細(xì)菌16S rRNA基因，設(shè)計(jì)特異性引物，提取樣品中微生物基因組DNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測樣品中海洋玫瑰桿菌族(Roseobacter clade)細(xì)菌。
文檔編號C12Q1/68GK102242203SQ20111017176
公開日2011年11月16日 申請日期2011年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月10日
發(fā)明者黨宏月, 王琳, 陳瑞鵬 申請人:中國石油大學(xué)(華東)