專利名稱：一種具有雙結(jié)構(gòu)域的低溫中性植酸酶PhyH及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種具有雙結(jié)構(gòu)域的低溫中性植酸酶PhyH及其基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
myo-肌醇六磷酸(IP6，myo-inositol hexakisphosphate)又叫做植酸(phytic acid)，是自然界中肌醇磷酸的最常見的形式。植酸的分子式是C6H18O24P6，分子量是660. 09。植酸主要以植酸鈣鎂鉀鹽的形式廣泛存在于植物種子內(nèi)，也存在于動物有核紅細胞內(nèi)，在土壤、植物以及微生物分泌到胞外的酶中都發(fā)現(xiàn)有植酸酶的存在?？上攵?，植酸酶對于自然環(huán)境中磷的代謝循環(huán)有著重要的作用。另外，植酸對絕大多數(shù)金屬離子都有極強絡(luò)合能力，絡(luò)合力與EDTA相似，但比EDTA的應(yīng)用范圍更廣。在通常條件下，植酸中的磷酸酯鍵是非常穩(wěn)定的，對于植酸的降解一般有兩種方法，一是化學方法，但利用化學方法來降解植酸是極其困難的；另一種方法是酶解法，目前我們已知的能夠有效降解植酸的只有植酸酶。目前植酸酶已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于飼料行業(yè)，特別是來源于真菌和細菌的組氨酸酸性磷酸酶類(HAP)植酸酶，因其最適pH偏酸和比活高等特點，可以顯著的提高它們在雞和豬的生產(chǎn)性能。如大腸桿菌和曲霉來源地植酸酶已經(jīng)廣泛地應(yīng)用在動物養(yǎng)殖業(yè)。但因為在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的魚類生長環(huán)境和體內(nèi)溫度較低，PH偏中性，導致HAP類植酸酶的應(yīng)用受到了限制，所以具有中性PH特征的BPP類植酸酶越來越受到關(guān)注。但是目前已知BPP類植酸的最大缺點是催化效率低，很難滿足實際生產(chǎn)需求。所以獲得新型優(yōu)質(zhì)BPP植酸酶，提高BPP 類植酸酶的催化效率，都將可以大大擴展其實際應(yīng)用空間，也正是目前急需解決的問題和執(zhí)占。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有雙結(jié)構(gòu)域的低溫中性植酸酶。本發(fā)明的另一目的是提供編碼上述雙結(jié)構(gòu)域低溫中性植酸酶的基因。本發(fā)明的另一目的是提供上述植酸酶N端及C端結(jié)構(gòu)域及其編碼基因，其中，N端結(jié)構(gòu)域可以協(xié)同提高其他植酸酶的催化效率。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述具有雙結(jié)構(gòu)域的低溫中性植酸酶基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述具有雙結(jié)構(gòu)域的低溫中性植酸酶基因的重組菌株。本發(fā)明的另一目的是提供上述具有雙結(jié)構(gòu)域的低溫中性植酸酶的應(yīng)用。本發(fā)明從芽孢桿菌(Bacillus sp. HJB17)(微生物保藏號是CGMCC No. 4868 ；保藏時間是2011年05月18號；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。100101)中分離得到一種新的具有雙結(jié)構(gòu)域的低溫中性植酸酶PhyH。本發(fā)明提供了一種具有雙結(jié)構(gòu)域的低溫中性植酸酶PhyH，其氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。SEQ ID NO. 1 MLVAKKLATKNMFLLGAVSLTLLAMLSGCQAGKFATPISAAVQPLSVNASHFHKVQLAGQDYQLFTTTT ALQIRQGNRELAQQAGQFSRLVLQPLDTDALLLAAMDINSNTLFLWRFSTKQTPSLQLLQRRLISSRVVDDLCFYHS TENQQLSLFLLGGRGGADQLLLQQQQQWLAQPVVIRELNIPYDSTACVVDQTAGALYIAEADRAIWRYQAEPEADEG RSLVQVNKPFGQLQGEVKALQTLSDGSLLALEEAPARLLHINSDGQLRSAIAVPALAEASGLAVSMQGNTATAYIST EDAGAVQQLAWPQAKPERQPKAPWQLLPTLQTEPASQRGDVMDDPAVWHHPARPELSLILGTDKRAGLDVY 匪 QG TRVQQLSVGRLNNVDVRYGLNWQGSAHDIAVASLRDDNSLQLFAIDSSGTLHNAGKVATSMSEIYGLCMYHSAQ SN KHYVFVNDKAGLIQQYRIDTD⑶HWQGSLVRALQVPSQPEGCVADDIRGLLFVGEEDAAIWRFAAEAEATTTGEAII RVDGERLVDDIEGITLAEHNGSSYLLVSSQGNDSYLVFDAAPPYTERPHFRIGTNPLLGIDGASETDGVDVTTRSLG PGFEQGAFIVQDGRNRMPEQGQNLKLVPffADILQQLN其中，該酶包含644個氨基酸和一個終止密碼子，前40個氨基酸是信號肽，因此， 成熟的植酸酶PhyH的理論分子量為67kDa。本發(fā)明的植酸酶PhyH同時具有雙結(jié)構(gòu)域，并有低溫活性。本發(fā)明從篩選到Bacillus sp. HJB17中獲得的中性植酸酶PhyH，其最適pH值為 7. 0，在堿性范圍內(nèi)pH 7. 0-12. 0，活性基本保持不變；最適溫度為35°C，并在低溫范圍內(nèi) (20-350C )仍具有60%左右的酶活力。本發(fā)明中性植酸酶PhyH包括兩個植酸酶結(jié)構(gòu)域N 端的不完整的結(jié)構(gòu)域PhyH-DI和C端的具有完整的典型BPP植酸酶結(jié)構(gòu)域PhyH-DII。其中 PhyH-DII和PhyH均具有植酸酶活性。本發(fā)明提供了編碼上述雙結(jié)構(gòu)域植酸酶PhyH的基因。具體地，該基因的序列如 SEQ ID NO. 2 所示SEQ ID NO. 2atgttagtagctaaaaagttagccacaaaaaatatgtttttactcggtgcagtcagtctgacgctgctg gccatgctaagcggctgtcaggctggcaagtttgccacacctatatcagctgcagtccaacctttatcggtcaatgc cagccacttccataaggtgcagctggccgggcaggattatcagctattcaccacaaccacggccttgcagatccgcc agggcaatcgcgagctggcgcagcaagctggccagtttagccgcctggtgctgcagccactggataccgatgcgctg ttattggcagcgatggatataaacagtaatactttgtttttatggcgtttttcaacaaagcaaacgcccagcctgca attgctgcaacgccggttgatcagcagccgggtggtagacgatctgtgcttttaccacagtactgaaaaccagcagc tcagcctgtttttactcggtggccgcggaggcgctgatcagctgctgttgcaacagcagcaacagtggctggcgcaa ccggtggtaatacgcgagttaaatatcccttatgacagcacggcttgtgtagtggatcagaccgctggtgcgctgta tatcgccgaagctgatcgcgctatctggcgctatcaggccgaacccgaagccgatgagggccgcagtttagttcagg taaataagccgtttggccagttgcagggcgaagtaaaagcgctgcaaacgttgtctgacggcagcctgctggcgctg gaggaagcaccggccagattgttacatattaacagcgacggccagctgcgcagcgccatagctgtcccggcgttggc cgaggccagcggtttagcggtcagtatgcagggcaacacggcaacagcctatatcagcactgaggatgccggtgcag tacagcagctagcggtggtgccgcaggcgaagccggagcgtcagcccaaagcgccggtagtccagctgttgccgacc ttacagactgagcccgccagtcagcgtggcgatgtgatggatgaccccgcggtgtggcatcatccggcgcggcctgagcttagcctgatcctcggcactgacaaacgcgccggactggatgtgtacaatatgcagggtacgcgcgtgcagcagc ttagcgtgggccggttaaataatgtcgatgtgcgctacggcctgaactggcagggtagtgcgcacgatattgccgta gccagtttgcgcgacgacaacagcctgcaactttttgctattgatagcagtggcacgctgcataatgccggtaaggt cgcaaccagcatgagcgagatttacggcctgtgtatgtatcacagtgcacaaagcaataagcattatgtgtttgtta atgataaagccggtttaattcagcagtatcgcatcgacacagacggcgaccactggcagggcagcttagtgcgcgct ttgcaggtaccgtcgcaaccggaaggctgtgtggccgatgatatacgcggcctgttatttgtcggcgaagaagatgc tgccatctggcgttttgccgctgaagccgaagcgacaaccacaggtgaagcgatcatccgcgttgatggtgagcggc tggtcgacgatattgaaggcataacattggcagagcataacggcagcagttatctgttggtatcaagccagggtaat gacagttacctggtgtttgacgccgcgccaccttatacagagcggccgcattttcgtattggcactaacccattact gggcatagatggcgcctctgagactgatggcgttgatgttaccacccgttcgctggggcctggctttgagcagggcg cctttatcgtacaggacggccgtaaccgtatgccggaacagggccaaaaccttaaactggtaccctgggcagatata ttgcagcaattaaac本發(fā)明提供了一種具有雙結(jié)構(gòu)域的低溫中性植酸酶，其N端不完整結(jié)構(gòu)域 (41-318aa)PhyH-DI的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示，該不完整結(jié)構(gòu)域PhyH-DI的理論分子量是31kDa。οSEQ ID NO. 3 AVQPLSVNASHFHKVQLAGQDYQLFTTTTALQIRQGNRELAQQAGQFSRLVLQPLDTDALLLAAMDINS NTLFLWRFSTKQTPSLQLLQRRLISSRVVDDLCFYHSTENQQLSLFLLGGRGGADQLLLQQQQQWLAQPVVIRELNI PYDSTACVVDQTAGALYIAEADRAIWRYQAEPEADEGRSLVQVNKPFGQLQGEVKALQTLSDGSLLALEEAPARLLH INSDGQLRSAIAVPALAEASGLAVSMQGNTATAYISTEDAGAVQQLAVVPQAKPE本發(fā)明的中性植酸酶PhyH的N端的不完整的結(jié)構(gòu)域PhyH-DI不能降解植酸(IP6)。 進一步的研究發(fā)現(xiàn)，PhyH-DI可以降解低磷底物IP4,并且可以與PhyH-DII及其他植酸酶協(xié)同作用，來提高植酸酶的催化效率。本發(fā)明提供了編碼上述不完整結(jié)構(gòu)域值酸酶PhyH-DI的基因。具體地，該基因的序列如SEQ ID NQ. 4所示SEQ ID NO. 4GCAGTCCAACCTTTATCGGTCAATGCCAGCCACTTCCATAAGGTGCAGCTGGCCGGGCAGGATTATCAG CTATTCACCACAACCACGGCCTTGCAGATCCGCCAGGGCAATCGCGAGCTGGCGCAGCAAGCTGGCCAGTTTAGCCG CCTGGTGCTGCAGCCACTGGATACCGATGCGCTGTTATTGGCAGCGATGGATATAAACAGTAATACTTTGTTTTTAT GGCGTTTTTCAACAAAGCAAACGCCCAGCCTGCAATTGCTGCAACGCCGGTTGATCAGCAGCCGGGTGGTAGACGAT CTGTGCTTTTACCACAGTACTGAAAACCAGCAGCTCAGCCTGTTTTTACTCGGTGGCCGCGGAGGCGCTGATCAGCT GCTGTTGCAACAGCAGCAACAGTGGCTGGCGCAACCGGTGGTAATACGCGAGTTAAATATCCCTTATGACAGCACGG CTTGTGTAGTGGATCAGACCGCTGGTGCGCTGTATATCGCCGAAGCTGATCGCGCTATCTGGCGCTATCAGGCCGAA CCCGAAGCCGATGAGGGCCGCAGTTTAGTTCAGGTAAATAAGCCGTTTGGCCAGTTGCAGGGCGAAGTAAAAGCGCT GCAAACGTTGTCTGACGGCAGCCTGCTGGCGCTGGAGGAAGCACCGGCCAGATTGTTACATATTAACAGCGACGGCC AGCTGCGCAGCGCCATAGCTGTCCCGGCGTTGGCCGAGGCCAGCGGTTTAGCGGTCAGTATGCAGGGCAACACGGCA ACAGCCTATATCAGCACTGAGGATGCCGGTGCAGTACAGCAGCTAGCGGTGGTGCCGCAGGCGAAGCCGGAG本發(fā)明提供了上述植酸酶結(jié)構(gòu)域PhyH-DI用于提高植酸酶活性的應(yīng)用。本發(fā)明提供了 PhyH-DII的氨基酸序列，具體地，該基因的序列如SEQ ID NO. 5所示，其理論分子量是36kDa，PhyH-DII可以有效的降解植酸。SEQ ID NO. 5RQPKAPVVQLLPTLQTEPASQRGDVMDDPAVWHHPARPELSLILGTDKRAGLDVYNMQGTRVQQLSVG RLNNVDVRYGLNWQGSAHDIAVASLRDDNSLQLFAIDSSGTLHNAGKVATSMSEIYGLCMYHSAQSNKHYVFVNDK AGLIQQYRIDTD⑶HWQGSLVRALQVPSQPEGCVADDIRGLLFVGEEDAAIWRFAAEAEATTTGEAIIRVDGERL VDDIEGITLAEHNGSSYLLVSSQGNDSYLVFDAAPPYTERPHFRIGTNPLLGIDGASETDGVDVTTRSLGPGFEQ GAFIVQDGRNRMPEQGQNLKLVPWADILQQLN本發(fā)明提供了 PhyH-DII的核苷酸序列，具體地，該基因的序列如SEQ ID NO. 6所示SEQ ID NO. 6cgtcagcccaaagcgccggtagtccagctgttgccgaccttacagactgagcccgccagtcagcgtggc gatgtgatggatgaccccgcggtgtggcatcatccggcgcggcctgagettagcctgatcctcggcactgacaaacg cgccggactggatgtgtacaatatgcagggtacgcgcgtgcagcagcttagcgtgggccggttaaataatgtcgatg tgcgctacggcctgaactggcagggtagtgcgcacgatattgccgtagccagtttgcgcgacgacaacagcctgcaa ctttttgctattgatagcagtggcacgctgcataatgccggtaaggtcgcaaccagcatgagcgagatttacggcct gtgtatgtatcacagtgcacaaagcaataagcattatgtgtttgttaatgataaagccggtttaattcagcagtatc gcatcgacacagacggcgaccactggcagggcagcttagtgcgcgctttgcaggtaccgtcgcaaccggaaggctgt gtggccgatgatatacgcggcctgttatttgtcggcgaagaagatgctgccatctggcgttttgccgctgaagccga agcgacaaccacaggtgaagcgatcatccgcgttgatggtgagcggctggtcgacgatattgaaggcataacattgg cagagcataacggcagcagttatctgttggtatcaagccagggtaatgacagttacctggtgtttgacgccgcgcca ccttatacagagcggccgcattttcgtattggcactaacccattactgggcatagatggcgcctctgagactgatgg cgttgatgttaccacccgttcgctggggcctggctttgagcagggcgcctttatcgtacaggacggccgtaaccgta tgccggaacagggccaaaaccttaaactggtaccctgggcagatatattgcagcaattaaac本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了植酸酶基因phyH，DNA全序列分析結(jié)果表明，該基因全長1224bp。將phyH的氨基酸序列及推導出的氨基酸序列在GenBank中進行BLAST比對，PhyH與來源于Idiomarina loihiensis L2TR的假定植酸酶的具有最高一致性(51%)， PhyH-DI 與來源于 B. amyloliquefaciens TS-Phy 的植酸酶一致性為 25%，PhyH-DII 與 TS-Phy的一致性為49%，與來源于B. subtil is PhyC的一致性為40%，說明phyH是一種新的植酸酶。本發(fā)明還提供了包含上述植酸酶基因phyH的重組載體，命名為pET22b(+)_phyH。 將本發(fā)明的植酸酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，優(yōu)選為將本發(fā)明的植酸酶基因插入到質(zhì)粒pET22b⑴上的EcoR I和Xho I限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于T7啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組大腸桿菌表達質(zhì)粒pET22b (+)-phyH。本發(fā)明還提供了包含上述植酸酶基因PhyH的重組菌株，優(yōu)選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為大腸桿菌BL21 (DE3)。本發(fā)明還提供了一種制備中性植酸酶PhyH的方法，包括以下步驟1)用上述的載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得到活性菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導重組植酸酶表達；
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3)回收并純化所表達的植酸酶PhyH。本發(fā)明還提供了上述植酸酶PhyH的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種具有雙結(jié)構(gòu)域的BPP植酸酶，它由N端的不完整的結(jié)構(gòu)域 PhyH-DI和C端的具有完整的典型BPP植酸酶結(jié)構(gòu)域PhyH-DII組成。研究發(fā)現(xiàn)，一方面，不完整的結(jié)構(gòu)域PhyH-DI不能降解植酸酶底物IP6,但是可以降解植酸水解過程中的中間產(chǎn)物 IP4，從而促進植酸底物的完全降解；另一方面，該結(jié)構(gòu)域可以與PhyH-DII等其他植酸酶協(xié)同作用，從而提高其他單結(jié)構(gòu)域質(zhì)酸酶的比活和催化效率，為提高BPP類植酸酶的催化效率提供了一種思路。同時，該酶具有低溫活性和良好的堿性穩(wěn)定性，具有實際應(yīng)用的潛力。本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是針對BPP類植酸酶催化效率低的現(xiàn)狀，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的、適合于在魚類飼料中應(yīng)用新的植酸酶。本發(fā)明的植酸酶最適PH為7.0，在pH 7. 0 12. 0都的穩(wěn)定性好；最適溫度35°C，在20-35°C保持60%以上的酶活，并且在0°C還有20%的酶活。其低溫和pH中性的特性，可使其在魚類飼料中應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了不完整的結(jié)構(gòu)域PhyH-DI可以降解IP4，并可以與完整的結(jié)構(gòu)域PhyH-DII協(xié)同作用，來提高雙結(jié)構(gòu)域植酸的催化效率。通過融合表達，發(fā)現(xiàn)這種協(xié)同作用同樣適用于其它的植酸酶。


圖1重組植酸酶的表達和純化，其中，1 PhyH未純化2 PhyH-DII未純化3 PhyH-DI 未純化 4 PhyH(67kDa) 5 PhyH-DII (36kDa) 6 PhyH-DI (31 kDa)圖2重組植酸酶PhyH和PhyH-DII的鈣離子濃度影響。圖3重組植酸酶PhyH和PhyH-DII的最適pH。圖4重組植酸酶PhyH和PhyH-DII的pH穩(wěn)定性。圖5重組植酸酶PhyH和PhyH-DII的最適溫度。圖6重組植酸酶PhyH的熱穩(wěn)定性。
圖7重組植酸酶PhyH-DII的熱穩(wěn)定性。圖8融合表達載體構(gòu)建圖。芽孢桿菌(Bacillus sp. HJB17)(微生物保藏號是=CGMCC No. 4868 ；保藏時間是 2011年05月18號；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；100101)
具體實施例方式試驗材料和試劑1、菌株及載體本發(fā)明從芽孢桿菌(Bacillus sp. HJB17)(微生物保藏號是 CGMCC No. 4868 ；保藏時間是2011年05月18號；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；100101)中分離得到一種新的具有雙結(jié)構(gòu)域的低溫中性植酸酶，大腸桿菌表達載體 pET22b (+)及菌株BL21(DE3)為實驗室保存。2、酶類及其它生化試劑內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。 購自Sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。細菌基因組提取試劑盒購自天根公司。
3、培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、NaCl，pH 7.0)。說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進行。實施例1芽孢桿菌Bacillus sp. HJB17產(chǎn)酶特性新疆天上一號冰川凍土樣品經(jīng)植酸酶篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)(低磷培養(yǎng)基LPM)后， 按常規(guī)稀釋平板，分別在4，20，37°C進行培養(yǎng)。然后將生長出的具有透明圈單菌落劃平板分純，并將有活性菌株進行鑒定，經(jīng)16S鑒定后該菌株為芽孢桿菌屬，命名為Bacillus sp.HJB17。低磷培養(yǎng)基LPM的配方如下酪蛋白胨Ig ；大豆蛋白胨0. 45g ；葡萄糖4g ；谷氨酸鹽0. 5g ；氯化鈉5g ； MgCl2L 7mM ；MgSO4L 4mM ；KC1，0. 47mM ；CaCl2O. 3mM ；溶于 900mL 50mMpH 7. 5Tris-HCl 中，定容至lOOOmL，分裝，滅菌15min待用。Bacillus sp. HJB17的最適生長條件是37°C，pH 7. 0。在37°C檢測到該菌具有植酸酶活性(0. 33 士 0. 05U · mr1)。實施例2芽孢桿菌Bacillus sp. HJB17植酸酶編碼基因phyH的克隆提取芽孢桿菌Bacillus sp. HJB17基因組DNA，采用細菌基因組提取試劑盒(天根公司)，具體操作間說明書。根據(jù)BPP植酸酶基因的保守區(qū)序列設(shè)計合成了簡并引物 BPP-F 和 BPP-R BPP-F 5 ‘ -GACGCAGCCGAYGAYCCNGCNITNTGG-3 ‘和 BPP-R 5' -CAGGSCGCANRTCIACRTTRTT-3‘。以 Bacillus sp. HJB 17 總 DNA 為模板進行 PCR擴增。 得到一約ISObp片段，將該片段回收后與PEASY-T3載體相連測序。根據(jù)測序得到的核苷酸序列，設(shè)計上游和下游各三條TAIL-PCR特異性引物設(shè)計方向為需要擴增的未知區(qū)域方向，sp2的位置設(shè)計在spl的內(nèi)側(cè)，sp3位于sp2的內(nèi)側(cè)。每兩個引物之間的距離沒有嚴格規(guī)定，引物長度一般22 30nt，退火溫度在60 65°C。并將它們分別命名為uspl，卿2，usp3(上游特異性引物)，dspl, dsp2, dsp3(下游特異性引物)見表1。表1植酸酶PhyH的TAIL-PCR特異性引物
權(quán)利要求
1.一種具有雙結(jié)構(gòu)域的低溫中性植酸酶PhyH，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一種具有雙結(jié)構(gòu)域的低溫中性植酸酶PhyH的基因，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的具有雙結(jié)構(gòu)域的低溫中性植酸酶PhyH。
3.如權(quán)利要求2所述的雙結(jié)構(gòu)域的低溫中性植酸酶PhyH的基因，其特征在于，其核酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.一種植酸酶結(jié)構(gòu)域PhyH-DI，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
5.權(quán)利要求4所述的結(jié)構(gòu)域PhyH-DI的基因，其特征在于，其核酸序列如SEQID NO. 4 所示。
6.權(quán)利要求4所述植酸酶結(jié)構(gòu)域PhyH-DI用于提高植酸酶的活性的應(yīng)用。
7.一種具有植酸酶活性的植酸酶結(jié)構(gòu)域PhyH-DII，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示.
8.權(quán)利要求7所述的結(jié)構(gòu)域PhyH-DII的基因，其特征在于，其核酸序列如SEQIDNO. 6 所示。
9.權(quán)利要求1所述具有雙結(jié)構(gòu)域的低溫中性植酸酶PhyH的應(yīng)用。
10.芽孢桿菌(Bacillussp. HJB17)，其保藏號是CGMCC No. 4868。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種具有雙結(jié)構(gòu)域的低溫中性植酸酶PhyH及其基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種來源于芽孢桿菌屬Bacillus sp.HJB17的中性植酸酶PhyH，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本發(fā)明提供了編碼上述中性植酸酶的編碼基因PhyH。本發(fā)明的植酸酶具有良好的pH穩(wěn)定性，在堿性范圍內(nèi)依然保持較高酶活；在低溫范圍具有較高的相對酶活；具有雙結(jié)構(gòu)域，N端為一個不完整的BPP植酸酶結(jié)構(gòu)域；C端是一個完整的植酸酶的結(jié)構(gòu)域。總之，本發(fā)明獲得的PhyH作為一種低溫中性植酸酶可以應(yīng)用于漁業(yè)養(yǎng)殖生產(chǎn)；其PhyH-DI結(jié)構(gòu)域可以提高其他植酸酶的催化效率，有助于其改進其他植酸酶的生產(chǎn)和應(yīng)用。
文檔編號C12N15/55GK102250853SQ20111017173
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月24日
發(fā)明者姚斌, 孟昆, 李中媛, 楊培龍, 柏映國, 石鵬君, 羅會穎, 袁鐵錚, 黃火清 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所