專利名稱：外源添加物促進微生物合成子囊霉素的方法及種子液和培養(yǎng)基的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及外源添加物促進微生物合成子囊霉素的方法及培養(yǎng)基制備。
背景技術(shù)：
子囊霉素(ascomycin，F(xiàn)K-520)是由吸水鏈霉菌子囊亞種(Sti^ptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus)發(fā)酵產(chǎn)生的一種由二十三元環(huán)組成的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。其化學名為17 α-乙基-1 β，14 α-二羥基-12 β [2-(4 α -羥基_3 β -甲氧基-1 β-I-(E)-甲基乙烯基)]-23 α，253-二甲氧基-13 0，19，21 α，27β-四甲基-11， 28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)[22，3，1，0] 二十八碳_18_2，3，10，16-四酮，一水合物。相對分子質(zhì)量為822. 5，分子式C44H69NO12 · H2O0易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚、苯，可溶于叔丁基甲醚，微溶于水、環(huán)己烷、正己烷，不溶于庚烷。子囊霉素是他克莫司(tacrolimus，F(xiàn)K-506)的乙基類似物。子囊霉素與他克莫司藥理作用相似，也具有免疫抑制作用，主要通過與巨內(nèi)酯胺基團與細胞質(zhì)中特定受體親免素巨菲蛋白-12(macr0philin-12)相結(jié)合，結(jié)合產(chǎn)生的親免素復合體與細胞質(zhì)內(nèi)的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶結(jié)合，抑制鈣調(diào)磷蛋白磷酸酶的活性，從而阻止了能激活T細胞質(zhì)內(nèi)核因子 (NF-AT)組分的脫磷酸作用，進而阻止T細胞合成相關(guān)炎性細胞因子的合成，且其它炎性細胞因子如IL-5、IL-10和TFY-γ等的量也都相應下降。子囊霉素可用于治療自身免疫性疾病、皮膚疾病及預防器官移植排斥。此外，一系列研究表明子囊霉素還具有抗瘧疾、神經(jīng)保護與再生、抗痙攣等活性。近年來國內(nèi)外主要選用以吸水鏈霉菌(Sti^ptomyces hygroscopicus)為代表的微生物來生產(chǎn)子囊霉素。1962年，日本藤澤制藥公司(Fujisawa)首次從日本三宮市土壤中分離的吸水鏈霉菌Str印tomyces hygroscopicus No. KK317的發(fā)酵液中提取得到子囊霉素。2007年，印度學者Parveen等申請專利W02007/029082報道了子囊霉素的單位達到 350-400mg/L,但國內(nèi)對子囊霉素的研究還處于起步階段，發(fā)酵效價一般在150_200mg/L，與國外發(fā)酵效價相比，有較大的差距。子囊霉素的生物合成途徑已經(jīng)基本明確，起始于聚酮合成酶催化的大環(huán)內(nèi)酯前體的組裝，聚酮合酶由3個多肽組成，第1個(FkbB)選擇莽草酸衍生物DHCHC作為起始單位， 添加4個延伸單元；第2個(FkbC)和第3個(FkbA)分別添加2個及4個延伸單元。每個延伸單元分別與1個特定的連接單位(丙二酰輔酶A或甲基丙二酰輔酶A)結(jié)合進行特定的β -酮步驟，再把合成鏈連接到下一個延伸單元上，可與PKS復合物結(jié)合的FkbP肽鏈合成酶催化中間體與六氫吡啶羧酸的氮原子縮合。與PKS復合物釋放后，前體的9位碳原子依次被FkbD和FkbO羥基化、氧化，可以產(chǎn)生β -羰基酰胺作用，同時31位碳上的羥基被FkbM 甲基化。子囊霉素的結(jié)構(gòu)組分在微生物中的來源已基本闡述明確內(nèi)酯環(huán)由1個乙基丙二酰、2個丙二酰、2個甲氧基丙二酰ACP和5個甲基丙二酰延伸單元組成，環(huán)外的環(huán)己烷來自莽草酸，哌可酸來自賴氨酸，甲氧基來自甲硫氨酸。目前對于子囊霉素的大部分研究工作集中在子囊霉素生物合成相關(guān)的酶及基因克隆、子囊霉素衍生物的開發(fā)、抗菌活性及臨床應用等方面，而在子囊霉素發(fā)酵、提取等生產(chǎn)工藝方面的研究則明顯不足，國內(nèi)對子囊霉素的發(fā)酵研究還處于起步階段。在發(fā)酵過程中前體的含量與最終目標產(chǎn)物的合成量有直接關(guān)系，通過在發(fā)酵開始或中間添加外源物能夠促使某些前體物質(zhì)的增加，最終使目標產(chǎn)物產(chǎn)量增加。如穆云龍等(穆云龍，余旭亞， 孟慶雄.莽草酸對子囊霉素生物合成的影響，中國抗生素雜志，2008，6 (23) :3-4.)研究了添加莽草酸前體物質(zhì)對子囊霉素生物合成的影響，結(jié)果表明發(fā)酵培養(yǎng)24h時添加0. 15% 的莽草酸，至96h發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵效價最高可達131. 7mg/L,發(fā)酵效價提高了 51 %，然而與高外的發(fā)酵效價相比仍有加大差距；SangJoon Mo等(Mo SJ, Ban YH, Park Jff, Yoo YJ, Yoon YJ. Enhanced FK506production in Streptomyce clavuligerus CKD 1119by engineering the supply ofmethylmalonyI-CoA precursor. J Ind Microbiol Biotechnol,2009,36 1473-1482.)人向R2YE培養(yǎng)基中加入油酸甲酯10mM(4. 37g/L)，他克莫司(Π(-506)的發(fā)酵單位提高了近2. 5倍。但是，外源添加物大豆油和異亮氨以及與莽草酸的組合使用在子囊霉素發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化方面，還未見有相關(guān)文獻和報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種外源添加物方法以提高子囊霉素的產(chǎn)量，重在尋找一種或幾種最優(yōu)的外源添加物在最適的發(fā)酵時間添加最適的量以提高子囊霉素前體的量，從而
顯著提高子囊霉素的產(chǎn)量。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明的外源添加物促進微生物合成子囊霉素的方法在吸水鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中接入體積比為10%的種子液，在26°C -30°c、通氣量0. 6-1. Ov/v/m、轉(zhuǎn)速300_500rpm、 pH6. 5-7. 5的搖床中培養(yǎng)發(fā)酵144-192h ；其中在進行發(fā)酵培養(yǎng)前向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入外源添加物；或者，在進行發(fā)酵合成子囊霉素的過程中，在菌體生長階段添加外源添加物；夕卜源添加物為莽草酸、異亮氨酸或大豆油中的一種或幾種。本發(fā)明飛吸水鏈霉菌是在室溫下取吸水鏈霉菌子囊亞種(ATCC14891)成熟斜面孢子用無菌水制成孢子懸液；0. 2mL孢子懸液接種到裝有40mL種子培養(yǎng)基的250mL的搖瓶中，26°C -30°C、180-220rpm 搖床中培養(yǎng) 48h。所述的方法，其中在進行發(fā)酵培養(yǎng)前向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入外源添加物時，莽草酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中的初始濃度為0. 5-3. Og/L，異亮氨酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中的初始濃度為 0. 5-3. Og/L，大豆油在發(fā)酵培養(yǎng)基中的初始濃度為l-5g/L ；在發(fā)酵過程中(菌體的生長階段)加入外源添加物時，莽草酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中的初始濃度為0. 5-3. Og/L，異亮氨酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中的初始濃度為0. 5-3. Og/L，大豆油在發(fā)酵培養(yǎng)基中的初始濃度為l-5g/L。所述的種子液培養(yǎng)基組成及含量為淀粉8_12g/L、葡萄糖25_35g/L、蛋白胨5-7g/L、酵母粉5-7g/L、碳酸鈣l-3g/L，初始pH7. O ；發(fā)酵培養(yǎng)基組成及含量為淀粉 15-25g/L、糊精 35-45g/L、麩質(zhì)粉 2_3g/L、蛋白胨 4_6g/L、酵母粉 8_12g/L、玉米漿 4_6g/L、 冷榨豆餅粉4-6g/L、磷酸氫二鉀0. 5-1. 5g/L、硫酸銨0. 5-1. 5g/L、硫酸鎂0. 5-1. 5g/L、碳酸鈣 0. 5-1.5g/L，初始 pH7.O。
本發(fā)明的優(yōu)點在于外源添加物增強菌體中子囊霉素前體物的積累，促進子囊霉素合成途徑代謝，使更多碳流流向目標產(chǎn)物，提高了子囊霉素的合成量。這種方法的益處在于提高底物轉(zhuǎn)化率，顯著提高子囊霉素合成量。本發(fā)明操作簡單，不增加額外的設備和人工， 僅通過較低的附加投入，提高了生物利用率，本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)吸水鏈霉菌子囊亞種，子囊霉素的發(fā)酵單位比對照提高了 55. 9-114.7%。
具體實施方式
下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步說明實施例1、3、5為在發(fā)酵培養(yǎng)前添加外源添加物，實施例2、4、6、7為在發(fā)酵培養(yǎng)過程中(菌體生長階段)添加外源添加物。實施例1在室溫下取吸水鏈霉菌子囊亞種(ATCC14891)成熟斜面孢子用無菌水制成孢子懸液；0. 2mL孢子懸液接種到裝有40mL種子培養(yǎng)基(組成及含量為淀粉10g/L、葡萄糖32g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、碳酸鈣lg/L，初始ρΗ7· 0)的250mL的搖瓶中，30°C、 ISOrpm搖床中培養(yǎng)48h ；以10%的接種量，加到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基(組成及含量為淀粉22g/ L、糊精40g/L、麩質(zhì)粉3g/L、蛋白胨4g/L、酵母粉12g/L、玉米漿4g/L、冷榨豆餅粉4g/L、磷酸氫二鉀0. 5g/L、硫酸銨lg/L、硫酸鎂0. 5g/L、碳酸鈣0. 5g/L，莽草酸0. 5g/L，初始pH7. 0) 的自動7. 5LDE發(fā)酵罐中；發(fā)酵條件30°C，通氣量控制0. 6v/v/m，轉(zhuǎn)速500rpm，pH7. 0的條件下，發(fā)酵192h。通過HPLC檢測發(fā)酵液中的子囊霉素濃度。子囊霉素發(fā)酵單位由原來的 170mg/L 提高到了 265mg/L，提高了 55.9%。實施例2在室溫下取吸水鏈霉菌子囊亞種(ATCC14891)成熟斜面孢子用無菌水制成孢子懸液；0. 2mL孢子懸液接種到裝有40mL種子培養(yǎng)基(組成及含量為淀粉8g/L、葡萄糖32g/ L、蛋白胨5g/L、酵母粉7g/L、碳酸鈣2g/L，初始pH7. 0)的250mL的搖瓶中，30°C、180rpm搖床中培養(yǎng)48h;以10%的接種量，加到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基(組成及含量為淀粉18g/L、糊精 42g/L、麩質(zhì)粉2g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉10g/L、玉米漿5g/L、冷榨豆餅粉4g/L、磷酸氫二鉀1. 5g/L、硫酸銨0. 5g/L、硫酸鎂0. 8g/L、碳酸鈣1. 2g/L，初始pH7. 0)的自動7. 5LDE發(fā)酵罐中。在發(fā)酵36h后添加0.5g/L的莽草酸。發(fā)酵條件30°C，通氣量控制0.6v/v/m，轉(zhuǎn)速 500rpm, pH7. 0的條件下，發(fā)酵180h。通過HPLC檢測發(fā)酵液中的子囊霉素濃度。子囊霉素發(fā)酵單位由原來的170mg/L提高到了 290mg/L，提高了 70. 6%。實施例3在室溫下取吸水鏈霉菌子囊亞種(ATCC14891)成熟斜面孢子用無菌水制成孢子懸液；0. 2mL孢子懸液接種到裝有40mL種子培養(yǎng)基(組成及含量為淀粉9g/L、葡萄糖29g/ L、蛋白胨4. 5g/L、酵母粉6. 5g/L、碳酸鈣1. 5g/L，初始pH7. 0)的250mL的搖瓶中，26°C、 220rpm搖床中培養(yǎng)48h ；以10%的接種量，加到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基(組成及含量為淀粉21g/ L、糊精41g/L、麩質(zhì)粉2. 2g/L、蛋白胨5. 5g/L、酵母粉1 lg/L、玉米漿5. 5g/L、冷榨豆餅粉 5. 5g/L、磷酸氫二鉀0. 8g/L、硫酸銨0. 8g/L、硫酸鎂0. 6g/L、碳酸鈣0. 7g/L，異亮氨酸2g/L， 初始pH7. 0)的自動7. 5LDE發(fā)酵罐中。發(fā)酵條件26°C，通氣量控制1. Ov/v/m,轉(zhuǎn)速500rpm， PH7.0的條件下，發(fā)酵144h。通過HPLC檢測發(fā)酵液中的子囊霉素濃度。子囊霉素發(fā)酵單位由原來的170mg/L提高到了 275mg/L，提高了 61.8%。實施例4在室溫下取吸水鏈霉菌子囊亞種(ATCC14891)成熟斜面孢子用無菌水制成孢子懸液；0. 2mL孢子懸液接種到裝有40mL種子培養(yǎng)基(組成及含量為淀粉15g/L、葡萄糖35g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉6g/L、碳酸鈣3g/L，初始ρΗ7· 0)的250mL的搖瓶中，26°C、 220rpm搖床中培養(yǎng)48h;以10%的接種量，加到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基(組成及含量為淀粉 25g/L、糊精32g/L、麩質(zhì)粉2. 2g/L、蛋白胨5. 5g/L、酵母粉12g/L、玉米漿6g/L、冷榨豆餅粉 5g/L、磷酸氫二鉀0. 6g/L、硫酸銨0. 7g/L、硫酸鎂lg/L、碳酸鈣lg/L，初始pH7. 0)的自動 7. 5LDE發(fā)酵罐中。在發(fā)酵24h后添加2g/L的異亮氨酸。發(fā)酵條件26°C，通氣量控制1. Ov/ v/m，轉(zhuǎn)速500rpm，pH7. 0的條件下，發(fā)酵156h。通過HPLC檢測發(fā)酵液中的子囊霉素濃度。 子囊霉素發(fā)酵單位由原來的170mg/L提高到了 305mg/L，提高了 79.4%。實施例5在室溫下取吸水鏈霉菌子囊亞種(ATCC14891)成熟斜面孢子用無菌水制成孢子懸液；0. 2mL孢子懸液接種到裝有40mL種子培養(yǎng)基(組成及含量為淀粉10g/L、葡萄糖25g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉6g/L、碳酸鈣2g/L，初始ρΗ7· 0)的250mL的搖瓶中，28°C、 200rpm搖床中培養(yǎng)48h ；以10%的接種量，加到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基(組成及含量為淀粉15g/ L、糊精40g/L、麩質(zhì)粉2. 5g/L、蛋白胨4g/L、酵母粉8g/L、玉米漿4g/L、冷榨豆餅粉4g/L、磷酸氫二鉀lg/L、硫酸銨lg/L、硫酸鎂lg/L、碳酸鈣lg/L，大豆油6g/L，初始pH7. 0)的自動 7. 5LDE發(fā)酵罐中。發(fā)酵條件30°C，通氣量控制0. 8v/v/m，轉(zhuǎn)速400rpm，pH7. 0的條件下，發(fā)酵168h。通過HPLC檢測發(fā)酵液中的子囊霉素濃度。子囊霉素發(fā)酵單位由原來的170mg/L 提高到了 295mg/L，提高了 73. 5%0實施例6在室溫下取吸水鏈霉菌子囊亞種(ATCC14891)成熟斜面孢子用無菌水制成孢子懸液；0. 2mL孢子懸液接種到裝有40mL種子培養(yǎng)基(組成及含量為淀粉10g/L、葡萄糖30g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉6g/L、碳酸鈣2g/L，初始ρΗ7· 0)的250mL的搖瓶中，28°C、 200rpm搖床中培養(yǎng)48h ；以10%的接種量，加到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基(組成及含量為淀粉25g/ L、糊精45g/L、麩質(zhì)粉2g/L、蛋白胨4g/L、酵母粉8g/L、玉米漿4g/L、冷榨豆餅粉4g/L、磷酸氫二鉀lg/L、硫酸銨lg/L、硫酸鎂lg/L、碳酸鈣lg/L，初始pH7. 0)的自動7. 5LDE發(fā)酵罐中。 在發(fā)酵24h后添加6g/L的大豆油。發(fā)酵條件28°C，通氣量控制0. 9v/v/m,轉(zhuǎn)速500rpm， PH6.5的條件下，發(fā)酵168h。通過HPLC檢測發(fā)酵液中的子囊霉素濃度。子囊霉素發(fā)酵單位由原來的170mg/L提高到了 345mg/L，提高了 102.9%。實施例7在室溫下取吸水鏈霉菌子囊亞種(ATCC14891)成熟斜面孢子用無菌水制成孢子懸液；0. 2mL孢子懸液接種到裝有40mL種子培養(yǎng)基(組成及含量為淀粉10g/L、葡萄糖30g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉6g/L、碳酸鈣2g/L，初始ρΗ7· 0)的250mL的搖瓶中，28°C、 200rpm搖床中培養(yǎng)48h ；以10%的接種量，加到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基(組成及含量為淀粉20g/ L、糊精40g/L、麩質(zhì)粉2. 5g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉10g/L、玉米漿5g/L、冷榨豆餅粉5g/L、 磷酸氫二鉀lg/L、硫酸銨lg/L、硫酸鎂lg/L、碳酸鈣lg/L，初始pH7. 0)的自動7. 5LDE發(fā)酵罐中。在發(fā)酵24h后添加2g/L的異亮氨酸、6g/L的大豆油，36h后添加0. 5g/L的莽草酸。發(fā)酵條件28°C，通氣量控制0. 8v/v/m，轉(zhuǎn)速450rpm，pH7.0的條件下，發(fā)酵168h。通過HPLC 檢測發(fā)酵液中的子囊霉素濃度。子囊霉素發(fā)酵單位由原來的170mg/L提高到了 365mg/L，提高了 114. 7%。
本發(fā)明并不局限于實例中所描述的技術(shù)，它的描述是說明性的，并非限制性的，發(fā)明的權(quán)限由權(quán)利要求所限定，基于本技術(shù)領(lǐng)域人員依據(jù)本發(fā)明所能夠變化、重組等方法得到的與本發(fā)明相關(guān)的技術(shù)，都在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.外源添加物促進微生物合成子囊霉素的方法，其特征是在吸水鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中接入體積比為10%的種子液，在-30°c、通氣量0. 6-1. Ov/v/m、轉(zhuǎn)速300_500rpm、 pH6. 5-7. 5的搖床中培養(yǎng)發(fā)酵144-19 ；其中在進行發(fā)酵培養(yǎng)前向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入外源添加物；或者，在進行發(fā)酵合成子囊霉素的過程中，在菌體生長階段添加外源添加物；外源添加物為莽草酸、異亮氨酸或大豆油中的一種或幾種。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述外源添加物莽草酸初始濃度為0.5-3. Og/ L，異亮氨酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中的初始濃度為0. 5-3. Og/L，大豆油在發(fā)酵培養(yǎng)基中的初始濃度為 l_5g/L。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述吸水鏈霉菌是在室溫下取吸水鏈霉菌子囊亞種(ATCC14891)成熟斜面孢子用無菌水制成孢子懸液；0. 2mL孢子懸液接種到裝有40mL 種子培養(yǎng)基的250mL的搖瓶中，26°C _30°C、180_220rpm搖床中培養(yǎng)48h。
4.使用到權(quán)利要求1的種子液，其特征是種子液培養(yǎng)基組成及含量為淀粉8-12g/L、 葡萄糖25-35g/L、蛋白胨5-7g/L、酵母粉5_7g/L、碳酸鈣l_3g/L，初始pH7. 0。
5.使用到權(quán)利要求1的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)基組成及含量為淀粉15-25g/ L、糊精35-45g/L、麩質(zhì)粉2-3g/L、蛋白胨4_6g/L、酵母粉8_12g/L、玉米漿4_6g/L、冷榨豆餅粉4-6g/L、磷酸氫二鉀0. 5-1. 5g/L、硫酸銨0. 5-1. 5g/L、硫酸鎂0. 5-1. 5g/L、碳酸鈣 0. 5-1.5g/L，初始 pH7. 0。
全文摘要
本發(fā)明公開了外源添加物促進微生物合成子囊霉素的方法及培養(yǎng)基制備，屬于子囊霉素的生物合成技術(shù)領(lǐng)域。其特征在于它利用子囊霉素生物合成過程是各種前體組裝的特性，在有氧發(fā)酵之初或有氧發(fā)酵過程中(菌體生長階段)向培養(yǎng)基中添加0.5-3.0g/L的莽草酸、0.5-3.0g/L的異亮氨酸、1-5g/L的大豆油，增強菌體中子囊霉素合成前體物DHCHC、丙二酸單酰、甲基丙二酸單酰的積累，促進子囊霉素合成途徑代謝，從而提高子囊霉素產(chǎn)量。本發(fā)明操作簡單，不增加額外的設備和人工，僅通過較低的附加投入，成本低廉，本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)吸水鏈霉菌子囊亞種，子囊霉素的發(fā)酵單位比對照提高了55.9-114.7％。
文檔編號C12P17/18GK102250982SQ20111016572
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月20日
發(fā)明者聞建平, 齊海山 申請人:天津大學