專利名稱：一種改造氧化葡萄糖酸桿菌產(chǎn)維生素c前體2-酮基-l-古龍酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)2-KLG的氧化葡萄糖酸桿菌工程菌及其構(gòu)建方法，采用分子手段引入SDH、SNDH,從而實(shí)現(xiàn)代謝山梨醇生產(chǎn)2-KLG，屬于遺傳工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
維生素C (Vitamin C，VC)，又稱為抗壞血酸(Ascorbic acid)，是一種人體必需的維生素和抗氧化劑，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料和化妝品等工業(yè)。目前國(guó)內(nèi)維生素C工業(yè)化生產(chǎn)采用二步發(fā)酵法，在第二步混合菌發(fā)酵體系中，執(zhí)行糖酸轉(zhuǎn)化的微生物只有小菌，小菌單獨(dú)生長(zhǎng)很困難，需要與大菌共同培養(yǎng)才能正常生長(zhǎng)。兩種菌的發(fā)酵控制為生產(chǎn)工藝增加了很大困難，且小菌產(chǎn)酸性狀不穩(wěn)定，因而導(dǎo)致生產(chǎn)不穩(wěn)定，經(jīng)常因菌種退化造成倒罐， 導(dǎo)致生產(chǎn)上屢屢遭受重大損失。我國(guó)維生素C發(fā)酵技術(shù)從山梨醇到2-KLG的發(fā)酵過程由3 種細(xì)菌參與，勢(shì)必在微生物代謝過程中造成底物和培養(yǎng)基的大量浪費(fèi)，發(fā)酵過程分為兩步不但延長(zhǎng)了生產(chǎn)周期還造成能源和人力的大量浪費(fèi)。因此，現(xiàn)有維生素C兩步發(fā)酵工藝尚存在巨大技術(shù)進(jìn)步的潛力。如何簡(jiǎn)化發(fā)酵工藝是一個(gè)迫切需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高產(chǎn)2-KLG的G. oxydans工程菌。所述工程菌可表達(dá)sdh、sndh基因。所述sdh、sndh基因核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。所述sdh、sndh基因克隆于G. oxydans-E. coli穿梭質(zhì)粒載體pGUCl上。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種高產(chǎn)2-KLG的G. oxydans基因工程菌的構(gòu)建方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的具體方案為1)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室對(duì)K. vulgare DSM 4205的全基因組測(cè)序結(jié)果中注釋的sdh、sndh 基因序列設(shè)計(jì)引物克隆sdh、sndh基因；2)將sdh、sndh基因與載體連接得到重組表達(dá)載體；3)將得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化氧化葡萄糖酸桿菌(GluconcAacter oxydans,ATCC 621H)后得到重組菌株。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)2-KLG的方法，工程菌種子培養(yǎng)后，按15 %比例接種5L發(fā)酵罐，發(fā)酵1 后，流加量碳源2. 5g/L. h，發(fā)酵參數(shù)轉(zhuǎn)速 500rpm, pH 5. 1 5. 4，通氣量 1. 5vvm,控制罐溫 34°C，罐壓 0. 05MPa。種子和斜面培養(yǎng)基(g/L)山梨醇15，酵母膏0.6，碳酸鈣0.4，pH 4. 8 5. 1，瓊脂 20(斜面培養(yǎng)基)，pH 7.0，121°C滅菌15min，氨芐青霉素終濃度lOOyg/mL。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)山梨醇25，酵母膏0.2，碳酸鈣0.2，初始pH 5. 1 5. 4，121°C 滅菌15min，氨芐青霉素終濃度100μ g/mL。
山梨醇、2-KLG含量測(cè)定液相色譜(LC)發(fā)酵樣品用流動(dòng)相十倍稀釋，0.45 μ m濾膜過濾。Agilent llOOsystem，RioRad公司Aminex HPX-87H色譜柱；流動(dòng)相2. 75 μ mol/L濃硫酸；柱溫35°C;流速0. 6mL/min ；進(jìn)樣量5 μ L ；檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器。本發(fā)明通過基因工程改造，將來源于普通生酮基古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare)的sdh、sndh基因表達(dá)于氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)中，獲得了一株利用山梨醇生產(chǎn)2-KLG的G. oxydans工程菌。采用G. oxydans工程菌利用山梨醇一步發(fā)酵生產(chǎn)2-KLG，解除了小菌對(duì)伴生菌依賴的問題，簡(jiǎn)化了維生素C生產(chǎn)工藝。2-KLG的產(chǎn)量可達(dá)83g/L，具有很好的應(yīng)用前景。本發(fā)明提供的構(gòu)建方法簡(jiǎn)單，適于標(biāo)準(zhǔn)化。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物Pl :5，GGAATTCCATATGATGAAACCGACTTCGCTGCTTTGGGC3，；P2 :5，CGCGGAT CCTTATTGCGGCAGGGCGAAGACGTAGA3，，克隆 K. vulgare DSM4205 的 sdh 基因序列擴(kuò)增后克隆到G. oxydans-E. coli穿梭質(zhì)粒載體ρ⑶Cl上，構(gòu)建表達(dá)載體ρ⑶Cl_sdh，將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109后，挑選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并經(jīng)NdeI及BamHI酶切后，出現(xiàn)1740bp 的條帶，證明已經(jīng)成功構(gòu)建表達(dá)載體ρ⑶Cl-sdh。設(shè)計(jì)引物P3 :5，CGCGGATCCATGTTACCCAAA TCATTGAAACATAAGA3，；P4 :5，CGAGCTCTCAGCGGG TGGCAGCGG3，，再將本實(shí)驗(yàn)室對(duì) K. vulgare DSM4205的全基因組測(cè)序結(jié)果中注釋的sndh基因序列擴(kuò)增后克隆到穿梭質(zhì)粒載體pGUCl 上，構(gòu)建表達(dá)載體ρ⑶Cl-sdh-sndh，將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109后，挑選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并經(jīng)BamHI及McI酶切后，出現(xiàn)1830bp的條帶，證明已經(jīng)成功構(gòu)建表達(dá)載體 pGUCl-sdh-sldh。實(shí)施例2G. oxydans工程菌的構(gòu)建將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E. coli JM109o由于重組質(zhì)粒上帶有氨芐青霉素抗性基因，轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)，涂布到含有氨芐青霉素的LB(酵母膏5g/L，蛋白胨IOg/ L，NaCl 10g/L，固體培養(yǎng)基加20g/L瓊脂，調(diào)節(jié)pH 7. 0，121 °C滅菌15min)，挑取轉(zhuǎn)化后平板上正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，分別出現(xiàn)1740bp、1830bp的條帶，對(duì)照未能PCR出同樣條帶，證明已成功轉(zhuǎn)化到E. coli中，再將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化G. oxydans,得到 G. oxydans-pGUCl-sdh-sndh 工禾呈菌。實(shí)施例3發(fā)酵生產(chǎn)2-KLG種子和斜面培養(yǎng)基(g/L)山梨醇20，酵母膏2，碳酸鈣0. 4，pH 4. 8 5. 1，瓊脂 20(斜面培養(yǎng)基)，pH 7.0，121°C滅菌15min，氨芐青霉素終濃度lOOyg/mL。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)山梨醇80，酵母膏5，碳酸鈣0.2，初始pH 5. 1 5. 4，121°C滅菌15min，氨芐青霉素終濃度ΙΟΟμ g/mL。培養(yǎng)條件從斜面中接種重組菌于20mL的種子培養(yǎng)基中，30°C、200rpm培養(yǎng)3 后接15%于發(fā)酵培養(yǎng)基，于34°C、220rpm進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵周期48h。2-KLG產(chǎn)量為52g/ L0實(shí)施例4發(fā)酵生產(chǎn)2-KLG工程菌種子培養(yǎng)后，按15 %比例接種5L發(fā)酵罐，發(fā)酵1 后流加量碳源2. 5g/L. h，發(fā)酵參數(shù)轉(zhuǎn)速500rpm, pH 5. 1 5. 4，通氣量1. 5vvm,控制罐溫34°C，罐壓0. 05MPa, 發(fā)酵結(jié)束后2-KLG產(chǎn)量達(dá)到83g/L。 雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種高產(chǎn)2-KLG的氧化葡萄糖酸桿菌(GluconcAacter oxydans)基因工程菌，其特征在于表達(dá)外源sdh、sndh基因。
2.權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述sdh基因核苷酸序列如SEQIDN0. 1 所示。
3.權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述sndh基因核苷酸序列如SEQIDNO. 2 所示。
4.權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述sdh、sndh基因克隆于 G. oxydans-E. coli 穿梭質(zhì)粒載體 pGUCl 上。
5.構(gòu)建權(quán)利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于包括如下步驟1)設(shè)計(jì)引物克隆sdh、sndh基因核苷酸序列；2)將sdh、sndh基因克隆到重組表達(dá)載體；3)將得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化氧化葡萄糖酸桿菌(GluconcAacteroxydans)后得到重組菌株。
6.應(yīng)用權(quán)利要求1所述基因工程菌生產(chǎn)2-KLG的方法，其特征在于工程菌種子培養(yǎng)后， 按15 %比例接種5L發(fā)酵罐，發(fā)酵1 后流加量碳源2. 5g/L. h，發(fā)酵參數(shù)轉(zhuǎn)速500rpm，pH 5. 1 5. 4，通氣量1. 5vvm，控制罐溫34°C，罐壓0. 05MPa。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述碳源為山梨醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種改造氧化葡萄糖酸桿菌產(chǎn)維生素C前體2-酮基-L-古龍酸的方法，屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過基因工程技術(shù)，將來源于普通生酮基古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare)的山梨糖脫氫酶(SDH)、山梨酮脫氫酶(SNDH)基因表達(dá)于氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)中，獲得了一株利用山梨醇生產(chǎn)2-KLG的G.oxydans工程菌。G.oxydans是二步發(fā)酵法生產(chǎn)2-KLG中第一步發(fā)酵過程常用菌種，將sdh、sndh基因表達(dá)于G.oxydans中，可以解除小菌對(duì)伴生菌依賴的問題，實(shí)現(xiàn)了從D-山梨醇到2-KLG的直接轉(zhuǎn)化，簡(jiǎn)化了維生素C生產(chǎn)工藝，2-KLG的產(chǎn)量可達(dá)83g/L，具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102250822SQ20111014607
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月1日
發(fā)明者周景文, 堵國(guó)成, 陳堅(jiān), 高麗麗 申請(qǐng)人:江南大學(xué)