專利名稱：一株能提高桉樹葉綠素含量的無機(jī)解磷菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株芽孢桿菌屬菌株及其應(yīng)用，更具體地涉及了一株能提高桉樹葉綠素含量的無機(jī)解磷菌。
背景技術(shù)：
桉樹同松樹、楊樹一起被稱為世界上三大速生樹種，由于其具有廣泛的適應(yīng)性，且經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，同時(shí)兼具有生態(tài)和社會(huì)效益，而受到不少國家的青睞。目前，桉樹已經(jīng)成為我國南方發(fā)展速生豐產(chǎn)林的戰(zhàn)略樹種。但由于桉樹受到連栽導(dǎo)致地力衰退嚴(yán)重的問題的影響，對(duì)桉樹的正常生長(zhǎng)造成了很大影響。磷素是植物營養(yǎng)三大要素之一，是植物體內(nèi)核酸及多種酶、輔酶、ATP等的重要組成成分，同時(shí)又以多種方式參與植物體內(nèi)的各種生理生化過程，對(duì)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝起著重要作用[1]。一般農(nóng)田土壤中磷素含量蘊(yùn)藏豐富，然而據(jù)估計(jì)，我國耕地面積的三分之二缺磷，因?yàn)檫@些磷素大多是不易被植物吸收利用的難溶性有機(jī)態(tài)和無機(jī)態(tài)含磷物質(zhì)。影響土壤中磷的利用率的因素很多，其中微生物對(duì)土壤磷的轉(zhuǎn)化和利用率影響最大。 所以近些年來利用有解磷作用的微生物肥料，以促進(jìn)土壤中植物不能直接吸收利用的有機(jī)態(tài)或無機(jī)態(tài)磷素的分解或溶解，使其在作物根際形成一個(gè)磷素供應(yīng)較充分的微區(qū)，從而提高磷素的利用率，達(dá)到提高植物磷素營養(yǎng)的目的。此類微生物化肥在我國應(yīng)用面積較大，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中表現(xiàn)出一定的效果，應(yīng)用前景看好。解磷微生物是土壤微生物的重要組成部分。解磷微生物或解磷菌( phosphatesoluble microorganisms,PSMs)是指土壤中能將難溶性化合態(tài)磷轉(zhuǎn)化為植物能夠吸收利用的簡(jiǎn)單的可溶性磷的一類特殊的微生物功能類群，主要包括解磷細(xì)菌、解磷真菌和解磷放線菌d]，目前已報(bào)道的大約有二十幾個(gè)屬。三大類解磷微生物解磷的效果存在較大的差異性，真菌數(shù)量少于細(xì)菌，但有些真菌的解磷能力則明顯大于細(xì)菌。又有學(xué)者根據(jù)解磷微生物作用于磷的形態(tài)不同，將其分為解無解磷菌和解有機(jī)磷菌。認(rèn)為能夠?qū)?fù)雜的有機(jī)磷礦化為簡(jiǎn)單的植物可吸收形態(tài)磷的微生物稱之為有機(jī)磷微生物；能夠?qū)⒅参镫y以吸收的無機(jī)磷酸鹽化合物轉(zhuǎn)化為可直接吸收利用形態(tài)磷的微生物，稱之為無機(jī)磷微生物。但是，很多解無機(jī)磷微生物也同時(shí)具有解有機(jī)磷的能力，因此，在實(shí)際上卻很難將它們分得很清楚，有些菌僅具有單一的解磷能力，有些菌同時(shí)具有兩種解磷能力，后者是比較理想的篩選對(duì)象。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株無機(jī)解磷菌，能提高桉樹葉綠素含量。本發(fā)明的無機(jī)解磷菌為芽孢桿菌屬(Macillus ^Aaericm)菌株P(guān)7，所述菌株P(guān)7 的保藏號(hào)為CGMCC No. 4768。本發(fā)明的芽孢桿菌屬、Bacillus sphaericus)菌株P(guān)7，已經(jīng)于2011年4月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4768。本發(fā)明的菌株P(guān)7可應(yīng)用于接種桉樹。所述接種的具體步驟如下
⑴將菌種點(diǎn)接入液體培養(yǎng)基，經(jīng)過4 振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為；所述液體培養(yǎng)基配制為每升液體培養(yǎng)基含有牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，pH 7. 2-7. 4 ；
⑵將菌液滴入血球計(jì)數(shù)板，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，得出菌液濃度； ⑶將菌液用超純水稀釋；
⑷在桉樹根際施入菌株濃度為0. 5X106cfu/ml -2. 5X106cfu/ml的菌液。本發(fā)明的菌株P(guān)7對(duì)提高桉樹植株葉綠素含量效果較強(qiáng)，具有高效的促進(jìn)磷吸收的能力。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的菌株P(guān)7能夠大幅提高桉樹植株的葉綠素含量，從而達(dá)到較大程度提高桉樹干物質(zhì)積累的作用。


圖1為無機(jī)解磷菌周期培養(yǎng)有機(jī)酸總量變化； 圖2為無機(jī)解磷菌周期培養(yǎng)有效磷含量分析。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1 無機(jī)解磷菌菌株P(guān)7的獲得
一、無機(jī)解磷菌菌株P(guān)7的分離篩選過程如下
(1)野外采集桉樹根際土壤。土壤取自福建省永安國有林場(chǎng)，地處永安市城郊，經(jīng)緯度為 E117° 23，18"，N25° 56，27"。(2)無機(jī)解磷菌分離
①根際土壤懸濁液的制備在無菌室中，準(zhǔn)確稱取新鮮土壤樣品5 g，放入裝有95 ml 無菌水的250 ml三角瓶中，置搖床上振蕩20 min，使微生物細(xì)胞分散，靜置20-30 s,即成 ΙΟ—1稀釋液；在按10倍逐步稀釋的方法，連續(xù)稀釋，制成10_4、10_5、10_6、10_7、10_8、10_9等一系列稀釋菌液，用于有關(guān)微生物的測(cè)定M。②采用稀釋平板涂抹法分離解磷菌時(shí)，采用10_4、10_5、10_6稀釋度，用移液器各取 IOOul的稀釋菌液于無機(jī)磷平板中央，并用接菌環(huán)在平板上涂布均勻。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。細(xì)菌培養(yǎng)7d，觀察菌落生長(zhǎng)情況，同時(shí)計(jì)算具有解磷作用的解磷菌的菌株數(shù)。分離無機(jī)解磷菌采用無機(jī)磷培養(yǎng)基。③用接種環(huán)挑取培養(yǎng)基上出現(xiàn)明顯溶磷圈或透明圈的菌落，用連續(xù)劃線的方法劃線純化，無機(jī)解磷菌于觀V培養(yǎng)7 d，得到單株具解磷能力的菌株。同時(shí)測(cè)量無機(jī)解磷菌的菌落直徑和透明圈直徑，計(jì)算透明圈與菌落直徑比，初步斷定菌落解磷效果。將提純的無機(jī)解磷菌株接種到斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)保存置于4°C冰箱備用。(3)無機(jī)解磷菌解無機(jī)磷能力的定量測(cè)定將不加磷的無機(jī)磷液體培養(yǎng)基分裝于 150 ml三角瓶中，每瓶30 ml，精確加入0.250 g Cei3(PO4)2，滅菌后加入Iml已用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基活化M h的待測(cè)菌液，設(shè)3次重復(fù)。置全溫振蕩培養(yǎng)箱160 Pmirr1 培養(yǎng)5d，菌株培養(yǎng)液，10000 rpm離心20 min，上清液采用鉬銻抗比色法測(cè)定其磷含量，同時(shí)用PH計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液的pH值，以加Iml牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基做為參比液。(4)培養(yǎng)液有效磷含量測(cè)定——銷銻抗比色法。取菌株培養(yǎng)液離心后的上清液200 μ 1加入50 ml容量瓶中，加水至15_20ml，加 1滴2，4- 二硝基酚指示劑，用稀堿溶液和稀酸(硫酸)調(diào)節(jié)pH值至溶液呈微黃色。用移液管加5 ml鉬銻抗顯色劑，用水定容，搖勻。30 min后，在分光光度計(jì)上用700 nm波長(zhǎng)比色， 以空白試驗(yàn)溶液為參比液，調(diào)吸收值到零，然后測(cè)定待測(cè)液的吸收值，在工作曲線上查出顯示液的溶磷量，顏色在8 h內(nèi)可保持穩(wěn)定。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[6]牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，瓊脂 18. 0 g/L, pH 7. 2-7. 4。無機(jī)磷培養(yǎng)基(蒙金娜基礎(chǔ)培養(yǎng)基)[6~8]葡萄糖10.0 g/L, (NH4)2SO4 0.5 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 3 g/L, NaCl 0. 3 g/L, KCl 0. 3 g/L, FeSO4 · 7H20 0. 03 g/L, MnSO4 · 4H20 0.03 g/L, Ca3 (PO4)2 5.0 g/L，酵母浸膏 0. 5g/L，瓊脂 18. 0 g/L, pH 7.2-7.4。(5)結(jié)果分析 ①無機(jī)磷菌平板試驗(yàn)
無機(jī)磷平板上篩選出30株具有明顯透明圈的無機(jī)解磷菌。菌株P(guān)7，透明圈與菌落直徑的比為2. 493cm，從平板試驗(yàn)分析具有較強(qiáng)的解磷能力。②無機(jī)磷菌菌體吸收磷含量
進(jìn)一步測(cè)定無機(jī)解磷菌在溶解難溶性磷的過程中被菌體自身吸收利用的磷含量，表明菌株P(guān)7，吸收磷含量為29. 162 μ g/ml，從菌體本身的磷含量分析可知，菌種P7具有較強(qiáng)的吸收磷的能力。③無機(jī)磷菌溶解的有效磷含量
測(cè)定發(fā)現(xiàn)，無機(jī)解磷菌菌株P(guān)7溶解的有效磷含量為367. 169 μ g/ml,而對(duì)照僅 5. 481 μ g/ml，無機(jī)解磷菌菌株P(guān)7的解磷能力是對(duì)照的66. 99倍。菌株P(guān)7具有較強(qiáng)的解磷能力。④無機(jī)磷菌培養(yǎng)液pH值
進(jìn)一步測(cè)定無機(jī)解磷菌菌株P(guān)7的培養(yǎng)液pH值為4.沈，對(duì)照為6. 73。菌株P(guān)7的培養(yǎng)液PH值比對(duì)照下降了 2.47。結(jié)果表明，溶磷量與pH值存在相關(guān)關(guān)系，這與陳陽等M研究結(jié)果相一致，表明菌株P(guān)7具有較強(qiáng)的溶磷能力。(6)其它性能
①菌株P(guān)7對(duì)不同磷源物質(zhì)的溶解活力配制無機(jī)磷液體培養(yǎng)基，同時(shí)分別用磷酸鐵 (12.088 g/L)、磷酸氫鈣(11. 096 g/L)替代原培養(yǎng)基中磷酸鈣作為磷源物質(zhì)，其它成分不變_。按每瓶30mL的裝液量裝入150mL錐形瓶中，121°C滅菌20min。冷卻后用移液槍吸取Iml已用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基活化48h，濃度約調(diào)節(jié)為IO9Cfu /mL的P7的菌液，分別接入上述2種不同磷源物質(zhì)培養(yǎng)基中，設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)對(duì)不同磷源物質(zhì)培養(yǎng)基分別以不接菌的搖瓶作為空白對(duì)照。置于^°C、160 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)5 d。②菌株P(guān)7周期培養(yǎng)有效磷含量分析配制無機(jī)磷液體培養(yǎng)基，分別將滅菌后的液體無機(jī)磷培養(yǎng)基裝入150ml三角瓶中。用移液槍分別移取Iml的P7菌液于三角瓶中，置全溫振蕩培養(yǎng)箱160 r/min培養(yǎng)7d，分別于第ld、2d、3d、5d、7d取出每個(gè)樣的三個(gè)重復(fù)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。取5ml進(jìn)行離心測(cè)培養(yǎng)液中有效磷的含量，采用鉬銻抗比色法測(cè)定其
磷含量。③有機(jī)酸總量的測(cè)定[14]準(zhǔn)確稱取4 g氫氧化鈉并用蒸餾水定容至1000 ml，用精確配制的0. 05 mol/L草酸進(jìn)行標(biāo)定，標(biāo)定氫氧化鈉溶液的濃度為0. 081967mol/L。將上述所得發(fā)酵液稀釋10倍，用移液管精確吸取10 mL到三角瓶中，加入酚酞指示液2滴，用標(biāo)定好的氫氧化鈉滴定液(0.081967mol/L)滴定，滴定至溶液顯粉紅色。根據(jù)所用氫氧化鈉溶液的體積計(jì)算出發(fā)酵液中的總酸含量，總酸含量以草酸計(jì)。每1 ml氫氧化鈉滴定液相當(dāng)于 3. 688525Hig 草酸(C2H2O4)。④結(jié)果分析
a、無機(jī)磷菌株對(duì)磷酸鐵的溶解活力
通過液體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照與菌株P(guān)7對(duì)磷酸鋁的溶解活力存在較大差異。對(duì)照處理為 15.211 vg. ml—1，菌株P(guān)7處理為68. 152 vg. ml—1，是對(duì)照的4. 48倍，菌株P(guān)7具有較強(qiáng)的溶解磷酸鐵能力。b、無機(jī)磷菌株對(duì)磷酸一氫鈣的溶解活力
菌株P(guān)7對(duì)磷酸一氫鈣的溶解能力為317. 403 vg. ml—1，而對(duì)照的磷酸一氫鈣溶解能力僅為28. 947 vg. mr1.因此，菌株P(guān)7溶解磷酸一氫鈣能力是對(duì)照的10. 96倍。對(duì)培養(yǎng)液pH 值進(jìn)行測(cè)定顯示，空白對(duì)照PH值為6. 47，菌株P(guān)7 pH值為5. 18，比對(duì)照下降了 19.9%。表明菌株P(guān)7具有較強(qiáng)的溶解磷酸一氫鈣能力。c、培養(yǎng)液有機(jī)酸含量與時(shí)間關(guān)系
隨著培養(yǎng)時(shí)間的推進(jìn)，培養(yǎng)液中有機(jī)酸含量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)(圖1)。菌株的解磷效果與它的產(chǎn)酸作用息息相關(guān)。有機(jī)酸含量在一定程度上反應(yīng)了培養(yǎng)液的解磷效果。d、周期培養(yǎng)磷含量與時(shí)間的關(guān)系
可以看出隨著時(shí)間的推移，菌液中有效磷的含量基本呈上升趨勢(shì)(圖2)。不同作用時(shí)間內(nèi)不同菌株的解磷能力存在差異性。菌株P(guān)7菌液中有效磷的含量基本呈上升趨勢(shì)，且趨勢(shì)明顯。這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)過程中，菌株發(fā)揮解磷作用，增加了培養(yǎng)液中有效磷的含量。二、菌株P(guān)7鑒定
無機(jī)解磷菌菌株P(guān)7的光學(xué)顯微鏡鑒定將菌種制成載玻片，在顯微鏡下觀察并參考 《伯杰細(xì)菌鑒定》進(jìn)行初步鑒定。[1]供試菌株P(guān)7。[2]芽孢桿菌屬(Bacillus sp.):細(xì)胞呈直桿狀，0. 5 2. 5 μ mX 1. 2 10 μ m，常以成對(duì)或鏈狀排列，具圓端或方端。細(xì)胞染色大多數(shù)在幼齡培養(yǎng)時(shí)呈現(xiàn)革蘭氏陽性，以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)。芽孢橢圓、卵圓、柱狀、圓形，能抗許多不良環(huán)境。每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)一個(gè)芽孢，生孢不被氧所抑制。好氧或兼性厭氧，具有對(duì)熱、PH和鹽各種多樣性的生理特性?；墚愷B(yǎng)菌，具發(fā)酵或呼吸代謝類型。接觸酶陽性。無機(jī)解磷菌菌株分子分類鑒定 ⑴供試菌株Ρ7。⑵培養(yǎng)基
6將菌種點(diǎn)接入液體培養(yǎng)基，經(jīng)過4 振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為。所述液體培養(yǎng)基配制為牛肉膏 3.0 g/L，蛋白胨 5. 0 g/L，氯化鈉 10.0 g/L，pH 7.2-7.4。⑶引物
利用細(xì)菌16S rDNA特異引物F27和R1492進(jìn)行PCR擴(kuò)增[15]，該引物可以擴(kuò)增供試菌株幾乎全部的16S rDNA序列，引物序列如下
Primer 1 (F27) 5 ‘ -AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3 ‘ Primer2(R1492) 5 ‘ -TAG GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3 ‘；
試驗(yàn)方法
①細(xì)菌總DNA的提取
將供試菌株分別用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，大約M-48 h。采用離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(購自上海生工生物工程有限公司)提取總DNA，步驟如下
a.取1.5 ml菌體培養(yǎng)液于一滅菌EP管中，10 000 rpm離心1 min，去上清液，收集菌體。b.向菌體沉淀中加入200 μ 1緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮。c.向管中加入20 μ 1蛋白酶K溶液，混勻。d.加入220 μ 1緩沖液GB，振蕩15 s，70°C放置10 min，溶液變清亮，簡(jiǎn)短離心以
去除管蓋內(nèi)壁的水珠。e.加入220 μ 1無水乙醇，充分振蕩混勻15 s，簡(jiǎn)短離心以管蓋內(nèi)壁的水珠。f.將上一步所得都加入一個(gè)吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000 rpm離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。g.向吸附柱CB3中加入500 μ 1緩沖液GD，12000 rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。h.向吸附柱CB3中加入700 μ 1漂洗液PW，12000 rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附
柱CB3放入收集管中。i.向吸附柱CB3中加入500 μ 1漂洗液PW，12000 rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。j.將吸附柱CB3放入收集管中，12000 rpm離心2 min，倒掉廢液，將吸附柱CB3 置于室溫放置數(shù)8 min,以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。k.將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴100 μ 1 洗脫緩沖液ΤΕ，室溫放置5 min, 12000 rpm離心2 min，將溶液收集到離心管中，一 20°C保
存?zhèn)溆?。②PCR擴(kuò)增
(1) PCR反應(yīng)體系為25μ110XPCR Buffer2.5μ 1dNTP (濃度 2. 5 mmol/L)2.5μ 1Mg2 +3.25μ 1引物 1 (50 μπιο )1..0μ 1引物 2 (50 μπιο )1..0μ 1模板DNA2..0μ 權(quán)利要求
1.一株無機(jī)解磷菌，其特征在于所述無機(jī)解磷菌為芽孢桿菌屬OfeciBm sphaericus)菌株 P7，保藏號(hào)為 CGMCC No. 4768。
2.一種如權(quán)利要求1所述的無機(jī)解磷菌的用途，其特征在于將所述無機(jī)解磷菌接種于桉樹。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無機(jī)解磷菌的用途，其特征在于所述接種的具體步驟如下⑴將菌種點(diǎn)接入液體培養(yǎng)基，經(jīng)過4 振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為；所述液體培養(yǎng)基配制為牛肉膏3. O g/L，蛋白胨5. O g/L，氯化鈉10. O g/L，pH 7. 2-7. 4 ； ⑵將菌液滴入血球計(jì)數(shù)板，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，得出菌液濃度； ⑶將菌液用超純水稀釋；⑷在桉樹根際施入菌株濃度為0. 5X106cfu/ml -2. 5X106cfu/ml的菌液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株無機(jī)解磷菌，所述無機(jī)解磷菌為芽孢桿菌屬(Bacillussphaericus)菌株P(guān)7，保藏號(hào)為CGMCCNo.4768。將所述無機(jī)解磷菌接種于桉樹，能提高桉樹植株葉綠素含量。本發(fā)明的菌株P(guān)7對(duì)提高桉樹植株葉綠素含量效果較強(qiáng)，具有高效的促進(jìn)磷吸收的能力，能夠大幅提高桉樹植株的葉綠素含量，從而達(dá)到較大程度提高桉樹干物質(zhì)積累的作用。
文檔編號(hào)C12R1/07GK102250786SQ20111013206
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月21日
發(fā)明者俞新玲, 吳承禎, 洪偉, 洪滔, 謝安強(qiáng) 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)