專(zhuān)利名稱(chēng)：一種提高l-苯丙氨酸生產(chǎn)強(qiáng)度的酪氨酸流加方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高L-苯丙氨酸生產(chǎn)強(qiáng)度的酪氨酸流加方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
L-苯丙氨酸(L-Phe)是人體必需但自身無(wú)法合成的八種氨基酸之一，也是一種重要的醫(yī)藥和食用化學(xué)品中間體。在醫(yī)藥行業(yè)主要用于生產(chǎn)氨基酸輸液和合成氨基酸類(lèi)藥物；在食品行業(yè)主要用于合成二肽甜味劑阿斯巴甜(Aspartame，簡(jiǎn)稱(chēng)APM)，具有良好的應(yīng)用前景。L-Phe的制備方法主要有提取法、化學(xué)合成法、酶法和發(fā)酵法四種。其中提取法因?yàn)楹康?，很少采用。目前市?chǎng)所需的產(chǎn)品除少量化學(xué)合成外大多都是通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)的，但主要依賴(lài)進(jìn)口。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是適合于大腸桿菌的L-苯丙氨酸的高密度生產(chǎn)方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，提供技術(shù)方案為以L(fǎng)-酪氨酸(L-Tyr)缺陷型的大腸桿菌為出發(fā)菌株，在初始培養(yǎng)基中L-Tyr消耗完后，以25mg/h-100mg/h恒速流加L-Tyr至發(fā)酵結(jié)束。特別地，控制殘?zhí)菨舛葹? 士 3g/L以?xún)?nèi)，在初始培養(yǎng)基中L-Tyr消耗完后，以25mg/ h-100mg/h恒速流加L-Tyr至發(fā)酵結(jié)束。所述L-酪氨酸(L-Tyr)缺陷型大腸桿菌(Escherichia coli) WSH-BR165 (pAP03)， 保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏時(shí)間2010年1月18日，地址中國(guó)武漢，武漢大學(xué)， 分類(lèi)學(xué)命名為大腸桿菌(Escherichia coli)，保藏編號(hào)為CCTCC M 2010013，詳見(jiàn)專(zhuān)利申請(qǐng) 201010135604. 9。培養(yǎng)基成分種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5，pH調(diào)至7. 2 ；接種前加入卡那霉素至40mg/L。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 3，MgSO4 · 7H20 3，NaCl 1， Na-Citrate 1. 5，CaCl2 · 2H20 0. 015，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 1125，維生素 B1-HCl 0. 075，L-Tyr 0. 3，蛋白胨4，酵母粉2，微量元素營(yíng)養(yǎng)液(TES) 1. 5mL/L,卡納霉素0. 04，pH調(diào)至6. 8。TES (g/L) =Al2(SO4)3 · 18H20 2. 0，CoSO4 · 7H20 0. 75，CuSO4 · 5H20 2. 5，H3BO3O. 5， MnSO4 · 7H20 24，Na2MoO4 · 2H20 3. 0，NiSO4 · 6H20 2. 5，and ZnSO4 · 7H20 15。培養(yǎng)方法三角搖瓶中的種子培養(yǎng)方法接種量10%，溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。3L發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)方法初始裝液量為1. 5L，接種量為10%，溶氧水平通過(guò)與攪拌轉(zhuǎn)速自動(dòng)級(jí)聯(lián)控制為40%，通氣量為1. 5vvm，初始溫度為33°C，當(dāng)OD61tl達(dá)到0. 2時(shí)便升溫至38. 5 °C，并開(kāi)始流加L-Tyr至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過(guò)程中初始糖耗至5g/L時(shí)開(kāi)始流加700g/L的葡萄糖溶液，每池取樣測(cè)定殘?zhí)?，控制發(fā)酵過(guò)程中的糖濃度為5士3g/L至發(fā)酵結(jié)束。通過(guò)30% (ν/ν)磷酸及(ν/ν) 氨水將 ρΗ 維持在 6. 8 士 0. 3，流速為 25mg/h，50mg/h，75mg/h andl00mg/h 的 L-Tyr 流加的實(shí)施方法為將0. 9g，1. 8g，2. 7g與3. 6g L-Tyr溶解于72mL的(ν/ν)的氨水中后于升溫誘導(dǎo)后以2mL/h的速度泵入發(fā)酵液中。所述控制發(fā)酵過(guò)程中糖濃度的方法為通過(guò)每池測(cè)定實(shí)際殘?zhí)菨舛?，通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖溶液流加速率控制殘?zhí)菨舛仍?g/L 士 3g/L。殘?zhí)堑臏y(cè)定方法取發(fā)酵上清液，稀釋一百倍后，使用葡萄糖-谷氨酸鹽分析儀 SBA-40C測(cè)定殘?zhí)恰＜?xì)胞干重(DCW)的測(cè)定方法為取一定量的菌懸液置于IOmL容量瓶中，加去離子水定容，搖勻，用722型可見(jiàn)分光光度計(jì)，于eiOnm處比色測(cè)OD值，利用細(xì)胞干重標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)算得細(xì)胞干重，若測(cè)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中的菌體濃度則在定容前加2mL 2N的鹽酸溶解菌懸液中的碳酸鈣。L-苯丙氨酸濃度的測(cè)定方法采用氨基酸常用測(cè)定方法，高效液相色譜(HPLC)柱前衍生化方法進(jìn)行測(cè)定(Rapid, accurate, sensitive, and reproducible HPLC analysis of amino acids. Henderson,J. W,Ricker,R. D. ,Bidlingmeyer,B. A. ,Woodward,C. ,Agilent Technologies, USA,2000)。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于1)減少了有害副產(chǎn)物乙酸的產(chǎn)生，提高了發(fā)酵過(guò)程菌體的代謝活性；2)使與生長(zhǎng)代謝部分偶聯(lián)的L-Phe生產(chǎn)過(guò)程得到加強(qiáng)，提高了 L-Phe對(duì)葡萄糖底物的的率系數(shù)；3)提高了單位體積和時(shí)間內(nèi)L-Phe的產(chǎn)量，減少了發(fā)酵周期，提高了生產(chǎn)強(qiáng)度。
具體實(shí)施例方式對(duì)比例培養(yǎng)基組成詳見(jiàn)發(fā)明內(nèi)容部分。三角搖瓶中的種子培養(yǎng)方法接種量10%，溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。3L發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)方法初始裝液量為1. 5L，接種量為10%，溶氧水平通過(guò)與攪拌轉(zhuǎn)速自動(dòng)級(jí)聯(lián)控制為40%，通氣量為1. 5vvm，初始溫度為33°C，當(dāng)OD61tl達(dá)到0. 2時(shí)便升溫至38. 5°C。以恒定的速度F = 15mL/h向發(fā)酵液中流加700g/L的葡萄糖溶液直至發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)30% (ν/ν)磷酸及(ν/ν)氨水將ρΗ維持在6. 8士0.3。當(dāng)菌體濃度達(dá)到11. 5g/L而升溫誘導(dǎo)時(shí)剛好耗完。此后菌濃基本不再變化，而菌體隨時(shí)間的代謝活性的變化使得其對(duì)底物的需求量隨時(shí)間變化，因此在恒速流加葡萄糖的對(duì)比例中，殘?zhí)菨舛忍幱谟猩仙厔?shì)的變動(dòng)中。在30h后，監(jiān)測(cè)到殘?zhí)菨舛乳_(kāi)始大于10g/L， 發(fā)酵液中開(kāi)始積累有害的副產(chǎn)物乙酸，乙酸濃度積累至5g/L以上。實(shí)施例一3L發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)方法初始裝液量為1. 5L，接種量為10%，溶氧水平通過(guò)與攪拌轉(zhuǎn)速自動(dòng)級(jí)聯(lián)控制為40%，通氣量為1. 5vvm，初始溫度為33°C，當(dāng)OD61tl達(dá)到0. 2時(shí)便升溫至38. 5°C，當(dāng)初始糖耗完至5g/L以?xún)?nèi)時(shí)開(kāi)始流加700g/L的葡萄糖溶液，每池取樣測(cè)定殘?zhí)?，控制發(fā)酵過(guò)程中的糖濃度為5士3g/L至發(fā)酵結(jié)束，通過(guò)30% (ν/ν)磷酸及 (ν/ν)氨水將ρΗ維持在6. 8 士 0. 3。與對(duì)照相似，當(dāng)初始L-Tyr消耗完后，菌體濃度基本不變，保持在最大菌濃11. 5g/ L左右。誘導(dǎo)后底物葡萄糖一直被維持在適合L-Phe生產(chǎn)的濃度，在發(fā)酵過(guò)程中乙酸濃度始終維持在3g/L以下，沒(méi)有有害副產(chǎn)物的積累所帶來(lái)的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)施例二3L發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)方法初始裝液量為1. 5L，接種量為10%，溶氧水平通過(guò)與攪拌轉(zhuǎn)速自動(dòng)級(jí)聯(lián)控制為40%，通氣量為1. 5vvm，初始溫度為33°C，當(dāng)OD61tl達(dá)到0. 2時(shí)便升溫至38. 5°C，當(dāng)初始糖耗完至5g/L以?xún)?nèi)時(shí)開(kāi)始流加700g/L的葡萄糖溶液，每池取樣測(cè)定殘?zhí)牵刂瓢l(fā)酵過(guò)程中的糖濃度為5士3g/L至發(fā)酵結(jié)束，通過(guò)30% (ν/ν)磷酸及 (ν/ν)氨水將ρΗ維持在6. 8 士 0. 3。將0. 9g L-Tyr溶解于72mL的(ν/ν)的氨水中后于升溫誘導(dǎo)后以2mL/h的速度泵入發(fā)酵液中，即以25mg/h恒速流加L-Tyr。經(jīng)檢測(cè)升溫誘導(dǎo)后發(fā)酵液中L-Tyr已經(jīng)消耗完，由于其線(xiàn)性的流加方式，菌體生長(zhǎng)的比生長(zhǎng)速率在不停的減小，結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)施例三3L發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)方法初始裝液量為1. 5L，接種量為10%，溶氧水平通過(guò)與攪拌轉(zhuǎn)速自動(dòng)級(jí)聯(lián)控制為40%，通氣量為1. 5vvm，初始溫度為33°C，當(dāng)OD61tl達(dá)到0. 2時(shí)便升溫至38. 5°C，當(dāng)初始糖耗完至5g/L以?xún)?nèi)時(shí)開(kāi)始流加700g/L的葡萄糖溶液，每池取樣測(cè)定殘?zhí)?，控制發(fā)酵過(guò)程中的糖濃度為5士3g/L至發(fā)酵結(jié)束，通過(guò)30% (ν/ν)磷酸及 (ν/ν)氨水將ρΗ維持在6. 8 士 0. 3。將1. 8g L-Tyr溶解于72mL的(ν/ν)的氨水中后于升溫誘導(dǎo)后以2mL/h的速度泵入發(fā)酵液中，即以50mg/h恒速流加L-Tyr。菌體的平均比生長(zhǎng)速率較大，得到了較高的最大菌體量，詳見(jiàn)表1。實(shí)施例四3L發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)方法初始裝液量為1. 5L，接種量為10%，溶氧水平通過(guò)與攪拌轉(zhuǎn)速自動(dòng)級(jí)聯(lián)控制為40%，通氣量為1. 5vvm，初始溫度為33°C，當(dāng)OD61tl達(dá)到0. 2時(shí)便升溫至38. 5°C，當(dāng)初始糖耗完至5g/L以?xún)?nèi)時(shí)開(kāi)始流加700g/L的葡萄糖溶液，每池取樣測(cè)定殘?zhí)?，控制發(fā)酵過(guò)程中的糖濃度為5士3g/L至發(fā)酵結(jié)束，通過(guò)30% (ν/ν)磷酸及 (ν/ν)氨水將ρΗ維持在6. 8 士 0. 3。將2. 7g L-Tyr溶解于72mL的(ν/ν)的氨水中后于升溫誘導(dǎo)后以2mL/h的速度泵入發(fā)酵液中，即以75mg/h恒速流加L-Tyr。菌體的平均比生長(zhǎng)速率較大，得到了較高的最大菌體量，詳見(jiàn)表1。實(shí)施例五3L發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)方法初始裝液量為1. 5L，接種量為10%，溶氧水平通過(guò)與攪拌轉(zhuǎn)速自動(dòng)級(jí)聯(lián)控制為40%，通氣量為1. 5vvm，初始溫度為33°C，當(dāng)OD61tl達(dá)到0. 2時(shí)便升溫至38. 5°C，當(dāng)初始糖耗完至5g/L以?xún)?nèi)時(shí)開(kāi)始流加700g/L的葡萄糖溶液，每池取樣測(cè)定殘?zhí)?，控制發(fā)酵過(guò)程中的糖濃度為5士3g/L至發(fā)酵結(jié)束，通過(guò)30% (ν/ν)磷酸及(ν/ν)氨水將ρΗ維持在6. 8 士 0. 3。將3. 6g L-Tyr溶解于72mL的(ν/ν)的氨水中后于升溫誘導(dǎo)后以2mL/h的速度泵入發(fā)酵液中，即以100mg/h恒速流加L-Tyr。結(jié)果詳見(jiàn)表1。表1發(fā)酵結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)L-苯丙氨酸的方法，以L(fǎng)-酪氨酸缺陷型的大腸桿菌為出發(fā)菌株，其特征在于，在初始培養(yǎng)基中L-酪氨酸消耗完后，以25mg/h-100mg/h恒速流加L-酪氨酸至發(fā)酵結(jié)束。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，初始培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛认陆档?g/L時(shí)，通過(guò)流加葡萄糖的方式，控制發(fā)酵過(guò)程中控制殘?zhí)菨舛仍?士3g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述大腸桿菌保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M 2010013。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖溶液濃度為700g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以L(fǎng)-酪氨酸缺陷型的大腸桿菌CCTCCM 2010013為出發(fā)菌株，在初始培養(yǎng)基中L-酪氨酸消耗完后，以25mg/h-100mg/h恒速流加 L-酪氨酸至發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵過(guò)程中初始糖耗至5g/L時(shí)開(kāi)始流加700g/L的葡萄糖溶液，每池取樣測(cè)定殘?zhí)?，控制發(fā)酵過(guò)程中的糖濃度為5士3g/L至發(fā)酵結(jié)束，通過(guò)30% (ν/ν)磷酸 & 28% (ν/ν)氨水將 ρΗ 維持在 6. 8士0. 3。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以L(fǎng)-酪氨酸缺陷型的大腸桿菌CCTCCM 2010013為出發(fā)菌株，在初始培養(yǎng)基中L-酪氨酸消耗完后，以75mg/h恒速流加L-酪氨酸至發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵過(guò)程中初始糖耗至5g/L時(shí)開(kāi)始流加700g/L的葡萄糖溶液，每池取樣測(cè)定殘?zhí)牵刂瓢l(fā)酵過(guò)程中的糖濃度為5士3g/L至發(fā)酵結(jié)束，通過(guò)30% (ν/ν)磷酸及(ν/ν) 氨水將ρΗ維持在6. 8 士 0. 3。
全文摘要
一種提高L-苯丙氨酸生產(chǎn)強(qiáng)度的酪氨酸流加方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以L(fǎng)-酪氨酸(L-Tyr)缺陷型的大腸桿菌為出發(fā)菌株，在初始培養(yǎng)基中L-Tyr消耗完后，以25mg/h-100mg/h恒速流加L-Tyr至發(fā)酵結(jié)束。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于減少了有害副產(chǎn)物乙酸的產(chǎn)生，提高了發(fā)酵過(guò)程菌體的代謝活性；使與生長(zhǎng)代謝部分偶聯(lián)的L-Phe生產(chǎn)過(guò)程得到加強(qiáng)，提高了L-Phe對(duì)葡萄糖底物的的率系數(shù)；提高了單位體積和時(shí)間內(nèi)L-Phe的產(chǎn)量，減少了發(fā)酵周期，提高了生產(chǎn)強(qiáng)度。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102212569SQ20111009432
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月15日
發(fā)明者何敏, 劉峰, 徐堃 申請(qǐng)人:江蘇漢光生物工程有限公司