專利名稱:抗小兒腹瀉的牛初乳制品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及抗小兒腹瀉的牛初乳制品,特別是抗輪狀病毒的牛初乳制品。
背景技術(shù):
A組輪狀病毒(ARV)主要侵襲嬰幼兒,是致嬰幼兒病毒性腸炎的主要病原體,據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道全世界每年約有100多萬(wàn)兒童死于輪狀病毒腹瀉,是發(fā)展中國(guó)家嬰幼兒腹瀉死亡的首位原因,1999年底至2000年初,在我國(guó)北京、深圳等地方曾大面積爆發(fā)嬰幼兒輪狀病毒性腹瀉。免疫乳是指給哺乳動(dòng)物(主要是牛、山羊等)選擇性地接種一些能夠引起人或動(dòng)物疾病的細(xì)菌、病毒或其他一些外來(lái)抗原(Antigen),刺激機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答以分泌特異性的抗體(Antibody)進(jìn)入乳中,這種含有特異性抗體的乳即為免疫乳。免疫乳的外觀與普通初乳的外觀無(wú)異,但在功能上則發(fā)生了重大變化,對(duì)目標(biāo)抗原(致病微生物或毒素)的中和效價(jià)顯著提高。免疫乳中的抗體(即免疫球蛋白)能夠參與機(jī)體的黏膜免疫反應(yīng),特異性地中和或消除相應(yīng)的抗原(細(xì)菌或病毒),防止病原性腸道感染及相關(guān)疾病的發(fā)生。目前對(duì)A組輪狀病毒(ARV)治療上均不夠理想,目前大多采用支持療法,主動(dòng)免疫效果不理想。近年來(lái),有些學(xué)者曾以抗-ARV雞卵黃免疫球蛋白(簡(jiǎn)稱anti-ARV IgY)灌喂小鼠,小鼠獲得了被動(dòng)免疫保護(hù),但尚未用于人類。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于利用A組輪狀病毒(ARV)處理制成抗原,分別免疫健康妊娠乳牛, 然后用生物技術(shù)處理牛乳,可以獲得抗小兒腹瀉的牛初乳制品。抗小兒腹瀉的牛初乳制品,該技術(shù)方案是通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)的A組輪狀病毒 (ARV)抗原的制備,A組輪狀病毒(ARV)抗原的免疫,免疫乳的收集,免疫乳制成乳制品。其中A組輪狀病毒(ARV)抗原的制備有以下步驟 (1)MA104細(xì)胞的培養(yǎng)
MA104細(xì)胞是一種常用的生物制品,具體見《中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志》1998年 12卷3期記載的“MA104細(xì)胞牛輪狀病毒受體的提純及鑒定”。天津醫(yī)科大學(xué)可以提供 MA104細(xì)胞。從液氮罐中取出一瓶保存的MA104細(xì)胞,37°C速融,在無(wú)菌室接種到培養(yǎng)瓶中,放于37 °C的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);
培養(yǎng)液的配制MEM粉(GIBCO) 9. 0-10. Og溶入850mL五蒸水中;將m L-谷氨酰胺, 0. 15mol丙酮酸鈉,雙抗(10000單位的青霉和12500單位的鏈霉素)母液分別按1%加入 850mL MEM溶液中;定容至IOOOmL,抽濾除菌,分裝,-20°C凍存。上海源葉生物科技有限公司是專業(yè)從事生物化學(xué)及分子生物學(xué)試劑的開發(fā)商,可以提供MEM粉(GIBC0)。(2)輪狀病毒的培養(yǎng)取ImL購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院北京病毒研究所的人-Wa株輪狀病毒毒種加入胰蛋白酶至終濃度為1(^8/!1^,在371條件下作用30min ;將已經(jīng)貼壁生長(zhǎng)的MA-104細(xì)胞培養(yǎng)瓶用 D-Hanks液洗一遍,以除去未貼壁細(xì)胞;加入150 L作用后的病毒于培養(yǎng)瓶中,均勻分布于瓶底,37°C,平放,作用1小時(shí);加入維持液(98mL MEM細(xì)胞培養(yǎng)液+2mL標(biāo)準(zhǔn)小牛血清) IOmL至細(xì)胞病變。D-HankS液是常用洗液,其配方是公知的,也是由商家可以提供的,例如可以由研域(上海)化學(xué)試劑有限公司提供。(3)輪狀病毒全菌抗原制備
抗原與弗氏佐劑等體積混合,乳化,制成油包水疫苗。A組輪狀病毒抗原的免疫具體操作為在頸部肌肉注射或乳房周圍的皮下注射; 第一次免疫用弗氏完全佐劑,以后用弗氏不完全佐劑代替完全佐劑進(jìn)行免疫,抗原15mL與弗氏佐劑或弗氏不完全佐劑IOmL混合,乳化,制成油包水疫苗,共25mL/頭/次;
第一次免疫分娩前12周25mL/頭/第二次免疫分娩前10周25mL/頭/'、次第三次免疫分娩前8周25mL/頭/'、次第四次免疫分娩前7周25mL/頭/'、次第五次免疫分娩前6周25mL/頭/'、次第六次免疫分娩前5周25mL/頭/ζ次
其中免疫乳的收集時(shí)間為在母牛分娩后的72小時(shí)以內(nèi),每隔8小時(shí)收集一次初乳,以后每天收集一次,共收集7天,-20°C儲(chǔ)存。其中免疫乳制成牛初乳制品有如下步驟 (1)過(guò)濾和冷卻
將牛初乳直經(jīng)過(guò)濾袋凈化原料初乳,經(jīng)冷排處理進(jìn)入儲(chǔ)奶罐備用,儲(chǔ)奶罐溫度應(yīng)保持在4-5°C,在儲(chǔ)奶罐中初乳存放時(shí)間不可超過(guò)48小時(shí)。(2)標(biāo)準(zhǔn)化
為了保證產(chǎn)品質(zhì)量的相對(duì)穩(wěn)定,有必要調(diào)整不同批次間的免疫球蛋白含量以及效價(jià), 以使在加工前原料初乳中免疫球蛋白的含量大于10mg/mL,使得抗輪狀病毒牛初乳效價(jià)大于 1 :10000。(3)預(yù)熱升溫
采用熱水循環(huán)式板式熱交換器將儲(chǔ)奶罐中的原料初乳的溫度升至45°C。(4)脫脂
采用碟片式離心機(jī)離心脫脂,要求脫脂乳的含脂率控制在0. 以下。(5)預(yù)熱升溫,低溫巴氏滅菌
采用板式熱交換器將脫脂初乳升溫至65°C后,輸入保溫缸,在62°C保持40min,進(jìn)行低溫巴式滅菌。(6)超濾濃縮
采用外壓式中空纖維超率濃縮設(shè)備進(jìn)行循環(huán)式超率濃縮,濃縮時(shí)物料溫度保持在 50-55°C之間,待物料濃度達(dá)到20-23%左右,停止?jié)饪s; (7)低溫噴霧干燥采用尼魯公司的低溫噴霧干燥設(shè)備,最大限度地保持初乳中免疫球蛋白的活性;低溫噴霧干燥過(guò)程的參數(shù)如下進(jìn)風(fēng)溫度160°C ;流化床溫度60°C ;出料溫度62°C ;流化床溫度 600C ;旋風(fēng)分離器出口溫70V ;塔內(nèi)負(fù)壓0. 5mmH20 ;旋風(fēng)分離器壓差50mmH20 ;流化床壓差 45mmH20o(8)獲得牛初乳制品
最后將經(jīng)過(guò)低溫噴霧干燥的牛初乳根據(jù)生產(chǎn)需要制成各種牛初乳制品。本發(fā)明涉及的弗氏完全佐劑為12g羊毛脂與20mL液體石蠟油混合,每克佐劑含 Img經(jīng)過(guò)100°C,30min滅活的卡介苗,弗氏不完全佐劑不含卡介苗,其余與弗氏完全佐劑相同。本發(fā)明提供的抗小兒腹瀉的牛初乳制品是由經(jīng)過(guò)輪狀病毒免疫的母牛所產(chǎn)的牛初乳制得的,具有很強(qiáng)的特異性,對(duì)防治小兒腹瀉有很好的效果,且還有副作用小,不易產(chǎn)生耐藥株等優(yōu)點(diǎn),制備方法也較簡(jiǎn)便,易于產(chǎn)業(yè)化。具體實(shí)施例
實(shí)施例1 抗小兒腹瀉的牛初乳是通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)的A組輪狀病毒(ARV)抗原的制備,A組輪狀病毒(ARV)抗原的免疫,免疫乳的收集。其中A組輪狀病毒(ARV)抗原的制備有以下步驟 (1)MA104細(xì)胞的培養(yǎng)
從液氮罐中取出一瓶保存的MA104細(xì)胞,37°C速融,在無(wú)菌室接種到培養(yǎng)瓶中,放于 37 °C的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);
培養(yǎng)液的配制MEM粉(GIBC0)9. 5g溶入850mL五蒸水中;將2% L-谷氨酰胺,0. 15mol 丙酮酸鈉,雙抗(10000單位的青霉和12500單位的鏈霉素)母液分別按1%加入850mL MEM 溶液中;定容至IOOOmL,抽濾除菌,分裝,-20°C凍存。(2)輪狀病毒的培養(yǎng)
取ImL人-Wa株輪狀病毒毒種加入胰蛋白酶至終濃度為10 μ g/mL,在37°C條件下作用 30min ;將已經(jīng)貼壁生長(zhǎng)的MA-104細(xì)胞培養(yǎng)瓶用D-Hanks液洗一遍,以除去未貼壁細(xì)胞;加入150 L作用后的病毒于培養(yǎng)瓶中,均勻分布于瓶底,370C,平放,作用1小時(shí);加入維持液(98mL MEM細(xì)胞培養(yǎng)液+2mL標(biāo)準(zhǔn)小牛血清)IOmL至細(xì)胞病變。( 3)輪狀病毒全菌抗原制備
抗原與弗氏佐劑等體積混合,乳化,制成油包水疫苗。A組輪狀病毒抗原的免疫具體操作為在頸部肌肉注射或乳房周圍的皮下注射; 第一次免疫用弗氏完全佐劑,以后用弗氏不完全佐劑代替完全佐劑進(jìn)行免疫,抗原15mL與弗氏佐劑或弗氏不完全佐劑IOmL混合,乳化,制成油包水疫苗,共25mL/頭/次;
第一次免疫分娩前12周25mL/頭//次第二次免疫分娩前10周25mL/頭//次第三次免疫分娩前8周25mL/頭//次第四次免疫分娩前7周25mL/頭//次第五次免疫分娩前6周25mL/頭/次第六次免疫分娩前5周25mL/頭/次
其中免疫乳的收集時(shí)間為在母牛分娩后的72小時(shí)以內(nèi),每隔8小時(shí)收集一次初乳,以后每天收集一次,共收集7天,-20°C儲(chǔ)存。實(shí)施例2 抗小兒腹瀉的牛初乳是通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)的A組輪狀病毒(ARV)抗原的制備,A組輪狀病毒(ARV)抗原的免疫,免疫乳的收集。其中A組輪狀病毒(ARV)抗原的制備有以下步驟
(1)MA104細(xì)胞的培養(yǎng)
從液氮罐中取出一瓶保存的MA104細(xì)胞,37°C速融,在無(wú)菌室接種到培養(yǎng)瓶中,放于 37 °C的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);
培養(yǎng)液的配制MEM粉(GIBC0)9. Og溶入850mL五蒸水中;將2% L-谷氨酰胺,0. 15mol 丙酮酸鈉,雙抗(10000單位的青霉和12500單位的鏈霉素)母液分別按1%加入850mL MEM 溶液中;定容至IOOOmL,抽濾除菌,分裝,-20°C凍存。其中A組輪狀病毒(ARV)抗原的免疫具體操作為在頸部肌肉注射;第一次免疫用弗氏完全佐劑,以后用弗氏不完全佐劑代替完全佐劑進(jìn)行免疫,抗原IOmL與弗氏佐劑或弗氏不完全佐劑IOmL混合,乳化,制成油包水疫苗,共20mL/頭/次。其余同實(shí)施例1。實(shí)施例3 抗小兒腹瀉的牛初乳是通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)的A組輪狀病毒(ARV)抗原的制備,A組輪狀病毒(ARV)抗原的免疫,免疫乳的收集。其中A組輪狀病毒(ARV)抗原的制備有以下步驟
(2)MA104細(xì)胞的培養(yǎng)
從液氮罐中取出一瓶保存的MA104細(xì)胞,37°C速融,在無(wú)菌室接種到培養(yǎng)瓶中,放于 37 °C的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);
培養(yǎng)液的配制MEM粉(GIBCO)IO. Og溶入850mL五蒸水中;將2% L-谷氨酰胺,0. 15mol 丙酮酸鈉,雙抗(10000單位的青霉和12500單位的鏈霉素)母液分別按1%加入850mL MEM 溶液中;定容至IOOOmL,抽濾除菌,分裝,-20°C凍存。其中A組輪狀病毒(ARV)抗原的免疫具體操作為在乳房周圍的皮下注射;第一次免疫用弗氏完全佐劑,以后用弗氏不完全佐劑代替完全佐劑進(jìn)行免疫,抗原IOmL與弗氏佐劑或弗氏不完全佐劑IOmL混合,乳化,制成油包水疫苗,共20mL/頭/次。其余同實(shí)施例1。實(shí)施例4 將實(shí)施例1-3中的任何一項(xiàng)所獲得的牛初乳制成牛初乳制品有如下步驟
(1)過(guò)濾和冷卻
將牛初乳直經(jīng)過(guò)濾袋凈化原料初乳,經(jīng)冷排處理進(jìn)入儲(chǔ)奶罐備用,儲(chǔ)奶罐溫度應(yīng)保持在4-5°C,在儲(chǔ)奶罐中初乳存放時(shí)間不可超過(guò)48小時(shí)。(2)標(biāo)準(zhǔn)化
為了保證產(chǎn)品質(zhì)量的相對(duì)穩(wěn)定,有必要調(diào)整不同批次間的免疫球蛋白含量以及效價(jià), 以使在加工前原料初乳中免疫球蛋白的含量大于10mg/mL,使得抗輪狀病毒牛初乳效價(jià)大于 1 :10000。(3)預(yù)熱升溫
采用熱水循環(huán)式板式熱交換器將儲(chǔ)奶罐中的原料初乳的溫度升至45°C。(4)脫脂
7采用碟片式離心機(jī)離心脫脂,要求脫脂乳的含脂率控制在0. 以下。(5)預(yù)熱升溫,低溫巴氏滅菌
采用板式熱交換器將脫脂初乳升溫至65°C后,輸入保溫缸,在62°C保持40min,進(jìn)行低溫巴式滅菌。(6)超濾濃縮
采用外壓式中空纖維超率濃縮設(shè)備進(jìn)行循環(huán)式超率濃縮,濃縮時(shí)物料溫度保持在 50-55°C之間,待物料濃度達(dá)到20-23%左右,停止?jié)饪s; (7)低溫噴霧干燥
采用尼魯公司的低溫噴霧干燥設(shè)備,最大限度地保持初乳中免疫球蛋白的活性;低溫噴霧干燥過(guò)程的參數(shù)如下進(jìn)風(fēng)溫度160°C ;流化床溫度60°C ;出料溫度62°C ;流化床溫度 600C ;旋風(fēng)分離器出口溫70V ;塔內(nèi)負(fù)壓0. 5mmH20 ;旋風(fēng)分離器壓差50mmH20 ;流化床壓差 45mmH20o(8)獲得牛初乳制品
最后將經(jīng)過(guò)低溫噴霧干燥的牛初乳根據(jù)生產(chǎn)需要制成各種牛初乳制品。實(shí)施例5 以上各實(shí)施中的輪狀病毒是人-Wa株輪狀病毒毒種,是購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院北京病毒研究所。其余同各實(shí)施例1、2、3、4。效果實(shí)驗(yàn)
分別收集分娩后8h, 24h, 36h, 48h, 60h, 72h,以及第4、5、6、7、8天的初乳樣品,采樣序號(hào)依次稱為1-11。實(shí)驗(yàn)組9頭牛平均分成a、b、c3組,分別按實(shí)施例1、2、3獲得牛初乳,對(duì)照組2頭牛。獲得的初乳樣品采用已建立的間接ELISA法測(cè)定其中特異性抗體的效價(jià)。抗輪狀病毒牛初乳效價(jià)的平均值
權(quán)利要求
1.抗小兒腹瀉的牛初乳制品,是通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)的A組輪狀病毒抗原的制備,A組輪狀病毒抗原的免疫,免疫乳的收集,免疫乳制成乳制品。
2.如權(quán)利要求1所述的抗小兒腹瀉的牛初乳制品,其特征為免疫乳制成牛初乳制品有如下步驟(1)過(guò)濾和冷卻;(2)標(biāo)準(zhǔn)化;(3)預(yù)熱升溫;(4)脫脂;(5)預(yù)熱升溫,低溫巴氏滅菌;(6)超濾濃縮;(7)低溫噴霧干燥。
3.如權(quán)利要求1所述的抗小兒腹瀉的牛初乳制品,其特征為A組輪狀病毒抗原的制備有以下步驟MA104細(xì)胞的培養(yǎng)從液氮罐中取出一瓶保存的MA104細(xì)胞,37°C速融,在無(wú)菌室接種到培養(yǎng)瓶中,放于 37 °C的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);培養(yǎng)液的配制MEM粉9.0-10.(^溶入85011^五蒸水中;將洲L-谷氨酰胺,0. 15mol丙酮酸鈉,雙抗母液分別按1%加入850mL MEM溶液中;定容至IOOOmL,抽濾除菌,分裝,_20°C 凍存;(2)輪狀病毒的培養(yǎng)取ImL人-Wa株輪狀病毒毒種加入胰蛋白酶至終濃度為10 μ g/mL,在37°C條件下作用 30min ;將已經(jīng)貼壁生長(zhǎng)的MA-104細(xì)胞培養(yǎng)瓶用D-Hanks液洗一遍,以除去未貼壁細(xì)胞;加入150μ 作用后的病毒于培養(yǎng)瓶中,均勻分布于瓶底,370C,平放,作用1小時(shí);加入維持液IOmL至細(xì)胞病變;(3)輪狀病毒全菌抗原制備抗原與弗氏佐劑等體積混合,乳化,制成油包水疫苗。
4.如權(quán)利要求1所述的抗小兒腹瀉的牛初乳制品,其特征為Α組輪狀病毒抗原的免疫具體操作為在頸部肌肉注射或乳房周圍的皮下注射;第一次免疫用弗氏完全佐劑,以后用弗氏不完全佐劑代替完全佐劑進(jìn)行免疫,抗原15mL與弗氏佐劑或弗氏不完全佐劑IOmL 合,乳化,制成油包水疫苗,共25mL/頭丨/次;第一次免疫分娩前12周25mL/'頭/次第二次免疫分娩前10周25mL/'頭/次第三次免疫分娩前8周25mL/'頭/次第四次免疫分娩前7周25mL/'頭/次第五次免疫分娩前6周25mL/'頭/次第六次免疫分娩前5周25mL/'頭/次。
5.如權(quán)利要求1所述的抗小兒腹瀉的牛初乳制品,在母牛分娩后的72小時(shí)以內(nèi),每隔8 天,-20°C儲(chǔ)存。 時(shí)收集一次初乳,以后每天收集一次,共收集7
6.如權(quán)利要求1所述的抗小兒腹瀉的牛初乳制品,其特征為免疫乳制成牛初乳制品有如下步驟(1)過(guò)濾和冷卻將牛初乳直經(jīng)過(guò)濾袋凈化原料初乳,經(jīng)冷排處理進(jìn)入儲(chǔ)奶罐備用,儲(chǔ)奶罐溫度應(yīng)保持在4-5°C,在儲(chǔ)奶罐中初乳存放時(shí)間不可超過(guò)48小時(shí);(2)標(biāo)準(zhǔn)化為了保證產(chǎn)品質(zhì)量的相對(duì)穩(wěn)定,有必要調(diào)整不同批次間的免疫球蛋白含量以及效價(jià), 以使在加工前原料初乳中免疫球蛋白的含量大于10mg/mL,使得抗輪狀病毒牛初乳效價(jià)大于 1 :10000 ;(3)預(yù)熱升溫采用熱水循環(huán)式板式熱交換器將儲(chǔ)奶罐中的原料初乳的溫度升至45°C ;(4)脫脂采用碟片式離心機(jī)離心脫脂,要求脫脂乳的含脂率控制在0. 以下;(5)預(yù)熱升溫,低溫巴氏滅菌采用板式熱交換器將脫脂初乳升溫至65°C后,輸入保溫缸,在62°C保持40min,進(jìn)行低溫巴式滅菌;(6)超濾濃縮采用外壓式中空纖維超率濃縮設(shè)備進(jìn)行循環(huán)式超率濃縮,濃縮時(shí)物料溫度保持在 50-55°C之間,待物料濃度達(dá)到20-23%左右,停止?jié)饪s;(7)低溫噴霧干燥采用尼魯公司的低溫噴霧干燥設(shè)備,最大限度地保持初乳中免疫球蛋白的活性;低溫噴霧干燥過(guò)程的參數(shù)如下進(jìn)風(fēng)溫度160°C ;流化床溫度60°C ;出料溫度62°C ;流化床溫度 600C ;旋風(fēng)分離器出口溫70V ;塔內(nèi)負(fù)壓0. 5mmH20 ;旋風(fēng)分離器壓差50mmH20 ;流化床壓差 45mmH20 ;(8)獲得牛初乳制品最后將經(jīng)過(guò)低溫噴霧干燥的牛初乳根據(jù)生產(chǎn)需要制成各種牛初乳制品。
7.如權(quán)利要求2所述的抗小兒腹瀉的牛初乳制品,其特征為雙抗為10000單位的青霉和12500單位的鏈霉素組成的;維持液為98mL MEM細(xì)胞培養(yǎng)液和2mL標(biāo)準(zhǔn)小牛血清組成的。
8.如權(quán)利要求3所述的A組輪狀病毒抗原的制備,其特征為其中人-Wa株輪狀病毒毒種是購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院北京病毒研究所。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗小兒腹瀉的牛初乳制品,特別是抗輪狀病毒的牛初乳制品,是通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)的A組輪狀病毒(ARV)抗原的制備,A組輪狀病毒(ARV)抗原的免疫,免疫乳的收集,免疫乳制成乳制品。本發(fā)明制得抗小兒腹瀉的牛初乳制品不僅對(duì)防治小兒腹瀉有很好的效果,而且還有特異性好,副作用小,不易產(chǎn)生耐藥株,制備方法簡(jiǎn)便,易于產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A23C9/20GK102177970SQ20111009366
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月14日
發(fā)明者江小芬 申請(qǐng)人:江西英雄乳業(yè)股份有限公司