專利名稱：一種轉(zhuǎn)化dl-乳酸制備丙酮酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于丙酮酸的制備方法的技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用來自熒光假單胞菌 {Pseudomonas fluorescens)中的乳酸氧化酶(LOD)及過氧化氫酶(CAT)轉(zhuǎn)化DL-乳酸制備丙酮酸的方法。
背景技術(shù)：
丙酮酸(Pyruvate)是一種重要的醫(yī)藥、化工產(chǎn)品，它不僅在生物能量代謝中具有十分重要的作用，而且可作為多種有用化合物的前體。傳統(tǒng)的化學(xué)合成丙酮酸的方法是以酒石酸為原料，通過和硫酸氫鉀高溫下反應(yīng)得到丙酮酸，這個反應(yīng)過程中還需要引入氰化鈉和乙酰鹵化物合成乙酰氰化物，并進(jìn)一步水解乙酰氰化物，這種工藝原料成本較高，產(chǎn)率也較低。發(fā)酵法制取丙酮酸轉(zhuǎn)化率也往往較低，這是因為丙酮酸在糖代謝中處于最活躍的中心節(jié)點(diǎn)，在細(xì)胞中很容易轉(zhuǎn)化為其他化合物，因此很難累積，而且，丙酮酸作為發(fā)酵產(chǎn)物混合物的一種成分，往往是相當(dāng)?shù)蜐舛鹊?，從?fù)雜的發(fā)酵液中分離提取丙酮酸，一般是難以進(jìn)行的，費(fèi)用也較昂貴。酶法生產(chǎn)丙酮酸是近期研究多采用的技術(shù)，乳酸脫氫酶能使乳酸(Lactate)—步生成丙酮酸，該酶催化反應(yīng)如下
Lactate + NAD+ <"“Pyruvate + NADH + H+
該反應(yīng)是可逆反應(yīng)，反應(yīng)平衡傾向于乳酸一邊；輔酶NAD+為小分子化合物，很難固定， 不易再生，而且價格昂貴，這些因素限制了乳酸脫氫酶的應(yīng)用。乳酸氧化酶作為一種黃素蛋白，是以FMN或FAD作為輔因子，其電子轉(zhuǎn)移的形式不同于經(jīng)典的電子傳遞鏈，而是直接以氧作底物，F(xiàn)MN或FAD和酶蛋白結(jié)合非常牢固，整個反應(yīng)過程不需要游離的外源輔酶參與，這就解決了輔酶再生的問題。細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)乳酸氧化酶催化的生化反應(yīng)式為
CH3CH20HC00H (乳酸)+ O2........................................... CH3COCOOH (丙酮酸)+ H2O2
該反應(yīng)生成的過氧化氫繼續(xù)與丙酮酸進(jìn)行無酶催化反應(yīng)生成乙酸和二氧化碳。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對上述存在的缺陷而提供一種利用來自熒光假單胞菌 {Pseudomonas fluorescens)中的乳酸氧化酶(LOD)及過氧化氫酶(CAT)轉(zhuǎn)化DL-乳酸制備丙酮酸的方法。本發(fā)明采用來自熒光假單胞菌iPsmdomorms fluorescens)中的乳酸氧化酶 (LOD)及過氧化氫酶(CAT)轉(zhuǎn)化DL-乳酸制備丙酮酸的方法，利用微生物菌株(ATCC948) — 熒光假單胞菌粗酶液中的乳酸氧化酶(LOD)及過氧化氫酶(CAT)轉(zhuǎn)化DL-乳酸制備丙酮酸。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化DL-乳酸制備丙酮酸的方法，其詳細(xì)步驟為
(1)菌種選擇選用微生物菌株(ATCC948) —熒光假單胞菌iPsendomonasfluorescens)，采用以乳酸為唯一碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，該菌株具有高乳酸氧化酶活力和過氧化氫酶活力；
(2)斜面培養(yǎng)將熒光假單胞菌菌株接種于含有1.5-2. 0%的瓊脂糖并加有1. 0-2. 0% DL-乳酸鈉的固體斜面基本培養(yǎng)基上，25-35°C培養(yǎng)20-30小時；
(3)一級種子培養(yǎng)將步驟( 培養(yǎng)的菌株，無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于50 IOOmL含有1. 0-2.0% DL-乳酸鈉的液體基本培養(yǎng)基(LLM)中，25_35°C條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)20-30小時，制得一級種子；
(4)擴(kuò)大培養(yǎng)以3-5%(體積比)接種量，接一級種子于500 mL含有1.0-2.0% DL-乳酸鈉的LLM中，25-35°C條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)20-30小時，制得二級種子；
(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以3-5%(體積比)接種量，接二級種子于2L含有0. 1-0. 5%葡萄糖、 1. 0-2. 0% DL-乳酸鈉的LLM中，25_35°C條件下，培養(yǎng)6_8小時補(bǔ)料，補(bǔ)料液為15-25%的乳酸鈉溶液，補(bǔ)料速度為0. 2-0. 3 mL/min，培養(yǎng)10-15小時終止發(fā)酵培養(yǎng)，這時乳酸氧化酶酶活達(dá)到最高，期間以毛細(xì)管電泳法(CE)方法檢測丙酮酸生成量；
(6)收集菌體取步驟(4)的發(fā)酵液6000-8000 穿離心10-15分鐘，收集菌體沉淀，并用pH7. 4、33mM的磷酸鉀緩沖液洗滌2 3次；再將菌體溶于pH7. 4、33mM的磷酸鉀緩沖液中，使菌體的濃度達(dá)到每升100 200克濕細(xì)胞；
(7)超聲波裂解細(xì)胞超聲波破碎菌體細(xì)胞5-10分鐘(脈沖5秒，脈沖間隔5秒)，然后離心30-60分鐘(30，000-35, 000 ^)，取上清即得熒光假單胞菌粗酶液，在4°C儲存，備用；
(8)轉(zhuǎn)化實驗將步驟(7)中的熒光假單胞菌粗酶液與DL-乳酸鈉混合，使混合物中DL-乳酸鈉的終濃度達(dá)到5. 54-1，080mM，加入終濃度為0-1. 0 mM的乙二胺四乙酸鈉 (EDTA)，粗酶液蛋白濃度達(dá)到70-300 mg/L, 37-42°C, pH7. 2條件下，150-200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩 5-160小時；每間隔10分鐘-15小時取樣檢測底物消耗量和產(chǎn)物生成量；
(9)樣品鹽析去除酶蛋白取樣樣品中加入飽和度為50-60%的硫酸銨沉淀酶蛋白， 6000-8000 1§ 離心10分鐘，得到上清液即為樣品；
(10)樣品檢測待步驟(9)分離完之后，取1 5μ L樣品進(jìn)樣，利用毛細(xì)管電泳法(CE) 測定底物乳酸和產(chǎn)物丙酮酸的含量，計算出轉(zhuǎn)化率。液體基本培養(yǎng)基(LLM)配方組成為(為重量百分比)磷酸氫二鉀0.05%，氯化鈉 0.05%，硫酸鎂0.05%，硫酸亞鐵0.001%，酵母膏0. 1%，余量為水。乳酸氧化酶(LOD)及過氧化氫酶(CAT)共同催化轉(zhuǎn)化DL-乳酸制備丙酮酸的反應(yīng)式如下
權(quán)利要求
1.一種利用來自熒光假單胞菌ipseudomorms fluorescens, ATCC948)中的乳酸氧化酶(LOD)及過氧化氫酶(CAT)轉(zhuǎn)化DL-乳酸制備丙酮酸的方法，其特征在于利用微生物菌株(ATCC948) —熒光假單胞菌粗酶液中的乳酸氧化酶(LOD)及過氧化氫酶(CAT)轉(zhuǎn)化 DL-乳酸制備丙酮酸。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化DL-乳酸制備丙酮酸的方法，其詳細(xì)操作步驟為(1)菌種選擇選用微生物菌株(ATCC948) —熒光假單胞菌iPsendcmoims fluorescens)，采用以乳酸為唯一碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，該菌株具有高乳酸氧化酶活力和過氧化氫酶活力；(2)斜面培養(yǎng)將熒光假單胞菌菌株接種于含有1.5-2.0%的瓊脂糖并加有 1. 0-2. 0% DL-乳酸鈉的固體斜面基本培養(yǎng)基上，25-35°C培養(yǎng)20-30小時；(3)一級種子培養(yǎng)將步驟( 培養(yǎng)的菌株，無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于50 IOOmL含有1. 0-2. 0% DL-乳酸鈉的液體基本培養(yǎng)基(LLM)中，25_35°C條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)20-30小時，制得一級種子；(4)擴(kuò)大培養(yǎng)以3-5%(體積比)接種量，接一級種子于500 mL含有1.0-2.0% DL-乳酸鈉的LLM中，25-35°C條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)20-30小時，制得二級種子；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以3-5%(體積比)接種量，接二級種子于2L含有0. 1-0. 5%葡萄糖、 1. 0-2. 0% DL-乳酸鈉的LLM中，25-35°C條件下，培養(yǎng)6-8小時補(bǔ)料，補(bǔ)料液為15-25%的乳酸鈉溶液，補(bǔ)料速度為0. 2-0. 3 mL/min，培養(yǎng)10-15小時終止發(fā)酵培養(yǎng)，這時乳酸氧化酶酶活達(dá)到最高，期間以毛細(xì)管電泳法(CE)方法檢測丙酮酸生成量；(6)收集菌體取步驟(4)的發(fā)酵液6000-8000轉(zhuǎn)/分離心10-15分鐘，收集菌體沉淀， 并用pH7. 4、33mM的磷酸鉀緩沖液洗滌2 3次；再將菌體溶于pH7. 4、33mM的磷酸鉀緩沖液中，使菌體的濃度達(dá)到每升100 200克濕細(xì)胞；(7)超聲波裂解細(xì)胞超聲波破碎菌體細(xì)胞5-10分鐘(脈沖5秒，脈沖間隔5秒)，然后離心30-60分鐘(30，000-35, 000轉(zhuǎn)/分)，取上清液即得熒光假單胞菌粗酶液，在4°C儲存，備用；(8)轉(zhuǎn)化實驗將步驟(7)中的熒光假單胞菌粗酶液與DL-乳酸鈉混合，使混合物中DL-乳酸鈉的終濃度達(dá)到5. M-l，080mM，加入終濃度為0-1.0 mM的乙二胺四乙酸鈉 (EDTA)，粗酶液蛋白濃度達(dá)到70-300 mg/L, 37-42°C, pH7. 2條件下，150-200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩 5-160小時；每間隔10分鐘-15小時取樣檢測底物消耗量和產(chǎn)物生成量；(9)樣品鹽析去除酶蛋白取樣樣品中加入飽和度為50-60%的硫酸銨沉淀酶蛋白， 6000-8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，得到上清液即為樣品；(10)樣品檢測待步驟(9)分離完之后，取1 5μ L樣品進(jìn)樣，利用毛細(xì)管電泳法(CE) 測定底物乳酸和產(chǎn)物丙酮酸的含量，計算出轉(zhuǎn)化率。
3.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化DL-乳酸制備丙酮酸的方法，其特征在于液體基本培養(yǎng)基(LLM)組成為按重量計的下述組分磷酸氫二鉀0.05%，氯化鈉0.05%，硫酸鎂0.05%， 硫酸亞鐵0. 001%，酵母膏0. 1%，余量為水。
全文摘要
本發(fā)明屬于丙酮酸的制備方法的技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種采用來自熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)中的乳酸氧化酶(LOD)及過氧化氫酶(CAT)轉(zhuǎn)化DL-乳酸制備丙酮酸的方法。利用微生物菌株(ATCC948)—熒光假單胞菌粗酶液中的乳酸氧化酶(LOD)及過氧化氫酶(CAT)轉(zhuǎn)化DL-乳酸制備丙酮酸，既提高了產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率又保持了產(chǎn)物穩(wěn)定性。
文檔編號C12P7/40GK102199632SQ20111009239
公開日2011年9月28日 申請日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月13日
發(fā)明者谷勁松 申請人:濟(jì)南大學(xué)