專利名稱：重組葡激酶二聚體的制備及聚乙二醇定點(diǎn)修飾的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種重組葡激酶二聚體的制備方法及其N-末端的聚乙二醇定點(diǎn)修飾，能夠延長(zhǎng)葡激酶在體內(nèi)的循環(huán)半衰期和提高葡激酶的生物活性。
背景技術(shù)：
葡激酶(SAK)是一種含136個(gè)氨基酸的單鏈蛋白，相對(duì)分子量為15. 5kDa。作為新一代溶栓藥物，其溶栓效力與第二代溶血栓藥物組織纖溶酶原激活劑(Tissue plasminogenactivator, t-PA)相當(dāng)，但價(jià)格卻遠(yuǎn)低于t_PA及其衍生物。目前，國(guó)內(nèi)外重組葡激酶的研究都已進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)階段。葡激酶作為纖溶酶原(Plasminogen，Plg)的激活因子，能與Plg形成1 1的復(fù)合物，在痕量纖溶酶作用下，纖溶酶原被激活為纖溶酶， 發(fā)揮溶栓效應(yīng)。葡激酶通常通過(guò)在大腸桿菌的細(xì)胞溶質(zhì)中高效表達(dá)來(lái)獲得。但是，由于葡激酶具有抗原性和免疫原性，并且它在體內(nèi)的半衰期很短，導(dǎo)致葡激酶需要多次重復(fù)注射， 并且可能引發(fā)病人的不適應(yīng)反應(yīng)。對(duì)葡激酶進(jìn)行聚乙二醇(PEG)化學(xué)修飾可以有效解決上述缺陷。PEG是一種無(wú)毒、 無(wú)免疫原性的水溶性高分子物質(zhì)，可以通過(guò)化學(xué)反應(yīng)與蛋白質(zhì)和多肽等共價(jià)結(jié)合。PEG修飾可以延長(zhǎng)蛋白質(zhì)藥物在血液中的循環(huán)半衰期，并且降低其免疫原性和抗原性，從而提高蛋白質(zhì)藥物的藥效。另外，PEG修飾可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)藥物抵抗蛋白酶水解的能力，增強(qiáng)蛋白質(zhì)藥物的水溶性并且降低腎臟對(duì)蛋白質(zhì)的排泄作用。Collen等將葡激酶的Ser_3定點(diǎn)突變?yōu)镃ys_3，Cys能與PEG-馬來(lái)酰亞胺 (Mal-PEG)產(chǎn)生特異性反應(yīng)，生成定點(diǎn)修飾的均一產(chǎn)物。葡激酶的Cys突變體SY161分別與分子量為5kDa，IOkDa和20kDa的Mal-PEG反應(yīng)。PEG修飾后的SY161保持了完整的比活性、 纖維蛋白溶解能力以及人體血漿內(nèi)的纖維蛋白選擇性。倉(cāng)鼠、兔子和AMI患者的PEG-SY161 血漿清除量隨著PEG分子量的增大而降低。注射PEG-SY161后，抗體量在3_4周以后才達(dá)到中等水平，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于注射野生型葡激酶。因此，PEG修飾大大的降低了葡激酶的免疫原性和抗原性，并且延長(zhǎng)了它的循環(huán)半衰期。然而，PEG修飾同時(shí)也存在一些問(wèn)題。例如，PEG修飾導(dǎo)致葡激酶的生物活性降低。 由于PEG為鏈狀的大分子，它在屏蔽抗原決定簇的同時(shí)，也會(huì)干擾葡激酶與其受體纖溶酶原的相互作用，導(dǎo)致葡激酶的活性降低。因此，需要嘗試設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)新的PEG修飾方法來(lái)解決上述問(wèn)題，使葡激酶具有更好的藥用價(jià)值。蛋白質(zhì)的二聚體化可以通過(guò)增強(qiáng)蛋白質(zhì)與其受體間的親和力，提高蛋白的生物活性。另外，二聚體化后蛋白質(zhì)的分子量成倍增加，這可以提高它在體內(nèi)的循環(huán)半衰期。為制備定點(diǎn)結(jié)合的蛋白二聚體，通常采用基因工程為輔助手段的化學(xué)聚合方法。因此，為了使葡激酶在血液的循環(huán)半衰期延長(zhǎng)，抗原性和免疫原性降低，并且保持較高生物活性，本發(fā)明將蛋白質(zhì)的二聚體化和PEG修飾兩種方法有效地結(jié)合起來(lái)
發(fā)明內(nèi)容
為了降低葡激酶的抗原性和免疫原性、提高葡激酶在體內(nèi)的循環(huán)半衰期和藥效， 并且降低用藥次數(shù)，本發(fā)明公開(kāi)了一種在C-末端引入半胱氨酸的重組葡激酶。本發(fā)明還公開(kāi)了該重組葡激酶的制備方法。本發(fā)明還公開(kāi)了用同型雙功能連接劑，即兩端含有相同官能團(tuán)的試劑，來(lái)制備重組葡激酶二聚體的方法。本發(fā)明還公開(kāi)了該重組葡激酶二聚體實(shí)現(xiàn)N-末端聚乙二醇定點(diǎn)修飾的制備方法。本發(fā)明的重組葡激酶突變體，與野生型葡激酶相比，在C-末端多了 3個(gè)氨基酸，即甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸(-Gly-Gly-Cys)。由于引入的氨基酸遠(yuǎn)離葡激酶的活性中心， 二聚體化對(duì)葡激酶的活性影響較小。本發(fā)明所述重組葡激酶的制備方法包括如下步驟構(gòu)建重組葡激酶突變基因、突變基因與質(zhì)粒連接構(gòu)建表達(dá)載體、載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌并進(jìn)行高效表達(dá)、重組葡激酶蛋白的分離純化。本發(fā)明采用PCR法構(gòu)建的葡激酶突變基因與PET15質(zhì)粒結(jié)合，在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得了高效表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物主要集中于菌體細(xì)胞超聲破碎離心后的上清液中。用Q Sepharose High Performance陰離子交換層析法獲得了純化的重組葡激酶。本發(fā)明所述重組葡激酶二聚體的制備采用以下方案所述的同型雙功能連接劑為1，4_ 二馬來(lái)酰亞胺丁烷(ld-bismaleimidobutane， BMB)，其特征在于能與半胱氨酸的巰基產(chǎn)生特異性反應(yīng)，生成硫醚鍵，并且在還原性條件下不會(huì)被破壞。所述的葡激酶二聚體化是通過(guò)1，4_ 二馬來(lái)酰亞胺丁烷的2個(gè)馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)與葡激酶C-末端的半胱氨酸形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。葡激酶二聚體的制備條件如下1)1,4- 二馬來(lái)酰亞胺丁烷溶于N，N- 二甲基甲酰胺，濃度為4. OmM ；2)葡激酶濃度為0. 2-0. 3mM，所用緩沖體系為PBS緩沖液，pH 7. 4 ；3)葡激酶與1，4-二馬來(lái)酰亞胺丁烷以1 0.5(摩爾比)在4°C反應(yīng)過(guò)夜。本發(fā)明所述N-末端聚乙二醇(PEG)定點(diǎn)修飾的重組葡激酶二聚體(PEG-dSAK)的制備采用以下方案所述的聚乙二醇為單甲氧基聚乙二醇丙醛，分子量為20kDa，其特征在于能在特定條件下與葡激酶的N-末端通過(guò)共價(jià)鍵連接。葡激酶(SAK) 二聚體化及其PEG 化學(xué)修飾如下所示
權(quán)利要求
1.一種重組葡激酶突變體，其特征在于與野生型葡激酶相比，在C-末端多了 3個(gè)氨基酸，即甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸(-Gly-Gly-Cys)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組葡激酶突變體的制備方法，其特征在于包括如下步驟 構(gòu)建重組葡激酶突變基因；突變基因與質(zhì)粒連接構(gòu)建表達(dá)載體；載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌并進(jìn)行高效表達(dá)；重組葡激酶蛋白的分離純化。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的制備方法，其特征在于所述的表達(dá)載體為PET15質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的制備方法，其特征在于所述的大腸桿菌為E.coli BL21(DE3)。
5.一種重組葡激酶二聚體的制備方法，其特征在于所用重組葡激酶為權(quán)利要求1所述的重組葡激酶突變體，并用同型雙功能連接劑制備葡激酶二聚體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的制備方法，其特征在于所述的同型雙功能連接劑為1，4-二馬來(lái)酰亞胺丁烷。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的制備方法，其特征在于所述的葡激酶二聚體是通過(guò)1，4-二馬來(lái)酰亞胺丁烷的2個(gè)馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)與2個(gè)葡激酶分子C-末端的半胱氨酸形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。
8.—種N-末端聚乙二醇定點(diǎn)修飾的重組葡激酶二聚體的制備方法，其特征在于所述的葡激酶二聚體為權(quán)利要求5所述的重組葡激酶二聚體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的制備方法，其特征在于所述的聚乙二醇為單甲氧基聚乙二醇丙醛，分子量為 2. 0kDa-40. OkDa0
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種C-末端引入半胱氨酸的葡激酶突變體。與野生型葡激酶相比，該突變體在C-末端多了3個(gè)氨基酸，即甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸(-Gly-Gly-Cys)。本發(fā)明還公開(kāi)了該葡激酶突變體二聚體的制備方法。葡激酶的二聚體化是通過(guò)同型雙功能連接劑1，4-二馬來(lái)酰亞胺丁烷的2個(gè)馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)與葡激酶的C-末端的半胱氨酸形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。本發(fā)明還公開(kāi)了該葡激酶突變體二聚體實(shí)現(xiàn)N-末端聚乙二醇定點(diǎn)修飾的制備方法。在特定條件下，甲氧基聚乙二醇丙醛與葡激酶二聚體分子中的1個(gè)N-末端通過(guò)共價(jià)鍵連接。葡激酶二聚體的聚乙二醇修飾產(chǎn)物在生物活性方面要比葡激酶單體的修飾產(chǎn)物要高。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102199585SQ20111009237
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月13日
發(fā)明者劉如艷, 胡濤, 蘇志國(guó), 馬光輝 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所