專利名稱：柑橘黃龍病菌外膜蛋白多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及柑橘黃龍病菌外膜蛋白多克隆抗體及其制備方法，以及該抗體在檢測柑橘黃龍病菌中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
柑橘黃龍病是柑橘生產(chǎn)上防治難、危害重、威脅大的一種毀滅性病害，被人們稱作柑橘上的“艾滋病”，廣泛分布在我國幾乎所有的柑橘產(chǎn)區(qū)。浙江省于上世紀(jì)80年代在溫州南部首次發(fā)現(xiàn)該病害，隨著氣候變暖和柑橘生產(chǎn)的發(fā)展，疫情北擴(kuò)，目前除衢州和杭州尚未有報道外，臺州、溫州等主要柑橘產(chǎn)區(qū)病情嚴(yán)重。作為一種毀滅性病害，柑橘染病植株往往在2 3年內(nèi)喪失結(jié)果能力或死亡，甚至造成毀園。柑橘黃龍病的猖獗危害和蔓延擴(kuò)散，對柑橘產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定和發(fā)展造成了嚴(yán)重的威脅，已經(jīng)成為柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大障礙。目前對柑橘黃龍病尚缺乏有效的防治藥劑和理想的抗性品種，因此綜合防治是當(dāng)前該病害防治的主要方法。其中，嚴(yán)格的植物檢疫是保護(hù)無病區(qū)和新區(qū)柑橘的前提，建立無病毒苗圃、培育和種植無病毒苗木是預(yù)防黃龍病的基礎(chǔ)，及時消滅傳病木虱和徹底挖除病樹是防止病害流行的關(guān)鍵措施。然而，這些工作的開展都必須建立在明確柑橘材料內(nèi)是否存在黃龍病菌的基礎(chǔ)之上。因此，對黃龍病菌快速準(zhǔn)確地檢測和診斷是當(dāng)前該病害有效防控的重要前提?，F(xiàn)有對柑橘黃龍病的檢測和診斷，已經(jīng)發(fā)展了多種方法和技術(shù)，如田間診斷、指示植物鑒定、顯微鏡觀察、血清學(xué)檢測、核酸雜交檢測及PCR檢測等。雖然這些方法促進(jìn)了人們對柑橘黃龍病的深入研究起一定的作用，然而在柑橘實際生產(chǎn)應(yīng)用中卻表現(xiàn)出不同程度的局限性。如在田間診斷過程中，由于病害癥狀復(fù)雜多變，且易與缺素、病毒病害和藥害等癥狀相混淆，因此常導(dǎo)致診斷錯誤；而嫁接成功率不高和穩(wěn)定性差等問題影響了通過指示植物進(jìn)行鑒定的效率，且該方法耗時較長(往往要經(jīng)過幾個月時間才能得知鑒定結(jié)果)；通過顯微鏡、血清學(xué)等方法鑒定則需要特定的儀器設(shè)備和專業(yè)的實驗技能；核酸雜交和各種 PCR技術(shù)雖然可以快速準(zhǔn)確地檢測黃龍病，但與顯微鏡、血清學(xué)等方法一樣，需要昂貴的儀器設(shè)備、試劑材料和熟練的實驗技能。因此，迫切需要開發(fā)一種新技術(shù)或新產(chǎn)品，應(yīng)用于柑橘實際生產(chǎn)中對黃龍病快速、準(zhǔn)確地檢測和診斷。膠體金標(biāo)記免疫層析技術(shù)是一種新型的免疫學(xué)快速檢測和診斷技術(shù)。以此為基礎(chǔ)開發(fā)的膠體金免疫層析試紙條不僅具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、使用方便、檢測快速(通?？稍?0分鐘內(nèi)得到檢測結(jié)果)等特點(diǎn)，而且在使用過程中不需要特定的儀器設(shè)備和復(fù)雜的操作技巧，因此特別適應(yīng)于廣大基礎(chǔ)單位和個人的現(xiàn)場檢測和診斷。膠體金免疫層析試紙條主要工作原理是抗原與抗體的特異性結(jié)合，因此制備高質(zhì)量的抗體是研制理想的檢測產(chǎn)品的關(guān)鍵。通過以往對黃龍病的血清學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，制備的黃龍病菌抗體往往只與相似的抗原發(fā)生結(jié)合，有時甚至只與制備該抗體的抗原結(jié)合。并且目前黃龍病菌仍不能人工培養(yǎng)，所以用于制備抗血清的抗原只能從大量的植物病葉中提取，但該病菌僅局限存在于韌皮部篩管細(xì)胞中，含量較低且分布不均勻，因而所抽提的病菌濃度和純度較低，進(jìn)而導(dǎo)致所制備的抗血清效價較低、特異性較差。這些問題在很大程度上限制了黃龍病菌抗血清及相關(guān)產(chǎn)品或技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用。通過原核細(xì)胞對蛋白進(jìn)行高效表達(dá)是獲取高產(chǎn)量、高純度抗原的有效途徑，革蘭氏陰性細(xì)菌外膜蛋白(outer member protein，0MP)作為細(xì)菌外膜的重要組成部分，具有良好的免疫原性。目前已經(jīng)獲知黃龍病菌外膜蛋白基因序列，且分析發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的表面抗原活性。但通過體外表達(dá)方式大量獲得該蛋白，并以此為免疫原制備抗血清并將其用于柑橘黃龍病菌的檢測并未有見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過對柑橘黃龍病菌外膜蛋白基因進(jìn)行原核表達(dá)，獲得了大量高純度的目的蛋白，并以此為免疫原注射大白兔，制備并純化了抗外膜蛋白的多克隆抗體， 同時提供柑橘黃龍病菌外膜蛋白的多克隆抗體的制備方法，以及該抗體在檢測柑橘黃龍病菌中的應(yīng)用。本發(fā)明柑橘黃龍病菌外膜蛋白多克隆抗體其特征在于由原核表達(dá)獲得的目的蛋白作為免疫原注射大白兔后制備獲得，分別與柑橘黃龍病菌外膜蛋白N端和C端特異性結(jié)合，有效檢測柑橘材料中存在的黃龍病菌。本發(fā)明通過對柑橘黃龍病菌外膜蛋白基因進(jìn)行原核表達(dá)，獲得了大量高純度的目的蛋白，并以此為免疫原注射大白兔，制備并純化了抗外膜蛋白的多克隆抗體。經(jīng)效價測定和酶聯(lián)免疫實驗表明，所制備抗體效價高、特異性好，可用于田間感染柑橘黃龍病菌樣品的檢測。該產(chǎn)品為進(jìn)一步開發(fā)可用于柑橘黃龍病菌現(xiàn)場快速檢測的膠體金免疫層析試紙條奠定了基石出。本發(fā)明柑橘黃龍病菌外膜蛋白多克隆抗體的制備方法，其特征在于1)根據(jù)柑橘黃龍病菌外膜蛋白基因序列，設(shè)計并合成特異性引物0MPN5 5' -AGC GGATCCCAATTGAAGATGATAGTTCGCT-3‘和 0MPN3 5 ‘ -AGCAAGCTTTTACACATAATCGGATACATCAT-3'，以及引物0MPC5 5‘ -AGCGGATCCTATTTTTTAGGGAGTCCTATATC-3‘和0MPC3 5‘ -AGCAAG CTTTTACATGCGATTACCTATACG-3‘；2)利用CTAB法提取柑橘黃龍病菌侵染的柑橘葉片總DNA，然后以此為模板，以引物0MPN5和0MPN3擴(kuò)增柑橘黃龍病菌外膜蛋白N端-OMP-N基因片段，以引物0MPC5和0MPC3 擴(kuò)增柑橘黃龍病菌外膜蛋白C端-OMP-C基因片段；3)回收兩種擴(kuò)增產(chǎn)物，分別將其與克隆載體PMD18-T連接，構(gòu)建獲得含有OMP-N基因片段的重組質(zhì)粒pMD-OMP-N和含有OMP-C基因片段的重組質(zhì)粒pMD_0MP-C，利用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII酶切重組質(zhì)粒pMD-OMP-N、pMD-0MP-C及原核表達(dá)載體pIGH3，回收后利用T4DNA連接酶將目的基因片段與表達(dá)載體連接，構(gòu)建獲得含有OMP-N基因片段的重組質(zhì)粒PIGH3-0MP-N和含有OMP-C基因片段的重組質(zhì)粒pIGH3-0MP_C ；4)分別將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21中，挑取含重組質(zhì)粒ρIGH3-0MP-N和 PIGH3-0MP-C的菌落，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌液0D600為0. 5-0. 6時，加入0. 5mM的 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，4小時后離心收菌，通過SDS-PAGE電泳對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測；5)含重組質(zhì)粒pIGH3-0MP-N和pIGH3-0MP_C菌液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后離心收集菌體沉淀，PBS緩沖液懸浮沉淀，利用超聲波破碎儀破碎菌體細(xì)胞，離心收集包涵體蛋白，用8M的
4尿素變性溶解，過親和層析柱純化后于TGE復(fù)性液中透析復(fù)性，最后收集純化的蛋白OMP-N 禾口 OMP-C ；6)以純化的蛋白作為免疫原注射大白兔制備抗血清，開始以500μ g/500y 1蛋白配合等量弗氏完全佐劑注射，1周后以250μ g/500y 1配合等量弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫， 共5次，最后于兔子耳動脈取血清，進(jìn)行ELISA檢測，然后提取抗血清；7)分別利用原核表達(dá)產(chǎn)物OMP-N和OMP-C制備抗原交聯(lián)柱，抗血清經(jīng)高速離心， 濾紙過濾后，過柱純化，利用IOOmM的Glycine-HCl-pH2. 3洗脫抗體，收集洗脫抗體用Tris 緩沖液平衡至中性后，在PBS溶液中透析2小時，然后在含55%甘油的PBS溶液中透析4_8 個小時，即獲得濃度分別為6. Omg/mL和4. 5mg/mL的多克隆抗體。本發(fā)明提供兩種柑橘黃龍病菌外膜蛋白多克隆抗體的制備方法主要通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得大量高純度的柑橘黃龍病菌外膜蛋白N端和C端肽段，然后以此為免疫原注射大白兔制備抗血清，最后純化抗血清獲得對柑橘黃龍病菌外膜蛋白有特異性作用的多克隆抗體。本發(fā)明柑橘黃龍病菌外膜蛋白多克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于通過間接ELISA法利用該抗體檢測柑橘黃龍病菌，田間采集疑似柑橘黃龍病病害癥狀的樣品材料，及作為陰性對照的健康柑橘葉片和作為陽性的感染柑橘黃龍病菌的柑橘葉片，用液氮和包被緩沖液研磨后包被酶標(biāo)板，然后按照間接ELISA標(biāo)準(zhǔn)操作方法進(jìn)行，即依次于酶標(biāo)孔中加入封閉液、多克隆抗體、酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，最后加入酶作用底物顯色觀察，并于酶標(biāo)儀中讀取光吸收值，根據(jù)待測樣品OD45tl/陰性對照OD45tl的比值判定樣品是否感染黃龍病菌。本發(fā)明提供兩種柑橘黃龍病菌外膜蛋白多克隆抗體的應(yīng)用該抗體可通過間接 ELISA法用于對田間柑橘黃龍病的診斷，可對不同柑橘品種中和不同地區(qū)分離物的柑橘黃龍病菌進(jìn)行特異性檢測。以往對柑橘黃龍病菌抗體的制備通常以提純的柑橘黃龍病菌作為免疫原，因柑橘黃龍病菌不能人工培養(yǎng)，因此先要將感染黃龍病菌的柑橘枝條嫁接到長春花植株上，然后以感病的長春花枝條反復(fù)嫁接，獲得大量感染病菌的長春花葉片，然后再通過超速離心、蔗糖密度梯度離心等方法獲得黃龍病菌作為免疫原。該方法效率低、耗時長，且獲得的免疫原往往數(shù)量較少且純度不高，導(dǎo)致最后制備的抗體效價較低、靈敏度較差等。與之相比，本發(fā)明具有以下有益效果1)縮短了制備周期本方法通過原核表達(dá)方式獲得大量目的蛋白作為免疫原，不需要通過嫁接等手段獲得大量的樣品材料，因此也就避免了嫁接周期長、嫁接存活率低等因素的影響，縮短了免疫原和抗體的制備周期，提高了效率。2)提高了免疫原的產(chǎn)量和純度因柑橘黃龍病菌在植株中的含量較低，即使通過從大量病樣材料中提取黃龍病菌，其最后的產(chǎn)量也往往較低，且植物體本身的一些組分不可能完全被分離掉，導(dǎo)致最后提取物純度不夠高。而本法通過原核表達(dá)系統(tǒng)只針對黃龍病菌外膜蛋白進(jìn)行表達(dá)并分離純化，可獲得大量高純度的免疫原。3)所制備抗體的特異性和靈敏度較高因作為免疫原的柑橘黃龍病菌提取物通常數(shù)量和純度不高，而導(dǎo)致制備的抗體特異性和靈敏度不好。本法以高純度的外膜蛋白作為免疫原制備的抗體，通過ELISA實驗等檢測表明，所制備的抗體能特異性檢測柑橘黃龍病菌，而與缺素(如缺鎂、缺錳、缺鋅)和病毒性病害(如柑橘衰退病、柑橘碎葉病)引起的具有類似于柑橘黃龍病病害癥狀(如斑駁、黃化)的柑橘材料不產(chǎn)生陽性反應(yīng)。另外，還可檢測多個不同地區(qū)柑橘黃龍病菌分離物。


圖1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1 引物0MPN5/0MPN3 的擴(kuò)增條帶，2 引物0MPC5/0MPC3的擴(kuò)增條帶。圖2為重組質(zhì)粒pMD-OMP-N和pMD_0MP_C酶切產(chǎn)物電泳圖。M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)， 1 :pMD-0MP-N的酶切結(jié)果，2 :pMD-0MP-C的酶切結(jié)果。圖3為重組質(zhì)粒pIGH3-0MP-N和pIGH3-0MP_C的酶切產(chǎn)物電泳圖。M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1 :pIGH3-0MP-N的酶切結(jié)果，2 :pIGH3-0MP_C的酶切結(jié)果。圖4為原核表達(dá)載體pIGH3-0MP-N和pIGH3-0MP_C的構(gòu)建示意圖。圖5為誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖。M 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，1 未誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒PIGH3-0MP-N的菌體蛋白，2 誘導(dǎo)的含OMP-N的菌體蛋白，3 未誘導(dǎo)的含含重組質(zhì)粒pIGH3-0MP-C的菌體蛋白，4 誘導(dǎo)的含OMP-C的菌體蛋白，圖6為目的蛋白純化產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖。M 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，1 :目的蛋白 0ΜΡ-Ν, 2 目的蛋白 OMP-C。圖7為抗體對目的蛋白的Western-blot檢測結(jié)果。M 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，1 =IOOpg OMP-N蛋白與抗體Anti-OMP-N結(jié)合的條帶，2 IOpgOMP-N蛋白與抗體Anti-OMP-N結(jié)合的條帶，3:100pg OMP-C 蛋白與抗體 Anti-OMP-C 結(jié)合，4 IOpg 0MP-C 蛋白與抗體 Anti-OMP-C 結(jié)
口 O
具體實施例方式實施例1外膜蛋白基因的擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建1.特異性引物的設(shè)計及合成利用生物信息學(xué)軟件分析柑橘黃龍病菌外膜蛋白基因序列，設(shè)計用于特異性擴(kuò)增基因 N 端的特異性引物0MPN5 5 ‘ -AGCGGATCCCAATTGAAGATGATAGTTCGCT-3 ‘和 0MPN3 5 ‘-AGCAAGCTTTTACACATAATCGGATACATCAT-3 ‘，用于擴(kuò)增基因 C 端的引物 0MPC5 5 ‘ -AGCGG ATCCTATTTTTTAGGGAGTCCTATATC-3‘和0MPC3 5' -AGCAAGCTTTTACATGCGATTACCTATACG-3‘
，設(shè)計好的引物送交公司合成。2.柑橘葉片總DNA的提取田間采集柑橘黃龍病菌感染的柑橘葉片，取葉片中脈稱重約0. 1-0. 2g，于無菌研缽中用液氮研磨至粉末狀，加入適量的PVP和巰基乙醇，用改良的CTAB法抽提DNA，最后提取產(chǎn)物于15 μ L含RNase的TE溶液中溶解，取少量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以檢測DNA的質(zhì)量， 然后于-20°C保存?zhèn)溆谩?.外膜蛋白基因的PCR擴(kuò)增以1 -2 μ L總DNA為模板，分別以上述合成的特異性弓丨物0ΜΡΝ5/0ΜΡΝ3和0MPC5/ 0MPC3進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性Imin，58°C退火Imin，72°C延伸 Imin, 35個循環(huán)，最后72°C保溫lOmin，PCR反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳， 并于凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照。從擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜中可觀察到900bp和861bp左右大小的特異性條帶(見附圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致，即為柑橘黃龍病菌外膜蛋白N端(OMP-N)基因片段和C端(OMP-C)基因片段。4.目的基因的克隆目的基因與克隆載體的連接轉(zhuǎn)化利用凝膠回收試劑盒回收上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物， 取適量與克隆載體PMD18-T及連接液混合，然后放于16°C連接過夜；采用CaCl2法制備大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，采用熱激法將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布 LB培養(yǎng)基平板，并于37°C培養(yǎng)過夜。陽性克隆的篩選鑒定挑取平板上生長的單克隆菌落，于液體LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)。用堿裂解法從培養(yǎng)菌體中抽提質(zhì)粒，然后以質(zhì)粒為模板利用引物0MPN5/0MPN3和 0MPC5/0MPC3進(jìn)行PCR鑒定，同時用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII酶切質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，鑒定插入片段，從酶切產(chǎn)物的電泳圖譜中可觀察到2690bp左右的克隆載體條帶和900bp、861bp左右的目的條帶(見附圖2)，表明已制備獲得含有OMP-N基因片段的重組質(zhì)粒pMD-OMP-N和含有OMP-C基因片段的重組質(zhì)粒pMD_0MP-C。5.目的基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建目的基因與表達(dá)載體的連接轉(zhuǎn)化用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII酶切上述陽性克隆質(zhì)粒pMD-OMP-N、pMD-OMP-C及原核表達(dá)載體pIGH3，利用凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。利用T4DNA連接酶將目的基因和表達(dá)載體的回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，于22°C連接過夜； 采用CaCl2法制備大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，采用熱激法將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布LB培養(yǎng)基平板，并于37°C培養(yǎng)過夜。陽性克隆的篩選鑒定挑取平板上生長的單克隆菌落，于液體LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)。用堿裂解法從培養(yǎng)菌體中抽提質(zhì)粒，然后以質(zhì)粒為模板利用引物0MPN5/0MPN3和 0MPC5/0MPC3進(jìn)行PCR鑒定，同時用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII酶切質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定插入片段，篩選陽性克隆，同時將陽性克隆送交公司測序鑒定。從酶切產(chǎn)物的電泳圖譜中觀察到5900bp左右的表達(dá)載體的條帶和900bp、861bp左右的目的條帶(見附圖3)，且測序結(jié)果顯示插入片段與黃龍病菌外膜蛋白序列一致，表明已成功構(gòu)建含有OMP-N基因片段的原核表達(dá)載體pIGH3-0MP-N和含有OMP-C基因片段的原核表達(dá)載體pIGH3-0MP-C，構(gòu)建流程見附圖4。實施例2外膜蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化1.外膜蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)利用CaCl2法制備大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，將上述重組質(zhì)粒pIGH3-0MP_N和 PIGH3-0MP-C分別轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布LB培養(yǎng)基平板，并于37°C培養(yǎng)至菌落長出。挑取平板上的單克隆菌落，于LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，至對數(shù)生長期(0D600為 0. 5-0. 6)加入0. 5mM的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示在誘導(dǎo)后的菌體蛋白中有大小為58KD和55KD左右的特異條帶出現(xiàn)(見附圖5)，與預(yù)期目的蛋白大小一致。2.表達(dá)產(chǎn)物的分離純化挑取含重組質(zhì)粒pIGH3-0MP-N和pIGH3-0MP_C的菌落，于3mL LB培養(yǎng)基中搖菌過夜，第2天將菌液按1 100的比例加入到300mL LB培養(yǎng)基中，0D600為0. 5-0. 6時，加入 0. 5mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，4小時后離心收菌。用PBS緩沖液懸浮沉淀，利用超聲波破碎儀破
7碎菌體細(xì)胞，離心收集包涵體蛋白，用gM的尿素變性溶解，過親和層析柱純化后于TGE復(fù)性液中透析復(fù)性，最后收集純化的目的蛋白OMP-N和0MP-C，對純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物中的大部分的菌體蛋白已去除掉，獲得了較純的目的蛋白(見附圖6)。實施例3外膜蛋白多克隆抗體的制備及純化1.抗血清的制備及效價測定分別取OMP-N蛋白和OMP-C蛋白500 μ g，用PBS補(bǔ)充到500 μ L，加等量弗氏完全佐齊U，乳化3次后，皮下注射大白兔(免疫前取陰性血清)，2周后用250 μ g/500 μ L蛋白加等量弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫，之后分別在5周和8周后用250ug/500ul蛋白加等量弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫，第10周犧牲大白兔，提取抗血清。于酶標(biāo)板中分別包被OMP-N蛋白和 OMP-C蛋白，將陰性血清按1 1000和1 4000稀釋，陽性抗血清按1 1000，1 4000， 1 16000，1 32000，1 64000，1 128000稀釋，利用間接ELISA法測定抗血清效價。 ELISA檢測結(jié)果表明，所制備的OMP-N抗體和OMP-C抗體效價均大于1 64000。2.抗體的純化及檢測分別利用5mg OMP-N蛋白和5mg OMP-C蛋白制備抗原交聯(lián)柱，抗血清經(jīng)過高速離心，濾紙過濾后，過柱純化。首先用10倍柱體積PBS平衡交聯(lián)柱，血清過柱流穿2次，再用含 IM NaCl的PBS緩沖液清洗柱子，最后用IOOmM的Glycine-HCl (pH2. 3)洗脫抗體，收集洗脫抗體用Tris緩沖液平衡至中性后，在PBS溶液中透析2小時，然后在含55%甘油的PBS溶液中透析4-8個小時，收取獲得濃度分別為6. Omg/mL的OMP-N蛋白的多克隆抗體和4. Omg/ mL的OMP-C蛋白的多克隆抗體，置于_20°C冷凍保存。分別取10pg、100pg蛋白OMP-N和OMP-C，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，進(jìn)行Western-blot實驗，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印到NC膜上，然后經(jīng)過脫脂奶粉封閉、一抗孵育、二抗孵育等步驟后，進(jìn)行曝光顯色。結(jié)果顯示所制備的抗體均能與目的蛋白特異性結(jié)合 (見附圖7)。實施例4多克隆抗體的檢測應(yīng)用通過間接ELISA方法，利用所制備的抗體檢測植物材料中的柑橘黃龍病菌，操作步驟如下1)采集植物葉片材料，取葉片中脈0. 1-0. 2g于研缽中研磨至粉末狀，加入l_2mL 包被緩沖液充分研磨，同時處理健康的柑橘葉片和感染黃龍病的柑橘葉片分別作為陰性對照和陽性對照；2)將研磨液移入離心管中，于離心機(jī)中IOOOOrpm離心l_2min，取上清液加入酶標(biāo)板中(10(^17孔)，371溫育2-311或41孵育過夜；3)甩干酶標(biāo)板，每孔加入300 μ LPBST洗板3次，每次間隔3_5min，每孔加入 200 μ L含有2% BSA的封閉液，37°C溫育l_2h ； 4)甩干酶標(biāo)板，每孔加入300 μ LPBST洗板3次，每次間隔3_5min，每孔加入 100 μ L適當(dāng)稀釋的多克隆抗體，37°C孵育2h ；5)甩干酶標(biāo)板，每孔加入300 μ LPBST洗板3次，每次間隔3_5min，每孔加入 100 μ L辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔抗體，37°C溫育l_2h ；6)甩干酶標(biāo)板，每孔加入300 μ LPBST洗板3次，每次間隔3_5min，每孔加入
8100口1^底物顯色緩沖液11^，371溫育至出現(xiàn)顏色反應(yīng)(一般10-3011^11)，加入5(^1^ 2M的 H2S04終止反應(yīng)，將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中讀值；7)根據(jù)S/N(待測樣品OD450/陰性對照OD45tl)的比值判定樣品是否感染黃龍病菌， 判定標(biāo)準(zhǔn)為S/N彡2. 1，判為陽性；1. 5彡S/N < 2. 1，判為疑似；S/N < 1. 5，判為陰性。1.抗體檢測柑橘黃龍病樣品的靈敏度田間采集櫳柑、本地早、摱桔、甜橙等柑橘品種的葉片，以及通過嫁接感染柑橘黃龍病菌的長春花及健康長春花的葉片，每個品種10個樣本，取其中部分材料用液氮研磨后提取DNA，用特異性引物A2 5 ‘ -TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT-3 ‘和J5 5 ‘ -ACAAAAGCAGAAATAGCACGAACAA-3 ‘進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定待測樣品中是否含有黃龍病菌； 剩余材料用包被緩沖液研磨后包被酶標(biāo)板，利用所制備的抗體進(jìn)行間接ELISA實驗，同時比較PCR方法和ELISA方法對柑橘黃龍病樣品的檢出率。結(jié)果見表1，可以看出該兩種抗體可較好地檢測不同柑橘品種中感染的黃龍病菌，特別對于感染病菌的長春花樣品，其S/N 值可達(dá)3. 0以上，其對柑橘黃龍病菌的檢出率略低于PCR檢測方法。表1間接ELISA法和PCR法對黃龍病菌的檢測效果比較
權(quán)利要求
1.柑橘黃龍病菌外膜蛋白多克隆抗體，其特征在于由原核表達(dá)獲得的目的蛋白作為免疫原注射大白兔后制備獲得，分別與柑橘黃龍病菌外膜蛋白N端和C端特異性結(jié)合，有效檢測柑橘材料中存在的黃龍病菌。
2.柑橘黃龍病菌外膜蛋白多克隆抗體的制備方法，其特征在于1)根據(jù)柑橘黃龍病菌外膜蛋白基因序列，設(shè)計并合成特異性引物0MPN55' -AGCGGAT CCCAATTGAAGATGATAGTTCGCT-3‘和 0MPN3 5' -AGCAAGCTTTTACACATAATCGGATACATCAT-3‘ ，以及引物 0MPC5 5 ‘ -AGCGGATCCTATTTTTTAGGGAGTCCTATATC-3 ‘和 0MPC3 5 ‘ -AGCAAGCTT TTACATGCGATTACCTATACG-3‘；2)利用CTAB法提取柑橘黃龍病菌侵染的柑橘葉片總DNA，然后以此為模板，以引物 0MPN5和0MPN3擴(kuò)增柑橘黃龍病菌外膜蛋白N端-OMP-N基因片段，以引物0MPC5和0MPC3 擴(kuò)增柑橘黃龍病菌外膜蛋白C端-OMP-C基因片段；3)回收兩種擴(kuò)增產(chǎn)物，分別將其與克隆載體PMD18-T連接，構(gòu)建獲得含有OMP-N基因片段的重組質(zhì)粒pMD-OMP-N和含有OMP-C基因片段的重組質(zhì)粒pMD_0MP-C，利用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII酶切重組質(zhì)粒pMD-OMP-N、pMD-OMP-C及原核表達(dá)載體pIGH3，回收后利用T4DNA連接酶將目的基因片段與表達(dá)載體連接，構(gòu)建獲得含有OMP-N基因片段的重組質(zhì)粒pIGH3-0MP-N和含有OMP-C基因片段的重組質(zhì)粒pIGH3-0MP_C ；4)分別將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21中，挑取含重組質(zhì)粒pIGH3-0MP-N和 PIGH3-0MP-C的菌落，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌液0D600為0. 5-0. 6時，加入0. 5mM的 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，4小時后離心收菌，通過SDS-PAGE電泳對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測；5)含重組質(zhì)粒pIGH3-0MP-N和pIGH3-0MP_C菌液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后離心收集菌體沉淀， PBS緩沖液懸浮沉淀，利用超聲波破碎儀破碎菌體細(xì)胞，離心收集包涵體蛋白，用8M的尿素變性溶解，過親和層析柱純化后于TGE復(fù)性液中透析復(fù)性，最后收集純化的蛋白OMP-N和 OMP-C ；6)以純化的蛋白作為免疫原注射大白兔制備抗血清，開始以500μg/500y 1蛋白配合等量弗氏完全佐劑注射，1周后以250μ g/500y 1配合等量弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫，共5 次，最后于兔子耳動脈取血清，進(jìn)行ELISA檢測，然后提取抗血清；7)分別利用原核表達(dá)產(chǎn)物OMP-N和OMP-C制備抗原交聯(lián)柱，抗血清經(jīng)高速離心，濾紙過濾后，過柱純化，利用IOOmM的Glycine-HCl-pH2. 3洗脫抗體，收集洗脫抗體用Tris緩沖液平衡至中性后，在PBS溶液中透析2小時，然后在含55%甘油的PBS溶液中透析4_8個小時，即獲得濃度分別為6. Omg/mL和4. 5mg/mL的多克隆抗體。
3.柑橘黃龍病菌外膜蛋白多克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于通過間接ELISA法利用該抗體檢測柑橘黃龍病菌，田間采集疑似柑橘黃龍病病害癥狀的樣品材料，及作為陰性對照的健康柑橘葉片和作為陽性的感染柑橘黃龍病菌的柑橘葉片，用液氮和包被緩沖液研磨后包被酶標(biāo)板，然后按照間接ELISA標(biāo)準(zhǔn)操作方法進(jìn)行，即依次于酶標(biāo)孔中加入封閉液、多克隆抗體、酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，最后加入酶作用底物顯色觀察，并于酶標(biāo)儀中讀取光吸收值， 根據(jù)待測樣品OD45tl/陰性對照OD45tl的比值判定樣品是否感染黃龍病菌。
全文摘要
柑橘黃龍病菌外膜蛋白多克隆抗體，其特征在于由原核表達(dá)獲得的目的蛋白作為免疫原注射大白兔后制備獲得，分別與柑橘黃龍病菌外膜蛋白N端和C端特異性結(jié)合，有效檢測柑橘材料中存在的黃龍病菌。本發(fā)明通過對柑橘黃龍病菌外膜蛋白基因進(jìn)行原核表達(dá)，獲得了大量高純度的目的蛋白，并以此為免疫原注射大白兔，制備并純化了抗外膜蛋白的多克隆抗體。經(jīng)效價測定和酶聯(lián)免疫實驗表明，所制備抗體效價高、特異性好，可用于田間感染柑橘黃龍病菌樣品的檢測。該產(chǎn)品為進(jìn)一步開發(fā)可用于柑橘黃龍病菌現(xiàn)場快速檢測的膠體金免疫層析試紙條奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/70GK102212134SQ20111009073
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月12日
發(fā)明者張利平, 杜丹超, 胡秀榮, 陳國慶, 鹿連明 申請人:浙江省柑桔研究所