專利名稱：柑橘黃龍病的lamp快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)分子檢測方法，特別涉及一種柑橘黃龍病的LAMP快速檢測方法。
背景技術(shù)：
柑橘黃龍病(Huanglongbing，HLB)是世界柑橘業(yè)最具毀滅性的病害之一，是國內(nèi)外植物檢疫對象。該病害在我國主要由韌皮部桿菌屬細菌的亞洲種(Candidatus Liberibacter asiaticus)引起。特征性病狀是病樹的“黃梢”和葉片的斑駁型黃化；果實小，畸形，嚴重影響柑橘的品質(zhì)與產(chǎn)量。目前由于缺乏有效藥劑和抗病品種，主要采取砍除病樹、防治木虱和種植無病苗木的的防治方法，因此加強柑橘黃龍病的早期診斷顯得尤為重要。由于傳統(tǒng)的指示植物診斷、電鏡檢測和免疫學檢測方法不僅費時費力，而且檢測效率低；近年來，聚合酶鏈式反應(PCR)已應用到柑橘黃龍病的檢測上，但是PCR檢測技術(shù)需要特殊儀器設(shè)備且檢測成本較高，不適合在田間大規(guī)?？焖賾?，因此，在加強柑橘苗木檢疫監(jiān)測中，迫切需要一種成本低廉、簡便、快速、靈敏和特異的柑橘黃龍病快速檢測方法。LAMP是由Notomi于2000年開發(fā)的一種新型的核酸擴增技術(shù)，該技術(shù)利用4種不同的特異性引物識別靶基因的6個特定區(qū)域，借助具有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶，在等溫條件下進行靶序列高效擴增。它避免了常規(guī)PCR溫度循環(huán)的特殊要求，并且因其高效性、 簡易性、成本低廉且檢測周期短等特點，又在另一層面上提高了它的應用價值?，F(xiàn)已運用的領(lǐng)域主要集中在植物病毒和轉(zhuǎn)基因食品的檢驗檢疫工作中，在細菌、真菌、線蟲和昆蟲的檢驗檢疫工作相關(guān)報道相比甚少，因而有較大的開拓空間，LAMP檢測技術(shù)將會在植物檢疫領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有傳統(tǒng)檢測技術(shù)中的不足之處，提供一種靈敏度高、特異性強、不需要電泳及特殊儀器的柑橘黃龍病LAMP快速檢測方法，用于柑橘黃龍病的田間早期診斷。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種柑橘黃龍病的LAMP快速檢測方法，包括用于檢測柑橘黃龍病的LAMP擴增特異性引物組，分別為omp-FIP5' -GCCATGATACGACGCTTAGCA-TTGAGTGAGGGAGATCCAAT-3'omp-BIP5' -CTGAAGTCAATATTTCGCAATTGCC-TTTACGCTCACCCTC AGA-3;omp-F3 5' -ATTCGGCGTGAACTTGAA-3'omp-B3 5' -GCTATACCTACAGAACCAGC-3'。本發(fā)明利用4種不同的特異性引物識別靶基因的6個特定區(qū)域，借助具有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶，在等溫條件下進行靶序列高效擴增，建立了簡便、快速、靈敏度高和特異性強的HLB環(huán)介導等溫擴增(LAMP)檢測方法，便于在田間大規(guī)模快速應用。本發(fā)明的柑橘黃龍病LAMP檢測方法按照如下步驟完成(I)柑橘黃龍病病葉總DNA提取，采用CTAB法提取柑橘黃龍病DNA得到模板DNA 溶液；(2)柑橘黃龍病的LAMP擴增，配置反應體系為25 μ L，所述反應體系中各組分的含量為 5 X Reaction Buffer,8mM MgSO4U. 2mM dNTPs、Bst DNA 聚合酶 8U、I. 6 μ M omp-FIP、 I. 6 μ M omp_BIP、0. 2 μ M omp_F3、0. 2 μ M omp_B3、模板 DNA I. 0 μ L,加 ddH20 補足 25 μ L, 混勻，于63°C水浴鍋中反應70min,之后80°C下滅活5min結(jié)束反應；所述5XReaction Buffer 含 IOOmM Tris-HCl pH 8. 8、50mM KCl、50mM(NH4)2S04、0. 5% Tween 20。(3)反應結(jié)束后，觀察濁度，白色渾濁即為陽性，否則為陰性；或在反應液中加入 SYBR Green I顯色液，出現(xiàn)綠色表明為陽性，橙色則表明為陰性；或瓊脂糖凝膠電泳，獲取電泳圖譜，圖譜中出現(xiàn)特征性梯狀條帶為陽性，未出現(xiàn)特征性梯狀條帶為陰性。有益效果本發(fā)明的LAMP檢測方法具特異性強、靈敏度高、簡便快速、成本低等優(yōu)點，無需電泳及特殊儀器，便于在田間大規(guī)模應用，該方法為HLB病害監(jiān)測構(gòu)建了一個快速檢測的技術(shù)平臺。說明書附I為LAMP瓊脂糖凝膠電泳圖，表明樣品I中含有柑橘黃龍病，樣品2和3分別為陰性對照和水對照。圖2為本發(fā)明特異性的瓊脂糖凝膠電泳圖，I-柑橘黃龍?。?_柑橘黑星病(國內(nèi))；3_柑橘黑星病(巴西)；4_柑橘潰瘍病；5_柑橘炭疽??；6_柑橘褐斑??；7_陰性對照； 8-水對照。
具體實施例方式實施例I :(I)柑橘黃龍病核酸提取利用CTAB法提取柑橘葉脈基因組DNA，提取方法參照Murray和Thompson (1980) 方法，具體操作如下I.按2%的比例將β -巰基乙醇加入到2% CTAB抽提緩沖液(w/v)中，在65°C 水浴中預熱[CTAB IOOmmoI/L Tris-HCl (pH = 8. O), 20mmol/LEDTA (pH = 8· O)，I. 4mol/L NaCl，最后pH調(diào)為8. O]。2.稱取O. 5g柑橘葉脈，置于研缽中加液氮研磨成粉末，用藥勺迅速將粉末轉(zhuǎn)入加入有2ml預熱的CTAB抽提液的離心管中，蓋嚴后迅速搖勻。3.于65°C水浴45min,中途每隔IOmin輕柔顛倒混勻一次。4.冷卻后加入等體積飽和酚/氯仿/異戊醇(25 24 I)，輕輕顛倒混勻乳化 IOmin,離心力12000g室溫離心IOmin05.取上清液至新的離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24 I)，輕輕顛倒混勻乳化IOmin,離心力12000g室溫離心IOmin (重復一次該步驟)。6.加入與上清液等體積的異丙醇，顛倒混勻，冰浴30min。7.離心力12000g 4°C離心lOmin，棄上清液，分別用70%乙醇和冷無水乙醇清洗沉淀一次，室溫下風干；用100 μ I滅菌的雙蒸水溶解DNA，用手指輕彈離心管使沉淀充分懸浮，-20°C保存?zhèn)溆谩?2)柑橘黃龍病的LAMP擴增，配置反應體系為25 μ L，所述反應體系中各組分的含量為 5XReaction Buffer [IOOmM Tris-HCl pH 8. 8、50mM KCl、50mM(NH4)2S04、0. 5% Tween 20] (5μ L) ,8mM MgSO4U. 2mM dNTPs,Bst DNA聚合酶 8U、I. 6 μ M omp-FIP (5; -GCCATGATAC GACGCTTAGCA-TTGAGTGAGGGAGATCCAA T-3/ )、I. 6 μ Momp-BIP(5' -CTGAAGTCAATATTTCGCAATTGCC-TTTACGCTCACCC TCAGA-3' )、0. 2 μ M omp_F3 (5' -ATTCGGCGTGAACTTGAA-3' )、0. 2 μ M omp_B3 (5' -GCTATACCTACAGAACCAGC-3')、模板 DNA I. 0 μ L (樣品I)，加ddH20補足25 μ L，混勻，同時以陰性樣品(樣品2)和水(樣品3) 作陰性對照及水對照，于63°C在水浴鍋中反應70min，之后80°C下滅活5min結(jié)束反應。(3)反應結(jié)束后，觀察濁度，樣品I為白色渾濁即為陽性，樣品2、3為陰性；或在反應液中加入SYBR Green I顯色液I μ 1，樣品I出現(xiàn)綠色表明為陽性，樣品2、3為橙色則表明為陰性；或瓊脂糖凝膠電泳，獲取電泳圖譜，樣品I的圖譜中出現(xiàn)特征性梯狀條帶為陽性 (如圖I所示)，樣品2、3未出現(xiàn)特征性梯狀條帶為陰性。用該LAMP方法分別對柑橘黃龍病、柑橘黑星病(國內(nèi))、柑橘黑星病(巴西)、柑橘潰瘍病、柑橘炭疽病、柑橘褐斑病等柑橘病害的DNA為模板，同時以陰性樣品和水作陰性對照及水對照，進行LAMP特異性檢測(如圖2所示)，結(jié)果表明，只有HLB樣品為陽性，對照組均為陰性，說明該方法特異性強；同時對LAMP產(chǎn)物酶切后，能夠明顯鑒定出兩條帶，分別為70bp和133bp。另外，通過采用一系列稀釋的質(zhì)粒DNA，進行了 LAMP和普通PCR的靈敏度檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LAMP的靈敏度是普通PCR的100倍。
權(quán)利要求
1.一種柑橘黃龍病的LAMP快速檢測方法，其特征在于包括用于檢測柑橘黃龍病的 LAMP擴增特異性引物組，分別為omp-FIP5' -GCCATGATACGACGCTTAGCA-TTGAGTGAGGGAGATCC AAT-3'omp-BIP5' -CTGAAGTCAATATTTCGCAATTGCC-TTTACGCTCACCCTC AGA-3'omp-F3 5' -ATTCGGCGTGAACTTGAA-3'omp-B3 5' -GCTATACCTACAGAACCAGC-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述柑橘黃龍病的LAMP快速檢測方法，其特征在于按照如下步驟完成(1)柑橘黃龍病病葉總DNA提取，采用CTAB法提取柑橘黃龍病DNA得到模板DNA溶液；(2)柑橘黃龍病的LAMP擴增，配置反應體系為25μ L，所述反應體系中各組分的含量為 5 X Reaction Buffer,8mM MgSO4U. 2mMdNTPs,Bst DNA 聚合酶 8U、I. 6 μ M omp-FIP、I. 6 μ M omp_BIP、0. 2 μ M omp-F3>0. 2 μ M omp_B3、模板 DNA I. 0 μ L,加 ddH20 補足 25 μ L,混勻，于 63°C水浴鍋中反應70min,之后在80°C下滅活5min結(jié)束反應；所述5 X Reaction Buffer含 IOOmM Tris-HCl pH 8. 8、50mMKCl、50mM(NH4)2S04、0. 5% Tween 20。(3)反應結(jié)束后，觀察濁度，白色渾濁即為陽性，否則為陰性；或在反應液中加入SYBR Green I顯色液，出現(xiàn)綠色表明為陽性，橙色則表明為陰性；或用瓊脂糖凝膠電泳，獲取電泳圖譜，圖譜中出現(xiàn)特征性梯狀條帶為陽性，未出現(xiàn)特征性梯狀條帶為陰性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種柑橘黃龍病LAMP快速檢測方法，包括用于檢測柑橘黃龍病的LAMP擴增特異性引物組，分別為omp-FIP、omp-BIP、omp-F3和omp-B3。應用本發(fā)明及其建立的檢測方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)的檢測周期長、靈敏度不高、特異性不強、操作復雜、儀器設(shè)備要求高等缺陷，特別適合田間樣品快速檢測、HLB流行監(jiān)控和脫毒苗木的鑒定，對該病的監(jiān)測構(gòu)建了一個快速檢測的技術(shù)平臺。
文檔編號C12Q1/04GK102605092SQ201210101160
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月9日
發(fā)明者周常勇, 唐科志, 李中安, 蘇華楠, 黃麗 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院柑桔研究所