專利名稱：協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞活制劑及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)，特別是一種用協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞制作的活細(xì)胞制劑及其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胎盤成體干細(xì)胞是來源于新生兒胎盤組織的一族亞全能干細(xì)胞，其在發(fā)育階段與胚胎干細(xì)胞接近，又具備多能成體干細(xì)胞的許多生物學(xué)特征，使用不需配型，數(shù)量豐富，分化能力強(qiáng)，可定向分化為間充質(zhì)干細(xì)胞、血管干細(xì)胞、上皮干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、肝干細(xì)胞等多種干細(xì)胞，同時(shí)不產(chǎn)生腫瘤。胎盤作為胚胎發(fā)育中維系母體和胎兒氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)交換的暫時(shí)性器官，由起源于細(xì)胞滋養(yǎng)層及胚外中胚層的胎兒叢密絨毛膜與母體子宮的基蛻膜共同組成，無論從解剖結(jié)構(gòu)還是發(fā)育生物學(xué)上，都包含了較為幼稚的胚胎及趨于成熟的成體干細(xì)胞成分；胎盤在胎兒娩出后即完成使命，成為“廢棄”物，對(duì)其研究不會(huì)涉及倫理道德問題。腫瘤特別是惡性腫瘤發(fā)病率日益增高，且傳統(tǒng)治療如手術(shù)、放療、化療難以徹底清除殘存的腫瘤細(xì)胞，特別是腫瘤干細(xì)胞，導(dǎo)致其治愈率低，復(fù)發(fā)率和病死率高，成為嚴(yán)重危害人類健康的最大敵人，腫瘤的防治就顯的極為迫切。越來越多研究表明腫瘤干細(xì)胞 (cancer stem cells,CSCs)是腫瘤形成的起始細(xì)胞與腫瘤轉(zhuǎn)移的先鋒細(xì)胞，同時(shí)也為腫瘤復(fù)發(fā)的根源。當(dāng)今腫瘤防治技術(shù)方法并不少，且均有一定的作用，但遠(yuǎn)期效果都欠佳，究其根本原因就在于這些方法在設(shè)計(jì)上都沒針對(duì)腫瘤干細(xì)胞。因此，很有必要設(shè)計(jì)一些定向腫瘤干細(xì)胞的新技術(shù)來防治發(fā)病率與日俱增的腫瘤，尤其是能刺激宿主打破對(duì)腫瘤干細(xì)胞的多重免疫麻痹的新策略。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明正是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，打破在腫瘤形成過程中與腫瘤建立后宿主對(duì)腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生多重免疫麻痹，從而阻止腫瘤的發(fā)展與演進(jìn)，設(shè)計(jì)出定向腫瘤干細(xì)胞的新策略協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞活制劑及制備與應(yīng)用。胎盤成體干細(xì)胞介于較為幼稚的胚胎及趨于成熟的成體干細(xì)胞之間，是比骨髓干細(xì)胞更為原始的祖細(xì)胞。研究表明胎盤成體干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞在抗原表達(dá)、分化潛能等生物學(xué)特性具有極大的相似性(1)高表達(dá)腫瘤胚胎發(fā)生抗原，包括免疫原性與反應(yīng)原性， 二者之間可能具有交叉免疫性，( 無限增殖潛能，(3)自我分化能力(4)逃逸免疫系統(tǒng)的識(shí)別，( 誘導(dǎo)血管生長因子的產(chǎn)生。特別是轉(zhuǎn)染后表達(dá)協(xié)同刺激分子的胎盤成體干細(xì)胞制劑。本發(fā)明的任務(wù)是這樣實(shí)現(xiàn)的協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞活制劑，是在 2ml的凍存管中保存有培養(yǎng)5代后的重組協(xié)同刺激分子修飾的胎盤干細(xì)胞活制劑，干細(xì)胞為5 X IO5個(gè)，凍存液為人的AB血漿，總體積為1ml，于_196°C液氮中保存待用。上述協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞活制劑的制備方法其操作是在無菌條件下分為以下五個(gè)步驟制備(1)處理胎盤組織，(2)分離胎盤成體干細(xì)胞，(3)胎盤成體干細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)，(4)胎盤成體干細(xì)胞的基因修飾( 胎盤成體干細(xì)胞活制劑的制備。本發(fā)明生產(chǎn)的協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞活制劑的應(yīng)用，是對(duì)腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生直接作用而達(dá)到抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與演進(jìn)，作為一種廣譜抗腫瘤制劑應(yīng)用。本發(fā)明的胎盤成體干細(xì)胞制劑的使用選擇在腫瘤發(fā)生之后，選擇最常見的腫瘤肺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌為治療模型，注射部位選擇腫瘤對(duì)側(cè)方皮下，為打破腫瘤免疫逃逸機(jī)制，首次免疫治療10天后再進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫治療。


以下是本發(fā)明說明書附圖的圖面說明圖1是本發(fā)明(A)腫瘤干細(xì)胞(CSCs)，(B)骨髓干細(xì)胞(BSCs)，(C)單純胎盤干細(xì)胞(PSCs)與(D)協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞(Co-PSCs)顯微相差比較。圖2是本發(fā)明肺癌的干細(xì)胞治療模型療效比較，實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用胎盤成體干細(xì)胞活制劑治療后腫瘤體積明顯小于對(duì)照組，尤其是協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞活制劑 (Co-PSCs,即本發(fā)明制劑)治療組大部分宿主的腫瘤明顯消退。圖3是本發(fā)明乳腺癌的干細(xì)胞治療模型療效比較，實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用胎盤成體干細(xì)胞活制劑治療后腫瘤體積明顯小于對(duì)照組，尤其是本發(fā)明制劑治療組(Co-PSCs)大部分宿主的腫瘤明顯至完全消退。圖4是本發(fā)明肝癌的干細(xì)胞治療模型療效比較，實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用胎盤成體干細(xì)胞活制劑治療后腫瘤體積明顯縮小，尤其是本發(fā)明制劑治療組(Co-PSCs)大部分荷瘤宿主的腫瘤顯著消退。圖5是本發(fā)明結(jié)腸癌的干細(xì)胞治療模型療效比較，實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用胎盤成體干細(xì)胞活制劑治療后腫瘤體積明顯小于對(duì)照組，尤其是本發(fā)明制劑治療組(Co-PSCs)大部分荷瘤宿主的腫瘤完全消退。圖6(A)是本發(fā)明制劑注射后抑制腫瘤干細(xì)胞的增殖與對(duì)照組(Control)、骨髓干細(xì)胞組(BSCs)及單純胎盤干細(xì)胞組(PSCs)相比，腫瘤組織的⑶133/MUC-1免疫組化染色顯示協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞(Co-PSCs，本發(fā)明制劑)治療組的腫瘤組織中腫瘤干細(xì)胞明顯少于對(duì)照組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)。(B)是本發(fā)明制劑注射激活NK 細(xì)胞腫瘤組織CD57、DX5免疫組化染色顯示本發(fā)明制劑治療組(Co-PSCs)腫瘤內(nèi)活化NK 細(xì)胞明顯多于其它各組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P < 0. 05)。圖7(A)是本發(fā)明制劑注射后增加T細(xì)胞活性與對(duì)照組(Control)、骨髓干細(xì)胞組(BSCs)，及單純胎盤干細(xì)胞組(PSCs)相比，腫瘤組織的T細(xì)胞免疫組化染色顯示本發(fā)明制劑治療組(Co-PSCs)的腫瘤組織中活化CD8+T和CD4+T細(xì)胞(箭頭)明顯多于對(duì)照組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0. 05)。(B)是本發(fā)明制劑注射后增加淋巴細(xì)胞分泌干擾素=Elispot 分析顯示本發(fā)明制劑治療組(Co-PSCs)體內(nèi)淋巴細(xì)胞分泌的干擾素-Y (IFN-γ，介導(dǎo)抗腫瘤細(xì)胞免疫)及白介素_4(IL-4，介導(dǎo)抗腫瘤體液免疫)高于對(duì)照組，尤其是IFN-γ顯著增高，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P < 0. 05)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1.該抗腫瘤制劑采用協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞制作，一方面提高了干細(xì)胞的免疫原性使宿主對(duì)腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生有效的致敏淋巴細(xì)胞與免疫抗體，誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)腫瘤產(chǎn)生特異性殺傷作用，產(chǎn)生特異性抗腫瘤細(xì)胞與體液免疫；另一方面還激活了 NK和CD8+T 細(xì)胞，分泌TNF-α、IFN-Y等多種細(xì)胞因子，以非特異殺傷腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮非特異性的抗腫瘤作用，兩條抗腫瘤途徑相輔相成，從根源上抑制腫瘤干細(xì)胞在體內(nèi)的增殖成瘤、發(fā)展與轉(zhuǎn)移。治療上采用10天間斷性方案，首次治療10天后進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫治療，最大限度打破機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫耐受，起到促使腫瘤消退的作用；2.具有廣譜的抗腫瘤效果，抑制多種腫瘤的發(fā)生、演進(jìn)和轉(zhuǎn)移，延長荷瘤宿主的生
4存期；3.胎盤成體干細(xì)胞對(duì)協(xié)同刺激分子的表達(dá)起到保護(hù)及緩釋的作用，長效刺激機(jī)體，防止宿主產(chǎn)生免疫麻痹，激發(fā)更強(qiáng)的抗腫瘤免疫反應(yīng)；4.胎盤成體干細(xì)胞為正常細(xì)胞，作為細(xì)胞治療制劑，經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證不存在體內(nèi)成瘤的安全問題；5.胎盤取材方便，無痛苦，少污染，不涉及倫理道德問題。6.該生物制劑來自胎盤，資源豐富，制備簡便，成本低廉，具有大規(guī)模工程化培養(yǎng)的可能，為腫瘤生物學(xué)治療提供潛在的理想資源。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明以下將結(jié)合實(shí)施例和說明書附圖作進(jìn)一步詳述實(shí)施例1. 一種協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞活制劑是在2ml的凍存管中保存有培養(yǎng)5代后的重組協(xié)同刺激分子修飾的胎盤成體干細(xì)胞活制劑(參見說明書附圖1D)， 干細(xì)胞為5 X IO5個(gè)，凍存液為人的AB血漿，總體積為1ml，于_196°C液氮中保存待用。實(shí)施例2.協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞活制劑的制備于無菌條件下制備上述干細(xì)胞活制劑，共分為以下五個(gè)步驟(1)處理胎盤組織，( 分離胎盤成體干細(xì)胞， (3)胎盤成體干細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)，(4)胎盤成體干細(xì)胞的基因修飾，( 胎盤成體干細(xì)胞活制劑的制備，詳述如下(1)處理胎盤組織足月生產(chǎn)的胎盤組織，捐獻(xiàn)者均簽署知情同意書，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，將胎盤組織剪碎成IcmX IcmX Icm大小，5倍于胎盤組織體積的D-Hank’ s 平衡鹽液沖洗3次后收集胎盤組織小塊；(2)分離胎盤成體干細(xì)胞將胎盤組織小塊以比例每Iml胎盤組織小塊加入5ml 0. 2%膠原酶液，37°C消化50min，消化終止后用200目濾網(wǎng)過濾，收集單細(xì)胞，在收集到的單細(xì)胞中以比例Iml細(xì)胞體積加入3 5ml紅細(xì)胞裂解液，4°C水浴5min以去除紅細(xì)胞，再以5倍于胎盤細(xì)胞體積的D-Hank’ s平衡鹽液洗一遍，以50倍于胎盤細(xì)胞的體積加入配好的低糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含10% FBS、5ng/ml bFGFU00U/ml青霉素、100μ g/ml鏈霉素和25mmo 1/L谷氨酰胺，調(diào)整培養(yǎng)細(xì)胞密度為1 X IO5個(gè)/ml，接種于75cm2的培養(yǎng)瓶，置于 37°C,5% CO2，飽和濕度95%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3 4天進(jìn)行換液；(3)胎盤成體干細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)使用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)模式擴(kuò)大培養(yǎng)，傳代單純胎盤成體干細(xì)胞5次(參見說明書附圖1C)；(4)胎盤成體干細(xì)胞的基因修飾培養(yǎng)5代后，該細(xì)胞具有很好的貼壁穩(wěn)定性，通過含B7-1協(xié)同刺激分子基因的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染胎盤成體干細(xì)胞，建立高表達(dá)B7-1協(xié)同刺激分子的修飾化胎盤成體干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染表達(dá)效率高于95% (參見說明書附圖1D)；(5)胎盤成體干細(xì)胞活制劑的制備收集胎盤干細(xì)胞裝入2ml凍存小管，每支 5 X IO5個(gè)基因修飾的胎盤成體干細(xì)胞，凍存液為人的AB血漿，總體積為Iml，于_196°C液氮中貯存，解凍后直接使用。實(shí)施例3.協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞活制劑治療腫瘤的動(dòng)物模型構(gòu)建 采用6-8周齡、18-24g的C57BL/6小鼠建立肺癌模型。采用6_8周齡、18_24g的Balb/C小鼠建立乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌模型。每只右側(cè)脅部皮下接種活腫瘤細(xì)胞5X IO5個(gè)(0.1ml)， 種瘤后第9天腫瘤可摸及約3mm3大小，開始采用實(shí)施例1的制劑進(jìn)行治療。實(shí)施例4.協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞活制劑體內(nèi)注射誘發(fā)腫瘤消退實(shí)施例1制劑的使用，選擇在腫瘤發(fā)生之后，首先選擇最常見的腫瘤男性肺癌、女性乳腺癌作為治療模型，注射部位選擇腫瘤對(duì)側(cè)方皮下，劑量為5X IO5個(gè)干細(xì)胞活制劑，10天后進(jìn)行一次同劑量加強(qiáng)免疫治療。多種腫瘤包括肺癌、乳腺癌、肝癌與結(jié)腸癌模型治療結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用實(shí)施例1的制劑治療后腫瘤體積明顯小于對(duì)照組，尤其是協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞治療組大部分腫瘤明顯至完全消退(參見說明書附圖2-5)。實(shí)施例5.協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞活制劑體內(nèi)注射抑制腫瘤干細(xì)胞的增殖與對(duì)照組相比，腫瘤組織的CD133/MUC-1免疫組化染色顯示，實(shí)施例1制劑治療組 (Co-PSCs)的腫瘤組織中腫瘤干細(xì)胞明顯少于對(duì)照組(參見說明書附圖6A)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P < 0. 05)。實(shí)施例6.協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞活制劑體內(nèi)注射激活NK細(xì)胞與對(duì)照比較，腫瘤組織⑶57、D)(5免疫組化染色顯示實(shí)施例1制劑治療組(Co-PSCs)腫瘤組織中活化NK細(xì)胞明顯多于對(duì)照組(參見說明書附圖6B)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P < 0. 05)。實(shí)施例7.協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞活制劑體內(nèi)注射增加T細(xì)胞活性與對(duì)照組相比，腫瘤組織的T細(xì)胞免疫組化染色顯示，實(shí)施例1制劑治療組(Co-PSCs)的腫瘤組織中活化CD4+T和CD8+T細(xì)胞明顯多于對(duì)照組(參見說明書附圖7A)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (*P < 0. 05)。實(shí)施例8.協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞活制劑體內(nèi)注射增加淋巴細(xì)胞分泌干擾素與對(duì)照比較，Elispot分析顯示實(shí)施例1制劑治療組(Co-PSCs)淋巴細(xì)胞分泌的干擾素- 明顯高于對(duì)照組(參見說明書附圖7B)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P < 0. 05)。
權(quán)利要求
1.一種協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞活制劑，其特征在于是在2ml的凍存管中保存有培養(yǎng)5代后的重組協(xié)同刺激分子修飾的胎盤成體干細(xì)胞活制劑，干細(xì)胞為5X IO5 個(gè)，凍存液為人的AB血漿，總體積為1ml，于_196°C液氮中保存待用。
2.制備權(quán)利要求1協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞活制劑的方法，其特征在于于無菌條件下分為以下五個(gè)步驟制備(1)處理胎盤組織足月生產(chǎn)的胎盤組織，捐獻(xiàn)者均簽署知情同意書，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，將胎盤組織剪碎成IcmX IcmX Icm大小，5倍于胎盤組織體積的D-Hank’ s平衡鹽液沖洗3次后收集胎盤組織小塊；(2)分離胎盤成體干細(xì)胞將胎盤組織小塊以比例每Iml胎盤組織小塊加入5ml0. 2% 膠原酶液，37°C消化50min，消化終止后用200目濾網(wǎng)過濾，收集單細(xì)胞，在收集到的單細(xì)胞中以比例Iml細(xì)胞體積加入3 5ml紅細(xì)胞裂解液，4°C水浴5min以去除紅細(xì)胞，再以 5倍于胎盤細(xì)胞體積的D-Hank’ s平衡鹽液洗一遍，以50倍于胎盤細(xì)胞的體積加入配好的低糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含10% FBS、5ng/ml bFGFU00U/ml青霉素、100μ g/ml鏈霉素和 25mmol/L谷氨酰胺，調(diào)整培養(yǎng)細(xì)胞密度為1 X IO5個(gè)/ml，接種于75cm2的培養(yǎng)瓶，置于37°C， 5% CO2，飽和濕度95%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3 4天進(jìn)行換液；(3)胎盤成體干細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)使用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)模式擴(kuò)大培養(yǎng)，傳代單純胎盤成體干細(xì)胞5次；(4)胎盤成體干細(xì)胞的基因修飾培養(yǎng)5代后，該細(xì)胞具有很好的貼壁穩(wěn)定性，通過含 B7-1協(xié)同刺激分子基因的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染胎盤成體干細(xì)胞，建立高表達(dá)B7-1協(xié)同刺激分子的修飾化胎盤成體干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染表達(dá)效率高于95% ；(5)胎盤成體干細(xì)胞活制劑的制備收集胎盤干細(xì)胞裝入2ml凍存小管，每支5X105個(gè)基因修飾的胎盤成體干細(xì)胞，凍存液為人的AB血漿，總體積為1ml，于_196°C液氮中貯存， 解凍后直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1一種協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞活制劑的應(yīng)用，其特征在于對(duì)腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生直接作用而達(dá)到抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，作為一種廣譜抗腫瘤制劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞活細(xì)胞制劑及其制備與應(yīng)用。其制劑是在2ml的凍存管中保存有5×105個(gè)培養(yǎng)5代的協(xié)同刺激分子修飾胎盤成體干細(xì)胞，凍存液為人的AB血漿，總體積為1ml，于-196℃液氮中保存待用。其制備方法是在無菌條件下分五個(gè)步驟1.處理胎盤組織，2.分離胎盤成體干細(xì)胞，3.胎盤成體干細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)，4.胎盤成體干細(xì)胞的基因修飾，5.胎盤成體干細(xì)胞活制劑的制備。本發(fā)明制劑具有廣譜的抗腫瘤效果，直接作用于腫瘤干細(xì)胞而抑制多種腫瘤的發(fā)生、演進(jìn)和轉(zhuǎn)移，從根源阻止腫瘤的發(fā)生發(fā)展。制劑取材方便，無倫理道德問題，資源豐富，制備簡便，成本低廉，為腫瘤治療提供新的策略。
文檔編號(hào)C12N15/861GK102210707SQ20111008095
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月1日
發(fā)明者宋娜, 張冬梅, 楊莉, 陳縣城, 陳巧玲, 魏于全 申請人:四川大學(xué)