專(zhuān)利名稱(chēng)：Jmjd8基因及表達(dá)產(chǎn)物對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及JmjC結(jié)構(gòu)域蛋白S(JMJDS)基因和蛋白在肝癌檢測(cè)方面的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及JMJD8基因、蛋白及其激動(dòng)劑在肝癌治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我國(guó)最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，占居民腫瘤死亡第二位。肝癌出現(xiàn)癥狀時(shí)多屬中晚期，切除后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高。因此，肝癌的早期診斷對(duì)采用合理的治療手段、延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間和降低肝癌死亡率具有重要意義。因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)可用于肝癌診斷的相關(guān)蛋白。 此外，為了有效地抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)可用于抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種可用于肝癌診斷的相關(guān)蛋白。本發(fā)明的另一目的是提供一種抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種JmjC結(jié)構(gòu)域蛋白S(JMJDS)或其基因的用途，它們被用于制備檢測(cè)肝癌的試劑或試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒包括對(duì)JMJD8蛋白或mRNA進(jìn)行定量檢測(cè)的試劑以及相應(yīng)的標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)。在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)中記載了以下使用說(shuō)明對(duì)JMJD8蛋白或mRNA進(jìn)行定量檢測(cè)，并將檢測(cè)結(jié)果用于表征肝癌幾率高低。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑包括JMJD8特異性抗體，或JMJD8的特異性引物。在另一優(yōu)選例中，上述的試劑包括檢測(cè)用芯片，包括核酸芯片和蛋白質(zhì)芯片。在另一優(yōu)選例中，所述的核酸芯片包括基片和點(diǎn)樣在基片上的癌癥相關(guān)基因的特異性寡核苷酸探針，所述的癌癥相關(guān)基因的特異性寡核苷酸探針包括與JMJD8基因或mRNA特異性結(jié)合的探針。在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白質(zhì)芯片包括基片和點(diǎn)樣在基片上的癌癥相關(guān)蛋白的特異性抗體，所述的癌癥相關(guān)蛋白的特異性抗體包括抗JMJD8蛋白的特異性抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的JMJD8蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于檢測(cè)肝癌的診斷試劑盒，所述的試劑盒含有一容器，所述容器中含有檢測(cè)JMJD8蛋白或mRNA的檢測(cè)試劑；以及標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)，所述標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)注明所述試劑盒用于檢測(cè)肝癌。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)試劑包括特異性抗體和引物。在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)中注明以下內(nèi)容
當(dāng)檢測(cè)對(duì)象的JMJD8的mRNA表達(dá)量與P -肌動(dòng)蛋白的mRNA表達(dá)量之比(0. 008 (較佳地< 0. 007，更佳地< 0. 006，最佳地< 0. 005)，則提示該檢測(cè)對(duì)象患肝癌的幾率高于普通人群。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒用于檢測(cè)人肝臟樣品或血液樣品。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種JMJD8蛋白、JMJD8基因或其激動(dòng)劑的用途，它們被用于制備抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的藥物，或用于制備治療肝癌的藥物。在本發(fā)明第四方面，提供了一種體外非治療性的抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的方法，包括步驟在JMJD8蛋白或其激動(dòng)劑存在下，培養(yǎng)癌細(xì)胞，從而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖。在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括向癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加JMJD8激動(dòng)劑，從而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖。在另一優(yōu)選例中，所述的癌細(xì)胞是肝癌細(xì)胞。 在本發(fā)明的第五方面，提供了一種篩選治療肝癌的候選化合物的方法，所述方法包括步驟(a)測(cè)試組中，在細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測(cè)試化合物，并觀察所述測(cè)試組的細(xì)胞中JMJD8的表達(dá)量和/或活性；在對(duì)照組中，在相同細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測(cè)試化合物，并觀察對(duì)照組的所述細(xì)胞中JMJD8的表達(dá)量和/或活性；其中，如果測(cè)試組中細(xì)胞的JMJD8的表達(dá)量和/或活性大于對(duì)照組，就表明該測(cè)試化合物是對(duì)JMJD8的表達(dá)和/或活性有促進(jìn)作用的治療肝癌的候選化合物。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞包括肝癌細(xì)胞或肝細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟(b)對(duì)于步驟(a)中獲得的候選化合物，進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的抑制作用。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中包括步驟測(cè)試組中，肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測(cè)試化合物，并觀察肝癌細(xì)胞的數(shù)量和/或生長(zhǎng)情況；在對(duì)照組中，在肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測(cè)試化合物，并觀察肝癌細(xì)胞的數(shù)量和/或生長(zhǎng)情況；其中，如果測(cè)試組中肝癌細(xì)胞的數(shù)量或生長(zhǎng)速度小于對(duì)照組，就表明該測(cè)試化合物是對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或增殖有抑制作用的治療肝癌的候選化合物。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種JMJD8基因、JMJD8蛋白或其激動(dòng)劑的用途，它們被(a)用于制備促進(jìn)化療或放療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的藥物組合物，或(b)用于制備促進(jìn)化療或放療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的促進(jìn)劑，或(C)用于制備使得癌細(xì)胞對(duì)化療或放療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更敏感的增敏劑。在另一優(yōu)選例中，所述的JMJD8蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。在本發(fā)明的第七方面，提供了一種JMJD8基因、JMJD8蛋白或其激動(dòng)劑的用途，它們被用作癌癥治療的增敏劑或促進(jìn)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)劑。在另一優(yōu)選例中，所述的JMJD8蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。在本發(fā)明的第八方面，提供了一種抑制或治療癌癥的方法，包括步驟給需要治療的對(duì)象(哺乳動(dòng)物)施用安全有效量的JMJD8激動(dòng)劑的用途。在另一優(yōu)選例中，所述的癌癥包括肝癌。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


圖I顯示了 JMJD8基因在肝癌的mRNA表達(dá)水平明顯低于相應(yīng)癌旁組織及正常組織。(HCC, hepatocellular carcinoma,肝細(xì)胞肝癌；N, normal liver,正常肝；CNL，corresponding noncancerous liver,相應(yīng)的癌旁組織)。圖2顯示了 JMJD8基因原核表達(dá)產(chǎn)物顯著抑制SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)(control，空白對(duì)照給藥組；BSA，無(wú)關(guān)給藥組，)。圖3顯示了 JMJD8基因過(guò)表達(dá)顯著抑制SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)(Lenti-vector，對(duì)照細(xì)胞株；lenti-shJMJD8，干擾細(xì)胞株；Lent i_JMJD8，過(guò)表達(dá)細(xì)胞株)。
圖4 :慢病毒介導(dǎo)建立的SMMC-7721穩(wěn)定細(xì)胞株中JMJD8基因表達(dá)水平鑒定(Lenti-vector,對(duì)照細(xì)胞株；lenti_shJMJD8,干擾細(xì)胞株；Lenti_JMJD8,過(guò)表達(dá)細(xì)胞株)。圖5顯示了 JMJD8基因過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞中已誘發(fā)的早期凋亡(Lenti-vector,對(duì)照細(xì)胞株；lenti_shJMJD8,干擾細(xì)胞株；Lenti_JMJD8,過(guò)表達(dá)細(xì)胞株；UV,紫外)。其中，caspase酶活性越高,凋亡越高。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，JMJD8在肝癌組織中低表達(dá)，而在癌旁組織及正常組織中高表達(dá)，因此JMJD8可作為肝癌檢測(cè)的標(biāo)志物用于檢測(cè)或輔助性檢測(cè)肝癌。此外，JMJD8的激動(dòng)劑可抑制癌細(xì)胞(尤其是肝癌細(xì)胞)的生長(zhǎng)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明人用real-time PCR方法得到原發(fā)肝癌的癌組織樣本和癌旁組織樣本的JMJD8基因表達(dá)譜，通過(guò)比較兩種組織的表達(dá)譜，得到癌與癌旁組織間表達(dá)差異性。JMJD8基因在癌組織中的mRNA表達(dá)明顯低于癌旁組織及正常組織(P < 0. 001)。因此，可以把JMJD8基因開(kāi)發(fā)成小型基因芯片或RT-PCR試劑盒用于肝癌的鑒別診斷。本發(fā)明還通過(guò)原核表達(dá)的方法純化的到JMJD8基因原核表達(dá)蛋白。通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，意外地發(fā)現(xiàn)在未經(jīng)變性和復(fù)性處理的情況下，原核表達(dá)的JMJD8蛋白(濃度彡850nM)居然能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721的生長(zhǎng)。因此，JMJD8的基因原核表達(dá)產(chǎn)物可以開(kāi)發(fā)成藥物用于肝癌的治療。本發(fā)明人還以慢病毒載體系統(tǒng)為介導(dǎo)系統(tǒng)，在肝癌細(xì)胞SMMC-7721中過(guò)表達(dá)JMJD8基因(經(jīng)鑒定過(guò)表達(dá)倍數(shù)為100倍)。通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)JMJD8基因的過(guò)表達(dá)明顯抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721的生長(zhǎng)。因此，可將JMJD8基因用于肝癌的基因治療。此外，通過(guò)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)JMJD8基因的過(guò)表達(dá)明顯促進(jìn)因化療或放療而誘發(fā)的細(xì)胞早期凋亡。因此，可將JMJD8基因與肝癌的化療或放療聯(lián)用，以促進(jìn)肝癌的治療效果。JMJD8蛋白和多核苷酸在本發(fā)明中，“本發(fā)明蛋白”、“本發(fā)明多肽”、“ JMJD8蛋白”可互換使用，指JmjC結(jié)構(gòu)域蛋白8 (簡(jiǎn)稱(chēng)為JMJD8)。應(yīng)理解，所述術(shù)語(yǔ)還包括JMJD8的活性片段和衍生物。
在本發(fā)明中，“本發(fā)明基因”、“本發(fā)明多核苷酸”指編碼JMJD8蛋白或其活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正義和反義核酸。JMJD8基因定位于細(xì)胞染色體16pl3. 3，cDNA全長(zhǎng)為1936bp,編碼全長(zhǎng)264個(gè)氨基酸的蛋白。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“JMJD8蛋白”、“JMJD8多肽”或“肝癌標(biāo)志物JMJD8”可互換使用，都指具有人蛋白JMJD8氣基酸序列的蛋白或多妝。全長(zhǎng)JMJD8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. :1所示(其中ORF位于第5_796位)，全長(zhǎng)JMJD8蛋白的氨基酸如SEQ ID NO. :2所示。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的。如本文所用，“分離的JMJD8蛋白或多肽”是指JMJD8蛋白基本上不含天然與其相 關(guān)的其它蛋白、脂類(lèi)、糖類(lèi)或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化JMJD8蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。在本發(fā)明中，JMJD8蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼JMJD8的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類(lèi)似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼多肽的功能。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段，包括正義和反義的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼JMJD8蛋白的多核苷酸。本發(fā)明的人JMJD8核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開(kāi)的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過(guò)凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或JMJD8蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組的JMJD8蛋白。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟(I).用本發(fā)明的編碼人JMJD8蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；
(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人JMJD8編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲(chóng)細(xì)胞；CH0、COS、或293細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)
口 o
抗體本發(fā)明還包括對(duì)人JMJD8蛋白具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人JMJD8基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人JMJD8基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體?？谷薐MJD8蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的人JMJD8
蛋白。、激動(dòng)劑和藥物組合物利用本發(fā)明蛋白，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與JMJD8蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，尤其是激動(dòng)劑等。本發(fā)明JMJD8蛋白的激動(dòng)劑，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可促進(jìn)JMJD8蛋白的表達(dá)和/或活性，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞(包括肝癌)的生長(zhǎng)或增殖。通常，可將這些激動(dòng)劑配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中PH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明JMJD8蛋白或其激動(dòng)劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類(lèi)載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類(lèi)的藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約I微克-10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的JMJD8基因、蛋白或其激動(dòng)劑還特別適合與其他抗腫瘤的化療藥物或放療聯(lián)用，從而促進(jìn)化療或放療所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。檢測(cè)方法和試劑盒本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)人JMJD8蛋白水平或mRNA水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的。試驗(yàn)中所檢測(cè)的人JMJD8蛋白水平，可以用于診斷肝癌。一種檢測(cè)樣品中是否存在JMJD8蛋白的方法是利用JMJD8蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，它包括將樣品與JMJD8蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在JMJD8蛋白。JMJD8蛋白或其多核苷酸可用于JMJD8蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列或DNA芯片上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷?？笿MJD8的抗體可以固定在蛋白質(zhì)芯片上，用于檢測(cè)樣品中的JMJD8蛋白。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)肝癌的的試劑盒，它含有特異性擴(kuò)增JMJD8的引物對(duì)和/或JMJD8特異性抗體。篩選方法本發(fā)明還提供了基于JMJD8進(jìn)行藥物篩選的方法。一種方法是先篩選影響(促進(jìn))JMJD8表達(dá)或活性的化合物，然后對(duì)篩選出的化合物進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)癌細(xì)胞。一種篩選方法可基于JMJD8的mRNA的表達(dá)水平。其中，代表性的癌細(xì)胞包括(但并不限于):肝癌細(xì)胞。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括(a) JMJD8的表達(dá)水平可用作肝癌檢測(cè)的標(biāo)志物。(b) JMJD8蛋白或其激動(dòng)劑可有效抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。實(shí)施例一、材料組織樣本50對(duì)癌和癌旁組織來(lái)自于原發(fā)性肝癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本，這些標(biāo)本來(lái)自于啟東肝癌研究所和浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院。9例正常肝來(lái)自于意外死亡者。上述所有標(biāo)本的取得均通過(guò)上海市政府授權(quán)的WHO合作組織倫理委員會(huì)的同意。組織樣本的臨床資料包括性別、年齡、腫瘤大小、病理分級(jí)(Edmonson)、肝硬化與否、轉(zhuǎn)移與否、復(fù)發(fā)與否、HBV和HCV感染情況等。所有患者術(shù)前都沒(méi)有接受化療，術(shù)后隨訪最長(zhǎng)達(dá)60個(gè)月。 RNA樣本(組織總RNA提取)I.樣品的收集和保存離體組織切割成小塊后立即置于液氮中速凍，然后移至-80°C冰箱保存。2.組織塊破碎組織塊放于液氮中研磨成粉，每克組織加入ImlTrizol (Invitrogen 公司)。3.總RNA抽提按每毫升Trizol加0. 2ml的氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫孵育2_3分鐘；4°C，10，000g離心15分鐘；將無(wú)色上清液移入新的離心管中，加0. 5ml異丙醇，室溫孵育10分鐘，IOOOOg 4°C離心10分鐘;倒掉上清，0. 75ml75%乙醇洗滌，4°C，7，500g離心5分鐘；倒掉上清，室溫干燥RNA沉淀5-10分鐘，用DEPC處理后的無(wú)RNA酶H2O溶解沉淀。4.分光光度計(jì)法定量RNA，并取少量總RNA進(jìn)行電泳，檢查RNA是否降解。二、通用方法I.反轉(zhuǎn)錄細(xì)胞總RNA 9 ill (4-5 ii g)和 Oligo dT (10 y M) I 混合，72 °C 加熱 5min 后，立刻置于冰上 IOmin ;力卩入 8^il 反轉(zhuǎn)錄混合液(10 X RT Buffer 2 u I, 25mMMgC122 u I, IOmMdNTPs I u 1,0. ImM DTT 2u I, RNase inhibitor I y I)，在 PCR 儀上 42°C加熱 5min 后，力口A Iu 1(50U) SuperScriptI 11 反轉(zhuǎn)錄酶，42°C 反應(yīng) 50min ;70°C 加熱 15min 終止反應(yīng)，置于冰上；加入 I U I RNase H，37°C反應(yīng) 20min。
2. Real-time PCR 定量擴(kuò)增時(shí)，每個(gè)反應(yīng)取Super Mix PCR反應(yīng)液10 yl，cDNA 2^1、引物和探針各1111，配成20111體系。按如下條件進(jìn)行擴(kuò)增:預(yù)變性95°C 5min，95°C 30s,62°C 15s、75°C 15s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各檢測(cè)標(biāo)本中正常肝組織、癌旁組織、癌組織的相對(duì)濃度差異。根據(jù)ABI PRISM 7300Sequence Detection System自帶軟件進(jìn)行分析。3.慢病毒的包裝及靶基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)本發(fā)明中使用的慢病毒包裝體系是購(gòu)自Addgene公司的三質(zhì)粒系統(tǒng)，包括pWPXL，psPAX2和pMD2.G。轉(zhuǎn)染試劑用Lipofectamine 2000，三質(zhì)粒的用量的摩爾比為I : I : I。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEK-293T細(xì)胞(ATCC =CRL-11268)接至IOcm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，到第二天約達(dá)到95%以上的融合度，用作轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
將JMJD8基因克隆進(jìn)病毒載體pWPXL中，與包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2. G共同轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，48小時(shí)后收獲上清中的病毒顆粒。以MOI = 50感染靶細(xì)胞(7721肝癌細(xì)胞)，感染液中加入6 u g/ml的polybrene輔助感染，感染24小時(shí)后換為普通培養(yǎng)基進(jìn)行后
續(xù)實(shí)驗(yàn)。4.細(xì)胞增殖和凋亡檢測(cè)細(xì)胞增殖采用CCK-8試劑(Dojindo公司)。96孔板種植2，500個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞處理后，每孔加入IOiU CCK-8，37°C孵育2小時(shí)，檢測(cè)450nm波長(zhǎng)吸收值。采用Caspase-Glo 3/7試劑(Promega公司)檢測(cè)caspase-3和caspase-7活性。96孔板種植2，500個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)藥物處理后，每孔加入50 ii I Caspase-Glo 3/7試劑，室溫避光I小時(shí),檢測(cè)熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。實(shí)施例I肝癌組織中JMJD8基因的mRNA表達(dá)明顯低于相應(yīng)的癌旁組織及正常肝組織。在本實(shí)施例中，運(yùn)用real-time PCR的方法對(duì)50對(duì)肝癌組織、相應(yīng)癌旁組織(50例)及正常組織(9例)中的JMJD8基因進(jìn)行了 mRNA水平的檢測(cè)，以各組織中P -actin的表達(dá)水平為統(tǒng)一參照。結(jié)果表明，JMJD8基因的mRNA水平的表達(dá)在肝癌組織及其相應(yīng)癌旁組織中有顯著差異，其中肝癌組織中的表達(dá)明顯低于相應(yīng)的癌旁組織(P < 0.0001)，并且明顯低于正常肝組織(P < 0. 0001)。因此，這種顯著差異可用于區(qū)分肝癌組織、癌旁組織(見(jiàn)圖I)。其中，就基于￠-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行歸一化處理后，若檢測(cè)的JMJD8的相對(duì)表達(dá)(0. 008 (較佳地< 0. 007，更佳地< 0. 006，最佳地< 0. 005)，則提示該檢測(cè)對(duì)象患肝癌的幾率高于普通人群。實(shí)施例2JMJD8基因的原核表達(dá)產(chǎn)物的制備設(shè)計(jì)引物(sense:5，-CATATGATGGCGCCGGCG-3 ' (SEQ ID NO. 3) ；antisense -CGGCCCGACGCTCCTGCGAC-3 ; (SEQ ID NO. :4))，以常規(guī)方法抽提 cDNA 為模板，應(yīng)用
Pfu酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件95°C lmin,55°C lmin，72°C 2. 5min，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物為1.2kb，經(jīng)Nde I/Sall雙酶切，分別克隆于市售的表達(dá)載體pET21a和融合表達(dá)載體pET232a(購(gòu)自Novogen)上，然后將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入常規(guī)的大腸桿菌BL21 (DE3)宿主菌進(jìn)行表達(dá)。采用Ni2NTAresin (購(gòu)自Qiagen),按廠商說(shuō)明進(jìn)行純化,從而獲得表達(dá)的JMJD8蛋白(為trxA2-JmjD8融合蛋白)。實(shí)施例3JMJD8基因的原核表達(dá)產(chǎn)物能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)。將上一實(shí)施例中制備的純化JMJD8基因原核表達(dá)蛋白，直接外加在SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)上清中，觀察體外細(xì)胞生長(zhǎng)情況。結(jié)果意外地發(fā)現(xiàn)JMJD8基因的原核表達(dá)產(chǎn)物，在未經(jīng)復(fù)性處理就具有活性，能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的生長(zhǎng)，并且850nM的JMJD8為有效濃度(見(jiàn)圖2)。 由于原核表達(dá)體系能夠方便地大規(guī)模制備JMJD8蛋白，且JMJD8蛋白在不必變性復(fù)性的情況下就具有很高的活性，因此這有利于對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)行抑制。實(shí)施例4JMJD8基因的過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)。在本實(shí)施例中，以慢病毒為介導(dǎo)系統(tǒng)，在SMMC-7721細(xì)胞中過(guò)表達(dá)JMJD8基因，然后在體外進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。此外，還引入針對(duì)JMJD8基因的shRNA。ShRNA靶向的基因序列如下5’-TAGATCACTTCTGAGTACCCGGGTC-3’ (SEQ ID NO. :5)。shRNA 在體內(nèi)會(huì)形成或產(chǎn)生siRNA，從而抑制JMJD8的表達(dá)。結(jié)果表明JMJD8基因過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的生長(zhǎng)(見(jiàn)圖3)。作為負(fù)向?qū)φ眨肓酸槍?duì)JMJD8基因的shRNA，以便減少細(xì)胞中JMJD8基因的表達(dá)(見(jiàn)圖4，穩(wěn)定細(xì)胞株中JMJD8基因表達(dá)水平降低)，得到了與基因過(guò)表達(dá)相反的結(jié)果(即促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng))，這符合預(yù)期。本實(shí)驗(yàn)證明了，通過(guò)使用合適的介導(dǎo)系統(tǒng)，可將JMJD8基因用于對(duì)肝癌的基因治療。實(shí)施例5JMJD8基因的過(guò)表達(dá)能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡在本實(shí)施例中，以慢病毒為介導(dǎo)系統(tǒng)，在肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞中過(guò)表達(dá)JMJD8基因。再以藥物staurosporine (星形孢菌素)、etoposide (依托泊式)或用紫外線UV處理細(xì)胞，檢測(cè)JMJD8表達(dá)量不同的細(xì)胞株中細(xì)胞早期凋亡的水平。體外細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)證明JMJD8基因過(guò)表達(dá)能夠顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞SMMC-7721中已誘導(dǎo)的細(xì)胞早期凋亡(見(jiàn)圖5)。作為負(fù)向?qū)φ?，引入了針?duì)JMJD8基因的shRNA，目的在減少細(xì)胞中JMJD8基因的表達(dá)(見(jiàn)圖4)。得到了與基因過(guò)表達(dá)相反的結(jié)果(抑制已誘導(dǎo)的細(xì)胞早期凋亡)，這符合預(yù)期。鑒于JMJD8基因可促進(jìn)已誘發(fā)的細(xì)胞早期凋亡，因此可將JMJD8與肝癌的化學(xué)治療聯(lián)用。此外，JMJD8可促進(jìn)UV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這表明可將JMJD8與肝癌的放射性治療聯(lián)用。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可
以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種JmjC結(jié)構(gòu)域蛋白8CJMJD8)或其基因的用途，其特征在于，用于制備檢測(cè)肝癌的試劑或試劑盒。
2.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的試劑盒包括對(duì)JMJD8蛋白或mRNA進(jìn)行定量檢測(cè)的試劑以及相應(yīng)的標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)。
3.一種用于檢測(cè)肝癌的診斷試劑盒，所述的試劑盒含有一容器，所述容器中含有檢測(cè)JMJD8蛋白或mRNA的檢測(cè)試劑；以及標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)，所述標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)注明所述試劑盒用于檢測(cè)肝癌。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)中注明以下內(nèi)容 當(dāng)檢測(cè)對(duì)象的JMJD8的mRNA表達(dá)量與P -肌動(dòng)蛋白的mRNA表達(dá)量之比< 0. 008 (較佳地< 0. 007，更佳地< 0. 006，最佳地< 0. 005)，則提示該檢測(cè)對(duì)象患肝癌的幾率高于普通人群。
5.一種JMJD8蛋白、JMJD8基因或其激動(dòng)劑的用途，其特征在于，被用于制備抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的藥物，或用于制備治療肝癌的藥物。
6.一種體外非治療性的抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的方法，其特征在于，包括步驟在JMJD8蛋白或其激動(dòng)劑存在下，培養(yǎng)癌細(xì)胞，從而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖。
7.一種篩選治療肝癌的候選化合物的方法，其特征在于，所述方法包括步驟 (a)測(cè)試組中，在細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測(cè)試化合物，并觀察所述測(cè)試組的細(xì)胞中JMJD8的表達(dá)量和/或活性；在對(duì)照組中，在相同細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測(cè)試化合物，并觀察對(duì)照組的所述細(xì)胞中JMJD8的表達(dá)量和/或活性； 其中，如果測(cè)試組中細(xì)胞的JMJD8的表達(dá)量和/或活性大于對(duì)照組，就表明該測(cè)試化合物是對(duì)JMJD8的表達(dá)和/或活性有促進(jìn)作用的治療肝癌的候選化合物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟 (b)對(duì)于步驟(a)中獲得的候選化合物，進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的抑制作用。
9.一種JMJD8基因、JMJD8蛋白或其激動(dòng)劑的用途，其特征在于，(a)用于制備促進(jìn)化療或放療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的藥物組合物，或(b)用于制備促進(jìn)化療或放療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的促進(jìn)劑，或(C)用于制備使得癌細(xì)胞對(duì)化療或放療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更敏感的增敏劑。
10.一種JMJD8基因、JMJD8蛋白或其激動(dòng)劑的用途，其特征在于，被用作癌癥治療的增敏劑或促進(jìn)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了JMJD8基因及表達(dá)產(chǎn)物對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。具體地，本發(fā)明提供了原核表達(dá)的JmjC結(jié)構(gòu)域蛋白8(JMJD8)，并通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)證明該蛋白用于肝癌的治療。本發(fā)明還以慢病毒為介導(dǎo)系統(tǒng)得到了JMJD8過(guò)表達(dá)的SMMC-7721細(xì)胞，通過(guò)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)證明該基因可用于肝癌的基因治療。此外，細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)證明了JMJD8基因、蛋白或其激動(dòng)劑可用于肝癌的聯(lián)合化學(xué)治療。
文檔編號(hào)C12N5/09GK102735843SQ20111008039
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月31日
發(fā)明者何祥火, 趙瑩珺 申請(qǐng)人:上海市腫瘤研究所