專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)黃牛Dapperl基因單核苷酸多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測(cè)，特別涉及一種檢測(cè)黃牛Dapperl基因單核苷酸多態(tài)性的方法。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性(SNP)就是指基因組DNA序列中由于單個(gè)核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。在任何已知或未知的基因內(nèi)或附近都可能找到數(shù)量不等的SNPs，基因編碼區(qū)內(nèi)的SNPs(cSNPs)比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)的變異率僅占周?chē)蛄械?/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻具重要意義，因此倍受關(guān)注。近年來(lái)，人們發(fā)展了許多用于探尋分子遺傳標(biāo)記的方法，最常見(jiàn)的有單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)(SSCP)、直接測(cè)序技術(shù)和PCR-RFLP等，但SSCP操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，結(jié)果易造成誤判； 而直接測(cè)序技術(shù)成本又較高。PCR-RFLP方法是一種檢測(cè)SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)后使用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行切割，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，就能準(zhǔn)確地鑒別SNP位點(diǎn)。 PCR-RFLP方法不僅具有DNA測(cè)序法的準(zhǔn)確性，又克服了費(fèi)用昂貴、繁瑣操作、假陽(yáng)性的缺點(diǎn)，而且所檢測(cè)的序列位點(diǎn)無(wú)特殊性要求。Dapperl蛋白是一種信號(hào)調(diào)控分子。在爪蟾和斑馬魚(yú)等低等動(dòng)物中，Dapperl在早期胚胎發(fā)育的多個(gè)過(guò)程中起重要作用。目前，對(duì)于Dapperl基因的研究多在人類(lèi)和魚(yú)類(lèi)上， 主要在Wnt信號(hào)通路中的作用以及相關(guān)疾病發(fā)生機(jī)理等方面做了大量研究。國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)關(guān)于動(dòng)物Dapperl基因遺傳變異的研究。中國(guó)黃牛Dapperl基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匱乏， 該基因位點(diǎn)的功能研究及其遺傳變異與經(jīng)濟(jì)性狀(如體重和日增重等性狀)關(guān)聯(lián)的研究仍是空白。由于Dapperl基因功能涉及體重和日增重等生長(zhǎng)性狀，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法為Dapperl基因的SNP與生長(zhǎng)性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國(guó)黃牛生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問(wèn)題在于利用PCR-RFLP方法檢測(cè)黃牛Dapperl基因的多態(tài)性，并將其與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，驗(yàn)證其是否可以作為黃牛分子育種中輔助選擇的分子標(biāo)記， 從而加快良種選育速度。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種檢測(cè)黃牛Dapperl基因單核苷酸多態(tài)性的方法，以包含Dapperl基因的待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P1、P2、P3、P4為引物，PCR擴(kuò)增黃牛Dapperl基因；用限制性?xún)?nèi)切酶Ms 口、Hindll、NcoI, HhaI分別消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛Dapperl基因第8344位、第 8428位、第10513位、第10765位的單核苷酸多態(tài)性，所述的引物對(duì)Pl為上游弓丨物:gttgactgtt ccccctccac accac 25bp ；
下游弓丨物:gaggaacatt gggctctgca cggcccc ；27bp0所述的引物對(duì)P2為上游弓丨物:gaggagcggc ttggtaacca tgtca 25bp ；下游弓丨物cagcgttcac actggtcctc gg ； 22bp。所述的引物對(duì)P3為上游弓丨物:tgtgaagcag atacaagggg cagcc 25bp ；下游弓丨物:gtggcaaagg ttttagcgaa tcc ； 23bp。所述的引物對(duì)P4為上游弓丨物:tacccaacat tgatgccttt ttcgc 25bp ；下游弓丨物:caagacaggg tcagtggtcc aatc。 24bp0所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4°C 預(yù)變性 5min ；30 ；34 個(gè)循環(huán) 94°C 變性 30s，65 °C 退火 30s，72 °C 延伸 30s ； 72°C延伸 IOmin0所述的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為3.0%。所述的根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛Dapperl基因第8344位的單核苷酸多態(tài)性為T(mén)T基因型表現(xiàn)為159bp條帶；CT基因型表現(xiàn)為159bp、131bp和^bp條帶；CC基因型表現(xiàn)為131bp和^bp條帶。第84 位的單核苷酸多態(tài)性為T(mén)T基因型表現(xiàn)為211bp條帶；CT基因型表現(xiàn)為211bp、187bp和24bp條帶；CC基因型表現(xiàn)為187bp和24bp。第10513 位的單核苷酸多態(tài)性為GG基因型表現(xiàn)為206bp條帶；AG基因型表現(xiàn)為206bp、183bp和 23bp條帶；AA基因型表現(xiàn)為183bp和23bp。第10765位的單核苷酸多態(tài)性為CC基因型表現(xiàn)為242bp條帶；CG基因型表現(xiàn)為242bp、219bp和23bp條帶；GG基因型表現(xiàn)為219bp和 23bp0本發(fā)明根據(jù)Dapperl基因的序列設(shè)計(jì)引物，分別以5種黃牛品種的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序后得到黃牛Dapperl基因的部分序列。與 NCBI公布的序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)在第8344位、第8似8位、第10513位、第10765位存在SNP 多態(tài)性。針對(duì)上述四處SNP多態(tài)性，本發(fā)明還公開(kāi)了其篩查和檢測(cè)方法，通過(guò)設(shè)計(jì)特定的引物PCR擴(kuò)增特定的限制性?xún)?nèi)切酶酶切鑒定，能夠簡(jiǎn)單、快速、成本低、精確的檢測(cè)其單核苷酸的多態(tài)性。本發(fā)明對(duì)5個(gè)黃牛品種的SNP基因型進(jìn)行了檢測(cè)和基因頻率分析，對(duì)上述SNP位點(diǎn)與黃牛部分生長(zhǎng)性狀(體重和日增重等)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明該位點(diǎn)能夠作為提高黃牛生長(zhǎng)性狀的分子標(biāo)記。


圖1為黃牛Dapperl基因PCR產(chǎn)物電泳圖，其中圖la、IbUcUd分別為第8344位、 第8似8位、第10513位、第10765位的多態(tài)位點(diǎn)PCR產(chǎn)物電泳圖；圖2為黃牛Dapperl基因酶切電泳結(jié)果圖，其中圖2a、2b、2c、2d分別為黃牛 Dapperl基因包含第8344位、第8似8位、第10513位、第10765位的多態(tài)位點(diǎn)PCR產(chǎn)物的酶切電泳結(jié)果；
圖3為黃牛Dapperl基因SNP多態(tài)性測(cè)序結(jié)果圖，其中圖3a、;3b、3C、3d分別為黃牛Dapperl基因包含第8344位、第8似8位、第10513位、第10765位多態(tài)位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果圖，曲線(xiàn)上方的“方框”包括的堿基為突變堿基；圖4是本發(fā)明用來(lái)檢測(cè)SNP多態(tài)性的PCR引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增產(chǎn)物中SNP位點(diǎn)突變的示意圖，圖4a、4b、4c、4d分別檢測(cè)是黃牛Dapperl基因包含第8344位、第8似8位、第10513 位、第10765位多態(tài)位點(diǎn)的PCR引物設(shè)計(jì)，其中方框中表示突變位點(diǎn)、陰影部分為內(nèi)切酶識(shí)別序列，小寫(xiě)是引入的錯(cuò)配堿基。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明利用PCR-RFLP方法對(duì)黃牛Dapperl基因第8344位、第8似8位、第10513 位、第10765位的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，下面結(jié)合對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。a、黃牛Dapperl基因含第六外顯子和3端側(cè)翼區(qū)PCR引物的設(shè)計(jì)以NCBI所公布的牛(NC_007308. 4)序列為參考，利用I^rimer 5. 0設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增包含黃牛Dapperl基因第六外顯子和3端側(cè)翼區(qū)的PCR引物。擴(kuò)增第六外顯子的引物為上游弓丨物acaccacaat ctaattccct tgc23bp ；下游弓丨物cttaccttga agttcggtag cag ； 23bp0擴(kuò)增3端側(cè)翼區(qū)的引物為上游引物ggtggtgacagtgagtgga19bp ；下游弓丨物ttgggctaat gtttagatgg。20bp。以上述引物對(duì)黃?；蚪M擴(kuò)增，擴(kuò)增包含黃牛Dapperl基因(NC_007308. 4) 第六外顯子和3端側(cè)翼區(qū)片段，對(duì)擴(kuò)增的片段進(jìn)行測(cè)序鑒定后，在第六外顯子存在兩處SNP (NC_007308. 4 :8344C > T,8428C > Τ)，同時(shí)，在3端側(cè)翼區(qū)也存在兩處 SNP(NC_007308. 4 :10513A > G,10765C > G)。經(jīng)過(guò)分析，以上四處SNP不存在天然酶切位點(diǎn)，因此，通過(guò)設(shè)計(jì)引物P(PI、P2、P3、 P4)分別對(duì)四處SNP引入MspI、HindII、NcoI、HhaI酶切位點(diǎn)。b、以引物P進(jìn)行PCR擴(kuò)增待測(cè)黃牛的Dapperl基因片段1、黃牛樣本的采集本發(fā)明具體以5個(gè)中國(guó)地方黃牛品種的種群作為檢測(cè)對(duì)象，具體采集樣本見(jiàn)表1 表1黃牛樣本的采集品種樣品數(shù)樣品名稱(chēng)樣品來(lái)源采樣方式
郟縣紅牛河南省平頂山市郟縣(JX cattle)355血樣紅牛育種中心及各村鎮(zhèn)靜脈采血草原紅牛吉林省通榆縣三家子草原(CY cattle)235血樣紅牛保種場(chǎng)靜脈采血秦川牛陜西省秦川牛場(chǎng)、陜西省秦川(QC cattle)216血樣牛良種繁育中心和陜西省大荔縣靜脈采血南陽(yáng)牛河南省南陽(yáng)市黃牛良種(NY cattle)213血樣繁育場(chǎng)(國(guó)家級(jí)黃牛保種場(chǎng))靜脈采血魯西牛(LX cattJe)166血樣山東魯西牛原種場(chǎng)靜脈采血2、血樣基因組DNA的分離、提取、純化1)冷凍血樣(主要為血細(xì)胞)室溫解凍，轉(zhuǎn)移500 μ L至1. 5mLEppendorf離心管， 加入等體積PBS液，充分混勻，12000r/min離心IOmin (4°C )，棄去上清液，重復(fù)上述步驟至上清液透明、沉淀呈淡黃色；2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500 μ L，搖動(dòng)，使血細(xì)胞沉淀脫離離心管管壁， 37°C 水浴 Ih ；3)加蛋白酶K至3yL(20mg/mL)并混勻，55°C過(guò)夜至澄清，尚未澄清者，可補(bǔ)加 ι μ L蛋白酶κ混勻繼續(xù)消化直至澄清；4)將反應(yīng)液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500 μ L，溫和搖動(dòng)離心管20min，使其充分混勻；4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另一 1. 5mL離心管中，重復(fù)一次；5)加氯仿 500 μ L,充分混勻 20min,4°C，12000r/min 離心 IOmin,將上清液轉(zhuǎn)入另一 1. 5mL離心管中；6)加氯仿、異戊醇混合液(24 1) 500 μ L，充分混勻20min, 4°C，12000r/min離心 lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另一 1. 5mL離心管中；7)加0. 1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無(wú)水乙醇，混合轉(zhuǎn)動(dòng)離心管， 直至白色的絮狀沉淀析出，_20°C保存30 60min ；8) 40C，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；9) 40C，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈；10)干燥后的DNA溶于80 100 μ L的TE液，4°C保存直至DNA完全溶解，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，-80°C保存。11) 500 μ L的DNA溶液中加入10% SDS使其終濃度為0. 1 %，加入蛋白酶K至終濃度達(dá)到50 μ g/mL ；12) 5 °C 保溫 IOh 左右；13)等體積苯酚、氯仿、異戊醇05 24 1)和氯仿分別抽提一次；14) 12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另一離心管中；15)加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積冰冷無(wú)水乙醇沉淀DNA ；16)倒掉液體，70%乙醇洗滌后晾干，加入60 μ L滅菌超純水溶解，4°C待檢測(cè)。
3、PCR 擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系采用混合加樣法，即根據(jù)每一個(gè)反應(yīng)體系所需的各種組分的數(shù)量和 1次反應(yīng)所需的PCR反應(yīng)的個(gè)數(shù)，算出各種反應(yīng)組分的總量，加入到1個(gè)1. 5mL離心管中，充分混勻后瞬時(shí)離心，再分裝到每個(gè)0. 2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬時(shí)離心后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2:表2PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)黃牛Dapperl基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，以包含Dapperl基因的待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P1、P2、P3、P4為引物，PCR擴(kuò)增黃牛Dapperl 基因；用限制性?xún)?nèi)切酶Mspl、HindII, NcoI, HhaI分別消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛Dapperl基因第8344 位、第8似8位、第10513位、第10765位的單核苷酸多態(tài)性，所述的引物對(duì)Pl為上游引物gttgactgtt ccccctccac accac 下游引物:gaggaacatt gggctctgca cggcccc ； 所述的引物對(duì)P2為上游引物:gaggagcggc ttggtaacca tgtca 下游引物cagcgttcac actggtcctc gg ； 所述的引物對(duì)P3為上游引物:tgtgaagcag atacaagggg cagcc 下游引物:gtggcaaagg ttttagcgaa tcc ； 所述的引物對(duì)P4為上游引物tacccaacat tgatgccttt ttcgc 下游引物:caagacaggg tcagtggtcc aatc。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)黃牛Dapperl基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；30 ；34個(gè)循環(huán)94°C變性30s，65°C退火30s，72°C延伸30s ；72°C延伸 IOmin0
3.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)黃牛Dapperl基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為3. 0%。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)黃牛Dapperl基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于， 根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛Dapperl基因第8344位的單核苷酸多態(tài)性為T(mén)T基因型表現(xiàn)為159bp條帶；CT基因型表現(xiàn)為159bp、131bp和^bp條帶；CC基因型表現(xiàn)為131bp 和28bp條帶。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)黃牛Dapperl基因單核苷酸多態(tài)性的方法，第84 位的單核苷酸多態(tài)性為T(mén)T基因型表現(xiàn)為21 Ibp條帶；CT基因型表現(xiàn)為211bp、187bp和Mbp條帶；CC基因型表現(xiàn)為187bp和Mbp。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)黃牛Dapperl基因單核苷酸多態(tài)性的方法，第10513位的單核苷酸多態(tài)性為GG基因型表現(xiàn)為206bp條帶；AG基因型表現(xiàn)為206bp、183bp和23bp條帶；AA基因型表現(xiàn)為183bp和23bp。
7.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)黃牛Dapperl基因單核苷酸多態(tài)性的方法，第10765位的單核苷酸多態(tài)性為CC基因型表現(xiàn)為M2bp條帶；CG基因型表現(xiàn)為M2bp、219bp和23bp條帶；GG基因型表現(xiàn)為219bp和23bp。
8.權(quán)利要求1至7中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的檢測(cè)黃牛Dapperl基因單核苷酸多態(tài)性的方法在鑒定不同黃牛群體多態(tài)性中的診斷應(yīng)用。
9.權(quán)利要求8所述的診斷應(yīng)用，其特征在于，鑒定不同黃牛多態(tài)性是，黃牛Dapperl基因第8344位和第10513位的SNP作為在黃牛分子育種中輔助選擇的分子標(biāo)記，第8344位的CC基因型以及第10513位的AA基因型為提高黃牛體重和日增重的候選分子遺傳標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)黃牛Dapper1基因單核苷酸多態(tài)性的方法，以包含Dapper1基因的待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P(P1、P2、P3、P4)為引物，PCR擴(kuò)增黃牛Dapper1基因；用限制性?xún)?nèi)切酶MspI、HindII、NcoI、HhaI分別消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛Dapper1基因第8344位、第8428位、第10513位、第10765位的單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法為Dapper1基因的單核苷酸多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國(guó)黃牛肉用生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102206706SQ20111006269
公開(kāi)日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者張茜茜, 王璟, 王辰, 胡沈榮, 藍(lán)賢勇, 賴(lài)新生, 陳宏 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)