專利名稱：一種快速檢測(cè)山羊Six6基因單核苷酸多態(tài)性的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物分子育種領(lǐng)域，涉及基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測(cè)，特別涉及一種檢測(cè)山羊同源異型框Six6基因第232位(以序列Accession No. ΝΜ_001104993. 1 為參考)單核苷酸變異或SNP的方法，及其在動(dòng)物生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAQ育種中用于快速建立遺傳資源優(yōu)良的山羊種群。
背景技術(shù)：
山羊是人類的重要家畜物種資源之一，它在各國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)和人們生活中扮演著重要角色。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，社會(huì)對(duì)山羊產(chǎn)品的需求不斷加強(qiáng)，期望山羊育種專家盡快培育出更早、更好、更快地獲得山羊產(chǎn)品的優(yōu)良品種。在高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高效的山羊育種目標(biāo)上，山羊育種專家一直關(guān)注生長(zhǎng)發(fā)育性狀，但現(xiàn)在的問題是僅靠傳統(tǒng)育種手段不斷改良并提高這些性狀，顯然是不行的，還需要標(biāo)記輔助選擇(MAS)介導(dǎo)的現(xiàn)代分子育種技術(shù)的介入。數(shù)量遺傳學(xué)理論指出，生長(zhǎng)性狀是山羊有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的數(shù)量性狀之一，由微效多基因控制，其遺傳力較低，所以僅用常規(guī)育種手段對(duì)其改良、提高時(shí)遺傳進(jìn)展無疑是非常緩慢的，且效果不會(huì)理想。DNA標(biāo)記的出現(xiàn)為加速生長(zhǎng)性狀的遺傳進(jìn)展提供了可靠的手段和有力的保障，使標(biāo)記輔助選擇(MAQ育種成為一種具有廣闊前景的分子育種技術(shù)，因?yàn)镈NA標(biāo)記具有“多態(tài)性豐富、遺傳穩(wěn)定、不受組織、生理發(fā)育階段及環(huán)境影響” 等諸多優(yōu)點(diǎn)。為此，借助現(xiàn)代先進(jìn)的MAS育種手段對(duì)我國(guó)山羊品種進(jìn)行卓有成效的遺傳改良，找到山羊生長(zhǎng)發(fā)育性狀的分子標(biāo)記，是提高我國(guó)山羊生產(chǎn)水平，尤其是發(fā)育速度的根本途徑。然而目前，在利用MAS育種技術(shù)改良山羊生長(zhǎng)發(fā)育性狀的實(shí)踐中，首先需要在DNA水平上篩查和檢測(cè)與山羊生長(zhǎng)發(fā)育性狀密切相關(guān)的DNA標(biāo)記，其次是建立基因多態(tài)性的快速檢測(cè)方法，然后是基因多態(tài)與生長(zhǎng)發(fā)育性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)量遺傳學(xué)分析，從而實(shí)現(xiàn)MAS和實(shí)現(xiàn)早期診斷選擇。在山羊生長(zhǎng)發(fā)育性狀的MAS育種中，研究DNA標(biāo)記與目標(biāo)性狀之間的關(guān)系，有兩種基本方法候選基因分析和連鎖標(biāo)記分析。在動(dòng)物研究中，候選基因分析比連鎖標(biāo)記分析更易操作，且不需要進(jìn)行特意實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、費(fèi)用低、統(tǒng)計(jì)功效強(qiáng)，被廣泛采用，適用于任何可取得基因型和表型數(shù)據(jù)的群體。該方法通過統(tǒng)計(jì)方法建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，從而確定該候選基因與未知基因的關(guān)系或效應(yīng)。一般而言，候選基因通常是一些與研究性狀生長(zhǎng)發(fā)育過程有關(guān)的基因，可能是結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因或是在生化代謝途徑中影響該性狀表達(dá)的基因。在本發(fā)明中，Six同源框(Six-homeobox)基因家族符合山羊生長(zhǎng)發(fā)育性狀的重要候選基因的要求。Six同源框基因家族是一類處于哺乳和脊椎動(dòng)物垂體內(nèi)的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，被命名為Six基因Wajima et al，2010)。目前在小鼠、人、雞、青蛙、線蟲和果蠅等物種中均已鑒定出該類基因。至今，在脊椎動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)了至少6個(gè)成員因子Sixl、Six2、Six3、 Six4、Six5和Six6，分為3大亞家族，即Sixl/2、Six3/6和Six4/5。該家族基因所編碼氨基酸的結(jié)構(gòu)域基本相似，分為N-端結(jié)構(gòu)域(NT)、Six蛋白互作域(SD)、Homeobox同源結(jié)構(gòu)域 (HD)和C-端結(jié)構(gòu)域(CT)。2009年，Kumar等揭示了該家族基因所編碼的轉(zhuǎn)錄因子在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、垂體前葉正常發(fā)育、垂體機(jī)能衰退、癌癥和腫瘤等方面發(fā)揮著重要的作用。作為Six家族中一個(gè)新同系物成員，Six6基因(又名0PTX2和Six9)與Six3基因緊密相關(guān)，其編碼氨基酸含有兩個(gè)高度保守的HDs結(jié)構(gòu)域和SDs結(jié)構(gòu)域。人Six6基因定位于染色體14q22. 3_q23，DNA序列全長(zhǎng)2567bp，含有2個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子，共編碼246個(gè)氨基酸。牛Six6基因定位于10號(hào)染色體上，DNA序列全長(zhǎng)共2574bp，包括3個(gè)外顯子和2 個(gè)內(nèi)含子，共編碼222個(gè)氨基酸。Six6基因的主要功能是調(diào)控垂體早期特克氏囊中細(xì)胞分化及垂體前葉細(xì)胞的形成，為是一個(gè)缺陷相關(guān)的重要候選基因。Six6基因的表達(dá)比較不廣泛，主要表達(dá)在發(fā)育的下丘腦、垂體等區(qū)域。已有研究表明，缺乏Six6轉(zhuǎn)錄因子的動(dòng)物常會(huì)出現(xiàn)垂體發(fā)育不全和視網(wǎng)膜與視神經(jīng)缺陷等癥狀；在正常發(fā)育過程中，Six6主要作用機(jī)理是通過與輔阻遏蛋白Tlel和Dachl互作來抑制P27Kipl啟動(dòng)子，而該啟動(dòng)子自身就是胚胎發(fā)育中垂體前體細(xì)胞分化和視網(wǎng)膜的抑制劑；feillardo等Q001)揭示Six6基因的缺失或單倍劑量不足，都將會(huì)導(dǎo)致垂體異常和雙邊無眼畸形。在成年鼠大腦中，Six6基因與Six3 基因在胚胎發(fā)育早期的神經(jīng)板區(qū)域重疊表達(dá)，隨著胚胎的發(fā)育開始分離成不同的區(qū)域，其中，Six6則主要分布在丘腦和小丘腦區(qū)域，提示Six6在腦發(fā)育過程中具有重要作用(Conte et al.，2005)。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是指DNA序列上發(fā)生的單個(gè)核苷酸堿基之間的變異，在人群中這種變異的發(fā)生頻率至少大于1%，它是基因組中存在的一種數(shù)量非常豐富的變異形式，占人類基因組中遺傳多態(tài)性的90%以上。由于SWs是二等位基因分子標(biāo)記，所以，理論上在一個(gè)二倍體生物群體中，SNPs可能是由2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)等位基因構(gòu)成，但實(shí)際上3 個(gè)或4個(gè)等位基因的SNPs極其罕見，故SNPs通常被簡(jiǎn)單地稱為二等位基因分子標(biāo)記。根據(jù)SNI3s在基因組中分布的位置，可分為基因編碼區(qū)SNPs (cSNPs)、基因周邊SNPs (pSNPs)和基因間SNPs(iSNPs)等三類?？傮w而言，cSNP比較少，又分為同義cSNPs和錯(cuò)義cSNPs，而 PSNP和iSNP較多。就SNP得生物功能而言，錯(cuò)義cSNPs涉及堿基序列的改變，將導(dǎo)致編碼氨基酸的改變，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列的改變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能；同義cSNP雖然未能改變目的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，但有研究顯示同義突變會(huì)影響目的蛋白質(zhì)的翻譯效率，進(jìn)而對(duì)基因功能產(chǎn)生重要影響；pSWs和iSWs產(chǎn)生功能的機(jī)制主要是影響轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的的結(jié)合能力從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，或者內(nèi)含子區(qū)域SNP產(chǎn)生功能的分子機(jī)制是與附近其它基因SNP連鎖或者可能影響mRNA的剪接從而影響蛋白質(zhì)的功能。不僅如此，在群體遺傳研究中，這些SNPs作為遺傳標(biāo)記在群體遺傳和生物進(jìn)化的研究中也具有重要意義。 因此，SNP在遺傳病和育種的研究中卻具重要意義，倍受動(dòng)物育種專家的青睞。目前，主要采用幾種不同的路線來發(fā)現(xiàn)SNPs 即DNA序列測(cè)定方法、PCR-SSCP與 DNA測(cè)序結(jié)合法、AS-PCR方法、引物延伸法、寡核苷酸連接反應(yīng)、PCR-RFLP和引入突變位點(diǎn)的-PCR-RFLP(Forced-PCR-RFLP)法等(Liu et al，2010)。在這些 SNP 檢測(cè)技術(shù)中，DNA 序列測(cè)定法是最為準(zhǔn)確的SNP檢測(cè)方法，但是，其檢測(cè)費(fèi)用極其昂貴，且需要有DNA測(cè)序儀等大型儀器，同時(shí)，在測(cè)序過程中需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗(yàn)，故DNA序列測(cè)定法不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的理想SNP檢測(cè)方法；利用PCR-SSCP與DNA測(cè)序結(jié)合法檢測(cè)SNP可以適當(dāng)降低檢測(cè)費(fèi)用，但是，PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)過程比較長(zhǎng)，操作比較繁瑣，且實(shí)驗(yàn)過程中存在假陽性問題，所以，也并非理想的SNP檢測(cè)手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測(cè)方法，在未來的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設(shè)計(jì)特別的引物，且只能針對(duì)特定的基因位點(diǎn)，同時(shí)，檢測(cè)過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點(diǎn)；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)SNP位點(diǎn)，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、 微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測(cè)平臺(tái)，對(duì)于一般的分子實(shí)驗(yàn)室來說可實(shí)施性不強(qiáng)。PCR-RFLP 和R)rced-PCR-RFLP方法是一種檢測(cè)SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)后使用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割，然后進(jìn)行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準(zhǔn)確地鑒別SNP位點(diǎn)，它們不僅具有DNA測(cè)序法的準(zhǔn)確性，又克服了費(fèi)用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點(diǎn)，而且所檢測(cè)的序列位點(diǎn)無特殊性要求。但是由于通常的PCR-RFLP分析受到特定的自然酶切位點(diǎn)的限制， 故在實(shí)際應(yīng)用中受到了一定的限制，不過，F(xiàn)orced PCR-RFLP由于可以通過設(shè)計(jì)引物過程中進(jìn)行定點(diǎn)突變從而使新的人工引入突變與待檢測(cè)突變構(gòu)成一個(gè)新的酶切位點(diǎn)。因此， Forced-PCR-RFLP的使用性和廣泛性受到科研工作者的熱切關(guān)注。目前，關(guān)于Six6基因SNP研究，多見于人、小鼠、海洋魚等生物的體外表達(dá)分析， 且常被作為器官機(jī)能缺陷和重要的疾病預(yù)測(cè)相關(guān)的候選基因，而鮮見于家畜和家禽SNP分析，目前在山羊中還未見相關(guān)報(bào)道。中國(guó)山羊Six6基因SNP領(lǐng)域的研究匱乏，基因位點(diǎn)的功能研究及其遺傳變異與生長(zhǎng)發(fā)育(如體重、體斜長(zhǎng)、胸圍等性狀)的關(guān)聯(lián)研究仍是空白。 在動(dòng)物生產(chǎn)實(shí)踐中，由于Six6基因SNP位點(diǎn)對(duì)形成胚胎、調(diào)控生長(zhǎng)激素和促進(jìn)垂體分泌激素等具有重要的作用，為此，本發(fā)明提供了一種引入突變位點(diǎn)的forced PCR-RFLP方法快速 Six6基因SNP，同時(shí)分析SNP與生長(zhǎng)性狀關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)可以作為提高山羊管圍的分子遺傳標(biāo)記，在中國(guó)山羊生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAQ育種中，將有利于快速建立遺傳資源優(yōu)良的山羊種群。主要參考文獻(xiàn)Conte I，Morcillo J, Bovolenta P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics, 2005,234 :718-725Kumar JP. The sine oculis homeobox(Six)famiIy of transcription factors as regulators of development and disease. Cellular and Molecular Lift Sciences, 2009,66 :565-583.Liu Y,Li M,Cheung,YM. Sham PC,Michael KN. SKM-SNP :SNP markers detection method. Journal of Biomedical Informatics,2010,43(2) :233-239.Yajima H, Motohashi N, Ono Y, Sato S, Ikeda K, Masuda S, Yada E, Kanesaki Hi, Miyagoe-Suzu ki Y, Takeda Si, Kawakami K. Six family genes control the proliferation and differentiation of muscle satellite cells. Experimental Cell Research,2010，316(17) :2932-2944.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于利用forced PCR-RFLP方法檢測(cè)山羊Six6基因的多態(tài)性， 并將其與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，驗(yàn)證其是否可以作為山羊分子育種中輔助選擇的分子標(biāo)記，從而加快良種選育速度。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種檢測(cè)山羊Six6基因單核苷酸多態(tài)性的方法，以包含Six6基因的待測(cè)山羊全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增山羊Six6基因；用限制性內(nèi)切酶I^stI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定山羊基因NM_001104993. 1 :g. 232位的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對(duì)P為上游引物5，-TCCTCCAATCCCTCCCG-3，17nt ；下游引物5，-AACATCGAGGCAGCGCCGGCGACTGC-3，26nt。所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性 5min ；30 35 個(gè)循環(huán) 94°C變性 30s, 51. 3°C退火 30s，72°C延伸 30s ； 72°C延伸 IOmin0所述的瓊脂糖凝膠電泳為3. 5%的瓊脂糖凝膠電泳。所述根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定山羊Six6基因第232位的單核苷酸多態(tài)性為 CC基因型表現(xiàn)為184bp條帶；CT基因型表現(xiàn)為184bp、156bp和^bp條帶；TT基因型表現(xiàn)為156bp和^bp條帶。其中，28bp條帶在3. 5%瓊脂糖凝膠電泳中因片段太小不可見，但不影響鑒定基因型。本發(fā)明根據(jù)Six6基因的序列設(shè)計(jì)引物，分別以5個(gè)山羊品種的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序后得到山羊Six6基因的部分序列。與NCBI 公布的序列進(jìn)行比較后，發(fā)現(xiàn)在第232位存在SNP多態(tài)性。針對(duì)上述第232位的SNP多態(tài)性，本發(fā)明還公開了其篩查和檢測(cè)方法，通過設(shè)計(jì)特定的引物，PCR擴(kuò)增目的片段，然后用特定的限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，能夠簡(jiǎn)單、快速、成本低、精確的檢測(cè)其單核苷酸的多態(tài)性。本發(fā)明對(duì)5個(gè)山羊品種的SNP基因型進(jìn)行了檢測(cè)和基因頻率分析，對(duì)上述SNP位點(diǎn)與山羊一些生長(zhǎng)性狀(成年體重、體高、體斜長(zhǎng)、胸圍、胸深、胸寬、腰角寬、管圍、體軀指數(shù)、體長(zhǎng)指數(shù)、胸圍指數(shù)、管圍指數(shù)、胸寬指數(shù)和髖骨指數(shù))進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明該位點(diǎn)可以作為山羊管圍性狀的分子標(biāo)記。


圖1為山羊Six6基因第232位CC基因型個(gè)體的測(cè)序圖；帶框的字母g表示該位點(diǎn)發(fā)生突變?chǔ)琠001104993. 1 :g. 232C ；藍(lán)線表示C堿基的測(cè)序峰，紅線代表T堿基的測(cè)序峰；黑線代表G堿基的測(cè)序峰；綠線代表A堿基的測(cè)序峰)圖2為山羊Six6基因第232位CT基因型個(gè)體的測(cè)序圖；帶框的字母_表示該位點(diǎn)發(fā)生突變:ΝΜ_001104993. 1 :g. 232C > T ；圖3為山羊Six6基因的PCR產(chǎn)物電泳(1_7分別表示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；Marker I大校分別是 600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 和 IOObp)；圖4為山羊Six6基因第232位不同基因型PCR產(chǎn)物的I^stI酶切電泳結(jié)果(泳道1 為CC基因型；泳道2,3,4均為CT基因型；Marker為Markerl，分別是600bp、500bp、400bp、 300bp、200bp 和 IOObp)；
圖5為山羊Six6基因Forced PCR-RFLP中的序列分析圖，采用PstI Forced PCR-RFLP 方法檢測(cè)山羊 Six6 基因 5，UTR 和部分 Exonl (NMJ)Ol 104993. 1 :g. 232C > Τ)，
圖中，[NNNN^分別對(duì)應(yīng)表示上游和下游引物序列；CTGCAG表示I^stI內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)；
■或0表示突變位點(diǎn)，為ΝΜ_001104993. 1 g. 232C > T ；陰影A表示引入的突變堿基。 kquencel 為 ΝΜ_001104993. 1 序列(Six6 基因序列)Jequence 2 為山羊 Six6 基因 5，UTR 區(qū)域的NM_001104993. 1 :g. 232C等位基因的序列Jequence3為山羊Six6基因5，UTR區(qū)域的ΝΜ_001104993. 1 :g. 232T等位基因的序列。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明利用i^orced PCR-RFLP方法對(duì)山羊Six6基因5，UTR和部分Exonl區(qū)域的第232位突變的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，下面對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。I、山羊Six6基因部分DNA序列的克隆與DNA測(cè)序1、山羊樣品的采集及處理本發(fā)明采用了 5種山羊品種共計(jì)619個(gè)個(gè)體，包括3個(gè)肉用山羊品種和2個(gè)絨山羊品種，具體為(1)無血緣關(guān)系的海南黑山羊(HNBG)耳組織樣品269份采自海南?。?2)無血緣關(guān)系的徐淮山羊(XH)耳組織樣品35份，采自江蘇省；(3)無血緣關(guān)系的徐淮山羊(BJ) 肌肉樣品21份，采自貴州?。?4)無血緣關(guān)系的陜北白絨山羊(SBWC)耳組織樣品201份， 采自陜西省白絨山羊場(chǎng)；( 無血緣關(guān)系的新疆白絨山羊(XJWC)耳組織樣品93份，采自新疆自治區(qū)。取山羊耳組織樣，在70%乙醇保存，冰盒低溫帶回實(shí)驗(yàn)室，-80°C保存?zhèn)溆谩?、基因組DNA的提取參考文獻(xiàn)Sambrock et al (2002)方法。3、DNA池的構(gòu)建用紫外光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品在洸0歷、280歷處的OD值。計(jì)算DNA含量和ODaitl/ OD280的比值，DNA濃度(ng) = 50 X OD260值X稀釋倍數(shù)。如OD260/OD280比值小于1. 6，說明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)或酚，則應(yīng)進(jìn)行純化；若比值大于1.8，則應(yīng)該考慮去除RNA純化。 DNA檢測(cè)完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/yL，然后從海南黑山羊群體中隨機(jī)選擇100個(gè)濃度為50ng/ μ L DNA樣品中取10 μ L混合構(gòu)建成品種DNA池；按照同樣的方法，也構(gòu)建徐淮山羊、板角山羊、陜北白絨山羊和新疆白絨山羊群體的DNA池。4、擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)(1)山羊Six6基因5’ UTR和第1外顯子區(qū)域PCR引物的設(shè)計(jì)以NCBI所公布的牛(NMJ)Ol 104993. 1)序列為參考，利用I^rimer 5. 0軟件設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增包含山羊Six6基因5’ UTR和第1外顯子區(qū)域的PCR引物，其引物序列如下SIX6-E1F 5' -TCC TCC AAT CCC TCC CG-3' (Accession No. ΝΜ_001104993. 1, nt 75-91)，17nt ；SIX6-E2R 5 ‘ -CGT TCA AGG CTC GGA GGT CTA T-3 ‘ (Accession No. ΝΜ_001104993. 1, nt 835-858)，22nt。以上述引物對(duì)山羊池DNA的混合基因組擴(kuò)增，能夠擴(kuò)增包含山羊Six6基因(NMJ)Ol 104993. 1序列)Six6基因5，UTR和第1外顯子區(qū)域第75bp 858bp的784bp的基因片段，擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、測(cè)序，獲得測(cè)序結(jié)果。對(duì)山羊Six6基因目的片段784bp 測(cè)序峰圖進(jìn)行分析，其中在測(cè)序片段的第158位點(diǎn)(NMJ)Ol 104993. 1 :g. 232)有兩個(gè)不同峰單核苷酸測(cè)序峰，說明第158位存在單核苷酸突變?chǔ)琠001104993. 1 :g. 232C > T，但不能形成任何酶切位點(diǎn)。故采用forced PCR-RFLP技術(shù)引入突變堿基從而構(gòu)成酶切位點(diǎn)。(2)山羊Six6基因forced PCR-RFLP分析中引入突變酶切位點(diǎn)的引物P的設(shè)計(jì)上游引物5，-TCCTCCAATCCCTCCCG-3，20bp ；下游引物5，-AACATCGAGGCAGCGCCGGCGACTQ C-3， 26bp。其中下游引物3’端起第2位引入錯(cuò)配堿基T >A，從而人為構(gòu)建了一個(gè)I^stI的酶切位點(diǎn)CTGCAG，可以使用forced PCR-RFLP方法進(jìn)行基因型的判定。以上述引物對(duì)山羊基因組擴(kuò)增，能夠擴(kuò)增包含山羊Six6基因(NMJ)Ol 104993. 1序列)Six6基因5，UTR和第1外顯子區(qū)域第73bp 256bp的184bp的基因片段，擴(kuò)增后片段的電泳檢測(cè)如圖1所示；當(dāng)?shù)?32位為T時(shí)，PCR擴(kuò)增Six6基因產(chǎn)物的第23Ibp 236bp序列為CTGCAG， 形成了限制性內(nèi)切酶I3StI的酶切位點(diǎn)CT/GCAG，當(dāng)在232位點(diǎn)由T突變?yōu)镃時(shí)，PCR擴(kuò)增 Six6基因產(chǎn)物的第231bp 236bp序列序列為CCGCAG，限制性內(nèi)切酶I3StI不能識(shí)別；這樣就可以對(duì)該位點(diǎn)SNP多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)用限制性內(nèi)切酶I^stI對(duì)引物P擴(kuò)增的基因片段進(jìn)行酶切消化時(shí)，可以將PCR產(chǎn)物切成3個(gè)片段、2個(gè)片段或不能切開。5、？0 克隆山羊的5丨乂6基因分別以5個(gè)山羊品種的DNA池為模板，用上述設(shè)計(jì)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 總反應(yīng)體系為25 μ L，包括0. 625U Taq DNA聚合酶(北京天根科技有限公司)，2XBuffer 12. 5 μ L〈內(nèi)含Mg++、dNTPs> (北京天根科技有限公司Mix)，0. 45 μ L山羊基因組DNA， IOpmol/μ L上、下游引物各0. 5μ L和滅菌超純水10. 8 μ L ；PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；；35個(gè)循環(huán)94°C變性30s，51. 6°C退火30s，72°C 延伸 30s ；72°C延伸 IOmin06、PCR產(chǎn)物純化和測(cè)序PCR擴(kuò)增完成之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的切膠回收及純化在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1. 5mL離心管中，然后用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒(北京天根生物公司)純化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說明書操作。把以5個(gè)品種DNA池為模板的PCR純化產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。對(duì)山羊Six6基因目的片段184bp測(cè)序峰圖進(jìn)行分析，其中在同一位點(diǎn)有兩個(gè)不同峰的是發(fā)生了單核苷酸突變；如圖3中CT型的第158位發(fā)生了單核苷酸的突變，出現(xiàn)了 C、T兩種檢測(cè)結(jié)果，即本發(fā)明篩查到了山羊Six6基因的SNP多態(tài)性，在山羊Six6基因第158位 (對(duì)應(yīng)于ΝΜ_001104993. 1第232位)為C或T的核苷酸多態(tài)性.當(dāng)?shù)?58位由C突變?yōu)門時(shí)，PCR擴(kuò)增Six6基因產(chǎn)物的第157bp 162bp序列為 C g GCAG，形成了限制性內(nèi)切酶I3StI的酶切位點(diǎn)CT/GCAG，當(dāng)在158位點(diǎn)由C突變?yōu)镃時(shí)， PCR擴(kuò)增Six6基因產(chǎn)物的第157bp 162bp序列序列為cgGCAG，限制性內(nèi)切酶I3StI不能識(shí)別；這樣就可以對(duì)該位點(diǎn)SNP多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。
當(dāng)用限制性內(nèi)切酶I^stI對(duì)引物P擴(kuò)增的基因片段進(jìn)行酶切消化時(shí)，可以將PCR產(chǎn)物切成2段或不能切開。II、山羊Six6基因C > T突變多態(tài)性的Forced-PCR-RFLP檢測(cè)1、多態(tài)位點(diǎn)分析當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的第158位點(diǎn)發(fā)生C > T突變時(shí)，即C突變?yōu)門，原來C g GCAG序
列相應(yīng)地變成Cg GCAG，從而形成了 I^stI限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列。2、PCR反應(yīng)條件PCR產(chǎn)物擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件分別如前面所述，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1. 0%瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖2所示，可以清晰的看到184bp的條帶。3、PCR產(chǎn)物酶切及RFLP檢測(cè)對(duì)于PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物首先分別進(jìn)行I^stI酶切，然后根據(jù)電泳結(jié)果判定其SNP多態(tài)性。20μ L 的 PstI 酶切體系為10μ L PCR 產(chǎn)物，10XBuffer(含 BSA)2. 0μ L， PstI (IOU/ μ L) 1. OuL, 7. OyL滅菌雙蒸水。將樣品混勻后離心，37°C恒溫培養(yǎng)箱中消化5 IOh, 3. 5%的瓊脂糖凝膠，120V電壓電泳池，EB染色檢測(cè)酶切結(jié)果，用Kodak DC 120凝膠成像分析系統(tǒng)照相分析，并判型、記錄其基因型。由于擴(kuò)增的184bp片段中第157-162位含有一個(gè)I^stI的酶切位點(diǎn)，故多態(tài)位點(diǎn)含有“T”的個(gè)體的PCR產(chǎn)物會(huì)被I^stI切成兩段(184bp， 156bp，28bp)，但由于^bp太短而在電泳圖中看不見，故在實(shí)際的電泳分析中，只能觀察到兩條帶；含有“C”的個(gè)體的PCR產(chǎn)物會(huì)被I^stI切成一段(184bp)。由于山羊?yàn)槎扼w動(dòng)物，當(dāng)發(fā)生C > T突變時(shí)，可形成不同的基因型，分別為CC、 CT和TT ；可以通過其酶切后的電泳圖來進(jìn)行判別，如圖3所示，其中各個(gè)泳道從左到右依次為CC基因型、CT基因型、DNA Maker I、CT基因型、CT基因型(其條帶分布由上到下依次為 600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和IOObp)。根據(jù)條帶的個(gè)數(shù)和條帶的大小，如圖3和圖 4，就能夠判定第158位的堿基類型，從而檢測(cè)其SNP。III、本發(fā)明制備的分子標(biāo)記在不同山羊群體多態(tài)性中的診斷應(yīng)用1、群體多態(tài)性中的診斷利用上述的SNP多態(tài)性檢測(cè)方法對(duì)5個(gè)山羊品種的DNA樣品(海南黑山羊
份、徐淮山羊35份、板角山羊21份、陜北白絨山羊201份和新疆白絨山羊93份)分別進(jìn)行 Forced PstI-RFLP(圖3)的基因型的鑒定。2、SNP位點(diǎn)的頻率統(tǒng)計(jì)分析基因型頻率是指一個(gè)群體中某一性狀的某種基因型個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)的比率。Paa =1/N，其中Paa代表某一位點(diǎn)的AA基因型頻率Aaa表示群體中具有AA基因型的個(gè)體數(shù)； N為檢測(cè)群體的總數(shù)量。基因頻率是指一個(gè)群體中某一基因數(shù)對(duì)其等位基因總數(shù)的相對(duì)比率。計(jì)算的公式
可以寫成PA = (2NM+NAal+NAa2+......+NAan)/2N。式中，Pa表示等位基因A頻率，^a表示群
體中具有AA基因型的個(gè)體數(shù)量，NAai表示群體中具有Aai基因型個(gè)體數(shù)量，al-an為等位基因A的η個(gè)不同的復(fù)等位基因。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。表1 5個(gè)山羊品種中Six6基因I^stI位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率
權(quán)利要求
1.一種快速檢測(cè)山羊Six6基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，以包含Six6基因的待測(cè)山羊全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增山羊Six6基因；用限制性內(nèi)切酶I3StI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定山羊Six6基因第232位的單核苷酸多態(tài)性，所述的引物對(duì)P為上游引物5 ’ TCCTCCAATCCCTCCCG-3 ’17nt ；下游引物5，-AACATCGAGGCAGCGCCGGCGACTGC-3，26nt0
2.如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)山羊Six6基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于， 所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；35個(gè)循環(huán)94°C變性30s，51. 6°C退火30s，72°C延伸30s ；72°C延伸 IOmin0
3.如權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)山羊Six6基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述的瓊脂糖凝膠電泳為3. 5%瓊脂糖凝膠電泳。
4.如權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)山羊Six6基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定山羊Six6基因第232位的單核苷酸多態(tài)性為CC基因型表現(xiàn)為184bp條帶；CT基因型表現(xiàn)為184bp、156bp和^bp條帶；TT基因型表現(xiàn)為156bp 和^bp條帶，其中，28bp條帶在3. 5%瓊脂糖凝膠電泳中因片段太小不可見，但不影響鑒定基因型。
5.權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的快速檢測(cè)山羊Six6基因單核苷酸多態(tài)性方法在鑒定不同山羊群體多態(tài)性中的診斷應(yīng)用。
6.權(quán)利要求5所述的診斷應(yīng)用，其特征在于，鑒定不同山羊群體多態(tài)性是，山羊Six6基因第232位SNP作為一個(gè)在山羊生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇育種中提高山羊管圍的分子遺傳標(biāo)記，CT基因作為一個(gè)提高山羊管圍的分子遺傳標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)山羊同源異型框6(six6)基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法，以包含Six6基因的待測(cè)山羊全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增山羊Six6基因；用限制性內(nèi)切酶PstI消化PCR產(chǎn)物后，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)電泳結(jié)果鑒定山羊Six6基因第232位的基因型(以序列Accession No.NM_001104993.1為參考)；在動(dòng)物生產(chǎn)實(shí)踐中，由于Six6基因單核苷酸變異或SNP對(duì)形成胚胎、調(diào)控生長(zhǎng)激素和促進(jìn)垂體分泌激素等具有重要的作用，故將該位點(diǎn)不同基因型與生長(zhǎng)發(fā)育性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CT基因型個(gè)體的管圍顯著大于CC基因型個(gè)體(P＝0.047)，說明CT基因型可以作為一個(gè)提高山羊管圍的分子遺傳標(biāo)記。故本發(fā)明提供的快速檢測(cè)Six6基因SNP的檢測(cè)方法，在中國(guó)山羊生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)育種中，有利于快速建立遺傳資源優(yōu)良的山羊種群。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102260734SQ20111006269
公開日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者淮永濤, 潘傳英, 藍(lán)賢勇, 陳宏 , 雷初朝 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)