專利名稱：光合作用相關(guān)的蛋白ppd1的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及光合作用相關(guān)的蛋白PPDl的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
緑色植物(包括藻類)的光合作用是指它們在光照下利用CO2和H2O合成有機(jī)物質(zhì)，并釋放出氧氣的過程。植物的光合作用不僅是一個(gè)規(guī)模巨大的能量轉(zhuǎn)換過程，它合成的有機(jī)物質(zhì)也是人類生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是農(nóng)業(yè)、林業(yè)和其他一切種植業(yè)、畜牧業(yè)以及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的物質(zhì)基礎(chǔ)。人們研究光合作用的目的，不僅在于掲示自然界這ー特異的生命活動(dòng)規(guī)律，而且企圖模擬這ー過程，提高光能轉(zhuǎn)換效率，使人類獲取更大的經(jīng)濟(jì)效益(匡廷云，2003，光合作用原初光能轉(zhuǎn)化過程的原理與調(diào)控，江蘇科學(xué)技術(shù)出版社)。
光合膜是光合作用原初光能轉(zhuǎn)化過程的場所。植物吸收的光能通過光合膜上電子傳遞和光合磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能。高等植物類囊體膜上的超分子蛋白復(fù)合物主要包括PSII，PSI，Ctyb6f以及ATP合成酶。植物吸收的光能經(jīng)常超過光合作用所能利用的能量，此時(shí)葉綠體中會產(chǎn)生大量的活性氧分子，活性氧會對類囊體膜上的蛋白復(fù)合物產(chǎn)生傷害，尤其對光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II的傷害最為嚴(yán)重(Asada K. 1999, Annu Rev PlantPhysiol PlantMol Biol, 50 :601-639) ο植物在長期的進(jìn)化過程中產(chǎn)生了許多光保護(hù)機(jī)制，其中就有許多蛋白參與蛋白復(fù)合體的修復(fù)以及組裝過程(Apel K. and Hirt H. 2004, Annu Rev PlantBiol,55 :373-399)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供PPDl蛋白的編碼基因在保護(hù)植物光系統(tǒng)I光合功能中的應(yīng)用。進(jìn)ー步講，上述保護(hù)光系統(tǒng)I光合功能可以是恢復(fù)突變體黃化苗為綠色苗。具體地講，上述應(yīng)用是將所述PPDl蛋白的編碼基因?qū)隤PDl降低的擬南芥突變體中的。上述PPDl蛋白是如下I)或2)蛋白I)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與I)活性相同的由I)衍生的蛋白質(zhì)。在實(shí)施例中，上述PPDl蛋白的編碼基因的編碼序列是序列表中序列I。更進(jìn)ー步講，上述PPDl蛋白的編碼基因是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述PPDl降低的擬南芥突變體中的；所述重組表達(dá)載體是將所述PPDl蛋白的編碼基因插入PCAMBIA1301的多克隆位點(diǎn)間構(gòu)成的重組載體。上述PPDl降低的擬南芥突變體是來自SALK_143493C的純合株系。我們?yōu)榱搜芯抗獗Ｗo(hù)和調(diào)控的機(jī)理，以模式生物擬南芥為材料，從美國ABRC (Arabidopsis Biological Resource Center)購買定位于葉綠體的核編碼基因的突變體，篩選到了一個(gè)參與光系統(tǒng)I合成和保護(hù)的突變體，該突變體的AT4gl5510位點(diǎn)的內(nèi)含子中由于插入了 T-DNA，導(dǎo)致成熟RNA和蛋白含量的降低，致使光系統(tǒng)I的合成受到影響，光敏感性増加，植物不能自養(yǎng)。該基因序列中推測含有PsbP結(jié)構(gòu)域，被命名為PPDl(PsbPdomain containing),其功能目前未知。PsbP蛋白是光系統(tǒng)II放氧復(fù)合物的外周蛋白，對于維護(hù)放氧復(fù)合物的穩(wěn)定具有重要作用。實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)基因后，可以得到基因T-DNA插入純合突變體的轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)株系，黃化苗的表型恢復(fù)成緑色(圖4)，并且能夠在土里自養(yǎng)，表明PPDl蛋白能夠保護(hù)光系統(tǒng)I的正常光合功能。


圖I為突變體的生長表型。圖2為77K熒光激發(fā)光譜。圖3WeStern-Bl0t檢測不同光強(qiáng)下光合膜蛋白含量變化，光強(qiáng)正常光，100 μ molm 2S 1 ;イ氐光，60 μ mol m 2S 1 ;高光，250 μ mol m 2S115 圖4為互補(bǔ)株系的表型。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例I、基因功能的發(fā)現(xiàn)過程I、突變體材料的鑒定購買回來的突變體種子(ABRC，SALK_143493C)在MS培養(yǎng)基上生長，發(fā)現(xiàn)其中有黃苗(圖I)，4周后移至營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)黃苗致死，從DNA水平上通過PCR方法鑒定外源T-DNA插入情況，發(fā)現(xiàn)純合體的PPDl基因的第二個(gè)內(nèi)含子中有外源T-DNA插入，雜合體的后代分離出黃苗，而且綠苗和黃苗的比例接近3 1，說明是單基因決定的表型。我們進(jìn)ー步對黃苗從基因表達(dá)水平上進(jìn)行鑒定，半定量RT-PCR和Q-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)成熟的轉(zhuǎn)錄本RNA降低到野生型的1/3水平，ffestern-blot結(jié)果表明突變體中PPDl蛋白含量也降低到野生型的1/3。以上結(jié)果表明外源T-DNA的插入造成基因表達(dá)的下降，從而造成了黃化表型。2、葉綠素突光參數(shù)測定對在培養(yǎng)基中生長3周的幼苗進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定，幾乎檢測不到突變體在810nm激發(fā)的P700吸收，表明光系統(tǒng)I功能的缺失是導(dǎo)致黃化表型的主要原因。77K低溫?zé)晒饪梢詸z測激發(fā)能在捕光色素復(fù)合物和光系統(tǒng)I反應(yīng)中心的傳遞過程，突變體中發(fā)生藍(lán)移的結(jié)果表明PPDl影響了光系統(tǒng)I的功能(圖2)。3、生理生化檢測為了進(jìn)一歩分析PPDl蛋白對光合作用的影響，我們檢測了三種不同光照強(qiáng)度下幼苗的光合膜蛋白的積累情況，結(jié)果如圖3所示，不同光照強(qiáng)度下生長的幼苗中幾乎檢測不到光系統(tǒng)I的核心蛋白，但是光系統(tǒng)I捕光色素有不同程度的積累，弱光下有所恢復(fù)。光系統(tǒng)II的核心蛋白都有不同程度的降低，弱光下都有所恢復(fù)，光系統(tǒng)II捕光天線含量沒有變化。突變體的其他膜蛋白復(fù)合物與野生型相比沒有明顯變化，這ー結(jié)果表明突變體具有一定的光敏感性，可能的解釋是PPDl蛋白含量的降低導(dǎo)致光系統(tǒng)I蛋白的積累以及功能喪失，多余的功能更容易對光系統(tǒng)II造成傷害。不同光照強(qiáng)度下突變體的葉綠素積累情況也表明突變體更具有光敏感性，表I表明，無論是葉綠素含量還是Fv/Fm，都是高光下降低，低光下有所恢復(fù)。
表I不同光強(qiáng)下色素含量以及Fv/Fm變化
權(quán)利要求
1.PPDl蛋白的編碼基因在保護(hù)植物光系統(tǒng)I光合功能中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述保護(hù)光系統(tǒng)I光合功能為恢復(fù)突變體黃化苗為綠色苗。
3.如權(quán)利要求I或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用是將所述PPDl蛋白的編碼基因?qū)隤PDl降低的擬南芥突變體中。
4.如權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述PPDl蛋白是如下I)或2)蛋白 1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； 2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與I)活性相同的由I)衍生的蛋白質(zhì)。
5.如權(quán)利要求1-4中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述PPDl蛋白的編碼基因的編碼序列是序列表中序列I。
6.如權(quán)利要求3-5中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述PPDl蛋白的編碼基因通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述PPDl降低的擬南芥突變體中的；所述重組表達(dá)載體是將所述PPDl蛋白的編碼基因插入PCAMBIA1301的多克隆位點(diǎn)間構(gòu)建的重組載體。
7.如權(quán)利要求3-6中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述PPDl降低的擬南芥突變體是來自SALK_143493C的純合株系。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種光合作用相關(guān)的蛋白PPD1的應(yīng)用。PPD1蛋白的編碼基因在保護(hù)植物光系統(tǒng)I光合功能中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。進(jìn)一步講，上述保護(hù)光系統(tǒng)I的光合功能為恢復(fù)突變體黃化苗為綠色苗。具體地講，上述應(yīng)用是將所述PPD1蛋白的編碼基因?qū)隤PD1降低的擬南芥突變體中。實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)基因后，可以得到基因T-DNA插入純合突變體的轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)株系，黃化苗的表型恢復(fù)成綠色，并且能夠在土里自養(yǎng)，表明PPD1蛋白能夠保護(hù)光系統(tǒng)I的正常光合功能。
文檔編號C12N15/82GK102676573SQ201110062048
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月15日
發(fā)明者丁順華, 劉軍, 盧從明, 張愛紅, 楊輝霞, 溫曉剛 申請人:中國科學(xué)院植物研究所