專利名稱：一種檢測黃牛Angptl6基因單核苷酸多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學領(lǐng)域，涉及基因單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)的檢測，特別涉及一種檢測黃牛Angptl6基因第2359位單核苷酸多態(tài)性的方法。
背景技術(shù)：
基因多態(tài)性是指不同物種或者同一物種內(nèi)的不同個體間基因組序列的差異，這些差異是由于染色體中DNA等位基因中核苷酸改變引起，主要包括堿基的替換、插入、缺失以及重復序列拷貝數(shù)的變異。SNP是由美國麻省理工學院的人類基因組研究中心的學者 Lander (1996)提出的一類遺傳標記系統(tǒng)，就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/ C/G)的變化而引起的多態(tài)性。它的變異形式有顛換、轉(zhuǎn)換、插入和缺失等，主要由單個堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換所引起。具有轉(zhuǎn)換型的堿基變異的SNPs約占2/3。分子育種，即分子標記輔助選擇育種(Molecular Mark-Assist Selection,MAS), 該技術(shù)是借助DNA分子標記對遺傳資源或育種材料進行選擇，對畜禽的綜合性狀進行品種改良，它是利用現(xiàn)代分子生物學和傳統(tǒng)遺傳育種相結(jié)合的方法，進行新品種的選育。在肉牛育種中，人們期望通過對與生長性狀有密切相關(guān)，并且與數(shù)量性狀緊密連鎖的DNA標記的選擇，達到早期選種和提高育種值準確性的目的，從而在畜禽育種中獲得較大的研究進展。分子遺傳標記輔助選擇就是將現(xiàn)代生物技術(shù)與常規(guī)選擇方法相結(jié)合，通過對遺傳標記的選擇來間接選擇控制某性狀的數(shù)量性狀位點(QTL)，使之能夠同時利用標記位點信息和數(shù)量性狀的表型信息，更準確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進展。 標記輔助選擇主要經(jīng)歷了三個階段第一階段是家畜各性狀間的遺傳分析；第二階段是蛋白質(zhì)(酶)標記對數(shù)量性狀的標記階段；第三個階段是分子遺傳標記階段。隨著分子標記技術(shù)日漸成熟與豐富，使覆蓋整個基因組的標記成為可能，通過與QTL間的連鎖分析，實現(xiàn)分子標記輔助選擇的目標。SNP作為新的遺傳標記已廣泛應用于基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。目前，主要采用幾種不同的路線來發(fā)現(xiàn)SNPs 即DNA序列測定方法、PCR-SSCP與 DNA測序結(jié)合法、PCR-RFLP法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應等。在這些 SNP檢測技術(shù)中，DNA序列測定法是最為準確的SNP檢測方法，但是，其檢測費用極其昂貴， 且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗，所以，DNA序列測定法不是一種應用于生產(chǎn)實際的理想SNP檢測方法；當然，利用PCR-SSCP與 DNA測序結(jié)合法檢測SNP可以適當降低檢測費用，但是，PCR-SSCP的實驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陰性問題，所以，也并非理想的SNP檢測手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未來的應用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設(shè)計特別的引物，且只能針對特定的基因位點，同時，檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應用的特點；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應技術(shù)檢測SNP位點，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測平臺，對于一般的分子實驗室來說可實施性不強。綜上所述，利用PCR-RFLP法可能是當前檢測SNP最理想的遺傳標記方法。血管生成素樣蛋白(Angiopoietin-likeproteins, Angpt Is)是一類既與血管生成有關(guān)，又與脂類代謝、葡萄糖代謝和胰島素敏感性密切相關(guān)的分泌性蛋白質(zhì)因子，先后發(fā)現(xiàn)了該家族的7個成員，分別為Angptll-7。Angptl6也稱為血管生成素相關(guān)生長因子(Angiopoietin-related growth factor，AGF)或血管生成素相關(guān)蛋白 5(angiopoietin-related protein 5，ARP^，是通過篩選血管生成素類似物的表達序列標簽(EST)庫而被克隆的。目前，有大量的研究證明Angptie是能量代謝和肥胖癥強有力的調(diào)制器，在促進生長發(fā)育、能量消耗和減少脂肪量方面發(fā)揮著重要的作用。然而，Angptie基因的研究絕大多數(shù)是在人和小鼠等模型動物上進行，在牛上的研究尚無報道。中國地方黃牛Angptie基因遺傳變異的研究仍是空白。因此，該基因的功能研究及其遺傳變異與生長性狀指標(如體重、日增重、體高、體長指數(shù)等)關(guān)聯(lián)的研究，可為進一步改良我國地方黃牛品種提供理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種檢測的黃牛Angptie基因單核苷酸多態(tài)性的方法，尋找與經(jīng)濟性狀關(guān)聯(lián)的SNP作為分子標記，加快具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟性狀黃牛種群的建立。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種檢測黃牛Angptl6基因單核苷酸多態(tài)性的方法，以包含Angptl6基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛Angptie基因；用限制性內(nèi)切酶kal消化PCR擴增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛Angptie基因第2359位的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對P為Pl (上游引物)5' -ACCCTGCTGTTCCTCCTAA-3 ‘ 19bpP2(下游引物)5' -ATCTTGCCGCCTCTGAAT-3‘18bp所述的PCR擴增反應程序為95°C預變性 5min ；94°C變性 40s，60°C退火 40s，72°C延伸 lmin，30 35 個循環(huán)； 72°C延伸 IOmin0所述的瓊脂糖凝膠電泳為質(zhì)量濃度為2%瓊脂糖凝膠電泳。所述根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛Angptie基因第2359位的單核苷酸多態(tài)性為CC基因型表現(xiàn)為731bp —條帶；TC基因型表現(xiàn)為731bp、481bp、250bp三條帶；TT基因型表現(xiàn)為481bp和250bp兩條帶。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下獨特的技術(shù)效果本發(fā)明根據(jù)已公布牛Angptl6基因(NCBI :NW_003104015)的序列設(shè)計引物，分別以4種黃牛品種的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，并對PCR產(chǎn)物進行測序，將測序后得到的黃牛Angptl6基因的部分序列與NCBI公布的序列(NCBI :NW_003104015)進行比較，發(fā)現(xiàn)在Angptl6基因的第2359位存在SNP多態(tài)性。針對上述第2359位的SNP多態(tài)性，本發(fā)明還公開了其篩查和檢測方法，進行PCR 擴增后，用特定的限制性內(nèi)切酶進行酶切鑒定，能夠簡單、快速、低成本、精確地檢測其單核苷酸的多態(tài)性
PCR擴增Angpt 16基因產(chǎn)物的第2357bp 2362bp序列為AGJACT時，其能被限制性內(nèi)切酶^aI識別；當上述該位點發(fā)生T > C突變時，PCR擴增Angptie基因產(chǎn)物的第 2357bp 2362bp序列為AG￡ACT，此時不能被限制性內(nèi)切酶kal所識別，這樣就可以對該位點SNP多態(tài)性進行檢測。由于Angptie基因功能涉及初生重、體重、日增重、體高、體重、體斜長、坐骨端寬等生長性狀以及體長指數(shù)、體軀指數(shù)、胸圍指數(shù)等生長指標，本發(fā)明提供的檢測方法為 AngptlB基因的SNP與黃牛部分生長性狀(體高、體重和體長等)進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明該位點能夠作為提高黃牛早期體長指數(shù)的分子標記，以便用于中國黃牛肉用生長性狀的標記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。


圖1為黃牛血樣基因組DNA電泳檢測圖；圖2為黃牛Angptl6基因包含第2359位的多態(tài)位點的731bp PCR產(chǎn)物電泳檢測圖；其中，泳道1、2、3為Angptie基因包含第2359位的多態(tài)位點的731bp片段的瓊脂糖電泳檢測圖；泳道 M 為 Marker D2000 (2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp)；圖3為黃牛Angptl6基因包含第2359位的多態(tài)位點的731bp PCR產(chǎn)物的kal酶切電泳檢測圖瓊脂糖凝膠電泳)；其中，泳道1 未進行酶切消化的PCR產(chǎn)物(731bp)； 泳道3 =CC基因型個體(731bp)；泳道4 =TT基因型個體(481bp，250bp)；泳道5 =TC基因型個體(731bp，481bp，250bp) ；M :D2000 (2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp)。圖4為黃牛Angptl6基因SNP的不同基因型測序圖。(圖4a、4b和如分別為基因型TC、TT、CC的測序圖，a表現(xiàn)為雙峰，而b和C均為單峰；NNNNNN為酶切識別位點，其中 TT基因型的AGTACT序列(如圖4b)能被限制性內(nèi)切酶ka I切斷，而CC基因型的AGCACT
序列(如圖4c)不能被限制性內(nèi)切酶Sca I切斷；^W_003104015 g.2359T^'代表
Angptl6 基因第 2359bp 處 T > A 的突變，|NW_003104015: g.2359T|代表 Angptl6 基因
第 2359bp 處為純合基因型 TT,^W_003104015； g.2359C |代表 Angptl6 基因第 2359bp 處為純合基因型CC)。圖5是黃牛Angptie基因第2內(nèi)含子DNA序列的ka I酶切分析圖，以 Sca I PCR-RFLP 方法檢測黃牛 Angptl6 基因第 2 內(nèi)含子 SNP(NW_003104015 :g. 2I359T > C)，圖中有三條序列，其中NW_003104015_g. Angptl6代表牛Angptl6基因DNA部分序列，g. Angptl6intron2TT代表以所述引物擴增得到的基因型為TT的片段序列，
g. Angptl6intron2CC代表以所述引物擴增得到的基因型為CC時的片段序列；|NNN|:帶方
框的堿基序列，分別為上游和下游引物序列；AGTACT 為^^ I酶切位點；* 代表相同堿基； 第2359位方框下的堿基代表突變NW_003104015 :g. 2359T > C。
具體實施例方式本發(fā)明通過對黃牛Angptie基因第2359位突變的單核苷酸多態(tài)性進行檢測，以便用于中國黃牛肉用生長性狀的標記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。下面結(jié)合具體樣本的檢測和性狀關(guān)聯(lián)對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。a、以下實施例中所用的主要試劑來源1、生化試劑與生物學試劑①Taq DNA聚合酶(購自北京天根生化科技有限公司)；②2XbuffeK內(nèi)含Mg++、dNTPs等 > (北京天根生化科技有限公司Mix)③限制性內(nèi)切酶ka I (購自TAKARA公司)；④蛋白酶K(購自華美生物工程公司)；⑤Marker D2000 購自北京天根生化科技有限公司；2.普通試劑普通試劑從華美生物工程公司購買，為進口分裝產(chǎn)品檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖、 Tris、EDTA、NaCl、Na0H、KCl、Na2HP04、KH2P04、Tris 飽和酚、氯仿、異戊醇、無水乙醇、醋酸鈉、 十二烷基磺酸鈉(SDS)、溴化乙錠(EB)、溴酚藍、乙酸、蔗糖、硼酸、瓊脂糖等。3.溶液與緩沖液所有溶液與緩沖液均采用去離子超純水配制。高壓滅菌條件為Mbf/ in(l. 034X IO5Pa)，25min。試劑配制方法均參考Sambrook等編著的《分子克隆實驗指南》。(1)樣品采集所用溶液抗凝劑A⑶檸檬酸2.4g;檸檬酸三鈉6.6g;葡萄糖7. 35g，定容至50mL ddH20中， 高壓滅菌。每IOmL新鮮血液中加入0.2mL的A⑶液。這一抗凝劑優(yōu)于肝素，在血液貯存過程中能更好地保存高分子的DNA。經(jīng)其抗凝的血液可以在0°C保存數(shù)天或-70°C長期保存。(2)血樣基因組DNA分離所用溶液①PBS 緩沖液NaCl 8g，KCl 0. 2g, Na2HPO4 1. 44g, KH2PO4 0. 24g，加超純水至 IOOOmL,調(diào)pH至7. 4，高壓滅菌。②10% SDS =IOg SDS溶解于90mL的超純水中，68°C水浴溶解，用HCl調(diào)pH至7. 2， 定容至100mL。③0.5mol/L EDTA EDTA 186. lg，溶于 800mL 的超純水中，用 NaOH 調(diào) pH 至 8. 0，定容至IOOOmL,高壓滅菌，4°C保存。④lmol/L Tris · Cl :121. 14g Tris，溶于 800mL 超純水中，HCl 調(diào)節(jié) pH 至 8. 0，定容至1000mL。高壓滅菌，4°C保存。⑤5mol/L NaCl =NaCl 292. 2g 溶于 IOOOmL 超純水中。
⑥D(zhuǎn)NA 抽提緩沖液0. 5mmol/L EDTA 40mL, lmmol/L Tris · Cl IOmL0⑦5mmol/L NaCl 4mL, 10% SDS IOmL 定容至 100mL。實際濃度為 200mmol/L EDTA, pH 8. 0 1 OOmmo 1/L Tris · HCl，pH 8. 0，200mmol/L NaCl,2% SDS。RNase 20μ g/mL。⑧NaAc緩沖液NaAc ·3Η20 20. 4g ；超純水40mL ；稀HAc調(diào)pH至 7. 4 ；定容至 50mL。⑨TE緩沖液=Tris .Cl 緩沖液(pH 8. 0) IOmmol/L，EDTA 緩沖液(pH 8. 0)0. Immol/ L，高壓滅菌，4°C保存。⑩蛋白酶K 用超純水配成20mg/mL，_20°C保存。(3)瓊脂糖電泳分析所用溶液①1 X TBE 緩沖液取 10 X TBE IOOmL 定容至 1000mL。
②上樣緩沖液0. 25%溴酚藍，0. 25%二甲苯青FF，40. 0% (w/v)蔗糖水溶液。b、黃牛Angptl6基因PCR引物的設(shè)計以 NCBI 所公布的牛(NW_003104015. 1，Region :153780-157580)序列為參考，利用Primer 5. 0設(shè)計能夠擴增包含黃牛Angptl6基因第2359bp區(qū)域的PCR引物，其引物序列如下Pl (上游引物)5' -ACCCTGCTGTTCCTCCTAA-3 ‘ 19bpP2(下游引物)5' -ATCTTGCCGCCTCTGAAT-3‘18bp用以上所述引物對黃牛基因組進行PCR擴增，能夠擴增包含黃牛Angptie基因 (NW_003104015. 1序列)第1879bp ^09bp的731bp的基因片段，擴增后片段的電泳檢測如圖2所示，其中，泳道1 3為檢測片段，泳道M為Marker D2000 ；對擴增的片段進行測序鑒定后，其中，第2321bp 2380bp的序列為如下所示
權(quán)利要求
1.一種檢測黃牛Angptie基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，以包含Angptie基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對Pl和P2為引物，PCR法擴增黃牛Angptl6基因；用限制性內(nèi)切酶^^1消化PCR擴增產(chǎn)物之后，再對酶切后的片段進行瓊脂糖凝膠電泳； 根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛Angptie基因第2359位的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對為Pl (上游引物)5' -ACCCTGCTGTTCCTCCTAA-3 ‘ 19bpP2(下游引物)5' -ATCTTGCCGCCTCTGAAT-3‘18bp0
2.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛Angptie基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述的PCR擴增反應程序為95°C預變性 5min ；94°C變性 40s，60°C退火 40s，72°C延伸 lmin，30 ；35 個循環(huán)；72°C 延伸IOmin ；4°C保存。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛Angptie基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述的瓊脂糖凝膠電泳為質(zhì)量濃度為2. 0%的瓊脂糖凝膠進行電泳。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛Angptie基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛Angptie基因第2359位的單核苷酸多態(tài)性為CC基因型表現(xiàn)為731bp—條帶；TC基因型表現(xiàn)為731bp、481bp、250bp三條帶；TT基因型表現(xiàn)為481bp 和250bp兩條帶。
5.權(quán)利要求1至4中任意一項權(quán)利要求所述的檢測黃牛Angptie基因單核苷酸多態(tài)性的方法在鑒定不同黃牛群體多態(tài)性中的診斷應用。
6.權(quán)利要求5所述的診斷應用，其特征在于，鑒定不同黃牛的多態(tài)性，是黃牛Angptie 基因第2359位SNP作為黃牛生長性狀的分子標記輔助選擇，CC基因型可以作為一個提高黃牛早期體長指數(shù)的候選分子遺傳標記。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測黃牛Angptl6基因單核苷酸多態(tài)性的方法，以包含Angptl6基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P(包含P1和P2)為引物，用PCR法擴增黃牛Angptl6基因，然后用限制性內(nèi)切酶ScaI消化PCR擴增產(chǎn)物，再對酶切后的片段進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛Angptl6基因(GenBank Accession numberNW_003104015)第2359位的單核苷酸多態(tài)性。由于Angptl6基因功能對生長發(fā)育性狀具有重要生物學功能，本發(fā)明提供的檢測方法為Angptl6基因的SNP與生長性狀關(guān)聯(lián)的建立奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，Angptl6基因單核苷酸多態(tài)性對體長指數(shù)有顯著影響，故本發(fā)明提供的檢測方法可用于中國黃牛肉用和生長性狀的分子標記輔助選擇，進而快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。
文檔編號C12Q1/68GK102206705SQ20111006269
公開日2011年10月5日 申請日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者侯飛, 李愛民, 藍賢勇, 蔡含芳, 都怡, 陳宏 , 雷初朝, 馬云, 馬偉 申請人:西北農(nóng)林科技大學