專利名稱：提高蛋白質(zhì)結(jié)晶率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高生物大分子結(jié)晶率的方法，特別涉及一種提高蛋白質(zhì)結(jié)晶率的方法，屬于蛋白質(zhì)的結(jié)晶領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
根據(jù)結(jié)構(gòu)基因組計劃的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，從純度很高的生物大分子到生長出衍射質(zhì)量的生物大分子晶體，其成功率不足20%。獲得生物大分子晶體的過程是從表達開始到獲得結(jié)構(gòu)的一系列流程中，成功率最低的環(huán)節(jié)之一。因此，生長高質(zhì)量生物大分子晶體仍是結(jié)構(gòu)生物學領(lǐng)域的瓶頸問題之一。生物大分子的結(jié)晶與其他的結(jié)晶過稱過一樣，是一個多參數(shù)控制的過程，通常要達到熱力學不穩(wěn)定過飽和的狀態(tài)。生物大分子的結(jié)晶是在水溶液中當溶液達到過飽和是進行的，包括晶核形成和生長過程。由于生物大分子對外部條件非常敏感，因此這些物質(zhì)的結(jié)晶是非常困難。需要采用溫和的技術(shù)手段才能使生物大分子逐漸從溶液中結(jié)晶出來，變?yōu)楣虘B(tài)結(jié)晶體，這需要控制待結(jié)晶的大分子物質(zhì)的濃度、沉淀劑、溫度、PH和化學添加劑等來實現(xiàn)。生物大分子的結(jié)晶方法主要有4種氣相擴散法、配液結(jié)晶法、液-液擴散法和平衡透析法。氣相擴散法的原理是在一個封閉體系內(nèi)，由于不含生物大分子的池液中結(jié)晶劑的濃度高于生物大分子結(jié)晶液滴中結(jié)晶劑的濃度，導(dǎo)致溶劑不斷從低濃度的結(jié)晶液滴向高濃度的池液擴散，從而使結(jié)晶液滴中生物大分子溶液和結(jié)晶劑溶液的濃度不斷增加，直到液滴與池液的蒸汽壓達到平衡。在此過程中生物大分子液滴逐漸達到過飽和，從而形成晶體。 在傳統(tǒng)的氣相擴散法中，結(jié)晶液滴濃度不斷濃縮直至與池液平衡，如果池液的濃度不足以使結(jié)晶液滴濃縮至生物大分子形核的過飽和度，則即使所使用的篩選試劑能在更高濃度下獲得晶體，但在實際篩選時卻得不到晶體。鹿芹芹等人在氣相擴散法中利用干燥劑替代池液進行蛋白質(zhì)分子結(jié)晶條件的蹄選，提高了蛋白質(zhì)分子結(jié)晶蹄選率(Replace reservoir solution with desiccant in vapor diffusion protein crystallization screening, Journal of Applied Crystallography, 2010, Vol. 43 :1021-1026)。干燥劑法是使用定量的干燥劑代替池液，起到高度濃縮液滴的作用，使液滴的濃度范圍大幅擴展，以此來提高生物大分子結(jié)晶篩選的成功率。干燥劑法可以使結(jié)晶液滴濃縮到更高的水平，提高了生物大分子結(jié)晶篩選的成功率，但是直接加入一定量的干燥劑會使液滴濃度濃縮到一個上限，對結(jié)晶液滴濃度濃縮到更高的范圍有一定的限制。生物大分子結(jié)晶成功率定義為結(jié)晶的液滴數(shù)與液滴總數(shù)的比例，其中的每個液滴的結(jié)晶條件是相同，該研究中采用結(jié)晶成功率來定義結(jié)晶可重復(fù)性。文獻中將傳統(tǒng)的氣相擴散方法和干燥劑法下的生物大分子結(jié)晶可重復(fù)性和結(jié)晶條件篩選進行了對比。采用傳統(tǒng)的氣相擴散方法在溶菌酶濃度分別為10，15，20，和25mg/ml，NaCl :20mg/ml ；池液40mg/ml ；緩沖液0. lmol/L NaAc,pH 4. 60，其結(jié)晶成功率分別為0，6. 3%，9. 4%，70. 8% ；而采用 5mg硅膠代替池液的干燥劑法的成功率分別為20. 8 %，62. 5 %，66. 7 %，100 %。采用Hampton Research公司貨號為HR2-144的hdex 96結(jié)晶試劑盒構(gòu)建結(jié)晶篩選溶液體系，使用干燥劑進行生物大分子結(jié)晶條件篩選，干燥劑法下的結(jié)晶篩選成功率 溶菌酶結(jié)晶篩選成功率為四.2%，蛋白酶K的結(jié)晶篩選成功率為39.6%，甜味蛋白的結(jié)晶篩選成功率為5.2%，糜蛋白酶原A II的結(jié)晶篩選成功率為19.8%，肌血球素結(jié)晶篩選成功率為1%，刀豆球蛋白A VI的結(jié)晶篩選成功率為36. 5%。該研究采用干燥劑單次加入進行篩選，雖然提高了結(jié)晶條件篩選的成功率，但是該方法存在如下缺陷1)干燥劑用量控制困難由于篩選試劑盒中的結(jié)晶試劑存在不同的濃度范圍，有些結(jié)晶溶液濃度比較高，有些結(jié)晶溶液濃度比較低，采用干燥劑單次加入的干燥劑法進行結(jié)晶條件篩選時，經(jīng)常導(dǎo)致其中部分條件長出晶體，部分條件仍為澄清液滴，而部分條件產(chǎn)生沉淀；2)生物大分子結(jié)晶條件篩選成功率低，篩選試劑盒中的結(jié)晶試劑的利用率低。由于篩選試劑盒中的結(jié)晶試劑的濃度范圍不同，結(jié)晶溶液濃度有高有低，采用單次加入干燥劑進行結(jié)晶的過程中，則存在部分結(jié)晶條件下干燥劑用量不足，結(jié)晶溶液濃度沒有濃縮到足夠高的程度，不形成高分子晶體，而有些結(jié)晶條件則又由于干燥劑用量大，結(jié)晶液滴因為濃縮速度過快，導(dǎo)致直接產(chǎn)生沉淀，而不能形成高分子晶體，因而降低了生物大分子結(jié)晶條件篩選的成功率，不能達到提高蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選成功率的目的。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有的生物大分子結(jié)晶條件篩選方法結(jié)晶成功率低的不足，本發(fā)明提供一種提高蛋白質(zhì)結(jié)晶率的方法，該方法利用干燥劑的強吸濕作用，在氣相擴散法中，使用干燥劑代替池液，逐級濃縮結(jié)晶液滴，使液滴的濃度范圍大幅擴展直至液滴蒸干，以此掃描更寬范圍的溶液濃度，來提高生物大分子結(jié)晶篩選的成功率。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種提高蛋白質(zhì)結(jié)晶率的方法，該方法包括1) 制備蛋白質(zhì)溶液將蛋白質(zhì)加入到緩沖溶液中，溶解，制成蛋白質(zhì)溶液；2)制備蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液將蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑與蛋白質(zhì)溶液混合，制得蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液；幻蛋白質(zhì)結(jié)晶將干燥劑和蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液置于同一密閉容器中，二者不直接接觸，恒溫靜置進行結(jié)晶；其中，步驟3)中將干燥劑分批次加入到容器中，在密閉條件下重復(fù)進行結(jié)晶處理，直至蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液完全干燥為至。本發(fā)明方法在蛋白質(zhì)結(jié)晶過程中逐步分批次的加入干燥劑，使蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液逐級干燥，先使一些濃度較高的溶液生長出晶體，隨著干燥劑量的增加，一些濃度低的溶液也有機會長出晶體，這樣就最大幅度提高了結(jié)晶率。其中，步驟幻中根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液的體積確定每批次所加入的干燥劑的用量， 本發(fā)明人通過實驗確定了每批次所加入干燥劑的最適宜用量，即當?shù)鞍踪|(zhì)結(jié)晶溶液的體積為1 2 μ 1時，第一次所加入的干燥劑的用量為2 5mg，以后每次所加入的干燥劑用量各為 0. 5-2mgo其中，步驟1)中所述蛋白質(zhì)溶液的濃度大于0，并且彡50mg/ml，優(yōu)選為2 50mg/ml，進一步優(yōu)選為10mg/ml。步驟2)中蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑與蛋白質(zhì)溶液的體積之比為 0.125-8 1，優(yōu)選為0.5-2 1，進一步優(yōu)選為1 1。
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所述干燥劑選自酸性干燥劑、中性干燥劑或堿性干燥劑中的一種或多種；優(yōu)選的， 所述的干燥劑選自硅膠、分子篩、蒙脫石、石灰、氯化鈣中的一種或多種。本發(fā)明中所述的用于蛋白質(zhì)容晶的容器可以是蛋白質(zhì)晶體板、坐滴板或懸滴板中的任一種。步驟3)中所述的恒溫優(yōu)選自0-60°C溫度范圍中的任何一種溫度；所述靜置時間優(yōu)選為48 96小時。本發(fā)明雖然僅以溶菌酶、蛋白酶K、甜味蛋白、糜蛋白酶原A II、肌血球素、刀豆球蛋白、核糖核酸酶A I和枯草桿菌蛋白酶A VIII為對象進行了實驗，但本發(fā)明方法能夠適用于提高各種蛋白質(zhì)的結(jié)晶率。其中，步驟幻中所述密閉容器選擇密封的蛋白質(zhì)晶體晶板、坐滴板、懸滴板中的一種；所述氣相擴散法結(jié)晶處理的溫度為0-60°C ；結(jié)晶處理時間為48 96小時。其中，驟3)中所述蛋白質(zhì)結(jié)晶包括如下步驟A)首先，向密閉容器中加入第一干燥劑；接著，向密閉容器中加入蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液，并且使干燥劑與蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液相互分離，容器密封后于恒溫條件下靜置，蛋白質(zhì)進行第一次結(jié)晶；B)向密閉容器中加入第二干燥劑，容器密封后于恒溫條件下靜置，蛋白質(zhì)進行第
二次結(jié)晶；C)重復(fù)步驟B)至少一次，逐級濃縮蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液，直至結(jié)晶液滴完全干燥，統(tǒng)計獲得蛋白質(zhì)晶體數(shù)。特別是，所述的蛋白質(zhì)結(jié)晶為氣相擴散法結(jié)晶。特別是，步驟A)中所述第一干燥劑的用量為2 5mg ；所述蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液的體積為1 2μ1;步驟B)中加入的第二干燥劑量為0.5-aiig;步驟Α)、Β)中靜置結(jié)晶的溫度為0-60°C ；靜置時間為48 96小時。尤其是，步驟3)中所述結(jié)晶處理過程包括如下步驟a)首先，向坐滴板的深孔3中加入第一干燥劑；接著，向坐滴板的坐滴孔2中加入蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液，密封坐滴板后，于恒溫條件下靜置，蛋白質(zhì)分子進行第一次結(jié)晶；b)向坐滴板的深孔3中加入第二干燥劑，密封坐滴板后于恒溫條件下靜置，蛋白質(zhì)分子進行第二次結(jié)晶；c)重復(fù)步驟b)至少一次，逐級濃縮蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液，直至結(jié)晶溶液完全干燥，統(tǒng)計獲得蛋白質(zhì)晶體數(shù)。其中，步驟a)中加入到深孔3中的所述第一干燥劑的用量是2 5mg/孔；加入到坐滴孔2中的蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液的體積為1 2 μ 1/孔。特別是，所述蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液中蛋白質(zhì)溶液和蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑體積之比為 0.125-8 1，優(yōu)選為0.5-2 1，進一步優(yōu)選為1 1。特別是，步驟a)中第一次結(jié)晶的溫度為0-60°C ；靜置時間為48 96小時。其中，步驟b)中第二次加入的干燥劑量為0.5-aiig/孔。特別是，步驟b)中采用如下步驟加入所述第二干燥劑b-Ι)取與步驟a)中坐滴板孔位相同的第二坐滴板，向第二坐滴板的每個深孔3中加入第二干燥劑，用透明膠帶1密封第二坐滴板；
b-2)倒置第二坐滴板使第二干燥劑黏貼到相應(yīng)第二坐滴板的深孔3位置的透明膠帶1上；b-3)用黏貼了第二干燥劑的透明膠帶1密封步驟b)中所述的坐滴板。其中，步驟b-Ι)中所述第二干燥劑的量為0.5-aiig/孔。本發(fā)明蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選的方法的具有的優(yōu)點如下1、本發(fā)明方法中的干燥劑具有強吸濕作用，在氣相擴散法中，使用干燥劑代替池液，高濃度濃縮結(jié)晶液滴，使結(jié)晶液滴的濃度范圍擴大，提高了蛋白質(zhì)分子結(jié)晶成功率；2、本發(fā)明使用逐漸加入干燥劑進行蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法，逐漸濃縮結(jié)晶液滴直至將液滴蒸干，先加入較少量的干燥劑使一些濃度較高的溶液生長出晶體，隨著干燥劑量的增加，一些濃度低的溶液也能長出晶體，使結(jié)晶液滴濃度范圍擴大，能夠最大幅度提高蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選成功率，蛋白質(zhì)分子結(jié)晶成功率達到7. 3 69. 8%，是采用單次加入相同量干燥劑蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的1. 2-7. 3倍。3、本發(fā)明方法結(jié)晶獲得的蛋白質(zhì)的晶體質(zhì)量高，比采用單次干燥劑進行一次結(jié)晶得到的蛋白質(zhì)晶體的分辨率提高了0.1-0.5 A。4、本發(fā)明方法操作簡單，結(jié)晶效率高，耗能低，環(huán)保，操作工藝條件容易控制，可重復(fù)性高，蛋白質(zhì)結(jié)晶晶體質(zhì)量可控性強，結(jié)晶成本低。下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作詳細說明。


圖1是本發(fā)明發(fā)明所用96孔坐滴板示意圖。圖2是圖1中a部分的放大圖，即坐滴板中深孔和坐滴孔相對位置的放大圖。圖中，1-透明膠帶；2-坐滴孔；3-深孔。
具體實施例方式本發(fā)明采用Hampton公司貨號為HR2-144的hdex 96結(jié)晶篩選試劑盒對溶菌酶、蛋白酶K、甜味蛋白、糜蛋白酶原A II、肌血球素、刀豆球蛋白結(jié)晶條件進行篩選，除了 Hampton公司貨號為HR2-144的hdex 96結(jié)晶篩選試劑盒之外，其他蛋白質(zhì)大分子結(jié)晶篩選試劑均適用于本發(fā)明，除了溶菌酶、蛋白酶K、甜味蛋白、糜蛋白酶原A II、肌血球素、 刀豆球蛋白之外，其他蛋白質(zhì)大分子均適用于本發(fā)明。本發(fā)明采用干燥劑硅膠、分子篩、蒙脫石、石灰、氯化鈣等進行蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選，除了硅膠、分子篩、蒙脫石、石灰、氯化鈣之外，其他干燥劑均適用于本發(fā)明。實施例1 溶菌酶結(jié)晶條件的篩選。1、制備溶菌酶溶液。將六次重結(jié)晶的溶菌酶(日本kikagaku公司，貨號為100940)溶于pH為7. 00， 0. 025mol/L HEPES-Na緩沖液中，然后用0. 22 μ m的濾膜過濾，濾去雜質(zhì)，制得濃度為IOmg/ ml的溶菌酶溶液。2、添加干燥劑。向第一 96 孔坐滴板(美國 Hampton 公司，貨號為 HR3-143，96-well sitting-drop Intelli-Plates)的每個深孔3中加入3. 5mg的干燥劑硅膠；
3、配制結(jié)晶溶液。用自動移液系統(tǒng)將Hampton公司貨號為HR2-144的hdex 96結(jié)晶試劑盒中的蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑分別轉(zhuǎn)移到每個深孔3中均添加了 3. 5mg干燥劑硅膠的第一 96孔坐滴板的相應(yīng)坐滴孔2中，其中，添加到坐滴孔2內(nèi)的結(jié)晶試劑的體積為1 μ 1/孔；接著將濃度為10mg/ml的溶菌酶溶液轉(zhuǎn)移到第一 96孔坐滴板的每個坐滴孔2中， 其中，每個坐滴孔2內(nèi)溶菌酶溶液的體積為1 μ 1，與蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑混合，用透明膠帶1密封第一 96孔坐滴板，制得溶菌酶結(jié)晶溶液，即每個坐滴孔2中溶菌酶結(jié)晶溶液的體積是 2μ 1 ；4、結(jié)晶處理。1)將密封的第一 96孔坐滴板放入控溫箱，恒溫靜置，溶菌酶進行第一次結(jié)晶處理，其中，恒溫靜置的溫度為20°C，靜置時間為72小時，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得溶菌酶晶體的數(shù)目，計算溶菌酶第一次結(jié)晶成功率為13. 5%，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的溶菌酶晶體的分辨率，平均分辨率為1.5 A;2)另取與第一 96孔坐滴板孔位相同的第二 96孔坐滴板，向第二 96孔坐滴板的每個深孔3中分別加入1. 5mg的干燥劑硅膠，用透明膠帶1密封第二 96孔坐滴板，倒置第二 96孔坐滴板，使干燥劑硅膠黏貼到相應(yīng)的第二 96孔坐滴板的深孔3位置的透明膠帶1上；3)用每個深孔3對應(yīng)部位都粘有干燥劑的透明膠帶1替換經(jīng)過第一次結(jié)晶后的第一 96孔坐滴板的透明膠帶1，新的硅膠干燥劑將繼續(xù)濃縮結(jié)晶液滴；4)將添加了新的干燥劑的第一 96孔坐滴板再次放入控溫箱中，恒溫靜置，溶菌酶結(jié)晶析出，其中，恒溫靜置的溫度為20°C，靜置時間為72小時，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得溶菌酶晶體的數(shù)目，計算溶菌酶第二次結(jié)晶成功率為33. 3%，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的溶菌酶晶體的分辨率，平均分辨率為1.5 A;5)重復(fù)步驟2、,3)、4)，第三次濃縮溶菌酶結(jié)晶液滴，全部溶菌酶結(jié)晶溶液蒸干， 在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得溶菌酶晶體的數(shù)目，計算溶菌酶第三次結(jié)晶率為51 %，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的溶菌酶晶體的分辨率，平均分辨率為1.6 A。實施例2 蛋白酶K結(jié)晶條件的篩選。1、制備蛋白酶K溶液。將蛋白酶K(美國Sigma公司，貨號為P6556)溶于pH為7. 00,0. 025mol/L HEPES-Na緩沖液中，然后用0. 22 μ m的濾膜濾去雜質(zhì)，濾去雜質(zhì)，制得濃度50mg/ml蛋白酶 K溶液。2、添加干燥劑。向第一 96孔坐滴板的每個深孔3中加入2. Omg的干燥劑硅膠；3、配制結(jié)晶溶液。用自動移液系統(tǒng)將Hampton公司貨號為HR2-144的hdex 96結(jié)晶試劑盒中的蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑分別轉(zhuǎn)移到每個深孔3中均添加了 2. Omg干燥劑硅膠的第一 96孔坐滴板的相應(yīng)坐滴孔2中，其中，添加到坐滴孔2內(nèi)結(jié)晶篩選試劑的體積為1 μ 1/孔；接著將濃度為50mg/ml的蛋白酶K溶液轉(zhuǎn)移到第一 96孔坐滴板的每個坐滴孔2 中，其中，每個坐滴孔2內(nèi)蛋白酶K溶液的體積為Ιμ ，與蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑混合，用透明膠帶1密封第一 96孔坐滴板，制得蛋白酶K結(jié)晶溶液，即每個坐滴孔2中蛋白酶K結(jié)晶溶液的體積是2μ1 ；4、結(jié)晶處理。1)將密封的第一 96孔坐滴板放入控溫箱，恒溫靜置，蛋白酶K進行第一次結(jié)晶處理，其中，恒溫靜置的溫度為0°C，靜置時間為96小時，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得蛋白酶 K晶體的數(shù)目，計算蛋白酶K第一次結(jié)晶成功率為對％，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的蛋白酶K晶體的分辨率，平均分辨率為1.2 A;2)另取與第一 96孔坐滴板孔位相同的第二 96孔坐滴板，向第二 96孔坐滴板的每個深孔3中分別加入0. 5mg的干燥劑硅膠，用透明膠帶1密封第二 96孔坐滴板，倒置第二 96孔坐滴板，使干燥劑硅膠黏貼到相應(yīng)的第二 96孔坐滴板的深孔3位置的透明膠帶1上；幻用每個深孔3對應(yīng)部位都粘有干燥劑的透明膠帶1替換經(jīng)過第一次結(jié)晶后的第一 96孔坐滴板的透明膠帶1，新的硅膠干燥劑將繼續(xù)濃縮結(jié)晶液滴；4)將添加了新的干燥劑的第一 96孔坐滴板再次放入控溫箱中，恒溫靜置，蛋白酶 K結(jié)晶析出，其中，恒溫靜置的溫度為0 °C，靜置時間為96小時，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得蛋白酶K晶體的數(shù)目，計算蛋白酶K第二次結(jié)晶成功率為41.7%，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的蛋白酶K晶體的分辨率，平均分辨率為1.3 A；5)重復(fù)步驟2)、3)、4)，第三次濃縮蛋白酶K結(jié)晶液滴，全部蛋白酶K結(jié)晶溶液蒸干，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得蛋白酶K晶體的數(shù)目，計算蛋白酶K第三次結(jié)晶成功率為 69. 8%，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的蛋白酶K晶體的分辨率，平均分辨率為 1.3 A。實施例3 甜味蛋白結(jié)晶條件的篩選。1、制備甜味蛋白溶液。將甜味蛋白(美國Sigma公司，貨號為T7638)溶于pH為7. 00，0. 025mol/L HEPES-Na緩沖液中，然后用0. 22 μ m的濾膜濾去雜質(zhì)，濾去雜質(zhì)，制得濃度為10mg/ml的甜味蛋白溶液。2、添加干燥劑。向第一 96孔坐滴板的每個深孔3中加入5mg的干燥劑蒙脫石；3、配制結(jié)晶溶液。用自動移液系統(tǒng)將Hampton公司貨號為HR2-144的hdex 96結(jié)晶試劑盒中的蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑分別轉(zhuǎn)移到每個深孔3中均添加了 5mg干燥劑蒙脫石的第一 96孔坐滴板的相應(yīng)坐滴孔2中，其中，添加到坐滴孔2內(nèi)的結(jié)晶試劑的體積為1 μ 1/孔；接著將甜味蛋白溶液轉(zhuǎn)移到第一 96孔坐滴板的每個坐滴孔2中，其中，每個坐滴孔2內(nèi)甜味蛋白溶液的體積為Ιμ ，與蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選試劑混合，用透明膠帶1密封第一 96孔坐滴板，制得甜味蛋白結(jié)晶溶液，即每個坐滴孔2中甜味蛋白結(jié)晶溶液的體積是 2μ 1 ；4、結(jié)晶處理。1)將密封的第一 96孔坐滴板放入控溫箱，恒溫靜置，甜味蛋白進行第一次結(jié)晶處理，其中，恒溫靜置的溫度為60°C，靜置時間為48小時，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得甜味蛋白晶體的數(shù)目，計算甜味蛋白第一次結(jié)晶成功率為2. 1%，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的甜味蛋白晶體的分辨率，平均分辨率為1.4A;
2)另取與第一 96孔坐滴板孔位相同的第二 96孔坐滴板，向第二 96孔坐滴板的每個深孔3中分別加入2mg的干燥劑蒙脫石，用透明膠帶1密封第二 96孔坐滴板，倒置第二 96孔坐滴板，使干燥劑蒙脫石黏貼到相應(yīng)的第二 96孔坐滴板的深孔3位置的透明膠帶 1上；幻用每個深孔3對應(yīng)部位都粘有干燥劑的透明膠帶1替換經(jīng)過第一次結(jié)晶后的第
一96孔坐滴板的透明膠帶1，新的蒙脫石干燥劑將繼續(xù)濃縮結(jié)晶液滴；4)將添加了新的干燥劑的第一 96孔坐滴板再次放入控溫箱中，恒溫靜置，甜味蛋白結(jié)晶析出，其中，恒溫靜置的溫度為60°C，靜置時間為48小時，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得甜味蛋白晶體的數(shù)目，計算甜味蛋白第二次結(jié)晶成功率為5.2% ；同時回收晶體，用X 射線衍射法測定獲得的甜味蛋白晶體的分辨率，平均分辨率為1.4 A；5)重復(fù)步驟幻、3)、4)2次，第四次濃縮甜味蛋白結(jié)晶液滴，全部甜味蛋白結(jié)晶溶液蒸干，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得甜味蛋白晶體的數(shù)目，計算甜味蛋白第四次結(jié)晶成功率為7. 3%，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的甜味蛋白晶體的分辨率，平均分辨率為1.5 A。實施例4 糜蛋白酶原A II結(jié)晶條件的篩選。1、制備糜蛋白酶原A II溶液。將糜蛋白酶原A 11(美國Sigma公司，貨號為C4879)溶于pH為7. 00，0. 025mol/ L HEPES-Na緩沖液中，然后用0. 22 μ m的濾膜過濾，濾去雜質(zhì)，制得濃度分別為10mg/ml的糜蛋白酶原A II溶液。2、添加干燥劑。向第一 96孔坐滴板的每個深孔3中加入2mg的干燥劑分子篩；3、配制結(jié)晶溶液。用自動移液系統(tǒng)將Hampton公司貨號為HR2-144的hdex 96結(jié)晶試劑盒中的蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑分別轉(zhuǎn)移到每個深孔3中均添加了 2mg干燥劑分子篩的第一 96孔坐滴板的相應(yīng)坐滴孔2中，其中，添加到坐滴孔2內(nèi)結(jié)晶篩選試劑的體積為0. 7 μ 1/孔；接著將糜蛋白酶原A II溶液轉(zhuǎn)移到第一 96孔坐滴板的每個坐滴孔2中，其中，每個坐滴孔2內(nèi)糜蛋白酶原A II溶液的體積為0.7μ1，與蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑混合，用透明膠帶 1密封第一 96孔坐滴板，制得糜蛋白酶原A II結(jié)晶溶液，即每個坐滴孔2中糜蛋白酶原A II結(jié)晶溶液的體積是1.4μ1;4、結(jié)晶處理。1)將密封的第一96孔坐滴板放入控溫箱，恒溫靜置，糜蛋白酶原A II進行第一次結(jié)晶處理，其中，恒溫靜置的溫度為20°C，靜置時間為72小時，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得糜蛋白酶原A II晶體的數(shù)目，計算糜蛋白酶原A II第一次結(jié)晶成功率為10.4%，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的糜蛋白酶原A II晶體的分辨率，平均分辨率為2.8人；2)另取與第一 96孔坐滴板孔位相同的第二 96孔坐滴板，向第二 96孔坐滴板的每個深孔3中分別加入Img的干燥劑分子篩，用透明膠帶1密封第二 96孔坐滴板，倒置第
二96孔坐滴板，使干燥劑分子篩黏貼到相應(yīng)的第二 96孔坐滴板的深孔3位置的透明膠帶 1上；幻用每個深孔3對應(yīng)部位都粘有干燥劑的透明膠帶1替換經(jīng)過第一次結(jié)晶后的第
9一 96孔坐滴板的透明膠帶1，新的分子篩干燥劑將繼續(xù)濃縮結(jié)晶液滴；4)將添加了新的干燥劑的第一 96孔坐滴板再次放入控溫箱中，恒溫靜置，糜蛋白酶原A II結(jié)晶析出，其中，恒溫靜置的溫度為20°C，靜置時間為72小時，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得糜蛋白酶原A II晶體的數(shù)目，計算糜蛋白酶原A II第二次結(jié)晶成功率為 20.8%，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的糜蛋白酶原A II晶體的分辨率，平均分辨率為2.8 A；5)重復(fù)步驟2)、3)、4)，第三次濃縮糜蛋白酶原A II結(jié)晶液滴，全部糜蛋白酶原A II結(jié)晶溶液蒸干，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得糜蛋白酶原A II晶體的數(shù)目，計算糜蛋白酶原A II第三次結(jié)晶成功率為36. 5%，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的糜蛋白酶原A II晶體的分辨率，平均分辨率為2.9 A。實施例5 肌血球素結(jié)晶條件的篩選。1、制備肌血球素溶液。將肌血球素(美國Sigma公司，貨號為M0630)溶于pH為7. 00，0. 025mol/L HEPES-Na緩沖液中，然后用0. 22 μ m的濾膜過濾，濾去雜質(zhì)，制得濃度分別為10mg/ml的肌血球素溶液。2、添加干燥劑。向第一 96孔坐滴板的每個深孔3中加入2mg的干燥劑石灰；3、配制結(jié)晶溶液。用自動移液系統(tǒng)將Hampton公司貨號為HR2-144的hdex 96結(jié)晶試劑盒中的蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑分別轉(zhuǎn)移到每個深孔3中均添加了 2mg干燥劑石灰的第一 96孔坐滴板的相應(yīng)坐滴孔2中，其中，添加到坐滴孔2內(nèi)的結(jié)晶篩選試劑的體積為0. 5 μ 1/孔；接著將肌血球素溶液轉(zhuǎn)移到第一 96孔坐滴板的每個坐滴孔2中，其中，每個坐滴孔2內(nèi)溶菌酶溶液的體積為0. 5 μ 1，與蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選試劑混合，用透明膠帶1密封第一 96孔坐滴板，制得肌血球素結(jié)晶溶液，即每個坐滴孔2內(nèi)肌血球素結(jié)晶溶液的體積為 1μ 1 ；4、結(jié)晶處理。1)將密封的第一 96孔坐滴板放入控溫箱，恒溫靜置，肌血球素進行第一次結(jié)晶處理，其中，恒溫靜置的溫度為20°C，靜置時間為96小時，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得肌血球素晶體的數(shù)目，計算肌血球素第一次結(jié)晶成功率為1 %，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的肌血球素晶體的分辨率，平均分辨率為1.55 A;2)另取與第一 96孔坐滴板孔位相同的第二 96孔坐滴板，向第二 96孔坐滴板的每個深孔3中分別加入0. 5mg的干燥劑石灰，用透明膠帶1密封第二 96孔坐滴板，倒置第二 96孔坐滴板，使干燥劑石灰黏貼到相應(yīng)的第二 96孔坐滴板的深孔3位置的透明膠帶1上；幻用每個深孔3對應(yīng)部位都粘有干燥劑的透明膠帶1替換經(jīng)過第一次結(jié)晶后的第一 96孔坐滴板的透明膠帶1，新的石灰干燥劑將繼續(xù)濃縮結(jié)晶液滴；4)將添加了新的干燥劑的第一 96孔坐滴板再次放入控溫箱中，恒溫靜置，肌血球素結(jié)晶析出，其中，恒溫靜置的溫度為20°C，靜置時間為96小時，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得肌血球素晶體的數(shù)目，計算肌血球素第二次結(jié)晶成功率為5.2%，同時回收晶體，用X 射線衍射法測定獲得的肌血球素晶體的分辨率，平均分辨率為1.55 A；
5)重復(fù)步驟幻,3)、4)，第三次濃縮肌血球素結(jié)晶液滴，全部肌血球素結(jié)晶溶液蒸干，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得肌血球素晶體的數(shù)目，計算肌血球素第三次結(jié)晶成功率為 7. 3%，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的肌血球素晶體的分辨率，平均分辨率為
1.6 A。實施例6 刀豆球蛋白A VI結(jié)晶條件的篩選。1、制備刀豆球蛋白A VI溶液。將刀豆球蛋白A VI (美國Sigma公司，貨號為L7647)溶于pH為7. 00，0. 025mol/ L HEPES-Na緩沖液中，然后用0. 22 μ m的濾膜過濾，濾去雜質(zhì)，制得濃度分別為ang/ml的刀豆球蛋白A VI溶液。2、添加干燥劑。向第一 96孔坐滴板的每個深孔3中加入2mg的干燥劑氯化鈣；3、配制結(jié)晶溶液。用自動移液系統(tǒng)將Hampton公司貨號為HR2-144的hdex 96結(jié)晶試劑盒中的蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑分別轉(zhuǎn)移到每個深孔3中均添加了 2mg干燥劑氯化鈣的第一 96孔坐滴板的相應(yīng)坐滴孔2中，其中，添加到每個坐滴孔2內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選試劑的體積分別為 0. 7μ 1 ；接著將刀豆球蛋白A VI溶液轉(zhuǎn)移到第一 96孔坐滴板的每個坐滴孔2中，其中，每個坐滴孔2內(nèi)豆球蛋白A VI溶液的體積為0.7μ1，與蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選試劑混合，用透明膠帶1密封第一 96孔坐滴板，制得刀豆球蛋白A VI結(jié)晶溶液，即每個坐滴孔2內(nèi)刀豆球蛋白 A VI結(jié)晶溶液的體積為1. 4μ 1 ；4、結(jié)晶處理。1)將密封的第一 96孔坐滴板放入控溫箱，恒溫靜置，刀豆球蛋白A VI進行第一次結(jié)晶處理，其中，恒溫靜置的溫度為20°C，靜置時間為48小時，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得刀豆球蛋白A VI素晶體的數(shù)目，計算刀豆球蛋白A VI第一次結(jié)晶成功率為31.3%，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的刀豆球蛋白A VI晶體的分辨率，平均分辨率為2 A;2)另取與第一 96孔坐滴板孔位相同的第二 96孔坐滴板，向第二 96孔坐滴板的每個深孔3中分別加入Img的干燥劑氯化鈣，用透明膠帶1密封第二 96孔坐滴板，倒置第二 96孔坐滴板，使干燥劑氯化鈣黏貼到相應(yīng)的第二 96孔坐滴板的深孔3位置的透明膠帶 1上；幻用每個深孔3對應(yīng)部位都粘有干燥劑的透明膠帶1替換經(jīng)過第一次結(jié)晶后的第一 96孔坐滴板的透明膠帶1，新的氯化鈣干燥劑將繼續(xù)濃縮結(jié)晶液滴；4)將添加了新的干燥劑的第一 96孔坐滴板再次放入控溫箱中，恒溫靜置，刀豆球蛋白A VI結(jié)晶析出，其中，恒溫靜置的溫度為20°C，靜置時間為48小時，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得刀豆球蛋白A VI晶體的數(shù)目，計算刀豆球蛋白A VI第二次結(jié)晶成功率為 37. 5%，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的刀豆球蛋白A VI晶體的分辨率，平均分辨率為2.1 A;5)重復(fù)步驟幻、3)、4)，第三次濃縮刀豆球蛋白々VI結(jié)晶液滴，全部刀豆球蛋白A VI結(jié)晶溶液蒸干，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得刀豆球蛋白A VI晶體的數(shù)目，計算刀豆球蛋白A VI第三次結(jié)晶成功率為42. 7%，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的刀豆球蛋白A VI晶體的分辨率，平均分辨率為2.1 A。實施例7 核糖核酸酶A I結(jié)晶條件的篩選。1、制備核糖核酸酶A I溶液。將核糖核酸酶A 1(美國Sigma公司，貨號為R4875)溶于pH為7. 00，0. 025mol/L HEPES-Na緩沖液中，然后用0. 22 μ m的濾膜過濾，濾去雜質(zhì)，制得濃度為10mg/ml的核糖核酸酶A I溶液。2、添加干燥劑。向第一 96孔坐滴板的每個深孔3中加入2mg的干燥劑氯化鈣；3、配制結(jié)晶溶液。用自動移液系統(tǒng)將Hampton公司貨號為HR2-144的hdex 96結(jié)晶試劑盒中的蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑分別轉(zhuǎn)移到每個深孔3中均添加了 2mg干燥劑氯化鈣的第一 96孔坐滴板的相應(yīng)坐滴孔2中，其中，添加到每個坐滴孔2內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選試劑的體積分別為 0. 5μ 1 ；接著將核糖核酸酶A I溶液轉(zhuǎn)移到第一 96孔坐滴板的每個坐滴孔2中，其中，每個坐滴孔2內(nèi)核糖核酸酶A I溶液的體積為1 μ 1，與蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選試劑混合，用透明膠帶 1密封第一 96孔坐滴板，制得核糖核酸酶A I結(jié)晶溶液，即每個坐滴孔2內(nèi)核糖核酸酶A I 結(jié)晶溶液的體積為1.5μ1;4、結(jié)晶處理。1)將密封的第一 96孔坐滴板放入控溫箱，恒溫靜置，核糖核酸酶A I進行第一次結(jié)晶處理，其中，恒溫靜置的溫度為20°C，靜置時間為48小時，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得核糖核酸酶A I晶體的數(shù)目，計算核糖核酸酶A I第一次結(jié)晶成功率為1%，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的核糖核酸酶A I晶體的分辨率，平均分辨率為2)另取與第一 96孔坐滴板孔位相同的第二 96孔坐滴板，向第二 96孔坐滴板的每個深孔3中分別加入Img的干燥劑氯化鈣，用透明膠帶1密封第二 96孔坐滴板，倒置第二 96孔坐滴板，使干燥劑氯化鈣黏貼到相應(yīng)的第二 96孔坐滴板的深孔3位置的透明膠帶 1上；幻用每個深孔3對應(yīng)部位都粘有干燥劑的透明膠帶1替換經(jīng)過第一次結(jié)晶后的第一 96孔坐滴板的透明膠帶1，新的氯化鈣干燥劑將繼續(xù)濃縮結(jié)晶液滴；4)將添加了新的干燥劑的第一 96孔坐滴板再次放入控溫箱中，恒溫靜置，核糖核酸酶A I結(jié)晶析出，其中，恒溫靜置的溫度為20°C，靜置時間為48小時，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得核糖核酸酶A I晶體的數(shù)目，計算核糖核酸酶A I第二次結(jié)晶成功率為3%，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的核糖核酸酶A I晶體的分辨率，平均分辨率為1.5 A;5)重復(fù)步驟幻,3)、4)，第三次濃縮核糖核酸酶A I結(jié)晶液滴，全部核糖核酸酶A I 結(jié)晶溶液蒸干，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得核糖核酸酶A I晶體的數(shù)目，計算核糖核酸酶 A I第三次結(jié)晶成功率為7.3%，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的核糖核酸酶A I 晶體的分辨率，平均分辨率為1.6 A。實施例8 枯草桿菌蛋白酶A VIII結(jié)晶條件的篩選。1、制備枯草桿菌蛋白酶A VIII溶液。將枯草桿菌蛋白酶A VIII (美國Sigma公司，貨號為P5380)溶于pH為7. 00，0. 025mol/L HEPES-Na緩沖液中，然后用0. 22 μ m的濾膜過濾，濾去雜質(zhì)，制得濃度為IOmg/ ml的枯草桿菌蛋白酶A VIII溶液。2、添加干燥劑。向第一 96孔坐滴板的每個深孔3中加入2mg的干燥劑氯化鈣；3、配制結(jié)晶溶液。用自動移液系統(tǒng)將Hampton公司貨號為HR2-144的hdex 96結(jié)晶試劑盒中的蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑分別轉(zhuǎn)移到每個深孔3中均添加了 2mg干燥劑氯化鈣的第一 96孔坐滴板的相應(yīng)坐滴孔2中，其中，添加到每個坐滴孔2內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選試劑的體積分別為1μ 1 ；接著將枯草桿菌蛋白酶A VIII溶液轉(zhuǎn)移到第一 96孔坐滴板的每個坐滴孔2中， 其中，每個坐滴孔2內(nèi)枯草桿菌蛋白酶A VIII溶液的體積為0.5 μ 1，與蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選試劑混合，用透明膠帶1密封第一 96孔坐滴板，制得枯草桿菌蛋白酶A VIII結(jié)晶溶液，即每個坐滴孔2內(nèi)枯草桿菌蛋白酶A VIII結(jié)晶溶液的體積為1. 5μ 1 ；4、結(jié)晶處理。1)將密封的第一96孔坐滴板放入控溫箱，恒溫靜置，枯草桿菌蛋白酶A VIII進行第一次結(jié)晶處理，其中，恒溫靜置的溫度為20°C，靜置時間為48小時，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得枯草桿菌蛋白酶A VIII晶體的數(shù)目，計算枯草桿菌蛋白酶A VIII第一次結(jié)晶成功率為0% ；2)另取與第一 96孔坐滴板孔位相同的第二 96孔坐滴板，向第二 96孔坐滴板的每個深孔3中分別加入Img的干燥劑氯化鈣，用透明膠帶1密封第二 96孔坐滴板，倒置第二 96孔坐滴板，使干燥劑氯化鈣黏貼到相應(yīng)的第二 96孔坐滴板的深孔3位置的透明膠帶 1上；幻用每個深孔3對應(yīng)部位都粘有干燥劑的透明膠帶1替換經(jīng)過第一次結(jié)晶后的第一 96孔坐滴板的透明膠帶1，新的氯化鈣干燥劑將繼續(xù)濃縮結(jié)晶液滴；4)將添加了新的干燥劑的第一 96孔坐滴板再次放入控溫箱中，恒溫靜置，枯草桿菌蛋白酶AVIII結(jié)晶析出，其中，恒溫靜置的溫度為20 °C，靜置時間為48小時，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得枯草桿菌蛋白酶A VIII晶體的數(shù)目，計算枯草桿菌蛋白酶A VIII第二次結(jié)晶成功率為2%，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的枯草桿菌蛋白酶A VIII晶體的分辨率，平均分辨率為2.3 A；5)重復(fù)步驟幻、3)、4)，第三次濃縮枯草桿菌蛋白酶々VIII結(jié)晶液滴，全部枯草桿菌蛋白酶A VIII結(jié)晶溶液蒸干，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得枯草桿菌蛋白酶A VIII晶體的數(shù)目，計算枯草桿菌蛋白酶A VIII第三次結(jié)晶成功率為3%，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的枯草桿菌蛋白酶A VIII晶體的分辨率，平均分辨率為2.35 A。對照例1、溶菌酶單次干燥結(jié)晶篩選。除了將干燥劑硅膠一次性放入到96孔坐滴板的每個深孔3中，其中每個深孔3 中干燥劑硅膠的量為6. 5mg，控溫箱中恒溫靜置是時間為216小時之外，其余與實施例1第一次結(jié)晶過程相同，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得溶菌酶晶體的數(shù)目，溶菌酶結(jié)晶篩選成功率為沈％，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的溶菌酶晶體的分辨率，平均分辨率為 1.9 A。對照例2、蛋白酶K單次干燥結(jié)晶篩選。
除了將干燥劑硅膠一次性放入到96孔坐滴板的每個深孔3中，其中每個深孔3 中干燥劑硅膠的量為:3mg，控溫箱中恒溫靜置是時間為288小時之外，其余與實施例2第一次結(jié)晶過程相同，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得溶菌酶晶體的數(shù)目，溶菌酶結(jié)晶篩選成功率為36. 5%同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的溶菌酶晶體的分辨率，平均分辨率為1.7A。對照例3、甜味蛋白單次干燥結(jié)晶篩選。除了將干燥劑蒙脫石一次性放入到96孔坐滴板的每個深孔3中，其中每個深孔3 中干燥劑硅膠的量為llmg，控溫箱中恒溫靜置是時間為236小時之外，其余與實施例3第一次結(jié)晶過程相同，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得溶菌酶晶體的數(shù)目，溶菌酶結(jié)晶篩選成功率為3. 同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的溶菌酶晶體的分辨率，平均分辨率為1.8Ao對照例4、糜蛋白酶原A II單次干燥結(jié)晶篩選。除了將干燥劑分子篩一次性放入到96孔坐滴板的每個深孔3中，其中每個深孔3 中干燥劑硅膠的量為細g，控溫箱中恒溫靜置是時間為216小時之外，其余與實施例4第一次結(jié)晶過程相同，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得溶菌酶晶體的數(shù)目，溶菌酶結(jié)晶篩選成功率為17. 7%同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的溶菌酶晶體的分辨率，平均分辨率為 3.2 A0對照例5、肌血球素單次干燥結(jié)晶篩選。除了將干燥劑石灰一次性放入到96孔坐滴板的每個深孔3中，其中每個深孔3中干燥劑硅膠的量為:3mg，控溫箱中恒溫靜置是時間為288小時之外，其余與實施例5第一次結(jié)晶過程相同，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得溶菌酶晶體的數(shù)目，溶菌酶結(jié)晶篩選成功率為
同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的溶菌酶晶體的分辨率，平均分辨率為1.8 A。對照例6、刀豆球蛋白A VI單次干燥結(jié)晶篩選。除了將干燥劑氯化鈣一次性放入到96孔坐滴板的每個深孔3中，其中每個深孔3 中干燥劑硅膠的量為細g，控溫箱中恒溫靜置是時間為288小時之外，其余與實施例6第一次結(jié)晶過程相同，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得溶菌酶晶體的數(shù)目，溶菌酶結(jié)晶篩選成功率為31. 3%，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的溶菌酶晶體的分辨率，平均分辨率為 2.4 A。對照例7、核糖核酸酶A I單次干燥結(jié)晶篩選。除了將干燥劑氯化鈣一次性放入到96孔坐滴板的每個深孔3中，其中每個深孔3 中干燥劑氯化鈣的量為細g，控溫箱中恒溫靜置是時間為288小時之外，其余與實施例7第一次結(jié)晶過程相同，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得核糖核酸酶A I晶體的數(shù)目，核糖核酸酶 A I結(jié)晶篩選成功率為3%，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的核糖核酸酶A I晶體的分辨率，平均分辨率為1.9 A。對照例8、枯草桿菌蛋白酶A VIII單次干燥結(jié)晶篩選。除了將干燥劑氯化鈣一次性放入到96孔坐滴板的每個深孔3中，其中每個深孔3 中干燥劑氯化鈣的量為細g，控溫箱中恒溫靜置是時間為288小時之外，其余與實施例8第一次結(jié)晶過程相同，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得枯草桿菌蛋白酶A VIII晶體的數(shù)目，枯草桿菌蛋白酶A VIII結(jié)晶篩選成功率為1%，同時回收晶體，用X射線衍射法測定獲得的枯草桿菌蛋白酶A VIII晶體的分辨率，平均分辨率為2.5 A。試驗例1 溶菌酶結(jié)晶條件的可重復(fù)性實驗。1、制備溶菌酶溶液。將六次重結(jié)晶的溶菌酶(日本kikagaku公司，貨號為100940)分別溶于pH為 4. 6,0. lmol/L NaAc緩沖液中，然后用0. 22 μ m的濾膜過濾，濾去雜質(zhì)，制得四種濃度分別為 20mg/ml，30mg/ml，40mg/ml，50mg/ml 的溶菌酶溶液。2、配制 NaCl 溶液。將NaCl溶于pH為4. 6，0. IM NaAc緩沖液中，使得NaCl的濃度為40mg/ml。3、配制溶菌酶結(jié)晶溶液。分別將四種濃度的溶菌酶溶液和NaCl溶液等體積混合，制得初始濃度分別為 10mg/ml, 15mg/ml,20mg/ml,25mg/ml的溶菌酶結(jié)晶溶液，四種溶菌酶結(jié)晶溶液中NaCl的濃度為 20mg/ml。4、溶菌酶結(jié)晶處理。1)向4個96孔坐滴板的每個深孔3中加入2. 5mg的干燥劑硅膠，用自動移液系統(tǒng)分別向4個96孔坐滴板的每個坐滴孔2中加入1.4μ 1的四種溶菌酶結(jié)晶溶液，然后用透明膠帶1密封4個96孔坐滴板，即1個96孔坐滴板對應(yīng)一種溶菌酶結(jié)晶溶液，也即是4 個96孔坐滴板中一個96孔坐滴板的坐滴孔2內(nèi)加入的是濃度為10mg/ml的溶菌酶結(jié)晶溶液，第二個96孔坐滴板的坐滴孔2內(nèi)加入的是濃度為15mg/ml的溶菌酶結(jié)晶溶液，第三個 96孔坐滴板的坐滴孔2內(nèi)加入的是濃度為20mg/ml的溶菌酶結(jié)晶溶液，第四個96孔坐滴板的坐滴孔2內(nèi)加入的是濃度為25mg/ml的溶菌酶結(jié)晶溶液；2)將密封后的96孔坐滴板放入控溫箱內(nèi)，靜置，溶菌酶結(jié)晶析出，其中控溫箱內(nèi)溫度控制為20°C，靜置72小時后，在顯微鏡下觀察，分別統(tǒng)計獲得溶菌酶晶體的數(shù)目，計算第一次結(jié)晶成功率，其中濃度為10mg/ml的溶菌酶結(jié)晶溶液的第一次結(jié)晶成功率為13. 5%； 濃度為15mg/ml的溶菌酶結(jié)晶溶液的第一次結(jié)晶成功率為64. 6% ；濃度為20mg/ml的溶菌酶結(jié)晶溶液的第一次結(jié)晶成功率為69. 8% ；濃度為25mg/ml的溶菌酶結(jié)晶溶液的第一次結(jié)晶成功率為96.9% ；3)另外取與步驟1)中所述96孔坐滴板孔位相同的另外4個新的96孔坐滴板，向 4個新的96孔坐滴板的每個深孔3中加入Img的硅膠干燥劑，用透明膠帶1分別密封4個新的96孔坐滴板，倒置4個新的96孔坐滴板，使干燥劑黏貼到相應(yīng)坐滴板的深孔3位置的透明膠帶1上；4)用每個深孔3對應(yīng)部位都粘有干燥劑的透明膠帶1替換經(jīng)過第一次結(jié)晶后的每個96孔坐滴板的透明膠帶1，新的硅膠干燥劑將繼續(xù)濃縮結(jié)晶液滴；5)將添加了新的硅膠干燥劑的4個96孔坐滴板再次放入控溫箱內(nèi)，靜置，溶菌酶結(jié)晶析出，其中控溫箱內(nèi)溫度控制為20°C，靜置72小時后，在顯微鏡下觀察，分別統(tǒng)計出獲得溶菌酶晶體的數(shù)目，計算第二次結(jié)晶成功率，其中濃度為10mg/ml的溶菌酶結(jié)晶溶液的第二次結(jié)晶成功率為59.4% ；濃度為15mg/ml的溶菌酶結(jié)晶溶液的第二次結(jié)晶成功率為 83. 3%;濃度為20mg/ml的溶菌酶結(jié)晶溶液的第二次結(jié)晶成功率為96. 9%;濃度為25mg/ml 的溶菌酶結(jié)晶溶液的第二次結(jié)晶成功率為100% ；6)重復(fù)進行第幻-幻步，逐漸濃縮溶菌酶結(jié)晶溶液，直至全部溶菌酶結(jié)晶溶液蒸干，每重復(fù)一次，就在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計出獲得溶菌酶晶體的數(shù)目；本試驗例中，溶菌酶經(jīng)過3次結(jié)晶，溶菌酶結(jié)晶溶液即全部蒸干，統(tǒng)計出獲得溶菌酶晶體的數(shù)目，計算第三次結(jié)晶成功率，其中濃度為10mg/ml的溶菌酶結(jié)晶溶液的第三次結(jié)晶成功率為92. 7% ；濃度為15mg/ml的溶菌酶結(jié)晶溶液的第三次結(jié)晶成功率為96. 9% ； 濃度為20mg/ml的溶菌酶結(jié)晶溶液的第三次結(jié)晶成功率為100% ；濃度為25mg/ml的溶菌酶結(jié)晶溶液的第三次結(jié)晶成功率為100%經(jīng)過統(tǒng)計得到如下結(jié)果可重復(fù)性實驗中初始濃度為10mg/ml溶菌酶溶液的第一次，第二次和第三次的成功率分別為13.5^,59.4^,92.7%,最終的成功率即第三次結(jié)晶成功率與文獻報道的干燥劑法相比，成功率提高至原水平的4. 5倍。初始濃度為15mg/ml 溶菌酶溶液的第一次，第二次和第三次的成功率分別為64. 6 %，83. 3 %，96. 9 %，最終的成功率與文獻報道的干燥劑法相比，成功率提高至原水平的1. 6倍。初始濃度為20mg/ml溶菌酶溶液的第一次，第二次和第三次的成功率分別為69. 8%，96. 9%，100%，最終的成功率與文獻報道的干燥劑法相比，成功率提高至原水平的1. 5倍。初始濃度為25mg/ml溶菌酶溶液的第一次，第二次和第三次的成功率分別為96. 9%，100%,100%,最終的成功率與文獻報道的干燥劑法相比，成功率相同。
權(quán)利要求
1.一種提高蛋白質(zhì)結(jié)晶率的方法，包括1)制備蛋白質(zhì)溶液將蛋白質(zhì)加入到緩沖溶液中，溶解，制成蛋白質(zhì)溶液；幻制備蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液將蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑與蛋白質(zhì)溶液混合，制得蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液；3)蛋白質(zhì)結(jié)晶將干燥劑和蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液置于同一密閉容器中，恒溫靜置進行結(jié)晶；其中，干燥劑和蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液不直接接觸；其特征在于步驟3) 中將干燥劑分批次加入到容器中，在密閉條件下重復(fù)進行結(jié)晶過程，直至蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液完全干燥為至。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液的體積確定每批次所加入的干燥劑的用量當?shù)鞍踪|(zhì)結(jié)晶溶液的體積為1 2μ 1時，第一次所加入的干燥劑的用量為2 5mg。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟3)中根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液的體積確定每批次所加入的干燥劑的用量當?shù)鞍踪|(zhì)結(jié)晶溶液的體積為1 2μ 1時，以后每次所加入的干燥劑用量各為0. 5-2mgo
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中所述蛋白質(zhì)溶液的濃度>0，并且 ^ 50mg/mlo
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)中蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑與蛋白質(zhì)溶液的體積之比為0.125-8 1。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述干燥劑選自酸性干燥劑、中性干燥劑或堿性干燥劑中的一種或多種。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的干燥劑選自硅膠、分子篩、蒙脫石、石灰、氯化鈣中的一種或多種。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟3)中所述密閉容器選自蛋白質(zhì)晶體板、坐滴板或懸滴板中的任一種。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的恒溫選自0-60°C溫度范圍中的任何一種溫度；所述靜置時間為48 96小時。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的蛋白質(zhì)包括溶菌酶、蛋白酶K、甜味蛋白、糜蛋白酶原A II、肌血球素、刀豆球蛋白、核糖核酸酶A I或枯草桿菌蛋白酶A VIII。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高蛋白質(zhì)結(jié)晶率的方法，用于解決現(xiàn)有的生物大分子結(jié)晶條件篩選方法結(jié)晶成功率低的技術(shù)問題。技術(shù)方案包括將蛋白質(zhì)加入到緩沖溶液中，溶解，制成蛋白質(zhì)溶液；將蛋白質(zhì)溶液與不同的蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑混合，制得蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液；將干燥劑分多次加入到密閉容器中，且使干燥劑與蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液相互分離，與蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液進行多次結(jié)晶處理，統(tǒng)計出獲得蛋白質(zhì)大分子晶體數(shù)，計算篩選成功率。本發(fā)明使用逐級干燥的方法，干燥劑用量逐漸增加，先使一些過飽和度較高的溶液生長出晶體，隨著干燥劑量的增加，一些過飽和度低的溶液也有機會長出晶體，最大限度地提高了蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的篩選成功率，而且經(jīng)過多次結(jié)晶后得到的晶體的分辨率提高，結(jié)晶蛋白質(zhì)的晶體質(zhì)量提高。
文檔編號C12N9/22GK102190702SQ20111005296
公開日2011年9月21日 申請日期2011年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月7日
發(fā)明者劉永明, 盧慧甍, 商澎, 尹大川, 郭衛(wèi)紅, 鹿芹芹 申請人:西北工業(yè)大學