專利名稱：一種新的氧肟酸類嗜鐵素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的嗜鐵素，具體涉及一種氧肟酸類嗜鐵素的制備方法及其在黃瓜枯萎病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
利用有益菌進(jìn)行病蟲害防治，已是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題，至今已有多種菌株成功地被開發(fā)成產(chǎn)品并得到推廣。它們?cè)诓∠x害防治中的重要地位來(lái)自他們固有的一些屬性。假單胞桿菌(Peudomonas spp.)是一類得到廣泛研究的生防細(xì)菌，這類細(xì)菌能產(chǎn)生特殊物質(zhì)嗜鐵素，而分泌嗜鐵素是其控制真菌病害的一種主要機(jī)制，因而成為科研工作者研究的熱點(diǎn)對(duì)象。嗜鐵素是一類小分子量(500 IOOODa)能特異地螯合!^3+的螯合因子，絕大多數(shù)細(xì)菌和真菌都能通過(guò)非核糖途徑合成分泌一種或幾種嗜鐵素，它的產(chǎn)生是地球上微生物適應(yīng)地殼高氧低鐵環(huán)境的結(jié)果。嗜鐵素按照它的螯合基團(tuán)的化學(xué)特性可分為三大類一類為氧肟酸類(hydroxamate)嗜鐵素、一類為兒茶酚類(catechol)嗜鐵素、還有一類為混合型(mixed ligand)嗜鐵素，有的報(bào)道稱其為α-羥基羧酸(α-hydroxycarboxylic)(也稱作檸檬酸型)。關(guān)于嗜鐵素的研究，國(guó)內(nèi)外目前仍處于基礎(chǔ)性研究階段。其提純和結(jié)構(gòu)分析方面的研究起步較早，而國(guó)內(nèi)卻鮮見報(bào)道，迄今為止，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)500多種化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的嗜鐵素。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)嗜鐵素的研究主要集中在其所參與的生防活動(dòng)。例如，許煜泉 (1999)對(duì)生防菌Peudomonas sp. JKD-2在低鐵條件下抑制稻瘟菌的生長(zhǎng)的研究驗(yàn)證了嗜鐵素鐵競(jìng)爭(zhēng)這一抗病性功能。陳雙雅和陳旋Q006)研究中提到嗜鐵素的抗生作用， 即嗜鐵素直接通過(guò)抑制病原菌來(lái)起到控制病害目的。Maria Guineth (2000)也提到嗜鐵素的抗生作用。冉隆賢000 通過(guò)對(duì)嗜鐵素缺失突變體控制桉樹灰霉病的研究提到了嗜鐵素對(duì)病害的誘導(dǎo)抗性作用。Van peer R(1992), Leeman M(1996)和 V. Ramamoorthy QOOO) 也提到嗜鐵素的誘導(dǎo)作用。此外，嗜鐵素近年來(lái)還探索應(yīng)用于醫(yī)藥等領(lǐng)域[18]?？傊?，嗜鐵素的功能是多樣的，它不但是依賴受體的高親和性的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，還是生長(zhǎng)因子或萌發(fā)因子， 也可以是抗生素或毒力因子。由此可見，嗜鐵素是一種很有開發(fā)和利用價(jià)值的新型生物活性物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從惡臭假單胞菌HZ-2菌株(!Peudomonas putida)(菌株HZ-2，是本發(fā)明人于2008年3月分離自浙江省杭州市多年種植蔬菜的杭州下沙喬司監(jiān)獄旁的大棚， 經(jīng)鑒定屬于惡臭假單胞菌)中分離出新的具有實(shí)用價(jià)值嗜鐵素和該化合物的制備方法，及其在防治植物病害，特別是防治黃瓜枯萎病中的應(yīng)用。惡臭假單胞菌的從不同地地域采的菌株也可以得到此類新物質(zhì)。一方面，本發(fā)明提供一種異羥肟酸類型嗜鐵素，具有如下結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.一種異羥肟酸類型嗜鐵素化合物的制備方法，包括(1)、發(fā)酵液體的準(zhǔn)備菌種惡臭假單胞菌在固體KMB培養(yǎng)基上活化Mh后，挑取單菌落接入5mL液體KMB培養(yǎng)基中，置于搖床中，，150r/分鐘條件下培養(yǎng)Mh，然后接種到固體種子培養(yǎng)基KMB中，在下培養(yǎng)Mh，得到一級(jí)種子；然后將培養(yǎng)好的一級(jí)種子挑取一環(huán)，在MKB培養(yǎng)基中發(fā)酵，其中1000毫升的KMB固體或液體培養(yǎng)基的成分包括酪蛋白氨基酸 5g，MgSO4 · 7H20 2. 5g，K2HPO4 · 3H20 2. 5g，F(xiàn)e3+ 的含量為 0. lmg/L ；O)、收集步驟(1)中發(fā)酵液IOOOmL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(43°C )濃縮成稍粘稠液體，離心去除白色不溶物，上清液用HCl將pH調(diào)至4備用；(3)、把步驟( 中得到的上清液樣品上到大孔吸附樹脂柱后液體濃縮后用CAS檢測(cè)液檢查，不顯示活性，再用不同極性的洗脫液依次洗脫，對(duì)洗脫液進(jìn)行減壓濃縮后，測(cè)定活性， 其中不同極性的依次洗脫的洗脫液為離子水、0.2%鹽酸溶液、10%甲醇-水溶液、30%甲醇-水溶液、50%甲醇-水溶液、80%甲醇-水溶液、100%甲醇、100%丙酮溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中獲得的異羥肟酸類型嗜鐵素化合物的結(jié)構(gòu)如下
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將步驟(3)中洗脫的樣品再用HPLC分離，分離的條件為材料ODS-BP ；流速1ml/分鐘；流動(dòng)相30%甲醇-水溶液洗脫30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中HPLC分離的條件為材料為ODS-BP；流速為Iml/分鐘；流動(dòng)相為5-60%甲醇-水進(jìn)行梯度洗脫30分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述的方法，其中在步驟(1)之后還對(duì)發(fā)酵液順次進(jìn)行如下檢測(cè)=(I)CAS測(cè)試液檢測(cè)，呈明顯橙紅色，則證明發(fā)酵液中富含有嗜鐵素；(2)進(jìn)行Arnow Assay試驗(yàn)，如果分析結(jié)果溶液顯黃色則認(rèn)為初步確定發(fā)酵液可能含氧肟酸類型嗜鐵素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的嗜鐵素的制備方法，該方法包括發(fā)酵液體的準(zhǔn)備，有機(jī)溶劑提取、萃取、經(jīng)常規(guī)柱色譜和高效液相色譜分離得到，它對(duì)農(nóng)業(yè)病害具有一定的防治作用，因此可以用于制備新型生物農(nóng)藥。
文檔編號(hào)C12R1/40GK102181499SQ201110052619
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月3日
發(fā)明者吳吉安, 施躍峰, 梁建根, 王連平, 竺利紅, 郝中娜, 陳建忠, 陳識(shí)峰, 陶榮祥 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院