專利名稱：一種乳酸乳球菌和該乳酸乳球菌產(chǎn)生的抗菌肽以及該抗菌肽的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于 微生物資源利用領(lǐng)域，具體涉及一種乳酸乳球菌和該乳酸乳球菌產(chǎn)生的抗菌肽以及該抗菌肽的用途。
背景技術(shù)：
食源性病原菌和食品腐敗菌不僅嚴(yán)重影響人類(lèi)健康，而且造成糧食的大量浪費(fèi)。 一些細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌素是一類(lèi)蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗菌肽，目前普遍認(rèn)為利用食品安全級(jí)乳酸菌細(xì)菌素替代化學(xué)防腐保鮮劑是提高食品安全和保障糧食安全的關(guān)鍵，因而篩選新的細(xì)菌素產(chǎn)生菌株以及抗菌肽的制備技術(shù)對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有重要的意義。乳酸菌自古以來(lái)就廣泛用于食品的防腐保鮮，在乳酸菌產(chǎn)生的眾多抑菌物質(zhì)中小分子肽類(lèi)物質(zhì)細(xì)菌素，由于可被人體分泌的酶降解，更凸顯了它的安全性和在食品保鮮中的應(yīng)用價(jià)值。乳酸乳球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素Msin是FAO批準(zhǔn)的唯一一個(gè)可用于食品保鮮的細(xì)菌素，Nisin的毒性極低(LD50約為7g/kg體重)，在唾液中IOmin內(nèi)可被完全降解，不會(huì)引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，因而廣泛應(yīng)用于乳制品、肉制品、酸性罐頭食品和發(fā)酵食品的防腐保鮮。但由于Nisin只能在酸性條件下呈可溶性狀態(tài)，在中性條件下溶解性低，穩(wěn)定性差，且易被肉類(lèi)蛋白吸附，這些特性極大地影響了 Nisin在肉制品保鮮中的應(yīng)用，因此有必要開(kāi)發(fā)新的多肽抗菌劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種乳酸乳球菌。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案一種乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp. lactis) LLC518,已于2011年1月26日保藏于中國(guó)微牛物菌種保藏管理委員會(huì)普通微牛物中心(CGMCC),保藏編號(hào)為CGMCC No. 4584。本發(fā)明中的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp. lactis)LLC518是從市售黃瓜制備的富集液中篩選獲得的，具體篩選方法為用含0. 01%溴甲酚紫的MRS選擇性培養(yǎng)基先篩選產(chǎn)酸菌株，再通過(guò)將篩選菌點(diǎn)種在MRS固體培養(yǎng)基表面，待生長(zhǎng)形成明顯的菌斑后， 上面再倒一層含指示菌乳桿菌(Lactobacillus sp.)LSX801的上層培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)，將產(chǎn)生抑菌圈的菌株進(jìn)一步經(jīng)過(guò)發(fā)酵，獲得發(fā)酵上清液，并通過(guò)排除發(fā)酵液中有機(jī)酸、過(guò)氧化氫的抑菌作用，進(jìn)一步通過(guò)糜蛋白酶和木瓜蛋白酶可消除抑菌活性從而證明菌株的發(fā)酵液中含有蛋白質(zhì)類(lèi)的抑菌物質(zhì)。通過(guò)形態(tài)學(xué)特征、生理生化學(xué)特征以及16SrDNA序列分析，依據(jù) 《伯杰氏細(xì)菌分類(lèi)手冊(cè)》和《乳酸細(xì)菌分類(lèi)鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》，表明該菌株屬于乳酸乳球菌乳酸亞禾中(Lactococcus lactis subsp. lactis),編號(hào)為 LLC518。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種上述乳酸乳球菌產(chǎn)生的抗菌肽以及抗菌肽的生
產(chǎn)方法。本發(fā)明所述的抗菌肽，是通過(guò)發(fā)酵乳酸乳球菌(Lactococcus lactissubsp.lactis)LLC518CGMCC No. 4584 而得到的抗菌肽，命名為 LacticinLLC518?？咕牡闹苽浞椒梢酝ㄟ^(guò)兩種途徑 第一個(gè)途徑首先從MRS斜面培養(yǎng)基上挑取已活化的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp. lactis) LLC518CGMCC No. 4584 接種于 MRS 種子培養(yǎng)基中，28°C搖床培養(yǎng) 12 小時(shí)，再將種子液按2 6%的接種量接種于MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C靜置培養(yǎng)24h即可得到發(fā)酵液；再將得到的發(fā)酵液離心；取上清液，0.45 μ m濾膜過(guò)濾，對(duì)濾過(guò)液進(jìn)行硫酸銨沉淀；然后離心，取沉淀得到的沉淀蛋白；將沉淀蛋白溶解在水中，采用截留分子量2000Da 的透析袋透析處理，真空冷凍干燥透析液獲得粗制干粉；再將粗制干粉溶解于水中，并經(jīng) Sephadex G-50凝膠層析，收集活性峰進(jìn)行反相HPLC處理，以獲得抗菌肽純品?？咕牡纳鲜黾兓襟E的具體條件如下將所述的發(fā)酵液經(jīng)4°C、8000r/min離心25min，取上清液經(jīng)孔徑0. 45 μ m的濾膜過(guò)濾，所得濾液以30 50 %的飽和度進(jìn)行硫酸銨沉淀，12h后，4°C，8000r/min離心45min得到沉淀蛋白，取沉淀蛋白溶解在水中后于截留分子量2000Da的透析袋中透析4h，將透析液放入_20°C冰箱冷凍后用冷凍干燥機(jī)制成所述的粗制干粉；將粗制干粉溶解在水中并經(jīng)孔徑0.45μπι的濾膜過(guò)濾后，經(jīng)S印hadex G_50凝膠層析，收集活性峰，RP-HPLC制備抗菌肽純品；所述的凝膠層析采用S印hadex G-50柱填料(26 X 100cm)，上樣量為5ml，流速為 1. 5ml/min,洗脫液為經(jīng)0. 22 μ m濾膜過(guò)濾二級(jí)水，活性峰收集保留時(shí)間為70-85min ；RP-HPLC 層析條件為色譜柱C18 柱 SymmetryShield ，規(guī)格19X150mm，上樣量970μ 1，流速2. 5ml/min，溫度25°C，波長(zhǎng)215nm，洗脫液A為超純水，B為色譜純乙腈。程序:0-6min 0-5% B，6_66min 5-100% B，66_80min 100% B ；活性峰收集保留時(shí)間為 32. 2-32. 5min。第二個(gè)途徑首先從MRS斜面培養(yǎng)基上挑取已活化的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp. lactis) LLC518CGMCC No. 4584 接種于 MRS 種子培養(yǎng)基中，28°C搖床培養(yǎng) 12 小時(shí)，再按2 6%的接種量接種于MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C靜置培養(yǎng)24h即可得到發(fā)酵液；再將發(fā)酵液經(jīng)陶瓷膜過(guò)濾除菌后，噴霧干燥得到粉末狀的抗菌肽成品。噴霧干燥步驟的具體條件如下將發(fā)酵液在溫度25°C的條件下，通過(guò)操作壓力為 0. 02Mpa，膜孔徑為0. 2μπι的陶瓷膜過(guò)濾后得到去除菌體的過(guò)濾液，向此過(guò)濾液中加入固體食鹽，固體食鹽的質(zhì)量占過(guò)濾液的體積比為5 20%，待固體食鹽完全溶解后進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥機(jī)的進(jìn)風(fēng)溫度為130 150°C，出風(fēng)溫度為110 130°C，即得粉末狀的抗菌肽成品。由上述任何一種途徑制得的抗菌肽也都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種上述抗菌肽在肉制品保鮮中用途。本發(fā)明中的抗菌肽尤其適用于對(duì)豬肉進(jìn)行保鮮，具體條件為每IOOg豬肉中添加 12ml抗菌肽溶液，抗菌肽的質(zhì)量百分比的濃度為3. 1%。本發(fā)明的有益效果如下1、本抗菌肽Lacticin LLC518與現(xiàn)有的抗菌肽Nisin不同，Nisin可被α -胰凝乳蛋白酶降解，對(duì)鏈霉蛋白酶Ε、胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感。而本抗菌肽除可被α-胰凝乳蛋白酶降解外，還可被木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶E和蛋白酶K降解。
2、本乳酸乳球菌產(chǎn)生的抗菌肽的抑菌譜不同于現(xiàn)有的抗菌肽Nisin，對(duì)Nisin敏感的藤黃微球菌無(wú)抑制作用。3、本乳酸乳球菌產(chǎn)生的抗菌肽在較廣的pH范圍內(nèi)有活性，特別是在堿性條件下仍具有抑菌作用。4、本抗菌 肽的作用方式殺死細(xì)菌，且在4°C條件下保藏條件下具有顯著的殺菌作用。5、本抗菌肽在肉制品中具有穩(wěn)定的抑菌作用，當(dāng)與EDTA、山梨酸鉀聯(lián)合作用時(shí)，可使抑菌作用達(dá)到最大值。


圖1為粗制干粉溶于水并經(jīng)膜過(guò)濾后通過(guò)S^hadex G_50的洗脫曲線；圖2為S印hadex-G-50分離峰的抑菌作用示意圖；圖3為抗菌肽高效液相色譜洗脫曲線；圖4為抗菌肽質(zhì)譜圖；圖5A是37°C下抗菌肽對(duì)LSX801的作用方式；圖5B是4°C下抗菌肽對(duì)LSX801的作用方式；圖5C是37°C下抗菌肽對(duì)單核增生李斯特菌的作用方式；圖5D是4°C下抗菌肽對(duì)單核增生李斯特菌的作用方式；圖6抗菌肽對(duì)豬肉中細(xì)菌的抑制作用；圖7純品抗菌肽對(duì)指示菌的抑制作用；圖8乳酸乳球菌LLC518的形態(tài)特征觀察圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1本發(fā)明的乳酸乳球菌LLC518采用以下方式得到1、將從安徽合肥市場(chǎng)中購(gòu)置的新鮮黃瓜洗凈切成小塊，裝滿50ml的無(wú)菌試管，壓實(shí)，用塑料皮和牛皮紙密封，30°C，富集培養(yǎng)48h后，取樣涂布于含0.01%溴甲酚紫的MRS選
擇培養(yǎng)基。2、挑取使含0. 01 %溴甲酚紫的MRS選擇培養(yǎng)基變黃的產(chǎn)酸菌株，進(jìn)一步分離純化；2、以乳桿菌(Lactobacillus sp. ) LSX801為指示菌，通過(guò)平板點(diǎn)種法獲得具有抑菌能力的菌株；3、通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)獲取發(fā)酵液，離心處理獲得上清液，并通過(guò)0. 45 μ m濾膜過(guò)濾除去菌體，添加40%的硫酸銨處理濾液，并經(jīng)透析、冷凍干燥制成粗蛋白干粉。將干粉溶于水溶液中，添加至牛灃杯中，采用平板擴(kuò)散法篩選有抑菌能力的菌株；4.通過(guò)糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶E、蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶處理粗蛋白干粉，確定抑菌物質(zhì)具有蛋白質(zhì)性質(zhì)；
5.通過(guò)形態(tài)學(xué)和生理生化特征以及16SrDNA序列特征的比對(duì)分析，確定乳酸乳球菌 LLC518 為乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp. Iactis)。乳酸乳球菌LLC518的生物學(xué)特征如下在MRS平板培養(yǎng)基上菌落呈圓形，中央隆起，表面光滑，邊緣整齊，乳白色，菌落直徑0.5 1.0mm。在MRS液體培養(yǎng)基中無(wú)菌膜，菌液混濁，有沉淀產(chǎn)生。革蘭氏陽(yáng)性菌，球形，菌體直徑約0. 5 0. 8um，無(wú)芽孢，無(wú)鞭毛，單個(gè)或成對(duì)存在。在厭氧條件下長(zhǎng)勢(shì)比好氧條件下好，厭氧條件下菌落直徑相對(duì)好氧條件下增大約0. 5mm,在有氧條件下生長(zhǎng)情況也良好，屬于兼性厭氧菌?？稍?0 40°C之間生長(zhǎng)，45°C不生長(zhǎng)，其中最適生長(zhǎng)溫度為30°C。在0_7%氯化鈉濃度下均可生長(zhǎng)。接觸酶陰性；可分解葡萄糖產(chǎn)酸，但不產(chǎn)氣，也不產(chǎn)生硫化氫，但可水解精氨酸產(chǎn)生氨；可分解七葉苷，但不分解淀粉和明膠；石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性，但不產(chǎn)生蛋白酶，不能使牛奶胨化；乙酰甲基甲醇試驗(yàn)陰性，表明該菌不能發(fā)酵葡萄糖生成乙酰甲基甲醇。發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，但不產(chǎn)氣，可發(fā)酵木糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、乳糖、麥芽糖和甘露醇產(chǎn)酸，利用棉籽糖和肌醇但不產(chǎn)酸。乳酸乳球菌LLC518的16SrDNA的序列為GCAGGCACGCTGGCGGCGTGCTATACATGCAAGTTGAGCGCTGAAGGTTGGTACTTGTACCGACTGGA TGAGCAGCGAACGGGTGAGTAACGCGTGGGGAATCTGCCTTTGAGCGGGGGACAACATTTGGAAACGAATGCTAAT ACCGCATAAAAACTTTAAACACAAGTTTTAAGTTTGAAAGATGCAATTGCATCACTCAAAGATGATCCCGCGTTGT ATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGATGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTG GGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAG CAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGGTAGAGAAGAACGTTGGTGAGAGTGGAAA GCTCATCAAGTGACGGTAACTACCCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCC GAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGTGGTTTATTAAGTCTGGTGTAAAAGGCAGTGGCTCA ACCATTGTATGCATTGGAAACTGGTAGACTTGAGTGCAGGAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATG CGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGCCTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGG GGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGATGTAGGGAGCTATAAGTTCT CTGTATCGCAGCTAACGCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGG GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCG TGCTATTC CTAGAGATAGGAAGTTCCTTCGGGACACGGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCG TGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAACG AGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACAC GTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCGAGACAGTGATGTTTAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGG ATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGT TCCCGGGCCTTGTACACACCGCCOGTCACACCACGGGAGTTGGGAGTACCCGAAGTAGGTTGCCTAACCGCAAGG AGGGCGCTCCTAAGTAAGACCGAGCTTC實(shí)施例2抗菌肽的制備步驟如下A、抗菌肽的發(fā)酵從MRS斜面培養(yǎng)基上挑取已活化的乳酸乳球菌(LactococcusIactis subsp. lactis) LLC518CGMCC No. 4584 接種于 MRS 種子培養(yǎng)基中，28°C搖床培養(yǎng) 12 小時(shí)，再將種子液按4%的接種量接種于MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C靜置培養(yǎng)24h即可得到發(fā)酵液；B、抗菌肽的分離與純化將所述的發(fā)酵液經(jīng)4°C、8000r/min離心25min，取上清液經(jīng)孔徑0. 45 μ m的濾膜過(guò)濾，所得濾液以30 50%的飽和度進(jìn)行硫酸銨沉淀，12h后，4°C， 8000r/min離心45min得到沉淀蛋白，取沉淀蛋白溶解在水中后于截留分子量2000Da的透析袋中透析4h，將透析液放入_20°C冰箱冷凍后用冷凍干燥機(jī)制成所述的粗制干粉；將粗制干粉溶解在水中并經(jīng)孔徑0. 45 μ m的濾膜過(guò)濾后，經(jīng)S印hadex G-50凝膠層析，收集活性峰，RP-HPLC制備抗菌肽純品； 所述的凝膠層析采用S印hadex G-50柱填料(26 X 100cm)，上樣量為5ml，流速為 1. 5ml/min,洗脫液為經(jīng)0. 22 μ m濾膜過(guò)濾二級(jí)水，活性峰收集保留時(shí)間為70-85min ；RP-HPLC 層析條件為色譜柱C18 柱 SymmetryShield ，規(guī)格19X150mm，上樣量970μ 1，流速2. 5ml/min，溫度25°C，波長(zhǎng)215nm，洗脫液A為超純水，B為色譜純乙腈。程序:0-6min 0-5% B，6_66min 5-100% B，66_80min 100% B ；活性峰收集保留時(shí)間為 32. 2-32. 5min。粗制干粉溶于水并經(jīng)膜過(guò)濾后通過(guò)S印hadex G-50的洗脫曲線如圖1所示，且 Sephadex-G-50分離峰的抑菌作用如圖2所示，圖2中1為S印hadex-G_50第一峰，2為 Sephadex-G-50 第二峰。RP-HPLC的洗脫曲線如圖3所示。實(shí)施例3抗菌肽的制備步驟如下A、抗菌肽的發(fā)酵從MRS斜面培養(yǎng)基上挑取已活化的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp. lactis) LLC518CGMCC No. 4584 接種于 MRS 種子培養(yǎng)基中，28°C搖床培養(yǎng) 12 小時(shí)，再將種子液按4%的接種量接種于MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C靜置培養(yǎng)24h即可得到發(fā)酵液；B、將發(fā)酵液在溫度25°C的條件下，通過(guò)操作壓力為0. 02Mpa，膜孔徑為0. 2 μ m的陶瓷膜過(guò)濾后得到過(guò)濾液，向此過(guò)濾液中加入固體食鹽，固體食鹽的質(zhì)量占過(guò)濾液的體積百分比為5 20 %，待固體食鹽完全溶解后進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥機(jī)的進(jìn)風(fēng)溫度為130 150°C，出風(fēng)溫度為110 130°C，即得粉末狀的抗菌肽成品。固體食鹽的質(zhì)量比對(duì)抗菌肽活力的影響在150ml乳酸乳球菌LLC518的發(fā)酵上清液中分別加入5%、10%、15%、20%的食鹽，進(jìn)風(fēng)溫度設(shè)為140°C，出風(fēng)溫度設(shè)為120°C，噴霧干燥處理后，取各個(gè)條件下的樣品0. 1克于5ml水中，測(cè)定其活力，所得樣品的活力如表 1所示，同時(shí)可以得到在加入15%食鹽時(shí)，總活力最大。表1輔料比對(duì)產(chǎn)品活力的影響
權(quán)利要求
1.一種乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp. lactis)LLC518,其在中國(guó)微牛物菌種保藏管理委員會(huì)普通微牛物中心的保藏編號(hào)為CGMCCNo. 4584。
2.一種抗菌肽的制備方法，其通過(guò)乳酸乳球菌(Lactococcus lactissubsp. lactis) LLC518CGMCC No. 4584發(fā)酵以得到抗菌肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗菌肽的制備方法，其包括以下制備步驟從MRS斜面培養(yǎng)基上挑取已活化的乳酸乳球菌(Lactococcus lactissubsp. lactis) LLC518CGMCC No. 4584 接種于MRS種子培養(yǎng)基中，28°C搖床培養(yǎng)12小時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期，再按2 6%的接種量接種于 MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C靜置培養(yǎng)24h達(dá)到穩(wěn)定期，即可得到發(fā)酵液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的抗菌肽的制備方法，其特征在于將得到的抗菌肽按照以下方法純化將得到的發(fā)酵液離心；取上清液，0. 45 μ m濾膜過(guò)濾，對(duì)濾過(guò)液進(jìn)行硫酸銨沉淀；然后離心，取沉淀蛋白；將沉淀蛋白溶解在水中，采用截留分子量2000Da的透析袋透析處理，將透析液真空冷凍干燥獲得粗制干粉；再將粗制干粉溶解于水中，并經(jīng)Sephadex G-50凝膠層析，收集活性峰進(jìn)行反相HPLC處理，以獲得抗菌肽純品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗菌肽的制備方法，其特征在于將所述的發(fā)酵液經(jīng)4°C、 8000r/min離心25min，取上清液經(jīng)孔徑0. 45 μ m的濾膜過(guò)濾，所得濾液以30 50 %的飽和度進(jìn)行硫酸銨沉淀，12h后，4°C，8000r/min離心45min得到沉淀蛋白，取沉淀蛋白溶解在水中后于截留分子量2000Da的透析袋中透析4h，將透析液放入-20°C冰箱冷凍后用冷凍干燥機(jī)制成所述的粗制干粉；將粗制干粉溶解在水中并經(jīng)孔徑0. 45 μ m的濾膜過(guò)濾后，經(jīng) Sephadex G-50凝膠層析，收集活性峰，RP-HPLC制備抗菌肽純品；所述的凝膠層析采用S印hadex G-50柱填料(26 X 100cm)，上樣量為5ml，流速為 1. 5ml/min,洗脫液為經(jīng)0. 22 μ m濾膜過(guò)濾二級(jí)水，活性峰收集保留時(shí)間為70-85min ；RP-HPLC層析條件為色譜柱:C18柱SymmetryShield ，規(guī)格19X 150mm，上樣量 970 μ 1，流速2. 5ml/min,溫度25°C，波長(zhǎng)215nm，洗脫液A為超純水，B為色譜純乙腈。 程序:0-6min 0~5 % B，6_66min 5-100% B，66_80min 100% B ；活性峰收集保留時(shí)間為 32. 2-32. 5min。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的抗菌肽的制備方法，其特征在于將發(fā)酵液經(jīng)陶瓷膜過(guò)濾除菌后，噴霧干燥得到粉末狀的抗菌肽成品。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗菌肽的制備方法，其特征在于將發(fā)酵液在溫度25°C的條件下，通過(guò)操作壓力為0. 02Mpa，膜孔徑為0. 2 μ m的陶瓷膜過(guò)濾后得到去除菌體的過(guò)濾液， 向過(guò)濾液中加入固體食鹽，固體食鹽的質(zhì)量占過(guò)濾液的體積百分比為5 20%，待固體食鹽完全溶解后進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥機(jī)的進(jìn)風(fēng)溫度為130 150°C，出風(fēng)溫度為110 130°C，即得粉末狀的抗菌肽成品。
8.由權(quán)利要求2 7中任一項(xiàng)所述的抗菌肽制備方法得到的抗菌肽。
9.權(quán)利要求8所述的抗菌肽在肉制品保鮮中的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗菌肽的用途，其特征在于抗菌肽用于豬肉的保鮮，具體條件為每IOOg豬肉中添加12ml抗菌肽溶液，抗菌肽的質(zhì)量百分比的濃度為3. 1%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乳酸乳球菌和該乳酸乳球菌產(chǎn)生的抗菌肽以及該抗菌肽的用途，本發(fā)明中的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis)LLC518，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為CGMCC No.4584。本發(fā)明中的乳酸菌菌株產(chǎn)生的抗菌肽能夠抑制四聯(lián)球菌、蘇云金芽胞桿菌、乳酸乳桿菌、英諾克李斯特菌，尤其對(duì)能引起嚴(yán)重食物中毒的單增李斯特菌有很強(qiáng)的抑制作用。因此本乳酸菌菌株及其抗菌肽在食品保鮮中有著積極的作用。
文檔編號(hào)C12R1/46GK102286393SQ20111004891
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月1日
發(fā)明者倪敬田, 別懷周, 張明, 方佳琪, 李瑞勝, 李翠, 祁克宗, 竺德強(qiáng), 謝繼輝, 陳麗園 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)