專利名稱：用于檢測(cè)豬肺炎支原體的lamp試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬衛(wèi)生檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及一種用于檢測(cè)豬肺炎支原體的試劑盒，特別涉及一種用于檢測(cè)豬肺炎支原體的LAMP試劑盒及其建立方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是引起豬氣喘病(MPS)的病原。 后者是豬群中流行最廣、傳播最快、最難凈化的疫病之一。豬肺炎支原體通過(guò)呼吸道傳播， 感染呼吸道上皮后導(dǎo)致呼吸道纖毛萎縮、脫落、損壞，上皮細(xì)胞壞死，降低呼吸道黏膜的免疫功能，引起肺部功能損傷，容易產(chǎn)生其它呼吸道病原的繼發(fā)感染。據(jù)報(bào)道，該病可使豬的飼料轉(zhuǎn)化率降低10%，生長(zhǎng)速度降低12% 15%，出欄時(shí)間延長(zhǎng)1個(gè)月，與胸膜肺炎放線桿菌、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒等混合感染時(shí)，情況更為嚴(yán)重，該病一旦爆發(fā)就難以控制，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)該病致病機(jī)理還不十分清楚。在檢測(cè)方面，國(guó)內(nèi)外已建立了多種血清學(xué)檢測(cè)方法，如免疫瓊擴(kuò)和間接血凝等，但免疫瓊擴(kuò)和間接血凝法存在著靈敏度不高等問(wèn)題。由于Mhp與非致病支原體之間存在著交叉反應(yīng)，所以血清學(xué)檢測(cè)方法的研發(fā)困難重重。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是由Τ. Notomi (2000)發(fā)明的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)依賴4條特異設(shè)計(jì)的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可以高效、快速、高特異地?cái)U(kuò)增靶序列。今年來(lái)，國(guó)外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體的檢測(cè)。Masaki Imai等人Q007)利用LAMP建立了禽流感病毒的實(shí)驗(yàn)室確診體系；Nobuyuki Hayashi等人Q007)針對(duì)四種香酒酵母的ITS序列設(shè)計(jì)了 LAMP特異性引物，建立了高效的LAMP檢測(cè)體系。LAMP還可以用于檢測(cè)其他與人類相關(guān)的病毒，如病毒性出血性敗血癥 (VHS)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、造血組織壞死病毒(IHHNV)、番茄黃化曲葉病毒等。LAMP還可以用于對(duì)動(dòng)物早期胚胎性別鑒定等。目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)有用于檢測(cè)豬肺炎支原體的LAMP試劑盒及在豬肺炎支原體檢測(cè)中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)豬肺炎支原體的LAMP試劑盒。本發(fā)明的另一目的在于提供上述LAMP試劑盒的制備方法。本發(fā)明的用于檢測(cè)豬肺炎支原體的LAMP試劑盒包含如下成分(I)LAMP 反應(yīng)液每 24 μ 1 LAMP 反應(yīng)液中含有:ddH201. 5 μ L ； 10 X ThermoPol buffer 2. 5 μ L ； IOOmM MgSO4I. 5μ 1 ;5MBetaine2. Ομ L ;2· 5mM dNTP 12μ L ;0. 2μ M Primer F31 μ L ； 0. 2μΜ Primer Β31 μ L ；1.6μΜ Primer FIP 0. 5 μ L ；1. 6 μ MPrimerBIPO. 5 μ L ；8U/ μ LBst 酶 1· 5μ L ;(2)四條LAMP引物(排序序列1-4)Forward Outer F3 AGTATTATTGTTGCTAATCCTGT
Reverse Outer B3 GTTCACCCATCACGTAGGForward Inner FIP CACTACCGATAACTTTTTGATCGGATGATATAATTACAAGGGCTTACCReverse Inner BIP GAACTGTTTTAGATACAGCAAGGCTTGAACCGAATTAGGCGATAC本發(fā)明的LAMP試劑盒的制備方法通過(guò)下述方法和步驟制備(參見(jiàn)附圖4)1)從基因數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得豬肺炎支原體基因組序列，通過(guò)BLAST軟件進(jìn)行同源性分析，獲得P36序列的豬肺炎支原體的特異性的保守靶序列；
2)根據(jù)步驟1)所得的保守靶的DNA序列，設(shè)計(jì)序列1-4的LAMP弓丨物；
3)根據(jù)所得的LAMP的引物配置LAMP反應(yīng)液，構(gòu)成檢測(cè)體系。 表1 MyL LAMP反應(yīng)液的具體配置。
加入的物質(zhì)終濃度加入的量F3 /B30·2μΜ1μ1/1μ1FIP / BIP 1.6μΜ0·5μ1/0.5μ1dNTP1.4mM(each)12μ110 X反應(yīng)緩沖液IX2.5μ1Bst 酶8U1.5μ1MgSO4O.lmM1·5μ1模板Ιμ Betaine0.4M2.0μ ddH20Up to 25 μ 本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供所述試劑盒的應(yīng)用方法。上述的用于檢測(cè)豬肺炎支原體的LAMP試劑盒檢測(cè)豬肺炎支原體的方法為首先配置LAMP反應(yīng)液，然后提取待測(cè)樣品中的核酸，取該核酸提取液加入上述已配制得的LAMP 反應(yīng)液中，置63°C恒溫60min進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，然后80°C ^iiin進(jìn)行酶的滅活；取出擴(kuò)增反應(yīng)管，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的渾濁度初步判斷結(jié)果濁則說(shuō)明待測(cè)樣品中存在豬肺炎支原體，澄清透明則說(shuō)明待測(cè)樣品中不存在豬肺炎支原體；取5 μ L LAMP產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖電泳梯狀條帶則說(shuō)明待測(cè)樣品中存在豬肺炎支原體，沒(méi)有梯狀條帶則說(shuō)明待測(cè)樣品中不存在豬肺炎支原體；剩余LAMP產(chǎn)物7000r/min離心5min 離心有沉淀則說(shuō)明待測(cè)樣品中存在豬肺炎支原體、沒(méi)有沉淀則說(shuō)明待測(cè)樣品中不存在豬肺炎支原體。上述用于檢測(cè)豬肺炎支原體的LAMP試劑盒的應(yīng)用方法具體包括以下步驟(1)配置上述M μ LLAMP反應(yīng)液；(2)提取待測(cè)樣品的核酸；(3)取IyL所述⑵核酸的提取液，加入步驟(1)配置的LAMP反應(yīng)液中，使終反應(yīng)體積為25 μ L，10000r/min瞬時(shí)離心30S以混勻反應(yīng)液；(4)置63°C恒溫60min進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，然后80°C 2min進(jìn)行酶的滅活；(5)取出擴(kuò)增反應(yīng)管，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的渾濁度初步判斷結(jié)果濁則說(shuō)明待測(cè)樣品中存在豬肺炎支原體，澄清透明則說(shuō)明待測(cè)樣品中不存在豬肺炎支原體；(6)取5 μ L LAMP產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖電泳離心有沉淀則說(shuō)明待測(cè)樣品中存在豬肺炎支原體、沒(méi)有沉淀則說(shuō)明待測(cè)樣品中不存在豬肺炎支原體；(7)剩余LAMP產(chǎn)物7000r/min離心5min 梯狀條帶則說(shuō)明待測(cè)樣品中存在豬肺炎支原體，沒(méi)有梯狀條帶則說(shuō)明待測(cè)樣品中不存在豬肺炎支原體。本發(fā)明以十一種與豬肺炎支原體類似病毒DNA為模板檢測(cè)體系的特異性，結(jié)果顯示，本發(fā)明方法只能擴(kuò)增豬肺炎支原體核酸而不能檢測(cè)到其他非目標(biāo)細(xì)菌、病毒核酸，證實(shí)所建立的LAMP具有良好的特異性；以10人10_2……10_9稀釋度的豬肺炎支原體為模板進(jìn)行 LAMP試驗(yàn)，結(jié)果顯示本LAMP可以檢測(cè)到10_5濃度核酸，敏感性為1. 43pg/25 μ L，證實(shí)所建立的LAMP具有良好的靈敏度；用Mob I內(nèi)切酶確定產(chǎn)物的特異性，結(jié)果顯示，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠電泳圖譜上呈階梯狀，經(jīng)過(guò)內(nèi)切酶消化，出現(xiàn)188bp電泳條帶，與預(yù)期理論值相符合，說(shuō)明是特異性擴(kuò)增。本發(fā)明具有下列突出的優(yōu)點(diǎn)1)高特異性4條引物對(duì)靶序列8個(gè)特異區(qū)域的識(shí)別保證了 LAMP擴(kuò)增的高度特異性，即LAMP能從相差僅一個(gè)核苷酸的基因標(biāo)本中，找出相應(yīng)的靶序列進(jìn)行擴(kuò)增(圖1)。2)高靈敏度LAMP靈敏度可與PCR相媲美或更高，其所需擴(kuò)增模板可達(dá) 1.43pg/25y 1 或更少(圖 2)。3)鑒定簡(jiǎn)便擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，肉眼就可以根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的渾濁度初步判斷結(jié)果濁則說(shuō)明待測(cè)樣品中存在豬肺炎支原體，澄清透明則說(shuō)明待測(cè)樣品中不存在豬肺炎支原體。4)操作簡(jiǎn)單一旦LAMP引物設(shè)計(jì)成功，只要將檢測(cè)樣品(靶核酸)和試劑一起放入63°C水浴鍋1小時(shí)，然后放入80°C的水浴鍋2分鐘就可以判斷擴(kuò)增與否。5)快速、高效擴(kuò)增整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)一小時(shí)即可完成，且產(chǎn)率可達(dá)到0. 8mg/ml。本發(fā)明的檢測(cè)體系可以在等溫條件下，快速、方便、高效、高特異性、高靈敏度地檢測(cè)到豬肺炎支原體，不需要復(fù)雜儀器，為獸醫(yī)安全衛(wèi)生的檢測(cè)提供了新的技術(shù)平臺(tái)，能較好的滿足目前對(duì)豬場(chǎng)養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的迫切需要，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。


圖1為豬肺炎支原體LAMP檢測(cè)體系的特異性檢測(cè)結(jié)果電泳圖；其中，M. DNA Marker ； 1泳道為豬肺炎支原體DNA ；2泳道為陰性對(duì)照；3_13泳道分別為副豬嗜血桿菌DNA、傳染性胸膜肺炎DNA模板、豬鏈球菌DNA模板、多殺性巴氏桿菌 DNA模板、雞毒支原體DNA模板、豬鼻支原體DNA模板、絮狀支原體DNA模板、藍(lán)耳病毒DNA 模板、圓環(huán)病毒DNA模板、豬瘟病毒DNA模板、偽狂犬病毒DNA模板。圖2為豬肺炎支原體LAMP檢測(cè)體系的靈敏度驗(yàn)證電泳圖；其中，M. DNAMarker ； 1泳道為陰性對(duì)照；2泳道為豬肺炎支原體DNA ；3-11泳道分別為以IO-1UO-2……10_9稀釋度的豬肺炎支原體核酸。圖3為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增特異性確認(rèn)電泳圖；其中，泳道1 :LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠電泳圖譜上成階梯狀；泳道2 經(jīng)內(nèi)切酶消化，出現(xiàn)188bp電泳條帶，與理論預(yù)期值相符合。圖4為本發(fā)明的LAMP試劑盒的建立方法及步驟的方框圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11，特異性DNA序列查找從美國(guó)基因數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank檢索獲得多株豬肺炎支原體基因租序列，通過(guò)BLAST 軟件進(jìn)行同源性分析即找到特異性的保守靶序列進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)。2，LAMP引物設(shè)計(jì)通過(guò)專門的LAMP引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物Primer design 4.0 (http//primerexlorer. jp :Eiken Chemical Co.Ltd， Janpan)，設(shè)計(jì)的具體引物為(排序序列1-4)
權(quán)利要求
1. 一種用于檢測(cè)豬肺炎支原體的LAMP試劑盒，其特征包含如下組分 (I)LAMP反應(yīng)液每 Μμ ILAMP 反應(yīng)液中含有ddH20 1. 5μ L ； 10 X ThermoPol buffer 2. 5 μ L ； IOOmM MgSO4L 5μ 1 ;5Μ Betaine 2. O μ L ；2. 5mM dNTP 12μ L ;0. 2μΜ Primer F31 μ L ;0. 2μ M Primer Β31μ L ； 1· 6 μ M Primer FIP 0· 5 μ L ； 1· 6 μ M Primer BIP 0. 5 μ L ；8U/μ L Bst 酶 1. 5μ L ；⑵排序序列1-4的LAMP引物ForwardOuterF3AGTATTATTGTTGCTAATCCTGTReverseOuterB3GTTCACCCATCACGTAGGForwardInnerFIPCACTACCGATMCTTTTTGATCGGATGATATAATTACAAGGGCTTACCReverseInnerBIPGAACTGTTTTAGATACAGCAAGGCTTGAACCGAATTAGGCGATAC
2.用于檢測(cè)豬肺炎支原體的LAMP試劑盒的制備方法，其特征是包括下述步驟(1)從基因數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得豬肺炎支原體特異性P36基因序列，通過(guò)BLAST軟件進(jìn)行同源性分析，獲得序列的保守靶部分；(2)根據(jù)步驟⑴所得的保守靶的DNA序列，設(shè)計(jì)序列1-4的LAMP引物；(3)根據(jù)所得的LAMP的引物配置LAMP反應(yīng)液，構(gòu)成檢測(cè)體系。
3.按權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是所述的LAMP反應(yīng)液是權(quán)利要求1所述的 24 μ L LAMP反應(yīng)液。
4.如權(quán)利要求1所述用于檢測(cè)豬肺炎支原體的LAMP試劑盒的使用方法，其特征是包括以下步驟(1)配置上述Mμ LLAMP反應(yīng)液；(2)提取待測(cè)樣品的核酸；(3)取IyL所述( 核酸的提取液，加入步驟(1)配置的LAMP反應(yīng)液中，使終反應(yīng)體積為25 μ L，10000r/min瞬時(shí)離心30s以混勻反應(yīng)液；(4)置63°C恒溫60min進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，然后80°C2min進(jìn)行酶的滅活；(5)取出擴(kuò)增反應(yīng)管，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的渾濁度初步判斷結(jié)果；(6)取5μ LLAMP產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖電泳；(7)剩余LAMP 產(chǎn)物 7000r/min 離心 5min。
5.如權(quán)利要求4所述的使用方法，其中所述步驟(5)所述的結(jié)果判斷為渾濁則說(shuō)明待測(cè)樣品中存在豬肺炎支原體，澄清透明則說(shuō)明待測(cè)樣品中不存在豬肺炎支原體；其中所述步驟(6)所述的結(jié)果判斷為沉淀則說(shuō)明待測(cè)樣品中存在豬肺炎支原體、沒(méi)有沉淀則說(shuō)明待測(cè)樣品中不存在豬肺炎支原體；其中所述步驟(7)所述的結(jié)果判斷為梯狀條帶則說(shuō)明待測(cè)樣品中存在豬肺炎支原體，沒(méi)有梯狀條帶則說(shuō)明待測(cè)樣品中不存在豬肺炎支原體。
全文摘要
本發(fā)明屬于衛(wèi)生檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及一種用于檢測(cè)豬肺炎支原體的LAMP試劑盒及其建立的方法和應(yīng)用。該試劑盒包含由四條LAMP引物的LAMP反應(yīng)液構(gòu)成的檢測(cè)體系。經(jīng)檢測(cè)驗(yàn)證，本發(fā)明試劑盒具有良好的特異性、靈敏度，擴(kuò)增快速、高效，且鑒定簡(jiǎn)便。本發(fā)明的檢測(cè)體系在63℃等溫條件下，能快速、方便、高效、高特異、高靈敏度地檢測(cè)到豬肺炎支原體，不需要復(fù)雜儀器，能較好滿足對(duì)豬肺炎支原體的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，為獸醫(yī)安全衛(wèi)生的檢測(cè)提供了新的技術(shù)平臺(tái)，能較好的滿足目前對(duì)豬場(chǎng)養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的迫切需要，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102154477SQ20111003327
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月31日
發(fā)明者馮志新, 劉茂軍, 熊祺琰, 邵國(guó)青 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院