專利名稱：大豆GmCOL5基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一個(gè)大豆開(kāi)花基因、其編碼蛋白及其在植物光周期和開(kāi)花時(shí)間調(diào)節(jié)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大豆是重要的農(nóng)作物之一，是植物蛋白質(zhì)、食用油、生物柴油以及異黃酮和卵磷脂等次生代謝產(chǎn)物的重要來(lái)源。因?yàn)榇蠖故嵌倘罩参?，開(kāi)花受光周期的嚴(yán)格控制，因而不同區(qū)域間的優(yōu)異品種不能相互引種、生育期也受環(huán)境光周期的制約ahang et al.，2008)。如果能降低大豆對(duì)光周期的敏感性，突破大豆開(kāi)花對(duì)光周期的限制，就能解決大豆的引種問(wèn)題， 從而實(shí)現(xiàn)各區(qū)域間優(yōu)質(zhì)品種的相互交換，豐富各地優(yōu)異種質(zhì)資源，調(diào)節(jié)大豆生育期，提高大豆產(chǎn)量和品質(zhì)。以往解決大豆光周期敏感性主要是通過(guò)雜交的方法獲得新品種，但是，這種育種方法具有對(duì)親本的依賴性強(qiáng)和周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，到目前為止尚未獲得大豆光周期廣適應(yīng)性品種。對(duì)擬南芥等植物的研究表明，植物的光周期是受極其復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)控制的 (Mouradov et al. ,2002 ；Turck et al. ,2008) 但是，其中一個(gè)關(guān)鍵蛋白對(duì)開(kāi)花時(shí)間的調(diào)節(jié)起著至關(guān)重要的作用，它就是CONSTANS(CO)基因。Putterill等(1995)最早報(bào)道了擬南芥中的CO基因。通過(guò)大量的研究發(fā)現(xiàn)CO介于生物節(jié)律鐘與下游開(kāi)花基因之間，將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殚_(kāi)花信號(hào)(Simrez et al.，2001)。隨著基因組學(xué)和生物信息學(xué)的興起和發(fā)展，不同物種中的CO不斷被認(rèn)知，如水稻(Oryza sativa) (Yano et al.，2000)、小麥(Tritivum aestivum)(Nemoto et al. ,2003)禾口衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)(Serrano et al. ,2009)的CO基因。在已研究的植物中，CO常以多個(gè)拷貝的形式存在于生物體中，各CO 拷貝的功能有明顯差異。擬南芥的CO家族有17個(gè)成員(Robson et al.，2001)，水稻中有 16個(gè)成員(Griffiths et al.，2003)，甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)中也克隆得到4個(gè)CO 同源基因(Robert et al.，1998)，在溫帶裸子植物歐洲云杉(Picea abies)中鑒定到2個(gè) CO同源基因(Holefors et al.，2009)。但大豆CO基因的功能及其應(yīng)用方面未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)調(diào)節(jié)大豆開(kāi)花基因表達(dá)來(lái)改變植物對(duì)光周期的敏感性和開(kāi)花時(shí)間也沒(méi)有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種大豆GmC0L5蛋白，其為1)、由SEQID N0. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或幻、在SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供編碼上述的大豆GmC0L5蛋白的基因，其核苷酸序列如 SEQ ID N0. 2 所示。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的氨基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。例如在非活性區(qū)段，將第(20 位的(N)替換為(V)，或是將第(159)位的(K)缺失，或是在(114位后面)增加(一個(gè)S)。因此，本發(fā)明的大豆GmC0L5蛋白還包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，具有大豆GmC0L5蛋白同等活性的由大豆GmC0L5蛋白衍生得到的蛋白質(zhì)。本發(fā)明基因包括編碼所述蛋白的核酸序列。此外，應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性以及不同物種密碼子的偏愛(ài)性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供攜帶GmC0L5基因的植物表達(dá)載體，所述植物表達(dá)載體為 p!35S-GW。本發(fā)明的GmC0L5(全稱為Glycine max CONSTANS Like 5)是從大豆‘墾農(nóng) 18，(Glycme max L. iKennong 18’)中克隆到的一個(gè)基因，它與擬南芥CO蛋白的氨基酸序列之間的同源性為53. 7%，在保守功能域(兩個(gè)B-box和一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域)序列高度同源。因此推測(cè)與擬南芥CO基因的功能類似，GmC0L5也具有促進(jìn)開(kāi)花的功能。大豆GmC0L5 基因主要在大豆子葉、莖、葉、花、莢中均有表達(dá)，其中在開(kāi)花期的葉中表達(dá)量最高。本發(fā)明將GmC0L5基因構(gòu)建到表達(dá)載體p35S_GW上，并在大腸桿菌DH5 α中擴(kuò)繁。 通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法，將P35S-GW攜帶的GmC0L5基因轉(zhuǎn)入擬南芥，獲得擬南芥轉(zhuǎn)化植株。結(jié)果表明，GmC0L5具有降低植物對(duì)光周期的敏感性并促進(jìn)擬南芥開(kāi)花的作用。本發(fā)明還提供含有GmC0L5核苷酸序列或其片段的克隆載體或各類表達(dá)載體、含有所述載體的宿主細(xì)胞、含有所述核苷酸序列的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還提供大豆開(kāi)花基因及其編碼蛋白在植物光周期和開(kāi)花時(shí)間調(diào)節(jié)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了大豆GmC0L5基因及其編碼的蛋白，并通過(guò)在植物中過(guò)表達(dá)GmC0L5 基因縮短植物生育期，促進(jìn)植物開(kāi)花。因此，GmC0L5基因及其編碼的蛋白可以調(diào)節(jié)花期，可用于解決雜交育種中的花期不遇的問(wèn)題，各種作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制的問(wèn)題以及光周期敏感性問(wèn)題和引種問(wèn)題。


圖1為本發(fā)明大豆開(kāi)花基因GmC0L5編碼蛋白的氨基酸序列與CO基因編碼蛋白的氨基酸序列的比較。圖2為克隆中間載體pGWCm的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為植物表達(dá)載體p35S-GW的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4A為大豆開(kāi)花基因GmC0L5在大豆中不同組織器官的表達(dá)水平。為圖4B為大豆開(kāi)花基因GmC0L5在大豆中不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平。圖5為大豆開(kāi)花基因GmC0L5在細(xì)胞核中的定位。圖6為大豆開(kāi)花基因GmC0L5轉(zhuǎn)化擬南芥，導(dǎo)致擬南芥早開(kāi)花。其中，在圖4中，短線前面的字母表示植株的發(fā)育時(shí)期，短線后面的字母表示器官，U代表單葉；T代表復(fù)葉(T后面的數(shù)字為復(fù)葉的順序)；F代表花；Pd代表莢；Pt代表葉柄(其后數(shù)字表示不同時(shí)期的莢)；R代表根；HH代表上胚軸；EH代表下胚軸；SAM代表生長(zhǎng)點(diǎn)At代表莖；L代表側(cè)生葉；C代表子葉，Sd代表播種后1周的幼苗。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1大豆開(kāi)花基因GmC0L5的克隆分另Ij禾Ij用正向弓丨物5 ‘ -TAAACAGAAAGGCAACC-3 ‘ 和反向引物 5' -CTAGAAAGTGGGAAAAATGCTAC-3 ‘通過(guò) RT-PCR 的方法從大豆‘墾農(nóng) 18，(Glycine max L. iKennong 18’ )的葉片擴(kuò)增CO同源基因。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5°C 5min 預(yù)變性，95°C 30S,50°C 35S,72°C 2min，25 個(gè)循環(huán)， 72 °C IOmin 延伸。將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物直接按照TA克隆方法克隆到如圖2所示的pGWCm載體上。 先將pGWCm載體用Ahd I內(nèi)切酶水解后用凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物以獲得T載體。然后PCR產(chǎn)物和T載體于16°C進(jìn)行過(guò)夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，并在其中擴(kuò)增，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。獲得的GmC0L5基因，其基因序列如SEQ ID NO 1所示；由其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。實(shí)施例2大豆開(kāi)花基因GmC0L5編碼蛋白的氨基酸序列分析大豆開(kāi)花基因的GmC0L5蛋白序列與擬南芥之間的同源性為53. 7%，且在保守功能域(兩個(gè)B-box和一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域)序列高度同源，如圖1所示。因此推測(cè)GmC0L5與擬南芥CO的功能類似，具有促進(jìn)植物開(kāi)花的活性。實(shí)施例3大豆開(kāi)花基因GmC0L5在大豆中不同組織器官及不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平利用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(quantitative real time RT-PCR)測(cè)定大豆開(kāi)花基因 GmC0L5在大豆中的表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用ABI M^One進(jìn)行，用STOR Green I檢測(cè)熒光信號(hào)。上游引物5' -GTGGTGATAAGGGTTTTTTGTTTG-3 ‘；下游引物5 ‘ AGTGTTGCTGTAATTCTGCTGGT 3'。反應(yīng)體系為SYBR Primix Ex Taq (2 X) (TaKaRa) 7. 5 μ 1上游引物(10μ Μ)0. 3 μ 1下游引物(10μ Μ)0. 3 μ 1ROX Reference Dye (50x)0. 3 μ 1cDNA1. 0μ 1滅菌雙蒸水5. 6 μ 1反應(yīng)參數(shù)為兩步法95°C 10S，熱啟動(dòng)；95°C 5S，60°C lmin，40個(gè)循環(huán)。用基因芯片數(shù)據(jù)分析軟件Genesis對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并作圖。大豆開(kāi)花基因GmC0L5主要在大豆子葉、莖、葉、花、莢中均有表達(dá)，其中在開(kāi)花期的葉中表達(dá)量最高，如圖3所示。實(shí)施例4大豆開(kāi)花基因GmC0L5編碼蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的定位采用基因槍轟擊的方法，將大豆開(kāi)花基因GmC0L5與YFP的融合基因，轉(zhuǎn)化至大豆葉片中。具體方法如下
1)微粒子彈的制備將10 μ g重組質(zhì)粒DNA與6 μ 1 50mg/ml的金粉懸液(直徑為1. 0 μ m)、4 μ 1 0. lmol/L亞精胺(抽濾滅菌)和6 μ 1 2. 5mol/LCaCl2,渦旋振蕩混勻，冰上靜置15min，12，OOOrpm離心10s，收集金粉沉淀，用20 μ 1無(wú)水乙醇重懸。2)轟擊受體材料將大豆幼嫩葉片擺放在MS培養(yǎng)基上，22°C預(yù)培養(yǎng)4h。選用 IlOOpsi的壓力膜，將20 μ 1金粉-DNA混合物點(diǎn)在轟擊膜中央，采用PDS 1000/He型基因槍(Bio-Rad)進(jìn)行轟擊，轟擊距離6cm，真空度為25 . Hg。轟擊后的表皮細(xì)胞22°C暗培養(yǎng) 24h后，在激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP2)下觀察。轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的YFP熒光信號(hào)表示大豆開(kāi)花基因GmC0L5編碼蛋白的定位，如圖4所示。圖4顯示大豆開(kāi)花基因GmC0L5編碼的蛋白在大豆葉片中主要定位于細(xì)胞核。實(shí)施例5大豆開(kāi)花基因GmC0L5的植物表達(dá)載體將從實(shí)施例1中得到的大豆開(kāi)花基因GmC0L5的克隆載體與如圖5所示的植物表達(dá)載體p35S-GW(購(gòu)自Invitrogen)等比例混合后通過(guò)LR反應(yīng)(兩種質(zhì)粒各50ng，LR酶 1 μ 1，補(bǔ)ddH20至終體積5 μ 1，混勻后25 °C反應(yīng)6小時(shí)以上)，將GmC0L5構(gòu)建在p35S_GW上， 命名為P35S-GW-C0L5，用于在植物中過(guò)表達(dá)大豆開(kāi)花基因GmC0L5，研究其功能。實(shí)施例6GmC0L5的轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得1農(nóng)桿菌液制備將含有目的基因雙元表達(dá)載體的根瘤農(nóng)桿菌GV3101: :p35S-GW-C0L5接種于5ml 含有相應(yīng)抗性的液體LB培養(yǎng)基中，28°C 200rmp培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化前Id接種于200ml含有相應(yīng)抗生素的液體LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)至0D600為0. 8 1. 2，5，OOOrmp離心15min收集菌體，菌體重懸于侵染緩沖液(含1/2MS大量，1/2MS微量，5c/0蔗糖和0. 02c/0 SilweetL-77, pH 5. 7)，使 0D600 為 0. 8 左右。2、擬南芥轉(zhuǎn)化擬南芥在長(zhǎng)日照條件下培養(yǎng)，待主莖抽苔后剪掉，待大多側(cè)枝現(xiàn)蕾時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將花序放進(jìn)盛有侵染緩沖液的容器中，浸泡10 30s，轉(zhuǎn)化完畢后，用黑色塑料袋罩住避光、保濕，16 24h后揭去塑料袋。常規(guī)管理至種子成熟。3、Basta抗性篩選轉(zhuǎn)基因植株種子收獲后于37 °C烘干(1周左右)，然后均勻播在土中，罩上保鮮膜防止污染并保濕，播種7 IOd后待子葉完全張開(kāi)時(shí)噴灑1 1000稀釋的Basta， 篩選陽(yáng)性植株。分別利用正向引物5 ‘ -GTTATGGGTCAACGGTTTC-3 ‘和反向引物 5' -CTAGAAAGTGGGAAAAATGCTAC-3‘鑒定獲得的抗性植株，確保為GmC0L5轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)PCR鑒定獲得GmC0L5過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因Tl代植株共3株。實(shí)施例7大豆開(kāi)花基因GmC0L5促進(jìn)擬南芥開(kāi)花從實(shí)施例6獲得的擬南芥轉(zhuǎn)化植株與其突變體co-2在長(zhǎng)日植株生長(zhǎng)室中的條件 (16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的光周期，光強(qiáng)80 μ mol ·πΓ2 · s—1)下同時(shí)培育。對(duì)其中30株 GmC0L5的T1代過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行花期觀測(cè)。結(jié)果表明，大豆開(kāi)花基因GmC0L5轉(zhuǎn)化擬南芥，促進(jìn)擬南芥開(kāi)花，對(duì)光周期不敏感，如圖6所示，其中右側(cè)代表對(duì)照co-2突變體，左側(cè)代表轉(zhuǎn)基因植株。GmC0L5的轉(zhuǎn)化株系從播種到開(kāi)花為20 35天，平均為30. 5天，而其對(duì)照co-2突變體的開(kāi)花時(shí)間為55 68天左右，平均為60. 8天。結(jié)果表明，大豆GmC0L5蛋白具有明顯促進(jìn)開(kāi)花的活性。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。序列說(shuō)明SEQ ID NOl所示為大豆GmC0L5的核苷酸序列；SEQ ID N02所示為大豆GmC0L5的氨基酸序列；SEQ IDN03和SEQN04所示為克隆大豆GmC0L5的引物對(duì)。SEQ IDNo 5和SEQ ID No 6 所示為大豆 GmC0L5Real-time PCR 引物對(duì)；SEQ ID No 7 和 SEQ ID No 8 所示為 PCR鑒定轉(zhuǎn)化株所用引物。
權(quán)利要求
1.大豆GmC0L5蛋白，其為1)、由SEQID NO. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或2)、在SEQID NO. 2所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述的蛋白的大豆GmC0L5基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權(quán)利要求4所述載體的宿主。
6.含有權(quán)利要求2或3所述基因的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
7.權(quán)利要求2或3所述的基因在調(diào)節(jié)植物光周期和開(kāi)花時(shí)間中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種大豆GmCOL5蛋白，其為1)、由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或2)、在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明同時(shí)公開(kāi)了編碼上述蛋白的基因GmCOL5，過(guò)表達(dá)所述基因可明顯促進(jìn)植物開(kāi)花，使開(kāi)花時(shí)間提前，生育期縮短。可用于解決雜交育種中的花期不遇問(wèn)題、各種作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制問(wèn)題、光周期敏感性問(wèn)題和引種問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102399273SQ20111003308
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月7日
發(fā)明者傅永福, 張曉玫 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所