專利名稱：生產(chǎn)高純度頭孢菌素c的基因工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程菌及其應(yīng)用，特別涉及生產(chǎn)高純度頭孢菌素C的基因工程菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
頭孢菌素C (Cephalosporin C，CPC)是工業(yè)生產(chǎn)頭孢菌素的原料，頭孢菌素屬于 β內(nèi)酰胺類抗生素，是一類具有重要應(yīng)用價值的廣譜抗生素。頭孢菌素C的工業(yè)生產(chǎn)菌是頂頭孢霉菌(Acremonium chrysogenum)。頭孢菌素C在頂頭孢霉菌中的生物合成途徑已經(jīng)研究得十分清楚，為利用基因工程手段改造頂頭孢霉菌奠定了良好基礎(chǔ)。去乙酰氧頭孢菌素C (Deacetoxycephalosporin C，DA0C)是頭孢菌素C生物合成過程中的一種中間產(chǎn)物。 在生物合成中，青霉素Mpenicillin N)被由基因cefEF編碼的擴(kuò)環(huán)/羥化雙功能酶催化， 首先擴(kuò)環(huán)生成DA0C，然后羥化生成DAC (Deacetylc印halosporin C)。在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)過程當(dāng)中，DAOC會累積在發(fā)酵液中，占終產(chǎn)物CPC總量的到2%之間。當(dāng)CPC作為原料進(jìn)入下游化學(xué)合成頭孢菌素的過程中，DAOC也會相應(yīng)的變成無法去除的雜質(zhì)，影響到產(chǎn)品的純度。蛋白cefF的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供頂頭孢霉cefF基因工程菌(Acremonium chrysogenum)，其保藏號為 CGMCC No. 4515。本發(fā)明的另一個目的是提供一種基因工程菌。本發(fā)明所提供的基因工程菌，為將如下融合基因?qū)胨拗骶玫降幕蚬こ叹?序列表中序列1中第7-1194位核苷酸所示DNA片段與蛋白cefF的編碼基因構(gòu)成的融合基因。所述蛋白cefF的編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列1中第1203-2275位核苷酸所示；所述宿主菌為頂頭孢霉菌(Acremonium chrysogenum)；所述融合基因是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌的。所述重組表達(dá)載體為將所述融合基因插入表達(dá)載體pAgl_H3的多克隆位點得到的重組表達(dá)載體；所述融合基因的核苷酸序列為序列表中序列1所示。所述頂頭孢霉cefF基因工程菌或所述基因工程菌在生產(chǎn)頭孢菌素C中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的又一個目的是提供含有如下融合基因的重組質(zhì)粒序列表中序列1中第 7-1194位核苷酸所示DNA片段與蛋白cefF的編碼基因構(gòu)成的融合基因。所述重組質(zhì)粒為將所述融合基因插入表達(dá)載體pAgl_H3的多克隆位點得到的重組表達(dá)載體；所述蛋白cefF的編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列1中第1203-2275位核苷酸所示；所述融合基因的核苷酸序列為序列表中序列1所示。蛋白cefF或蛋白cefF的編碼基因在用發(fā)酵菌制備頭孢菌素C的過程中降低產(chǎn)物中去乙酰氧頭孢菌素C的產(chǎn)量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述蛋白cefF的編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列1中第1203-2275位核苷酸所示。本發(fā)明的又一個目的是提供一種制備頭孢菌素C的方法，包括如下步驟發(fā)酵所述頂頭孢霉cefF基因工程菌或所述工程菌，得到頭孢菌素C。本發(fā)明將帶有頂頭孢霉菌啟動子PpcbC的棒狀鏈霉菌來源的基因cefF轉(zhuǎn)入頂頭孢霉菌中，使其在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá)，增強(qiáng)DAOC羥化生成DAC這一催化反應(yīng)，從而降低發(fā)酵產(chǎn)物中DAOC的量，達(dá)到提高工業(yè)產(chǎn)品CPC純度的目的。


圖1為PCR擴(kuò)增PpcbC產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為PCR擴(kuò)增cefF產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3為重組質(zhì)粒pAgl-H3_cefF的構(gòu)建。圖4為PCR驗證基因工程菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。圖5為野生型菌株中DAOC與CPC的檢測結(jié)果圖。圖6為基因工程菌株中DAOC與CPC的檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、生產(chǎn)高純度頭孢霉素的基因工程菌及其應(yīng)用頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum) CGMCC 3. 3795購自中國普通微生物保藏管理中心(CGMCC)；棒狀鏈霉菌(Sti^ptomyces clavuligerus)ATCC27064購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。一、構(gòu)建重組質(zhì)粒 pAg-H3_cefF1、PCR 擴(kuò)增啟動子 PpcbC以頂頭孢霉(Acrernonium chrysogenum) CGMCC 3. 3795 基因組 DNA 為模板，對基因pcbC的啟動子區(qū)設(shè)計引物對上游引物為5 ‘ -GactagtGTGGATGGCACCTTTTGGG-3 ‘，小寫字母為酶切位點 SpeI,下游引物為5 ‘ -CrrcrcrccGGTGACGGTTTGTCCTGCC-3 ‘，小寫字母為酶切位點 AscI οPCR擴(kuò)增得到1188bps大小DNA片段，使用SpeI和AscI雙酶切，回收1. Ikb片段，如圖1 (圖1中泳道1為DNA marker,泳道2為PpcbC的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)所示；并將所得到的PCR產(chǎn)物連接到克隆載體pEASY-Blimt (購自全式金公司)上進(jìn)行測序。序列測定結(jié)果表明，PCR反應(yīng)獲得的片段的核苷酸序列與啟動子PpcbC基因序列(genebank號為X74601. 1) 一致，即序列表中序列1中第7-1194位核苷酸。2、PCR 擴(kuò)增基因 cefF以棒狀鏈霉菌(Sti^ptomyces clavuligerus) ATCC27064 基因組 DNA 為模板，對基因cefF設(shè)計引物對上游引物5'-AggcgcgccCGAAGGAGCAGGGGAACA-3 ’，小寫字母為酶切位點 AscI，下游引物5'-CcctgcaggCGGCTTGAATGCAACGAC-3 ‘，小寫字母為酶切位點 SbfI。PCR擴(kuò)增得到1091bps大小DNA片段，使用AscI和SbfI雙酶切，回收11Λ片段，如圖2 (圖2中泳道1為DNA marker,泳道2為cefF的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)所示；并將所得到的 PCR產(chǎn)物連接到克隆載體pEASY-Blimt (購自全式金公司)上進(jìn)行測序。序列測定結(jié)果表明，PCR反應(yīng)獲得的片段的核苷酸序列為cefF基因序列，即序列表中序列1中第1203-2275 位核苷酸。該基因編碼的蛋白序列如序列表中序列2所示。3、構(gòu)建重組質(zhì)粒 pAg-H3_cefF使用SpeI和SbfI雙酶切質(zhì)粒pAgl_H3 (公眾可從中國科學(xué)院微生物研究所獲得， 記載過該質(zhì)粒的非專禾丨J文獻(xiàn)是A. Zhang et al. Efficient disruption of a polyketide synthase gene (pksl)for melanin synthesis through Agrobacterium-mediated transformation of Glarea lozoyensis Mol Gen Genomic(2003)268 :645-655),回收 6. 4kb DNA片段，與上述兩條DNA回收片段連接，方法是將回收6. 4kb的質(zhì)粒DNA片段與步驟1回收的1. Ikb啟動子PpcbC片段以及步驟2回收的cefF基因11Λ片段加入同一連接體系，使用T4DNALigase(NEB cat#M0202S)，16攝氏度反應(yīng)，得到重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，卡那霉素抗性篩選，挑取陽性克隆，將陽性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測序驗證，測序結(jié)果表明在質(zhì)粒pAgl-H3的SpeI和SbffI 酶切位點間插入了序列表中序列1所示DNA片段，其中第第7-1194位為啟動子PpcbC，第 1203-2275位為cefF基因，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將構(gòu)建重組質(zhì)粒命名為pAg-H3-cefF(圖 3)。二、重組質(zhì)粒pAgl-H3_cefF轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌制備根瘤農(nóng)桿菌AGL-I感受態(tài)細(xì)胞(1)將根瘤農(nóng)桿菌AGL-I(購自ATCC，產(chǎn)品目錄號為BAA-101)甘油保存液接種在含100 μ g/mL羧芐青霉素的LB瓊脂平板上，靜置培養(yǎng)兩天；(2)挑取單菌落接種在4mL含100yg/mL羧芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28°C、 250rpm振蕩過夜培養(yǎng)；(3)將4mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至含有IOOmL LB液體培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中J8°C、 250rpm 培養(yǎng)至 0D600 = 0. 5 ；(4)將培養(yǎng)液置于冰上10分鐘，4000rpm離心10分鐘收集菌體；(5)棄上清，用aiiL 20mM CaCl2重懸菌體，100 μ L分裝。浸入液氮1分鐘后放入-80°C保存。提取步驟一構(gòu)建的重組質(zhì)粒pAgl-H3_cefF DNA,取1 μ g該質(zhì)粒DNA，將其加入上
5述制備的根瘤農(nóng)桿菌AGL-I感受態(tài)細(xì)胞中混勻，放入液氮中5分鐘。37°C熱激20分鐘后加入700 μ L LB培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)2小時。將菌液均勻涂布在含有卡那霉素(75 μ g/mL) 的LB瓊脂平板上，倒置培養(yǎng)2天，得到含有重組質(zhì)粒pAgl-H3-CefF的根瘤農(nóng)桿菌單菌落。三、構(gòu)建含有cefF基因的頂頭孢霉工程菌株向培養(yǎng)7天的頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum) CGMCC 3. 3795瓊脂平板上滴加2mL無菌水，用無菌棉棒將菌體刮下，得到溶液用無菌脫脂棉過濾，得到頂頭孢霉孢子懸液。將步驟二得到的含有重組質(zhì)粒pAgl-H3-CefF的根瘤農(nóng)桿菌單菌落接種于5mLMM 液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)2天。用IM培養(yǎng)基將菌體稀釋到0D_ = 0. 15，振蕩培養(yǎng) 6小時，至0D_ = 0. 6。取100 μ L菌液與等體積頂頭孢霉孢子懸液混合(懸液濃度=IO7 個孢子/mL)，均勻涂布在CM培養(yǎng)基平板上，25°C倒置培養(yǎng)3天。用棉簽將平板上菌體轉(zhuǎn)接至含有50 μ g/mL潮霉素B和200 μ m/mL噻孢霉素鈉的TSA培養(yǎng)基平板上，倒置培養(yǎng) 5天至含有抗性篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)化子長出可見單菌落，再次轉(zhuǎn)接進(jìn)行純化培養(yǎng)，純化培養(yǎng)的方法為使用含有50 μ g/mL潮霉素B和200 μ m/mL噻孢霉素鈉的TSA培養(yǎng)基抑制農(nóng)桿菌的生長，使農(nóng)桿菌與頂頭孢霉轉(zhuǎn)化子分離，多次傳代，得到轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pAgl-H3-CefF的基因工程菌株。設(shè)未轉(zhuǎn)化的頂頭孢霉菌為野生型對照菌株。分別提純基因工程菌株和野生型對照菌株的基因組DNA和總RNA。通過RT-PCR擴(kuò)增，分別得到基因工程菌株和野生型對照菌株的cDNA。RT-PCR擴(kuò)增的引物為上游引物5'-ArrcrcrccCGAAGGAGCAGGGGAACA-3 ’，小寫字母為酶切位點 AscI，下游引物5'-CcctgcaggCGGCTTGAATGCAACGAC-3 ‘，小寫字母為酶切位點 SbfI。以重組質(zhì)粒pAgl-H3-CefF DNA為模板作為陽性對照，分別以基因工程菌株和野生型對照菌株的基因組DNA及cDNA為模板，進(jìn)行PCR驗證。使用的引物對如下上游引物5‘ -aRRCRCRccCGAAGGAGCAGGGGAACA-3 ‘，下游引物5‘ ccctgcaggCGGCTTGAATGCAACGAC-3 ‘。結(jié)果如圖4所示(圖4中，泳道1為11Λ DNA marker，泳道2為以基因工程菌株的基因組DNA為模板得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道4為以基因工程菌株的cDNA為模板得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道6為以重組質(zhì)粒pAgl-H3-cefF DNA為模板得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道3為以野生型對照菌株的基因組DNA為模板得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道5為以野生型對照菌株的cDNA為模板得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)。從圖4可見，以基因工程菌株基因組DNA及 cDNA為模板，均擴(kuò)增得到了約1000bps大小DNA片段，而以野生型對照菌株基因組DNA及 cDNA為模板均未出現(xiàn)該DNA片段。結(jié)果表明cefF基因已整合在獲得的基因工程菌株的基因組DNA上，并能夠在體內(nèi)正常轉(zhuǎn)錄。將上述獲得的基因工程菌株中的一株命名為頂頭孢霉cefF基因工程菌 (Acremonium chrysogenum)0該頂頭孢霉cefF基因工程菌已于2010年12月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 4515。以上各培養(yǎng)基的配制方法如下
(I)MM 培養(yǎng)基(IOOmL)K-buffer (K2HP0420g, KH2PO4H. 5g,加水至 lOOmL，ρΗ7· 0)ImLM-N (MgSO4 · 7Η20 3g, NaCl 1. 5g，加水至 IOOmL)2mL1 % CaCl2 · 2H20 水溶液(質(zhì)量百分比)0. ImL微量元素(ZnSO4· 7Η20 0. Olg, CuSO4 · 5H20 0. Olg, H3BO3 0. Olg, MnS04 · H2O 0. Olg, Na2MoO4 · 2H20 0. Olg,加水至 IOOmL)ImL20% NH4NO3水溶液(質(zhì)量百分比)0. 25mL20%葡萄糖水溶液(質(zhì)量百分比)ImL0. 01% FeSO4水溶液(質(zhì)量百分比)ImL50mg/mL卡那霉素水溶液0. 15mL純水93. 5mL(2) IM 培養(yǎng)基(IOOmL)K-buffer (K2HPO4 20g，Iffl2PO4 14. 5g，加水至 IOOmL, ρΗ7· 0)ImLM-N (MgSO4 · 7Η20 3g, NaCl 1. 5g，加水至 IOOmL)2mL1 % CaCl2 · 2H20 水溶液(質(zhì)量百分比)0. ImL微量元素(ZnSO4·7Η20 0. Olg，CuSO4 · 5Η20 0. OlgjH3BO3O. 01g，MnS04 .H2O 0. Olg, Na2MoO4· 2H20 0. Olg,加水至 IOOmL)ImL20 % NH4NO3水溶液(質(zhì)量百分比)0. 25mL20%葡萄糖水溶液(質(zhì)量百分比)ImL0. 01% FeSO4水溶液(質(zhì)量百分比)ImL50%甘油(質(zhì)量百分比)ImL2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(1M，pH5. 3)4mL50mg/mL卡那霉素水溶液0. 15mL乙酰丁香酮0. 2mL純水88. 5mL(3) CM 培養(yǎng)基(IOOmL)K-buffer (K2HPO4 20g，Iffl2PO4 14. 5g，加水至 IOOmL, ρΗ7· 0)ImLM-N (MgSO4 · 7Η20 3g, NaCl 1. 5g，加水至 IOOmL)2mL1 % CaCl2 · 2H20 水溶液(質(zhì)量百分比)0. ImL微量元素(ZnSO4·7Η20 0. Olg，CuSO4 · 5Η20 0. OlgjH3BO3O. 01g，MnS04 .H2O 0. Olg, Na2MoO4· 2H20 0. Olg,加水至 IOOmL)ImL20 % NH4NO3水溶液(質(zhì)量百分比)0. 25mL20%葡萄糖水溶液(質(zhì)量百分比)ImL0. 01% FeSO4水溶液(質(zhì)量百分比)ImL50%甘油(質(zhì)量百分比)ImL2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(1M，pH5. 3)4mL50mg/mL卡那霉素水溶液0. 15m乙酰丁香酮0. 2mL瓊脂1.5g
純水G) TSA 培養(yǎng)基(IL)蛋白胨；酶消化豆粕(購自O(shè)XOID公司，產(chǎn)品目錄號為CM0129)葡萄糖NaClK2HPO4瓊脂純水四、含有cefF基因的頂頭孢霉工程菌株的應(yīng)用1、發(fā)酵實驗對步驟三獲得的頂頭孢霉cefF基因工程菌和野生型對照菌株進(jìn)行多次搖瓶發(fā)酵；將搖瓶內(nèi)的所有物質(zhì)記作發(fā)酵液。頂頭孢霉cefF基因工程菌搖瓶發(fā)酵(1)將頂頭孢霉cefF基因工程菌和野生型對照菌株接種在產(chǎn)孢培養(yǎng)基瓊脂平板上，暗處生長7天，收集孢子；(2)分別取ImL頂頭孢霉cefF基因工程菌和野生型對照菌株的孢子懸液(IO7個 /mL)加IOOmL種子液培養(yǎng)基(500mL錐形瓶)，，搖床培養(yǎng)48h ；(3)分別取IOmL生長4 的頂頭孢霉cefF基因工程菌和野生型對照菌株種子液， 加入到IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基中(500mL錐形瓶)二8°C，搖床培養(yǎng)7天。
0118]頂頭孢霉產(chǎn)孢培養(yǎng)基0119]葡萄糖Ig0120]酵母抽提物2g0121]NaCl1.5g0122]CaCl2IOg0123]瓊脂25g0124]加蒸餾水至lL，pH 6.8。0125]頂頭孢霉種子液培養(yǎng)基MDIA 0126]葡萄糖IOg0127]CaCO35g0128]玉米漿30g0129]淀粉30g0130]加蒸餾水至lL，pH 7.0。0131]頂頭孢霉發(fā)酵培養(yǎng)基MDFA :0132]蔗糖36g0133]葡萄糖27g0134]DL-甲硫氨酸3. 2g0135]L-天冬氨酸12g0136]2% Fe (NH4) (SO4)2 · 6H208mL
88. 5mL
17g 3g 2. 5g 5g
2. 5g 15g I
微量元素液144mL
加蒸餾水至1L，pH 7. 4，
上述微量元素液
K2HPO4104g
KH2PO4102g
Na2SO4 · IOH2O11. 5g
MgSO4 · 7H202. 4g
ZnSO4 · 7H200. 2g
MnSO4 · H2O0. 2g
CuSO4 · 5H200. 05g
CaCl2 · 2H200. 5g
加蒸餾水至1L。
2、對發(fā)酵液中DAOC與CPC的高效液相色譜分析和質(zhì)譜分析
將上述步驟1得到的頂頭孢霍I cefF基因工程菌和野生型對照菌株的發(fā)酵液分別在室溫L離心，13000rpm，離心10分鐘，取上清進(jìn)行高效液相色譜分析和質(zhì)譜分析。
標(biāo)準(zhǔn)品為頭孢霉素C鋅鹽(Cephalosporin C zinc salt)(購自sigma公司，產(chǎn)品
目錄號為C3270)采用Agilent液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(Agilent 1200&6520Q-T0F mass)進(jìn)行分析。色譜條件色譜柱Thermo Hypersil Gold C18 (4. 6 X 25cm, 5 μ m)；流動相乙腈(acetonitrile) 0. 05 % 甲酸(methanoic acid)(梯度從 2 98 (ν/ν)到 20 80 (ν/ν)，20min)；柱溫35°C;、流速lmL/min;進(jìn)樣量20μ L。質(zhì)譜檢測條件正離子模式；加熱管溫度300°C ；干燥氣體流速10L/min ；碎裂電壓:115V ；掃描范圍:100-1000。結(jié)果在如上條件下，Cephalosporin C zinc salt標(biāo)準(zhǔn)品中CPC的保留時間為10. 2min， DAOC的保留時間為9. 5min。野生型頂頭孢霉的發(fā)酵液中，CPC和DAOC的保留時間如圖5 中A所示，其中CPC的保留時間為10. 279min,DA0C的保留時間為9. 476min ；CPC和DAOC的峰面積值如圖5中B所示，DAOC與CPC的峰面積比值為1. 60。頂頭孢霉cefF基因工程菌的發(fā)酵液中，CPC和DAOC的保留時間如圖6中A所示，其中CPC的保留時間為10. 253min, DAOC的保留時間為9. 530min ；CPC和DAOC的峰面積值如圖6中B所示，DAOC與CPC的峰面積比值為0. 24 ；從圖5中B和圖6中B可見，頂頭孢霉cefF基因工程菌與野生型對照菌株相比，發(fā)酵液中DAOC的含量顯著下降，CPC的含量升高，同時，DAOC與CPC含量的比值下降。與此結(jié)果說明，構(gòu)建的頂頭孢霉cefF基因工程菌可生產(chǎn)更高純度的頭孢菌素(CPC)。
權(quán)利要求
1.頂頭孢霉CefF基因工程菌(Acremoniumchrysogenum)，其保藏號為CGMCC No.4515。
2.一種基因工程菌，為將如下融合基因?qū)胨拗骶玫降幕蚬こ叹蛄斜碇行蛄?1中第7-1194位核苷酸所示DNA片段與蛋白cefF的編碼基因構(gòu)成的融合基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因工程菌，其特征在于所述蛋白cefF的編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列1中第1203-2275位核苷酸所示；所述宿主菌為頂頭孢霉菌(Acremonium chrysogenum)；所述融合基因是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的基因工程菌，其特征在于所述重組表達(dá)載體為將所述融合基因插入表達(dá)載體pAgl-H3的多克隆位點得到的重組表達(dá)載體；所述融合基因的核苷酸序列為序列表中序列1所示。
5.權(quán)利要求1所述的頂頭孢霉cefF基因工程菌或權(quán)利要求2-4中任一所述的基因工程菌在生產(chǎn)頭孢菌素C中的應(yīng)用。
6.含有如下融合基因的重組質(zhì)粒序列表中序列1中第7-1194位核苷酸所示DNA片段與蛋白cefF的編碼基因構(gòu)成的融合基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6中所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒為將所述融合基因插入表達(dá)載體pAgl-H3的多克隆位點得到的重組表達(dá)載體；所述蛋白cefF的編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列1中第1203-2275位核苷酸所示；所述融合基因的核苷酸序列為序列表中序列1所示。
8.蛋白cefF或蛋白cefF的編碼基因在用發(fā)酵菌制備頭孢菌素C的過程中降低產(chǎn)物中去乙酰氧頭孢菌素C的產(chǎn)量中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8中所述的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白cefF的編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列1中第1203-2275位核苷酸所示。
10.一種制備頭孢菌素C的方法，包括如下步驟發(fā)酵權(quán)利要求1所述的頂頭孢霉cefF 基因工程菌或權(quán)利要求2-4中任一所述工程菌，得到頭孢菌素C。
全文摘要
本發(fā)明公開了生產(chǎn)高純度頭孢霉素的基因工程菌及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的基因工程菌，為將如下融合基因?qū)胨拗骶玫降幕蚬こ叹蛄斜碇行蛄?中第7-1194位核苷酸所示DNA片段與蛋白cefF的編碼基因構(gòu)成的融合基因。將所得到的的基因工程菌中的一株命名為頂頭孢霉cefF基因工程菌(Acremonium chrysogenum)，其保藏號為CGMCC No.4515。本發(fā)明將帶有頂頭孢霉菌啟動子PpcbC的棒狀鏈霉菌來源的基因cefF轉(zhuǎn)入頂頭孢霉菌中，使其在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá)，增強(qiáng)DAOC羥化生成DAC這一催化反應(yīng)，從而降低DAOC在終產(chǎn)物CPC中的含量，達(dá)到提高工業(yè)產(chǎn)品純度的目的。
文檔編號C12N1/15GK102174420SQ201110031628
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月28日
發(fā)明者劉鋼, 安洋 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所