專利名稱：生產(chǎn)丁二酸的大腸桿菌基因工程菌及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)丁二酸的大腸桿菌基因工程菌及其構建方法與應用。
背景技術：
丁二酸是一種優(yōu)秀的平臺化合物，在化工、材料、醫(yī)藥、食品領域有著廣泛的用途。 丁二酸被美國能源部列為未來12種最有價值的平臺化合物之一，其可以衍生出很多下游產(chǎn)品，如1，4-丁二醇、四氫呋喃、Y-丁內酯、N-甲基吡咯烷酮、2-吡喏烷酮。丁二酸和1， 4-丁二醇聚合得到的PBS(聚丁二酸丁二醇酯)是一種性能優(yōu)良的生物全降解塑料。丁二酸未來的市場潛力每年將超過270萬噸。大約有250種可以用苯為原料生產(chǎn)的化工產(chǎn)品都可以通過丁二酸為原料生產(chǎn)。一旦實現(xiàn)了丁二酸的大規(guī)模生產(chǎn)，就可以部分取代石油化工廣品苯。目前丁二酸的生產(chǎn)主要是基于順酐為原料的石油化工路線。石油價格近年來波動很大，這嚴重制約了丁二酸生產(chǎn)的可持續(xù)性和價格穩(wěn)定。另一方面，化學合成法工藝復雜且常需高溫高壓，這大大增加了生產(chǎn)所需的能耗物耗；同時化學合成還會造成嚴重的環(huán)境污
^fe ο傳統(tǒng)的工業(yè)生物技術產(chǎn)業(yè)已經(jīng)發(fā)生或正在發(fā)生技術上和結構上的重大調整，已向微生物細胞工廠和高效生物催化為核心的生物煉制技術方向發(fā)展，傳統(tǒng)的生物工藝逐漸地被高效、低能耗和污染小的綠色新工藝、新技術所取代。開發(fā)丁二酸的高效生物合成技術能從根本上解決石油化工路線的弊端保證丁二酸價格穩(wěn)定不受制于石油價格波動，降低 PBS塑料的制造成本，促進其進一步的推廣應用；實現(xiàn)綠色可持續(xù)生產(chǎn)、簡化生產(chǎn)工藝、節(jié)能減排、減少環(huán)境污染。另外，丁二酸的生物制造過程中還可以吸收二氧化碳，對實現(xiàn)低碳經(jīng)濟具有很好的促進作用。目前丁二酸發(fā)酵菌種主要有兩大類。第一類是天然產(chǎn)丁二酸菌，主要有產(chǎn)丁二酸方文線桿菌(Actinobacillus succinogens)、產(chǎn)丁二酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、產(chǎn)丁二酸曼海姆菌(Mannheimia succiniciproducens)。另一類是通過代謝工程改造的工程菌，主要是大腸桿菌。天然產(chǎn)丁二酸菌在糖發(fā)酵過程中能夠積累高濃度的丁二酸。產(chǎn)丁二酸能力最強的天然菌是放線桿菌。美國Michigan Biotechnology Institute的Guttler等人分離得到的產(chǎn)丁二酸放線桿菌130Z菌株，利用98. 3g/L的葡萄糖發(fā)酵84小時可生產(chǎn)66. 4g/L的丁二酸。Gutttler等人在此基礎上，篩選出對單氟乙酸有很好抗性的突變菌，降低了副產(chǎn)物乙酸和甲酸的含量，進一步提高了丁二酸在發(fā)酵產(chǎn)物中的比例。在最適條件下，該突變菌株的丁二酸產(chǎn)量可以達到80 110g/L，發(fā)酵時間48h，糖轉化率達0.9g/g(Guettler et al., 1996，US Patent 5573931)。產(chǎn)丁二酸厭氧螺菌(ATCC 29305)是從小獵犬的口腔中分離得到的一種革蘭氏陰性嚴格厭氧菌，以葡萄糖乳糖為碳源發(fā)酵主產(chǎn)物為丁二酸和乙酸，同時生成少量的甲酸、乙醇和乳酸。在最優(yōu)條件下(PH6. 2，高濃度⑶幻，丁二酸的產(chǎn)量可以達到35g/L。Glassner等人以ATC(^9035為出發(fā)菌株，篩選出對單氟乙酸有很好抗性的突變菌ATCC 53488。在最優(yōu)發(fā)酵條件下丁二酸的產(chǎn)量可以超過50g/L，糖轉化率達0.9g/g(Glassner and Datta,1992, US Patent5143834)。天然產(chǎn)丁二酸菌雖然能夠高產(chǎn)丁二酸，但其自有很多缺陷。發(fā)酵過程中，糖酸轉化率最多只有0. 9g/g(理論最高值為1. 12g/g)，有相當一部分碳源流入到其他有機酸的合成。另外，天然產(chǎn)丁二酸菌發(fā)酵過程中需要豐富培養(yǎng)基，提高了生產(chǎn)成本和下游分離純化成本，限制了其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。大腸桿菌在糖發(fā)酵過程中雖然只積累少量的丁二酸，但由于其生理遺傳背景都很清晰，易于改造，因此很多研究單位都選取大腸桿菌作為出發(fā)菌種， 將其改造成高產(chǎn)丁二酸的工程菌。美國能源部Argorme國家實驗室最早開始了改造大腸桿菌生產(chǎn)丁二酸的工作。通過敲除丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脫氫酶，構建了菌株Nzmii。該菌株不能以葡萄糖為碳源發(fā)酵生長，但可以以乳糖、果糖、甘露糖和海藻糖等為碳源發(fā)酵生成丁二酸、乙酸和乙醇。 在此基礎上篩選出能夠重新利用葡萄糖為碳源發(fā)酵生長的突變菌株AFPlll。Vemuri等人通過在AFPlll中高表達lihizobium etli丙酮酸羧化酶基因，進一步提高了丁二酸的產(chǎn)量。在兩步法培養(yǎng)(即先有氧培養(yǎng)，然后無氧發(fā)酵產(chǎn)酸)條件下，丁二酸的最終濃度可達到 99. 2g/L，糖酸轉化率為 1. lg/g(Vemuri et al. ,2002, J Ind MicrobiolBiotechnol, 28 325-332)。美國Rice大學San研究組在改造大腸桿菌生產(chǎn)丁二酸方面做了大量的研究。通過敲除adhE、ldhA、ack-pta、iclR基因，構建出的工程菌SBS550MG在厭氧條件下可以生產(chǎn) 40g/L 的丁二酸，糖酸轉化率達到 1. 06g/g(San et al.，2005，PCT/US2005/033408)。上述的兩個研究組改造大腸桿菌生產(chǎn)丁二酸的工作，雖然構建出的工程菌能生產(chǎn)高濃度的丁二酸，但仍有一些缺陷。發(fā)酵過程采用的是兩步發(fā)酵，即先采用好氧過程將細胞培養(yǎng)生產(chǎn)起來，再轉變?yōu)閰捬踹^程進行發(fā)酵。這種工藝操作復雜，而且好氧工藝會很大程度上提高設備的建設和運行成本，因此在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)時可行性不高。另一方面，這些工程菌都需要使用豐富培養(yǎng)基，這將極大地提高發(fā)酵的原料成本。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供大腸埃希氏菌(Escherichia coliUZTIM。本發(fā)明所提供的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)XZT124，其保藏號為CGMCC No.4512。本發(fā)明的另一個目的是提供一種基因工程菌的構建方法。本發(fā)明所提供的基因工程菌的構建方法，包括以下步驟在出發(fā)大腸桿菌中提高磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的活性和抑制磷酸烯醇式丙 Sl酸舞酸轉移Bl (phosphoenolpyruvate sugar phosphotransferase)的 舌t生，得 Ι重組大腸桿菌，記作重組大腸桿菌I。所述方法還包括以下步驟在所述重組大腸桿菌I中提高半乳糖MFS轉運蛋白(galactose MFS transporter)的 舌t生禾口 高二幾酸Dcu轉運蛋白(dicarboxylate Dcu transporter)的 舌性，得到重組大腸桿菌，記作重組大腸桿菌II。
所述方法還包括以下步驟在所述重組大腸桿菌II中抑制丙酮酸甲酸裂解酶、乳酸脫氫酶、磷酸乙酰轉移酶和乙酸激酶的活性，得到重組大腸桿菌，記作重組大腸桿菌III。所述方法還包括以下步驟在所述重組大腸桿菌III中提高蘋果酸合成酶和異檸檬酸裂解酶的活性和提高丙酮酸脫氫酶的活性，得到重組大腸桿菌，記作重組大腸桿菌IV。所述提高磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的活性是向出發(fā)大腸桿菌中導入磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶編碼基因；所述導入磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶編碼基因的方法包括如下步驟向所述出發(fā)大腸桿菌中導入序列表中序列3所示DNA，得到中間重組大腸桿菌i ； 所述序列表中序列3所示DNA與所述出發(fā)大腸桿菌中的乙醇脫氫酶編碼基因發(fā)生同源重組；所述抑制磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶的活性是使所述磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶編碼基因的功能喪失；所述使所述磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶編碼基因的功能喪失的方法包括如下步驟向所述中間重組大腸桿菌i中導入序列表中序列 4所示DNA，得到重組大腸桿菌I ；所述序列表中序列4所示DNA與所述中間重組大腸桿菌i 中的磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶的酶I編碼基因發(fā)生同源重組；所述提高半乳糖MFS轉運蛋白的活性是在重組大腸桿菌I的半乳糖MFS轉運蛋白編碼基因的起始密碼子前加入序列表中序列2所示的啟動子序列；所述在半乳糖MFS轉運蛋白編碼基因的起始密碼子前加入序列表中序列2所示的啟動子序列的方法包括如下步驟向所述重組大腸桿菌I中導入序列表中序列5所示DNA，得到中間重組大腸桿菌ii ；所述序列表中序列5所示DNA與所述重組大腸桿菌I中的半乳糖MFS轉運蛋白編碼基因的啟動子發(fā)生同源重組；所述提高二羧酸Dcu轉運蛋白的活性是在中間重組大腸桿菌ii的二羧酸Dcu轉運蛋白編碼基因的起始密碼子前加入序列表中序列2所示的啟動子序列；所述在二羧酸 Dcu轉運蛋白編碼基因的起始密碼子前加入序列表中序列2所示的啟動子序列的方法包括如下步驟向所述中間重組大腸桿菌ii中導入序列表中序列6所示DNA，得到重組大腸桿菌II ；所述序列表中序列6所示DNA與所述中間重組大腸桿菌ii中的二羧酸Dcu轉運蛋白編碼基因的啟動子發(fā)生同源重組；所述抑制丙酮酸甲酸裂解酶的活性是使所述丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因的功能喪失；所述使所述丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因的功能喪失的方法包括如下步驟向所述重組大腸桿菌II中導入序列表中序列7所示DNA，得到中間重組大腸桿菌iii ；所述序列表中序列7所示DNA與所述重組大腸桿菌II中的丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因發(fā)生同源重組；所述抑制乳酸脫氫酶的活性是使所述乳酸脫氫酶編碼基因的功能喪失；所述使所述乳酸脫氫酶編碼基因的功能喪失的方法包括如下步驟向所述中間重組大腸桿菌iii中導入序列表中序列8所示DNA，得到中間重組大腸桿菌iv ；所述序列表中序列8所示DNA與所述中間重組大腸桿菌iii中的乳酸脫氫酶編碼基因發(fā)生同源重組；所述抑制磷酸乙酰轉移酶和乙酸激酶的活性是使所述乙酰轉移酶和乙酸激酶編碼基因的功能喪失；所述使所述乙酰轉移酶和乙酸激酶編碼基因的功能喪失的方法包括如下步驟向所述中間重組大腸桿菌iv中導入序列表中序列9所示DNA，得到重組大腸桿菌III ；所述序列表中序列9所示DNA與所述中間重組大腸桿菌iv中的磷酸乙酰轉移酶編碼基因和乙酸激酶編碼基因發(fā)生同源重組；所述提高蘋果酸合成酶和異檸檬酸裂解酶的活性是在重組大腸桿菌III的蘋果酸合成酶編碼基因的起始密碼子前加入序列表中序列2所示的啟動子序列；所述在蘋果酸合成酶編碼基因的起始密碼子前加入序列表中序列2所示的啟動子序列的方法包括如下步驟向所述重組大腸桿菌III中導入序列表中序列10所示DNA，得到中間重組大腸桿菌 ν ；所述序列表中序列10所示DNA與所述重組大腸桿菌III中的蘋果酸合成酶編碼基因的啟動子發(fā)生同源重組；所述提高丙酮酸脫氫酶的活性是在中間重組大腸桿菌ν的丙酮酸脫氫酶編碼基因的起始密碼子前加入序列表中序列2所示的啟動子序列；所述在丙酮酸脫氫酶編碼基因的起始密碼子前加入序列表中序列2所示的啟動子序列的方法包括如下步驟向所述中間重組大腸桿菌ν中導入序列表中序列11所示DNA，得到重組大腸桿菌IV ；所述序列表中序列11所示DNA與所述中間重組大腸桿菌ν中的丙酮酸脫氫酶El編碼基因的啟動子發(fā)生同源重組；所述磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶編碼基因為磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶的酶I編碼基因；所述二羧酸Dcu轉運蛋白為二羧酸Dcu轉運蛋白C;所述出發(fā)大腸桿菌為大腸桿菌K-12MG1655。由所述方法構建得到的重組大腸桿菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述大腸埃希氏菌)(ZT1M或所述重組大腸桿菌在生產(chǎn)丁二酸中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的又一個目的是提供一種生產(chǎn)丁二酸的方法。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)丁二酸的方法，包括以下步驟發(fā)酵所述大腸埃希氏菌 XZT124或所述重組大腸桿菌，得到丁二酸。所述發(fā)酵的溫度為25°C -39°C或25°C或37°C或39°C ；所述發(fā)酵的體系的pH值為6. 0-8. 0或6. 0或7. 0或8. 0 ；所述發(fā)酵的時間為48小時-96小時或48小時或72小時或96小時；所述發(fā)酵的接種量的體積百分比為0.01%-10%或0.01%或0.3%或10% ；所述發(fā)酵的培養(yǎng)基由以下成分組成大量元素葡萄糖、碳酸鹽、NH4H2PO4,(NH4) 2HP04、MgSO4 · 7H20 和 CaCl2 · 2H20 ；微量元素=FeCl3· 6H20、CoCl2 · 6H20、CuCl2 · 2H20, ZnCl2、Na2MoO4 · 2H20 和 MnCl2 · 4H202 ；水；以上成分在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度分別為大量元素葡萄糖50g/L-150g/L 或 50g/L 或 100g/L 或 150g/L、碳酸鹽 lg/L-20g/L 或 lg/L 或 7. 9g/L 或 8. 4g/L 或 10g/L 或 20g/L、NH4H2P040. 5g/L_5g/L 或 0. 5g/L 或 lg/L 或 5g/L、(NH4) 2HP04lg/L-10g/L 或 lg/L 或 3g/L 或 10g/L、MgSO4 · 7H20 0. lg/L_5g/L 或 0. lg/ L 或 lg/L 或 5g/L 和 CaCl2 · 2H20 0. lg/L_5g/L 或 0. lg/L 或 lg/L 或 5g/L ；微量元素=FeCl3· 6H20 0. 2 μ g/L_5 μ g/L 或 0. 2 μ g/L 或 1· 5 μ g/L 或 5 μ g/L、 CoCl2 ·6Η20 0. 05 μ g/L-5 μ g/L 或 0· 05 μ g/L 或 0· 1 μ g/L 或 5 μ g/L,CuCl2 ·2Η20 0. 05 μ g/L-5 μ g/L 或 0. 05 μ g/L 或 0. 1 μ g/L 或 5 μ g/L、ZnCl2O. 05 μ g/L-5 μ g/L 或 0. 05 μ g/L 或 0. 1 μ g/L 或 5 μ g/L、Na2MoO4 · 2H200. 05 μ g/L-5 μ g/L 或 0. 05 μ g/L 或 0. 1 μ g/L 或 5 μ g/L 和 MnCl2 · 4Η2020· 05 μ g/L-5 μ g/L 或 0· 05 μ g/L 或 0· 2 μ g/L 或 5 μ g/L ；所述碳酸鹽為KHCO3、NaHCO3 或 NH4HCO3。本發(fā)明所構建的大腸桿菌基因工程菌菌株)(ZT1M在厭氧條件下，利用無機鹽培養(yǎng)基，發(fā)酵94g/L的糖質原料可生產(chǎn)84g/L的丁二酸，適合工業(yè)化生產(chǎn)丁二酸。


圖1為含有不同鹽離子的培養(yǎng)基對HX018菌株生產(chǎn)丁二酸的影響。圖2為連續(xù)傳代培養(yǎng)工程菌HX018不同發(fā)酵時間的0D550值和丁二酸濃度。圖3為大腸桿菌基因工程菌)(ZT1M不同發(fā)酵時間的0D550值、丁二酸濃度和葡萄糖濃度。圖4為丁二酸標準品和基因工程菌發(fā)酵液的HPLC分析圖譜。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、大腸桿菌基因工程菌HX004的構建大腸桿菌基因工程菌HX004的構建分為以下兩個步驟(1)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因的整合采用基因全合成的方法獲得序列表中序列1所示的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，其包括一個人工啟動子片段、一個非翻譯區(qū)片段、一個密碼子經(jīng)過優(yōu)化的產(chǎn)丁二酸厭氧螺菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因片段和一個轉錄終止區(qū)片段?；蛘喜捎脙纱瓮粗亟M的方法，共有以下六步第一步，以大腸桿菌K_12MG1655(公眾可從天津工業(yè)生物技術研究所獲得，記載過大腸桿菌 K-12MG1655 的非專利文獻是 Blattner et al.，1997，The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12 Science，277 :1453-1462.)基因組 DNA 為模板，使用引物adhE-up/adhE-down，擴增大腸桿菌K-12MG1655的乙醇脫氫酶基因(adhE)。引物序列為adhE-up CATGCTAATGTAGCCACCAAA,adhE-down TTGCACCACCATCCAGATAA。擴增體系為NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer IOul、dNTP(IOmM each dNTP) lul、DNA 模板 20ng、引物(IOuM) 2ul、Phusion High-Fidelity DNAPolymerase (2. 5U/ ul)0. 5ul、蒸餾水33. 5ul，總體積為50ul。擴增條件為98°C預變性2分鐘(1個循環(huán))；98°C 變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸1分鐘30秒(30個循環(huán))；72°C延伸5分鐘(1個循環(huán))。 擴增產(chǎn)物包含乙醇脫氫酶基因及其上下游各400個左右堿基，并將其克隆到pEASY-Blimt 克隆載體(購自北京全式金生物技術有限公司)上。克隆體系為lul PCR擴增產(chǎn)物、Iul pEASY-Blunt克隆載體，輕輕混合、室溫反應5分鐘后加入50ul Transl-Tl感受態(tài)細胞中 (購自北京全式金生物技術有限公司)，冰浴30分鐘。42°C熱激30秒，立即至于冰上2分鐘。加入250ul LB培養(yǎng)基，200rpm，37°C孵育1小時。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的 LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質粒進行測序驗證，測序結果表明在載體PEASY-Blimt上插入了乙醇脫氫酶基因及其上下游各400個左右堿基，證明質粒構建正確，將得到的重組質粒命名為pXZ020。第二步，以pXZ020質粒DNA為模板，使用引物adhE-l/adhE-2擴增出一段DNA片段，引物序列為adhE-Ι TCCGGCTAAAGCTGAGAAAA,adhE-2 :GTGCGTTAAGTTCAGCGACA。擴增體系為NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer IOul、dNTP(IOmM each dNTP) lul、DNA 模板 20ng、引物(IOuM) 2ul、Phusion High-Fidelity DNAPolymerase (2. 5U/ ul)0. 5ul、蒸餾水33. 5ul，總體積為50ul。擴增條件為98°C預變性2分鐘(1個循環(huán))；98°C 變性10秒、60°C退火10秒、72°C延伸2分鐘(30個循環(huán))；72°C延伸5分鐘(1個循環(huán))。 PCR擴增產(chǎn)物包含pEASY-Blunt載體和乙醇脫氫酶編碼基因上下游的400個左右堿基。第三步，將含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖轉移酶基因(sacB)DNA片段連接至第二步的PCR擴增產(chǎn)物。pBMOOl質粒(來源于合肥百邁生物技術有限公司)經(jīng)過I^cI酶切(購自 NewEngland Biolabs 公司)，Klenow 酶(購自 NewEngland Biolabs 公司)補平粘末端，瓊脂糖凝膠電泳回收，獲得含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖轉移酶基因(sacB) 的DNA片段Q901bp)。連接體系為IOng的第二步PCR擴增產(chǎn)物，30ng的Km-sacB DNA片段，2ul 10XT4 ligation buffer (NEB 公司)，Iul T41igase (NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，補充蒸餾水至20ul。室溫連接2小時，取5ul加入50ul Transl-Tl感受態(tài)細胞中(購自北京全式金生物技術有限公司)，冰浴30分鐘。42°C熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。加入250ul LB培養(yǎng)基，200rpm，37°C孵育1小時。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質粒進行測序驗證，測序結果在上述第二步的PCR擴增產(chǎn)物上連接了 Km-sacB DNA片段，證明質粒構建正確，將得到的重組質粒命名為PXZ021。第四步，以pXZ021質粒DNA為模板，使用弓|物adhE-up/adhE-down擴增出DNA片段 I，擴增體系為=NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer IOul、dNTP (IOmM each dNTP) Iul, DNA 模板 20ng、引物(IOuM) 2ul、Phusion High-Fidelity DNAPolymerase (2. 5U/ul)lul、蒸餾水33. 5ul，總體積為50ul。擴增條件為98°C預變性2分鐘(1個循環(huán))；98°C變性10秒、 59°C退火10秒、72°C延伸1分鐘40秒(30個循環(huán))；72°C延伸5分鐘(1個循環(huán))。DNA片段I包含乙醇脫氫酶編碼基因上游400個左右堿基、Km-sacB DNA片段、乙醇脫氫酶編碼基因下游400個左右堿基。將DNA片段I用于第一次同源重組。首先將pKD46質粒(公眾可從天津工業(yè)生物技術研究所獲得，記載過PKD46質粒的非專利文獻是Datsenko，KA. ,and B. L. Wanner. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCRproducts. Proc Natl Acad Sci USA 97 :6640-6645.)通過氯化鈣轉化法轉化至大腸桿菌K-12MG1655，然后將DNA片段I電轉至帶有pKD46的大腸桿菌K-12MG1655。 電轉條件為首先準備帶有PKD46質粒的大腸桿菌K-12MG1655的電轉化感受態(tài)細胞；將 50ul感受態(tài)細胞置于冰上，加入50ngDNA片段I，冰上放置2分鐘，轉移至0. 2em的Bio-Rad 電擊杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數(shù)為電壓2. 5kv0電擊后迅速將Iml LB培養(yǎng)基轉移至電擊杯中，吹打5次后轉移至試管中，200轉，37°C孵育2小時，去除pKD46質粒。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個單菌落進行PCR驗證(使用引物adhE-up/adhE-down進行驗證，正確的菌落擴增產(chǎn)物為3700bp 左右的片段)。挑選一個正確的單菌落，將其命名為HX001。第五步，將序列表中序列1所示的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因片段連接至第二步的PCR擴增產(chǎn)物。序列表中序列1所示的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因片段由博尚生物技術有限公司合成。以合成的DNA片段為模板，使用引物pck-l/pck-2擴增出pck基因片段，引物序列為pck-1:TTAATTAACTAGT TTATCTCTGGCGGTG TTGAC,pck-2 :TTAATTAAAGAAACGCAAAAAGGCCATC。連接體系為IOng的第二步PCR擴增產(chǎn)物，30ng的pck基因片段，2ul 10XT41igation buffer (NEB 公司)，Iul T41igase (NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ ml)，補充蒸餾水至20ul。室溫連接2小時，取5ul加入50ul Transl-Tl感受態(tài)細胞中(購自北京全式金生物技術有限公司)，冰浴30分鐘。42°C熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。 加入250ul LB培養(yǎng)基，200rpm，37°C孵育1小時。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質粒進行測序驗證，測序結果在上述第二步的PCR擴增產(chǎn)物上連接了序列1所示的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因片段，證明質粒構建正確，將得到的重組質粒命名為PXZ022PCK。第六步，以p)(Z022PCK質粒DNA為模板，使用引物adhE-up/adhE-down擴增出DNA 片段II，DNA片段II的核苷酸序列如序列表中序列3所示。DNA片段II包含乙醇脫氫酶編碼基因上游400個左右堿基、序列表中序列1所示的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因片段和乙醇脫氫酶編碼基因下游400個左右堿基。DNA片段II用于第二次同源重組。首先將pKD46質粒通過氯化鈣轉化法轉化至HX001，然后將DNA片段II電轉至帶有pKD46質粒的HX001，電轉條件為首先準備帶有PKD46質粒的HX001的電轉化感受態(tài)細胞；將50ul感受態(tài)細胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分鐘，轉移至0. 2cm的Bio-Rad電擊杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數(shù)為電壓2. 5kv0電擊后迅速將 Iml LB培養(yǎng)基轉移至電擊杯中，吹打5次后轉移至試管中，200rpm，37°C孵育4小時，去除 PKD46質粒。將菌液轉移至含有10%蔗糖的沒有氯化鈉的LB液體培養(yǎng)基Q50ml燒瓶中裝 50ml培養(yǎng)基)，培養(yǎng)M小時后在含有6%蔗糖的沒有氯化鈉的LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。 經(jīng)過PCR驗證(使用引物adhE-up/adhE-down進行驗證，正確的菌落擴增產(chǎn)物為^60bp左右的片段)，挑選一個正確的單菌落，將其命名為HX002。(2)敲除HX002的磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶的酶I基因基因敲除的方法和上述步驟(1)的基因整合類似，也采用兩步同源重組的方法。第一步，以大腸桿菌K-12MG1655基因組DNA為模板，用引物ptsl-up/ptsl-down， 擴增大腸桿菌K-12MG1655的磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶的酶I基因ptsl。引物序列為ptsl-up CGCATTATGTTCCCGATGAT,ptsl-down :GCCTTTCAGTTCAACGGTGT。擴增體系與步驟(1)中第一步相同。擴增產(chǎn)物為磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶的酶I基因ptsl，并將其克隆到pEASY-Blimt克隆載體上。克隆體系與步驟(1)中第一步相同。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質粒進行測序驗證，測序結果表明在載體 pEASY-Blunt上插入了磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶的酶I基因ptsi，證明質粒構建正確，將得到的重組質粒命名為PXZ008。第二步，以pXZ008質粒DNA為模板，用引物ptsI-l/ptsI-2進行PCR擴增，得到 PXZ008質粒的DNA擴增片段，引物序列如下ptsl-l CGGCCCAATTTACTGCTTAG,ptsI-2 :ATCCCCAGCAACAGAAGTGT。擴增體系和擴增條件與步驟⑴的第二步相同。第三步，將含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖轉移酶基因(sacB)的DNA片段連接至第二步的PCR擴增產(chǎn)物。連接方法與步驟(1)的第三步相同，得到質粒PXZ009。第四步，以pXZ009質粒DNA為模板，用引物ptsl-up/ptsl-down進行PCR擴增，得到PXZ009質粒的DNA擴增片段。擴增體系和擴增條件與步驟(1)的第四步相同。將pXZ009 質粒的DNA擴增片段用于第一次同源重組，方法與步驟(1)的第四步相同。將質粒pXZ009 的DNA擴增片段電轉至帶有PKD46質粒的菌株HX002，去除pKD46質粒后，篩選卡那霉素抗性的菌落，得到菌株HX003。第五步，將第二步得到的pXZ008質粒的DNA擴增片段進行磷酸化處理，自連得到的質粒用于第二次同源重組。具體步驟如下將第二步的PCR擴增的產(chǎn)物首先用PCR 純化試劑盒清洗(EasyPure PCR Purification Kit，購自北京全式金生物技術有限公司)；取30ng純化后的PCR擴增產(chǎn)物，加入2ul 10XT4 ligation Buffer (NEB公司)Uul T4 Polynucleotide kinase (NEB 公司)，補充蒸餾水至 20ul，37°C 反應 30 分鐘；加入 Iul iMligase (NEB公司，400，OOOcohesiveend units/ml)，室溫反應2小時得到連接產(chǎn)物；取 5ul連接產(chǎn)物加入50ul Transl-Tl感受態(tài)細胞中，冰浴20分鐘。42°C熱激30秒，立即至于冰上2分鐘。加入250ul LB培養(yǎng)基，200rpm，37°C孵育1小時。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質粒進行測序驗證，測序結果上述第二步的PCR擴增產(chǎn)物進行了自連，證明質粒構建正確，得到質粒ρΧΖΟΙΟ。第六步，以ρΧΖΟΙΟ質粒DNA為模板，用引物ptsl-up/ptsl-down進行PCR擴增，得到ρΧΖΟΙΟ質粒的DNA擴增片段，其核苷酸序列如序列表中序列4所示。擴增體系和擴增條件與步驟(1)的第四步相同。將PXZOlO質粒的DNA擴增片段用于第二次同源重組，方法與步驟(1)的第六步相同。將質粒ΡΧΖΟΙΟ質粒的DNA擴增片段電轉至帶有pKD46質粒的菌株HX003，去除pKD46質粒后，篩選在蔗糖中能生長的菌落，篩選方法與步驟(1)的第六步相同。經(jīng)過PCR驗證(使用引物ptsl-up/ptsl-down進行驗證，正確的菌落擴增產(chǎn)物為727bp 左右的片段)，挑選一個正確的單菌落，將其命名為HX004，得到菌株HX004。實施例2、大腸桿菌基因工程菌HX008的構建大腸桿菌基因工程菌HX008的構建包括以下兩個步驟(1)在菌株HX004的半乳糖MFS轉運蛋白基因的起始密碼子前加入序列表中序列 2所示的人工強啟動子APl
啟動子替換的方法和基因整合類似，也采用兩次同源重組的方法。第一步，以大腸桿菌K-12 MG1655基因組DNA為模板，用引物galP-P-up/ galP-P-down進行PCR擴增，擴增得到半乳糖MFS轉運蛋白基因起始密碼子上下游各300個左右核苷酸的DNA片段。引物序列為galP-P-up :ATCTGCTGCACCCGATCTAC，galP-P-down :GAACCGGCAACAAACAAAAT。擴增體系與實施例1步驟(1)中第一步相同。并將該PCR擴增產(chǎn)物克隆到 pEASY-Blunt克隆載體上?？寺◇w系與實施例1步驟(1)中第一步相同，取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養(yǎng)， 提取陽性克隆質粒進行測序驗證，測序結果表明在載體PEASY-Blimt上插入了半乳糖MFS 轉運蛋白基因起始密碼子上下游各300個左右核苷酸的DNA片段，證明質粒構建正確，將得到的重組質粒命名為pXZOll。第二步，以pXZOll質粒DNA為模板，用引物galP-P-l/galP-P-2進行PCR擴增，得到pXZOll質粒的DNA擴增片段，引物序列如下gaip-p-l :ATGCCTGACGCTAAAAAACAGGG ；galP-P-2 :GATTAAACGCTGTTATCTGCAA。擴增體系和擴增條件與實施例1步驟(1)的第二步相同。第三步，將含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖轉移酶基因(sacB)的DNA片段連接至第二步的PCR擴增產(chǎn)物，連接方法與實施例1步驟(1)的第三步相同，得到質粒 p)(Z012。第四步，以pXZ012質粒DNA為模板，用引物galP-P-up/galP-P-down進行PCR擴增，得到PXZ012質粒的DNA擴增片段。擴增體系和擴增條件與實施例1步驟(1)的第四步相同。將PXZ012質粒的DNA擴增片段用于第一次同源重組，方法與實施例1步驟(1)的第四步相同。將質粒PXZ012的DNA擴增片段電轉至帶有pKD46質粒的菌株HX004，去除pKD46 質粒后，篩選卡那霉素抗性的菌落，得到菌株HX005。第五步，將序列表中序列2所示的DNA片段連接至第二步得到的pXZOll質粒的 DNA擴增片段上，得到質粒ρΧΖ013ΑΡ1。第六步，以ρΧΖ013ΑΡ1 質粒 DNA 為模板，用引物 galP-P-up/galP-P-down 進行 PCR 擴增，得到PXZ013AP1質粒的DNA擴增片段，其核苷酸序列如序列表中序列5所示。擴增體系和擴增條件與實施例1步驟(1)的第四步相同。將PXZ013AP1質粒的DNA擴增片段用于第二次同源重組，方法與實施例1步驟(1)的第六步相同。將質粒PXZ013AP1的DNA 擴增片段電轉至帶有PKD46質粒的菌株HX005，去除pKD46質粒后，篩選在蔗糖中能生長的菌落，篩選方法與實施例1步驟(1)的第六步相同。經(jīng)過PCR驗證(使用引物galP-P-up/ galP-P-down進行驗證，正確的菌落擴增產(chǎn)物為1051bp左右的片段)，挑選一個正確的單菌落，將其命名為菌株HX006，得到菌株HX006。(2)在HX006的二羧酸Dcu轉運蛋白C基因的起始密碼子前加入序列表中序列2 所示的人工強啟動子APl第一步，以大腸桿菌K-12MG1655基因組DNA為模板，用引物dcuC-P-up/ dcuC-P-down進行PCR擴增，擴增得到二羧酸Dcu轉運蛋白C基因起始密碼子上下游各400個左右核苷酸的DNA片段。引物序列為dcuC-P-up TGACAAAATGCAATCAAGGAA,dcuC-P-down :GAGACATCAGACAGGCGACA。擴增體系與實施例1步驟(1)中第一步相同。并將該PCR擴增產(chǎn)物克隆到 pEASY-Blunt克隆載體上?？寺◇w系與實施例1步驟(1)中第一步相同，取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養(yǎng)， 提取陽性克隆質粒進行測序驗證，測序結果表明在載體pEASY-Blunt上插入了二羧酸Dcu 轉運蛋白C基因起始密碼子上下游各400個左右核苷酸的DNA片段，證明質粒構建正確，將得到的重組質粒命名為PXZ065。第二步，以PXZ065質粒DNA為模板，用引物dcuC-P-l/dcuC-P-2進行PCR擴增，得到pXZ065質粒的DNA擴增片段，引物序列如下dcuC-P-1 iATGCTGACATTCATTGAGCTCCTTA,dcuC-P-2 :AATTTTTCCTGTCTCCAGGCCCCAA。擴增體系和擴增條件與實施例1步驟(1)的第二步相同。第三步，將含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖轉移酶基因(sacB)的DNA片段連接至第二步的PCR擴增產(chǎn)物，連接方法與實施例1步驟(1)的第三步相同，得到質粒 PXZ066。第四步，以pXZ066質粒DNA為模板，用引物dcuC-P-up/dcuC-P-dow進行PCR擴增，得到PXZ066質粒的DNA擴增片段。擴增體系和擴增條件與實施例1步驟(1)的第四步相同。將PXZ066質粒的DNA擴增片段用于第一次同源重組，方法與實施例1步驟(1)的第四步相同。將質粒PXZ066質粒的DNA擴增片段電轉至帶有PKD46質粒的菌株HX006，去除 PKD46質粒后，篩選卡那霉素抗性的菌落，得到菌株HX007。第五步，將序列表中序列2所示的DNA片段連接至第二步得到的PXZ065質粒的 DNA擴增片段上，得到質粒ρΧΖ067ΑΡ1。第六步，以PXZ067AP1質粒DNA為模板，用引物dcuC-P-up/dcuC-P-dow進行PCR擴增，得到PXZ067AP1質粒的DNA擴增片段，其核苷酸序列如序列表中序列6所示。擴增體系和擴增條件與實施例1步驟(1)的第四步相同。將PXZ067AP1質粒的DNA擴增片段用于第二次同源重組，方法與實施例1步驟(1)的第六步相同。將質粒PXZ067AP1的DNA擴增片段電轉至帶有PKD46質粒的菌株HX007，去除pKD46質粒后，篩選在蔗糖中能生長的菌落，篩選方法與實施例1步驟(1)的第六步相同。經(jīng)過PCR驗證(使用引物dcuC-P-up/dcuC-P-dow 進行驗證，正確的菌落擴增產(chǎn)物為1147bp左右的片段)，挑選一個正確的單菌落，將其命名為菌株HX008，得到菌株HX008。實施例3、大腸桿菌基因工程菌HX014的構建大腸桿菌基因工程菌HX014的構建包括以下三個步驟(1)在菌株HX008中敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因PflB第一步，以大腸桿菌K-12MG1655基因組DNA為模板，用引物pflB-up/pf IB-down， 擴增大腸桿菌K-12MG1655的丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB。引物序列為pflB-up TGTCCGAGCTTAATGAAAAGTT ；pflB-down CGAGTAATAACGTCCTGCTGCT。
擴增體系與實施例1步驟(1)中第一步相同。擴增產(chǎn)物為丙酮酸甲酸裂解酶基因 pflB，并將其克隆到pEASY-Blimt克隆載體上?？寺◇w系與實施例1步驟(1)中第一步相同。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質粒進行測序驗證，測序結果表明在載體PEASY-Blimt 上插入了丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB，證明質粒構建正確，將得到的重組質粒命名為 p)(Z014。第二步，以pXZ014質粒DNA為模板，用引物pfΙΒ-1/pf 1B-2進行PCR擴增，得到 PXZ014質粒的DNA擴增片段，引物序列如下pflB-1 :AAACGGGTAACACCCCAGAC ；pflB-2 :CGGAGTGTAAACGTCGAACA。擴增體系和擴增條件與實施例1中步驟(1)的第二步相同。第三步，將含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖轉移酶基因(sacB)的DNA片段連接至第二步的PCR擴增產(chǎn)物，連接方法與實施例1中步驟(1)的第三步相同，得到質粒 PXZ015。第四步，以pXZ015質粒DNA為模板，用引物pflB_up/pf IB-down進行PCR擴增，得到PXZ015質粒的DNA擴增片段。擴增體系和擴增條件與實施例1中步驟(1)的第四步相同。將PXZ015質粒的DNA擴增片段用于第一次同源重組，方法與實施例1中步驟(1)的第四步相同。將質粒PXZ015的DNA擴增片段電轉至帶有pKD46質粒的菌株HX008，去除pKD46 質粒后，篩選卡那霉素抗性的菌落，得到菌株HX009。第五步，將第二步得到的pXZ014質粒的DNA擴增片段進行磷酸化處理，自連得到的質粒用于第二次同源重組。具體方法與實施例1中步驟(1)的第四步相同，得到質粒 PXZ016。第六步，以pXZ016質粒DNA為模板，用引物pflB-up/pf IB-down進行PCR擴增，得到pXZ016質粒的DNA擴增片段，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。擴增體系和擴增條件與實施例1中步驟(1)的第四步相同。將PXZ016質粒的DNA擴增片段用于第二次同源重組，方法與實施例1中步驟(1)的第六步相同。將質粒PXZ016質粒的DNA擴增片段電轉至帶有pKD46質粒的菌株HX009，去除pKD46質粒后，篩選在蔗糖中能生長的菌落，篩選方法與實施例1步驟(1)的第六步相同。經(jīng)過PCR驗證(使用引物pfΙΒ-up/pfIB-down進行驗證，正確的菌落擴增產(chǎn)物為879bp左右的片段)，挑選一個正確的單菌落，將其命名為菌株 HXO10，得到菌株HXO10。(2)在菌株HX010中敲除乳酸脫氫酶基因IdhA第一步，以大腸桿菌K-12MG1655基因組DNA為模板，用引物ldhA-up/ldhA-down， 擴增大腸桿菌K-12MG1655的乳酸脫氫酶基因ldhA。引物序列為ldhA-up GATAACGGAGATCGGGAATG ；1 dhA-down CTTTGGCTGTCAGTTCACCA。擴增體系與實施例1步驟(1)中第一步相同。擴增產(chǎn)物為乳酸脫氫酶基因ldhA， 并將其克隆到pEASY-Blimt克隆載體上?？寺◇w系與實施例1步驟(1)中第一步相同。取 200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質粒進行測序驗證，測序結果表明在載體PEASY-Blimt上插
14入了乳酸脫氫酶基因ldhA，證明質粒構建正確，將得到的重組質粒命名為pXZOOl。第二步，以pXZOOl質粒DNA為模板，用引物ldhA-l/ldhA_2進行PCR擴增，得到 pXZOOl質粒的DNA擴增片段，引物序列如下1dhA-1 TCTGGAAAAAGGCGAAACCT ；ldhA-2 :TTTGTGCTATAAACGGCGAGT。擴增體系和擴增條件與實施例1中步驟(1)的第二步相同。第三步，將含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖轉移酶基因(sacB)的DNA片段連接至第二步的PCR擴增產(chǎn)物，連接方法與實施例1中步驟(1)的第三步相同，得到質粒 PXZ002。第四步，以pXZ002質粒DNA為模板，用引物ldhA-up/ldhA-down進行PCR擴增，得到PXZ002質粒的DNA擴增片段。擴增體系和擴增條件與實施例1中步驟(1)的第四步相同。將PXZ002質粒的DNA擴增片段用于第一次同源重組，方法與實施例1中步驟(1)的第四步相同。將質粒PXZ002的DNA擴增片段電轉至帶有pKD46質粒的菌株HX010，去除pKD46 質粒后，篩選氯霉素抗性的菌落，得到菌株HX011。第五步，將第二步得到的pXZOOl質粒的DNA擴增片段進行磷酸化處理，自連得到的質粒用于第二次同源重組。具體方法與實施例1中步驟(1)的第四步相同，得到質粒 p)(Z003。第六步，以pXZ003質粒DNA為模板，用引物ldhA-up/ldhA-down進行PCR擴增，得到pXZ003質粒的DNA擴增片段，其核苷酸序列如序列表中序列8所示。擴增體系和擴增條件與實施例1中步驟(1)的第四步相同。將PXZ003質粒的DNA擴增片段用于第二次同源重組，方法與實施例1中步驟(1)的第六步相同。將質粒PXZ003質粒的DNA擴增片段電轉至帶有pKD46質粒的菌株HXO11，去除pKD46質粒后，篩選在蔗糖中能生長的菌落，篩選方法與實施例1步驟(1)的第六步相同。經(jīng)過PCR驗證(使用引物ldhA-up/ldhA-down進行驗證，正確的菌落擴增產(chǎn)物為左右的片段)，挑選一個正確的單菌落，將其命名為菌株 HX012，得到菌株HX012。(3)在菌株HX012中敲除磷酸乙酰轉移酶基因pta和乙酸激酶基因ackA第一步，以大腸桿菌K-12MG1655基因組DNA為模板，用引物ackA-up/pta-down，擴增大腸桿菌K-12MG1655的磷酸乙酰轉移酶基因pta和乙酸激酶基因ackA。引物序列為ackA-up CGGGACAACGTTCAAAACAT ；pta-down :ATTGCCCATCTTCTTGTTGG。擴增體系與實施例1步驟(1)中第一步相同。擴增產(chǎn)物為磷酸乙酰轉移酶基因Pta 和乙酸激酶基因ackA，并將其克隆到pEASY-Blimt克隆載體上?？寺◇w系與實施例1步驟 (1)中第一步相同。取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質粒進行測序驗證，測序結果表明在載體pEASY-Blunt上插入了磷酸乙酰轉移酶基因pta和乙酸激酶基因ackA，證明質粒構建正確，將得到的重組質粒命名為PXZ023。第二步，以pXZ023質粒DNA為模板，用引物ackA-l/pta-2進行PCR擴增，得到 PXZ023質粒的DNA擴增片段，引物序列如下ackA-1 :AACTACCGCAGTTCAGAACCA ；
pta-2 TCTGAACACCGGTAACACCA。擴增體系和擴增條件與實施例1中步驟(1)的第二步相同。第三步，將含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖轉移酶基因(sacB)的DNA片段連接至第二步的PCR擴增產(chǎn)物，連接方法與實施例1中步驟(1)的第三步相同，得到質粒 PXZ024。第四步，以pXZOM質粒DNA為模板，用引物ackA-up/pta-down進行PCR擴增，得到 pXZOM質粒的DNA擴增片段。擴增體系和擴增條件與實施例1中步驟(1)的第四步相同。 將pXZOM質粒的DNA擴增片段用于第一次同源重組，方法與實施例1中步驟(1)的第四步相同。將質粒PXZOM的DNA擴增片段電轉至帶有PKD46質粒的菌株HX012，去除pKD46質粒后，篩選卡那霉素抗性的菌落，得到菌株HX013。第五步，將第二步得到的pXZ023質粒的DNA擴增片段進行磷酸化處理，自連得到的質粒用于第二次同源重組。具體方法與實施例1中步驟(1)的第四步相同，得到質粒 PXZ025。第六步，以pXZ025質粒DNA為模板，用引物ackA-up/pta-down進行PCR擴增，得到pXZ025質粒的DNA擴增片段，其核苷酸序列如序列表中序列9所示。擴增體系和擴增條件與實施例1中步驟(1)的第四步相同。將PXZ025質粒的DNA擴增片段用于第二次同源重組，方法與實施例1中步驟(1)的第六步相同。將質粒PXZ025質粒的DNA擴增片段電轉至帶有PKD46質粒的菌株HX013，去除pKD46質粒后，篩選在蔗糖中能生長的菌落，篩選方法與實施例1步驟(1)的第六步相同。經(jīng)過PCR驗證(使用引物ackA-up/pta-down進行驗證，正確的菌落擴增產(chǎn)物為808bp左右的片段)，挑選一個正確的單菌落，將其命名為菌株 HX014，得菌株 HX014。實施例4、大腸桿菌基因工程菌HX018的構建大腸桿菌基因工程菌HX018的構建包括以下兩個步驟(1)在菌株HX014的蘋果酸合成酶基因的起始密碼子前加入序列表中序列2所示的人工強啟動子APl第一步，以大腸桿菌K-12MG1655基因組DNA為模板，用引物aceB-P-up/ aceB-P-down進行PCR擴增，擴增得到蘋果酸合成酶基因起始密碼子上下游各300個左右核苷酸的DNA片段。引物序列為aceB-P-up :ATTCTGGCAGAGACGGAAGA ；aceB-P-down TCGAAATCGGCCATAAAGAC。擴增體系與實施例1中步驟(1)中第一步相同。并將該PCR擴增產(chǎn)物克隆到 pEASY-Blunt克隆載體上?？寺◇w系與實施例1中步驟(1)中第一步相同，取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質粒進行測序驗證，測序結果表明在載體pEASY-Blunt上插入了蘋果酸合成酶基因起始密碼子上下游各300個左右核苷酸的DNA片段，證明質粒構建正確，將得到的重組質粒命名為pXZ(^6。第二步，以pXZ(^6質粒DNA為模板，用引物aceB-P-l/aceB-P-2進行PCR擴增，得到pXZ(^6質粒的DNA擴增片段，引物序列如下aceB-P-1 :TTAATCCAGC GTTGGATTCA ；
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aceB-P-2 :ATGACTGAACAGGCAACAAC。擴增體系和擴增條件與實施例1中步驟(1)的第二步相同。第三步，將含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖轉移酶基因(sacB)的DNA片段連接至第二步的PCR擴增產(chǎn)物，連接方法與實施例1中步驟(1)的第三步相同，得到質粒 p)(Z027。第四步，以質粒PXZ027質粒DNA為模板，用引物aceB-P-up/aceB-P-down進行PCR 擴增，得到質粒PXZ027的DNA擴增片段。擴增體系和擴增條件與實施例1中步驟⑴的第四步相同。將質粒PXZ027的DNA擴增片段用于第一次同源重組，方法與實施例1中步驟 (1)的第四步相同。將質粒PXZ027的DNA擴增片段電轉至帶有pKD46質粒的菌株HX014， 去除pKD46質粒后，篩選卡那霉素抗性的菌落，得到菌株HX015。第五步，將序列表中序列2所示的DNA片段連接至第二步得到的pXZ(^6質粒的 DNA擴增片段上，得到質粒ρΧΖ(^8ΑΡ1。第六步，以ρΧΖ(^8ΑΡ1 質粒 DNA 為模板，用引物 aceB-P-up/aceB-P-down 進行 PCR 擴增，得到PXZ0WAP1質粒的DNA擴增片段，其核苷酸序列如序列表中序列10所示。擴增體系和擴增條件與實施例1中步驟(1)的第四步相同。將ρΧΖ(^8ΑΡ1質粒的DNA擴增片段用于第二次同源重組，方法與實施例1中步驟(1)的第六步相同。將質粒ρΧΖ(^8ΑΡ1的DNA 擴增片段電轉至帶有PKD46質粒的菌株HX015，去除pKD46質粒后，篩選在蔗糖中能生長的菌落，篩選方法與實施例1步驟(1)的第六步相同。經(jīng)過PCR驗證(使用引物aceB-P-up/ aceB-P-down進行驗證，正確的菌落擴增產(chǎn)物為1037bp左右的片段)，挑選一個正確的單菌落，將其命名為菌株HX016，得到菌株HX016。(2)在菌株HX016的丙酮酸脫氫酶El基因的起始密碼子前加入序列表中序列2所示的人工強啟動子APl第一步，以大腸桿菌K-12MG1655基因組DNA為模板，用引物aceE-P-up/ aceE-P-down進行PCR擴增，擴增得到丙酮酸脫氫酶El基因起始密碼子上下游各400個左右核苷酸的DNA片段。引物序列為aceE-P-up CAGAATGTCCGCCAGAACTT ；aceE-P-down GTGCACGGAAGAAGTGGTTA 擴增體系與實施例1中步驟(1)中第一步相同。并將該PCR擴增產(chǎn)物克隆到 pEASY-Blunt克隆載體上?？寺◇w系與實施例1中步驟(1)中第一步相同，取200ul菌液涂在含有卡那霉素的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質粒進行測序驗證，測序結果表明在載體pEASY-Blunt上插入了丙酮酸脫氫酶El基因起始密碼子上下游各400個左右核苷酸的DNA片段，證明質粒構建正確，將得到的重組質粒命名為PXZ017。第二步，以pXZ017質粒DNA為模板，用引物aceE-P-l/aceE-P-2進行PCR擴增，得到pXZ017質粒的DNA擴增片段，引物序列如下aceE-P-1 :ATGTCAGAACGTTTCCCAAATG ；aceE-P-2 :GGGTTATTCCTTATCTATC。擴增體系和擴增條件與實施例1中步驟(1)的第二步相同。第三步，將含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖轉移酶基因(sacB)的DNA片段連接至第二步的PCR擴增產(chǎn)物，連接方法與實施例1中步驟(1)的第三步相同，得到質粒 PXZ018。第四步，以pXZ018質粒DNA為模板，用引物aceE-P-up/aceE-P-down進行PCR擴增，得到質粒PXZ018的DNA擴增片段。擴增體系和擴增條件與實施例1中步驟(1)的第四步相同。將質粒PXZ018的DNA擴增片段用于第一次同源重組，方法與實施例1中步驟(1) 的第四步相同。將質粒PXZ018的DNA擴增片段電轉至帶有pKD46質粒的菌株HX016，去除 PKD46質粒后，篩選卡那霉素抗性的菌落，得到菌株HX017。第五步，將序列表中序列2所示的DNA片段連接至第二步得到的pXZ017質粒的 DNA擴增片段上，得到質粒ρΧΖ019ΑΡ1。第六步，以ρΧΖ019ΑΡ1 質粒 DNA 為模板，用引物 aceE-P-up/aceE-P-down 進行 PCR 擴增，得到PXZ019AP1質粒的DNA擴增片段，其核苷酸序列如序列表中序列11所示。擴增體系和擴增條件與實施例1中步驟(1)的第四步相同。將PXZ019AP1質粒的DNA擴增片段用于第二次同源重組，方法與實施例1中步驟(1)的第六步相同。將質粒PXZ019AP1的DNA 擴增片段電轉至帶有PKD46質粒的菌株HX017，去除pKD46質粒后，篩選在蔗糖中能生長的菌落，篩選方法與實施例1步驟(1)的第六步相同。經(jīng)過PCR驗證(使用引物aceE-P-up/ aceE-P-down進行驗證，正確的菌落擴增產(chǎn)物為IlMbp左右的片段)，挑選一個正確的單菌落，將其命名為菌株HX018，得到菌株HX018。實施例5、用基因工程菌HX004、HX008、HX014和HX018生產(chǎn)丁二酸方法I種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成大量元素葡萄糖，KHCO3,NH4H2PO4, (NH4)2HPO4, MgSO4 · 7H20 和 CaCl22H20 ；微量元素:FeCl3· 6H20, CoCl2 · 6H20, CuCl2 · 2H20, ZnCl2, Na2MoO4 · 2H20, MnCl2 · 4H202 ；水；以上成分在所述種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度分別為大量元素葡萄糖100g/L，KHC0310g/L，NH4H2P04lg/L，(NH4) 2HP043g/L， MgSO4 · 7H201g/L, CaCl2 · 2H20 0. lg/L ；微量元素=FeCl3· 6H20 L 5 μ g/L, CoCl2 · 6H20 0. 1 μ g/L, CuCl2 · 2H20 0. 1 μ g/L, ZnCl2O. 1 μ g/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 1 μ g/L, MnCl2 · 4H202 0. 2 μ g/L。以HX004、HX008、HX014和HX018菌株生產(chǎn)丁二酸，包括以下步驟(1)種子培養(yǎng)250ml三角瓶中種子培養(yǎng)基為150ml，121°C滅菌15min。冷卻后分別將基因工程菌HX004、HX008、HX014和HX018按照(V/V)的接種量接種于種子培養(yǎng)基， 在PH值為7. 0、37°C和IOOrpm的條件下培養(yǎng)18小時得到種子液，用于發(fā)酵培養(yǎng)基接種。(2)發(fā)酵培養(yǎng)500ml發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基體積為300ml，121°C滅菌15min。分別將步驟(1)得到的基因工程菌HX004、HX008、HX014和HX018的種子液按照0. 3% (V/V)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在PH值為7. 0 (采用K2CO3和KOH控制pH值，發(fā)酵過程中的pH值保持在7. 0)、37°C和150rpm的條件下培養(yǎng)72小時，得到發(fā)酵液。發(fā)酵液為發(fā)酵罐內所有物質。分析方法使用安捷倫(Agilent-1200)高效液相色譜儀對發(fā)酵液中的組分進行測定。發(fā)酵液中的葡萄糖和有機酸濃度測定采用伯樂(Biorad)公司的Aminex HPX-87H有機酸分析柱。丁二酸標準品購自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號為S3674-100G。丁二酸標準品的圖譜如圖4中A所示；丁二酸標準品的保留時間為14. ISmin0發(fā)酵液中的組分的分析圖譜如圖4中B所示；發(fā)酵液中丁二酸的保留時間為14. 12min。結果大腸桿菌基因工程菌HX004發(fā)酵7 后，發(fā)酵液中丁二酸濃度為Mg/L，丁二酸的產(chǎn)率為0. 5g/g，丁二酸生產(chǎn)速率為0. 33g/L-h,甲酸濃度為6. 5g/L，乳酸濃度為Ig/ L,乙酸濃度為10. 2g/L。大腸桿菌基因工程菌HX008發(fā)酵7 后，發(fā)酵液中丁二酸濃度為35g/L，相比 HX004提高了 46% ；丁二酸的產(chǎn)率為0. 65g/g，相比HX004提高了 30% ；丁二酸生產(chǎn)速率為 0. 48g/L · h，相比HX004提高了 46% ；甲酸濃度為4. 4g/L，相比HX004降低了 32% ；乳酸濃度為1.2g/L，相比HX004提高了 20% ；乙酸濃度為9. 6g/L，相比HX004降低了 6 %。大腸桿菌基因工程菌HX014發(fā)酵7 后，發(fā)酵液中丁二酸濃度為27g/L，相比 HX008降低了 23% ；丁二酸的產(chǎn)率為0. 80g/g，相比HX008提高了 23% ；丁二酸生產(chǎn)速率為 0. 38g/L*h，相比HX008降低了 23% ；乙酸濃度為lg/L，相比HX008降低了 90% ；未檢測到甲酸和乳酸。大腸桿菌基因工程菌HX018發(fā)酵7 后，發(fā)酵液中丁二酸濃度為23g/L，相比 HX008降低了 34% ；丁二酸的產(chǎn)率為0. 84g/g，相比HX008提高了；丁二酸生產(chǎn)速率為 0. 64g/L · h，相比HX008提高了 34% ；未檢測到甲酸、乳酸和乙酸。方法II種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成大量元素葡萄糖，KHCO3,NH4H2PO4, (NH4) 2HP04, MgSO4 · 7H20 和 CaCl22H20 ；微量元素:FeCl3· 6H20, CoCl2 · 6H20, CuCl2 · 2H20, ZnCl2, Na2MoO4 · 2H20, MnCl2 · 4H202 ；水；以上成分在所述種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度分別為大量元素葡萄糖50g/L，KHC03lg/L，NH4H2PO4O. 5g/L，(NH4) 2HP04lg/L， MgSO4 · 7Η200· lg/L, CaCl2 · 2H20 lg/L ；微量元素=FeCl3· 6H20 0. 2 μ g/L, CoCl2 · 6H20 0. 05 μ g/L, CuCl2 · 2H20 0. 05 μ g/ L, ZnCl2O. 05 μ g/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 05 μ g/L, MnCl2 · 4H2020. 05 μ g/L。以HX004、HX008、HX014和HX018菌株生產(chǎn)丁二酸，包括以下步驟(1)種子培養(yǎng)與方法I相同。(2)發(fā)酵培養(yǎng)500ml發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基體積為300ml，121°C滅菌15min。分別將步驟(1)得到的基因工程菌HX004、HX008、HX014和HX018的種子液按照0. 01% (V/V)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在PH值為6. 0 (采用K2CO3和KOH控制pH值，發(fā)酵過程中的pH保持6. 0)、25°C和150rpm的條件下培養(yǎng)48小時，得到發(fā)酵液。發(fā)酵液為發(fā)酵罐內所有物質。分析方法與方法I相同。結果與方法I無顯著差異。方法III種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成
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大量元素葡萄糖，KHCO3,NH4H2PO4, (NH4)2HPO4, MgSO4 · 7H20 和 CaCl22H20 ；微量元素:FeCl3· 6H20, CoCl2 · 6H20, CuCl2 · 2H20, ZnCl2, Na2MoO4 · 2H20, MnCl2 · 4H202 ；水；以上成分在所述種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度分別為大量元素葡萄糖150g/L, KHC0320g/L, NH4H2P045g/L, (NH4)2ΗΡ0410g/L， MgSO4 · 7H205g/L, CaCl2 · 2H20 5g/L ；微量元素=FeCl3· 6H20 5 μ g/L, CoCl2 · 6H20 5 μ g/L, CuCl2 · 2H20 5 μ g/L, ZnCl2 5 μ g/L, Na2MoO4 · 2H20 5 μ g/L, MnCl2 · 4H202 5 μ g/L。以HX004、HX008、HX014和HX018菌株生產(chǎn)丁二酸，包括以下步驟(1)種子培養(yǎng)與方法I相同。(2)發(fā)酵培養(yǎng)500ml發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基體積為300ml，121°C滅菌15min。分別將步驟(1)得到的基因工程菌HX004、HX008、HXO14和HXO18的種子液按照10% (V/V)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在PH值為8. O (采用K2CO3和KOH控制pH值，發(fā)酵過程中的pH值保持8.0)、39°C和150rpm的條件下培養(yǎng)96小時，得到發(fā)酵液。發(fā)酵液為發(fā)酵罐內所有物質。分析方法與方法I相同。結果與方法I無顯著差異。實施例6、對比含有不同鹽離子的培養(yǎng)基對HX018菌株生產(chǎn)丁二酸的影響使用三種不同的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，第一種種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基所用碳酸鹽為KHCO3, KHCO3在種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為10g/L。第二種種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基所用碳酸鹽為NaHCO3, NaHCO3在種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為8. 4g/ L。第三種種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基所用碳酸鹽為NH4HCO3, NH4HCO3在種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度7. 9g/L。此三種種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的其余組成成分和各組成成分的濃度均與實施例5中的方法I相同。以HX018菌株生產(chǎn)丁二酸，包括以下步驟(1)種子培養(yǎng)與實施例5中的方法I相同。(2)發(fā)酵培養(yǎng)除以下方法外，其余方法均與實施例5中的方法I相同。對于第一種發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵過程采用K2CO3和KOH控制pH。對于第二種發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵過程采用 Na2CO3和NaOH控制pH。對于第三種發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵過程采用(NH4) 2C03和NH4OH控制pH。分析方法與方法I相同。結果大腸桿菌基因工程菌HX018使用第一種鉀鹽培養(yǎng)基，發(fā)酵7 后，發(fā)酵液中丁二酸濃度為23g/L，丁二酸的產(chǎn)率為0. 84g/g，丁二酸生產(chǎn)速率為0. 32g/L化?；蚬こ叹?HX018使用第二種納鹽培養(yǎng)基，發(fā)酵7 后，發(fā)酵液中丁二酸濃度為8. 7g/L, 丁二酸的產(chǎn)率為0. 81g/g，丁二酸生產(chǎn)速率為0. 12g/L *h。HX018使用第三種銨鹽培養(yǎng)基，發(fā)酵7 后，發(fā)酵液中丁二酸濃度為7. 5g/L，丁二酸的產(chǎn)率為0. 79g/g，丁二酸生產(chǎn)速率為0. 10g/L-h(圖 1)。從結果可見，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基所用碳酸鹽為KHCO3時，發(fā)酵液中丁二酸濃度和丁二酸的產(chǎn)率最高；種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基所用碳酸鹽為NH4HCO3時，發(fā)酵液中丁二酸濃度和丁二酸的產(chǎn)率最低。
實施例7、構建大腸桿菌基因工程菌)(ZT1M500ml發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基體積為300ml，121°C滅菌15min，冷卻后接入菌株HX018， 接種量為0.3% (V/V)，發(fā)酵溫度為37°C，攪拌轉速為150rpm。發(fā)酵過程采用(NH4)2CO3* NH4OH控制pH值在7. 0。在發(fā)酵罐中連續(xù)傳代培養(yǎng)工程菌，每24h將發(fā)酵罐中的菌液按 1 1000的比例轉接到一個新的發(fā)酵罐中。經(jīng)過250代傳代馴化，得到菌株)(ZT1M (圖2)。發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成大量元素葡萄糖，NH4HCO3,NH4H2PO4, (NH4) 2HP04, MgSO4 · 7H20 和 CaCl22H20 ；微量元素:FeCl3· 6H20, CoCl2 · 6H20, CuCl2 · 2H20, ZnCl2, Na2MoO4 · 2H20, MnCl2 · 4H202 ；水；以上成分在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度分別為大量元素葡萄糖94g/L，NH4HCO3 7. 9g/L，NH4H2PO4 lg/L，(NH4)2HPO4 3g/L， MgSO4 · 7H20 lg/L, CaCl22H20 0. lg/L ；微量元素=FeCl3· 6H20 L 5 μ g/L, CoCl2 · 6H20 0. 1 μ g/L, CuCl2 · 2H20 0. 1 μ g/L, ZnCl2 0. 1 μ g/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 1 μ g/L, MnCl2 · 4H202 0. 2 μ g/L。該大腸埃希氏菌(Escherichia coli)XZT124已于2010年12月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 4512。實施例8、用基因工程菌)(ZT1M生產(chǎn)丁二酸種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成大量元素葡萄糖，NH4HCO3,NH4H2PO4, (NH4)2HPO4, MgSO4 · 7H20 和 CaCl22H20 ；微量元素:FeCl3· 6H20, CoCl2 · 6H20, CuCl2 · 2H20, ZnCl2, Na2MoO4 · 2H20, MnCl2 · 4H202 ；水；以上成分在所述種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度分別為大量元素葡萄糖94g/L，NH4HCO3 7. 9g/L，NH4H2PO4 lg/L, (NH4)2HPO4 3g/L， MgSO4 · 7H20 lg/L, CaCl22H20 0. lg/L ；微量元素=FeCl3· 6H20 L 5 μ g/L, CoCl2 · 6H20 0. 1 μ g/L, CuCl2 · 2H20 0. 1 μ g/L, ZnCl2 0. 1 μ g/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 1 μ g/L, MnCl2 · 4H202 0. 2 μ g/L。以)(ZT1M菌株生產(chǎn)丁二酸，包括以下步驟(1)種子培養(yǎng)與實施例5中的方法I相同。(2)發(fā)酵培養(yǎng)除發(fā)酵的時間為96小時以外，其余方法均與與實施例5中的方法I 相同。分析方法與實施例5中的方法I相同。結果大腸桿菌基因工程菌)(ZT1M發(fā)酵7 后，發(fā)酵液中丁二酸濃度為62g/L，丁二酸的產(chǎn)率為0. 87g/g，相比HX004、HX008、HX014和HX018的丁二酸的產(chǎn)率均有所提高；丁二酸的生產(chǎn)速率為0. 86g/L *h，相比HX004、HX008、HX014和HX018的丁二酸的生產(chǎn)速率均有所提高；發(fā)酵后，發(fā)酵液中丁二酸濃度為84g/L，殘?zhí)呛康陀?. 5g/L，丁二酸的產(chǎn)率為0. 90g/g, 丁二酸生產(chǎn)速率為0. 88g/L · h (圖3)。
2權利要求
1.大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)XZT124，其保藏號為 CGMCC No. 4512。
2.一種基因工程菌的構建方法，包括以下步驟在出發(fā)大腸桿菌中提高磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的活性和抑制磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶的活性，得到重組大腸桿菌，記作重組大腸桿菌I。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述方法還包括以下步驟在所述重組大腸桿菌I中提高半乳糖MFS轉運蛋白的活性和提高二羧酸Dcu轉運蛋白的活性，得到重組大腸桿菌，記作重組大腸桿菌II。
4.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述方法還包括以下步驟在所述重組大腸桿菌II中抑制丙酮酸甲酸裂解酶、乳酸脫氫酶、磷酸乙酰轉移酶和乙酸激酶的活性，得到重組大腸桿菌，記作重組大腸桿菌III。
5.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述方法還包括以下步驟在所述重組大腸桿菌III中提高蘋果酸合成酶和異檸檬酸裂解酶的活性和提高丙酮酸脫氫酶的活性，得到重組大腸桿菌，記作重組大腸桿菌IV。
6.根據(jù)權利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于所述提高磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的活性是向出發(fā)大腸桿菌中導入磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶編碼基因；所述導入磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶編碼基因的方法包括如下步驟向所述出發(fā)大腸桿菌中導入序列表中序列3所示DNA，得到中間重組大腸桿菌i ；所述抑制磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶的活性是使所述磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶編碼基因的功能喪失；所述使所述磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶編碼基因的功能喪失的方法包括如下步驟向所述中間重組大腸桿菌i中導入序列表中序列4所示 DNA，得到重組大腸桿菌I ；所述提高半乳糖MFS轉運蛋白的活性是在重組大腸桿菌I的半乳糖MFS轉運蛋白編碼基因的起始密碼子前加入序列表中序列2所示的啟動子序列；所述在半乳糖MFS轉運蛋白編碼基因的起始密碼子前加入序列表中序列2所示的啟動子序列的方法包括如下步驟向所述重組大腸桿菌I中導入序列表中序列5所示DNA，得到中間重組大腸桿菌ii ；所述提高二羧酸Dcu轉運蛋白的活性是在中間重組大腸桿菌ii的二羧酸Dcu轉運蛋白編碼基因的起始密碼子前加入序列表中序列2所示的啟動子序列；所述在二羧酸Dcu轉運蛋白編碼基因的起始密碼子前加入序列表中序列2所示的啟動子序列的方法包括如下步驟向所述中間重組大腸桿菌ii中導入序列表中序列6所示DNA，得到重組大腸桿菌II ； 所述抑制丙酮酸甲酸裂解酶的活性是使所述丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因的功能喪失; 所述使所述丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因的功能喪失的方法包括如下步驟向所述重組大腸桿菌Π中導入序列表中序列7所示DNA，得到中間重組大腸桿菌iii ；所述抑制乳酸脫氫酶的活性是使所述乳酸脫氫酶編碼基因的功能喪失；所述使所述乳酸脫氫酶編碼基因的功能喪失的方法包括如下步驟向所述中間重組大腸桿菌iii中導入序列表中序列8所示DNA，得到中間重組大腸桿菌iv ；所述抑制磷酸乙酰轉移酶和乙酸激酶的活性是使所述乙酰轉移酶和乙酸激酶編碼基因的功能喪失；所述使所述乙酰轉移酶和乙酸激酶編碼基因的功能喪失的方法包括如下步驟向所述中間重組大腸桿菌iv中導入序列表中序列9所示DNA，得到重組大腸桿菌III ； 所述提高蘋果酸合成酶和異檸檬酸裂解酶的活性是在重組大腸桿菌III的蘋果酸合成酶編碼基因的起始密碼子前加入序列表中序列2所示的啟動子序列；所述在蘋果酸合成酶編碼基因的起始密碼子前加入序列表中序列2所示的啟動子序列的方法包括如下步驟 向所述重組大腸桿菌III中導入序列表中序列10所示DNA，得到中間重組大腸桿菌ν ；所述提高丙酮酸脫氫酶的活性是在中間重組大腸桿菌ν的丙酮酸脫氫酶編碼基因的起始密碼子前加入序列表中序列2所示的啟動子序列；所述在丙酮酸脫氫酶編碼基因的起始密碼子前加入序列表中序列2所示的啟動子序列的方法包括如下步驟向所述中間重組大腸桿菌ν中導入序列表中序列11所示DNA，得到重組大腸桿菌IV ；所述磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶編碼基因為磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶的酶I編碼基因；所述二羧酸Dcu轉運蛋白為二羧酸Dcu轉運蛋白C ； 所述出發(fā)大腸桿菌為大腸桿菌K-12MG1655。
7.由權利要求2-6中任一所述的方法構建得到的重組大腸桿菌。
8.權利要求1所述的大腸埃希氏菌或權利要求7所述重組大腸桿菌在生產(chǎn)丁二酸中的應用。
9.一種生產(chǎn)丁二酸的方法，包括以下步驟發(fā)酵權利要求1所述的大腸埃希氏菌或權利要求7所述重組大腸桿菌，得到丁二酸。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的溫度為25°C -39°C或25°C或37°C或39°C ； 所述發(fā)酵的體系的PH值為6. 0-8. 0或6. 0或7. 0或8. 0 ； 所述發(fā)酵的時間為48小時-96小時或48小時或72小時或96小時； 所述發(fā)酵的接種量的體積百分比為0.01% -10%或0.01%或0.3%或10% ； 所述發(fā)酵的培養(yǎng)基由以下成分組成大量元素葡萄糖、碳酸鹽、NH4H2PCV (NH4)2HPO4^MgSO4 · 7H20 和 CaCl2 · 2H20 ； 微量元素:FeCl3 ·6Η20、CoCl2 ·6Η20、CuCl2 · 2H20, ZnCl2^Na2MoO4 · 2Η20 和 MnCl2 .4 ； 水；以上成分在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度分別為大量元素葡萄糖50g/L-150g/L或50g/L或100g/L或150g/L、碳酸鹽lg/L_20g/L或 lg/L 或 7. 9g/L 或 8. 4g/L 或 10g/L 或 20g/L、NH4H2P040. 5g/L_5g/L 或 0. 5g/L 或 lg/L 或 5g/ L、(NH4) 2HP04lg/L-10g/L 或 lg/L 或 3g/L 或 10g/L、MgSO4 · 7H20 0. lg/L_5g/L 或 0. lg/L 或 lg/L 或 5g/L 和 CaCl2 · 2H20 0. lg/L_5g/L 或 0. lg/L 或 lg/L 或 5g/L ；微量元素=FeCl3 · 6H20 0. 2 μ g/L-5 μ g/L 或 0. 2 μ g/L 或 1. 5 μ g/L 或 5 μ g/L、 CoCl2 ·6Η20 0. 05 μ g/L-5 μ g/L 或 0· 05 μ g/L 或 0· 1 μ g/L 或 5 μ g/L,CuCl2 ·2Η20 0. 05 μ g/ L-5 μ g/L 或 0. 05 μ g/L 或 0. 1 μ g/L 或 5 μ g/L、ZnCl2O. 05 μ g/L-5 μ g/L 或 0. 05 μ g/L 或 0. 1 μ g/L 或 5 μ g/L、Na2MoO4 · 2Η200. 05 μ g/L-5 μ g/L 或 0. 05 μ g/L 或 0. 1 μ g/L 或 5 μ g/L 和 MnCl2 · 4Η2020· 05 μ g/L-5 μ g/L 或 0· 05 μ g/L 或 0· 2 μ g/L 或 5 μ g/L ； 所述碳酸鹽為KHC03、NaHCO3或NH4HC03。
全文摘要
本發(fā)明公開了生產(chǎn)丁二酸的大腸桿菌基因工程菌及其構建方法與應用。本發(fā)明所提供的基因工程菌是按照包括以下步驟的方法構建的在出發(fā)大腸桿菌中提高磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的活性和抑制磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶的活性，得到重組大腸桿菌，記作重組大腸桿菌I。在此基礎上，進行一系列基因工程操作，構建得到重組大腸桿菌II、重組大腸桿菌III、重組大腸桿菌IV，即得到基因工程菌HX004、HX008、HX014和HX018。將基因工程菌經(jīng)傳代馴化得到基因工程菌菌株XZT124。本發(fā)明所構建的大腸桿菌基因工程菌菌株XZT124在厭氧條件下，利用無機鹽培養(yǎng)基，發(fā)酵94g/L的糖質原料可生產(chǎn)84g/L的丁二酸，適合工業(yè)化生產(chǎn)丁二酸。
文檔編號C12R1/19GK102174455SQ20111003162
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月28日 優(yōu)先權日2011年1月28日
發(fā)明者張學禮, 徐洪濤, 李清艷 申請人:天津工業(yè)生物技術研究所