專利名稱：擬南芥白粉病抗病性抑制基因edts3的克隆及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及在模式植物擬南芥中對白粉菌抗性的正調(diào)控因子的克隆、功能驗(yàn)證及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白粉病是由真菌中的白粉菌科引起的植物病害。當(dāng)植物被侵染發(fā)病時，會產(chǎn)生大量由菌絲體、分生孢子梗和分生孢子構(gòu)成的肉眼可見的白色粉狀物并由此而得名。白粉病在全世界分布廣泛，危害雙子葉植物尤為普遍。同時它也侵染多種禾本科植物，如小麥、大麥、燕麥和多種牧草。例如小麥白粉病是由?；约纳婢滩际习追劬穑怯绊懶←溕a(chǎn)的主要病害之一。在我國小麥白粉病曾連續(xù)幾次大流行，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。由于自然界中存在各種各樣的病原菌，植物在長期的協(xié)同進(jìn)化中逐漸形成了多層次的防御體系，它主要包括非寄主抗性、基礎(chǔ)抗性以及抗病基因介導(dǎo)的抗性。非寄主抗性主要通過植物自身結(jié)構(gòu)和次生代謝物防御，如植物細(xì)胞骨架和從頭合成植物抗毒素-抗菌復(fù)合物，所以具有廣譜、抗性強(qiáng)烈和持久的特點(diǎn)，是植物可以抵御大多數(shù)潛在病原菌侵染的主要原因?；A(chǔ)抗性又名基于病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecularpatterns, PAMPs)激發(fā)的抗性(PAMP-Triggered Immunity, PTI)。病原相關(guān)分子模式是寄主自身沒有，但在病原菌中卻廣泛存在，且對其生活史又至關(guān)重要并高度保守的分子特征，如細(xì)菌的鞭毛蛋白、延伸因子，真菌中的脂多糖和幾丁質(zhì)等。寄主細(xì)胞表面的受體能識別這些分子，并激活下游的MAPK的級聯(lián)信號通路，最終將信號傳遞入核，激活WKRY蛋白誘導(dǎo)病程(I^athogen-Responsive，PR)基因的表達(dá)，活性氧(Reactive OxygenSpecies, R0S)的產(chǎn)生和葡聚糖(callose)在侵入點(diǎn)的積累(1)，從而抵御病原菌的入侵?；A(chǔ)抗性的特點(diǎn)是抗譜廣，但通?？剐猿潭容^低?？共』蚪閷?dǎo)的抗性又名效應(yīng)因子激發(fā)的抗性(Effector TriggeredImmunity, ΕΤΙ)。在寄主植物進(jìn)化出PTI之后，部分病原菌演化出新的侵染機(jī)制。例如，細(xì)菌利用III 型分泌系統(tǒng)將效應(yīng)因子直接導(dǎo)入植物細(xì)胞內(nèi)部，來抑制PTI的產(chǎn)生。為了抵抗這些病原菌的侵染，植物進(jìn)化出了抗病基因(Resistance gene，R基因)來識別效應(yīng)因子(這時就可以稱為Avr蛋白)并誘導(dǎo)過敏反應(yīng)(Hypersensitive Response, HR)的發(fā)生來限制病原菌的生長和蔓延(Chisholm et al.，2006)。R基因介導(dǎo)的抗性的特點(diǎn)是特異性強(qiáng)，抗譜窄，抗性較高。植物的抗病反應(yīng)常受體內(nèi)的三種信號分子的調(diào)節(jié)與控制，這些信號分子分別是水楊酸SA,茉莉酸JA和乙烯ET。其中SA是各種植物抗病反應(yīng)的中心調(diào)控因子，是建立 (System Acquire Resistance, SAR)的基礎(chǔ)。而由JA/ET介導(dǎo)的抗病信號通路與SA通路是相互拮抗的。較為典型的例子就是假單胞桿菌產(chǎn)生類似JA/MeJA的一種植物生長物質(zhì)冠菌素(coronatine)來抑制SA-介導(dǎo)的抗性，從而降低植物的抗性O(shè))。目前，抗病基因克隆方法主要有扣除雜交法、酵母雙雜交系統(tǒng)、圖位克隆技術(shù)、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法和同源基因克隆等。對于模式植物擬南芥，圖位克隆分離基因成為最主要的方法之一，尤其是全基因組測序計(jì)劃的完成和各種分子標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)，以及DNA提取方法的日趨簡化，使克隆基因花費(fèi)時間大幅縮短。目前的抗病研究表明，擬南芥和其他雙子葉植物和單子葉禾本科植物在抗病的分子機(jī)理上是相似的。與R基因相比，抗病相關(guān)基因可以為植物提供更為廣譜和長效的抗性。 利用模式植物克隆植物抗病相關(guān)基因的目的，是為了尋找重要植物中具有類似功能的同源基因，通過植物基因工程技術(shù)，提高植物對病原菌的廣譜抗性。從擬南芥中克隆的抗病基因在生產(chǎn)上有潛在的應(yīng)用價值。例如，RPW8是在擬南芥上克隆的一個抗病基因，NPRl是在擬南芥中克隆的一個抗病反應(yīng)的重要調(diào)控因子。在煙草中過表達(dá)RPW8基因能提高煙草對白粉病菌的抗性；在水稻中過表達(dá)擬南芥基因NPRl能提高水稻對細(xì)菌的抗性。EDRl, EDR2和EDR3是擬南芥中調(diào)控白粉病抗性的相關(guān)基因，這些基因的突變導(dǎo)致植物對白粉菌的抗病性增強(qiáng)以及誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞死亡(Program Cell Death) (3-5) 0其中，EDRl編碼一個蛋白激酶，與乙烯反應(yīng)中的CTRl具有很高的同源性；EDR3編碼一個大分子的GIPase。edr2突變體，與edrl，edr3具有類似的表型，也具有增強(qiáng)的白粉病抗性及乙烯衰老反應(yīng)，而且它的抗病性也需要水楊酸信號通路，不需要茉莉酸或乙烯信號通路。EDR2 編碼一個新型的蛋白，具有三個結(jié)構(gòu)域，包括一個Pleckstrin Homology(PH)結(jié)構(gòu)域，一個 STeroidogenic Acute Regulatoryprotein-related Iipid-Transfer (START)結(jié)構(gòu)域以及一個功能未知但序列保守的羧基端結(jié)構(gòu)域DUF1336。前兩個區(qū)域的功能可能是與脂類結(jié)合， 而羧基端結(jié)構(gòu)域則可能參與蛋白與蛋白的相互作用。EDR2具有兩個脂類分子結(jié)合區(qū)，暗示脂類代謝與白粉病的抗病性以及植物細(xì)胞的程序性死亡密切相關(guān)。以edr2為切入點(diǎn)，利用模式植物擬南芥的研究較為完整和系統(tǒng)，技術(shù)較為先進(jìn)和成熟的優(yōu)勢，挖掘抗病相關(guān)基因，加快對抗病基因功能的了解及信號通路乃至網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的認(rèn)識拓展，將很有可能為農(nóng)作物的抗病防治和分子設(shè)計(jì)育種提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容
本申請包括在模式植物擬南芥中對白粉菌抗性的正調(diào)控因子EDTS3的克隆、功能驗(yàn)證及應(yīng)用。EDTS3基因的突變可以抑制擬南芥突變體edr2的白粉菌抗性，并同時抑制白粉菌誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞程序性死亡(Programmedcell death，PCD)。(1) 一種擬南芥抗白粉病抑制基因EDTS3序列，⑶S全長序列沈仙？，無內(nèi)含子。其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。(2) 一種擬南芥抗白粉病相關(guān)基因EDTS3編碼的蛋白序列，編碼87個氨基酸，大小 9. 784kD。其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。(3)EDTS3基因突變喪失自身功能后，表現(xiàn)出抑制edr2突變體的白粉菌抗性并抑制受白粉菌誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞死亡。其表型見圖1。(4)根據(jù)EDTS3基因突變后的抑制抗病表型，可以通過基因工程技術(shù)使其表達(dá)量升高，從而提高蔬菜及作物的抗病性。具體內(nèi)容如下1. 一種擬南芥白粉病抗病性抑制基因EDTS3，其為下列核苷酸序列之一
1) SEQ ID No. 1的核苷酸序列；2)與SEQ ID No. 1的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。2. 一種蛋白質(zhì)，其由以上1的基因EDTS3編碼。3.以上2的蛋白質(zhì)，其為1)由SEQ ID No. 2的氨基酸序列所示的蛋白；或2)將(1)的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有與(1)相同的功能的由(1)衍生的蛋白。4.以上1的基因EDTS3的突變基因edts3，其核苷酸序列與SEQ ID No. 1的核苷酸序列的區(qū)別在于其中發(fā)生A104G突變。5.以上4的突變基因edts3編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列與SEQ ID No. 2的氨基酸序列的區(qū)別在于其中發(fā)生1 突變。6.以上1的基因EDTS3或以上2或3的蛋白質(zhì)用于調(diào)控(增強(qiáng)或抑制)植物抗白粉病抗性或調(diào)控(促進(jìn)或抑制)白粉菌誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞程序性死亡的應(yīng)用，其中所述植物包括擬南芥、大麥、小麥，優(yōu)選為擬南芥突變體edr2。7.以上6的應(yīng)用，其中增強(qiáng)植物抗白粉病抗性或促進(jìn)白粉菌誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞程序性死亡的應(yīng)用通過在所述植物中過量或超量表達(dá)以上1的基因EDTS3或以上2或3的蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)，抑制植物抗白粉病抗性或抑制白粉菌誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞程序性死亡的應(yīng)用通過在所述植物中抑制以上1的基因EDTS3或以上2或3的蛋白質(zhì)的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，其中抑制權(quán)利要求 1的基因EDTS3或權(quán)利要求2或3的蛋白質(zhì)的表達(dá)可以通過使權(quán)利要求1的基因EDTS3發(fā)生失功能突變來實(shí)現(xiàn)。8.以上4的突變基因edts3用于抑制植物抗白粉病抗性和抑制白粉菌誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞程序性死亡的應(yīng)用，其中所述植物包括擬南芥、大麥、小麥，優(yōu)選為擬南芥突變體edr2。


圖1.野生型和突變體edr2，edts3/edr2生長4_6周后接種白粉病菌 (G. cichoracearum)8 天后的表型(上)，Trypan blue 染色結(jié)果(下)。圖2.通過圖位克隆的方法分離EDTS3基因的略圖。圖3.野生型、突變體edr2，edts3/edr2和互補(bǔ)載體轉(zhuǎn)化突變體edts3/edr2 (Tl) 生長4-6周后接種白粉病菌(G. cich0racearum)8天后的表型。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一 edts3突變體抑制抗病表型分析1. edts3/edr2突變體抑制edr2突變體的白粉病抗性及白粉菌誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(1)材料和方法edts3/edr2 (其中 edts3 是 enhanced disease resistance two suppressor 3) 是通過用0. 03% EMS (購自sigma公司)誘變突變體edr2 (4)，從誘變?nèi)后w中篩選出得到的一個可以抑制edr2白粉病菌抗性增強(qiáng)的突變體。進(jìn)而將得到的一個突變體命名為edts3/ edr2。
首先，把突變體edr2，edts3/edr2 和野生型 col_0 (購自 ArabidopsisBiological Resource Center (ABRC))的種子播到 MS 培養(yǎng)基(商購自 PhytoiTechnology Laboratories)，在4°C春化2_3天后，轉(zhuǎn)移到9h light/15hdark光照條件下的植物生長室。 大約7-10天，把幼苗移至土中。在幼苗生長4-6周后，接種白粉病菌(G. cichoracearum) (6)。該白粉病菌用擬南芥的一個對該白粉病菌易感的突變體pad4(7)保存。接菌時將生長有大量白粉孢子的pad4的植株輕輕地刮在待接白粉的植物葉片上，然后將接完菌的植物先用保鮮膜覆蓋保濕1天，后移去保鮮膜，植物繼續(xù)生長7天后，進(jìn)行抗病表型鑒定。將具有典型表型的葉片剪下，照相并進(jìn)行trypan blue染色。(2)結(jié)果與分析在接種白粉菌8天后，野生型和雙突變體edtS3/edr2的葉片上長滿白粉，而突變體edr2的葉片上基本上無可見的白粉菌孢子，并且表現(xiàn)白粉菌誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。染色也證明了上述結(jié)果野生型和雙突變體edtS3/edr2的葉片布滿了菌絲和分生孢子梗，而突變體中死亡的葉肉細(xì)胞被染成藍(lán)色(圖1)。上述結(jié)果表明edtS3/edr2突變體抑制了 edr2白粉菌抗性。實(shí)施例二 EDTS3基因的獲得1.利用圖位克隆分離出EDTS3基因我們利用圖位克隆分離了 EDTS3基因。具體做法是突變體edtS3/edr2與生態(tài)型 Lansberg (商購自ABRC)做雜交，獲得的Fl代自交產(chǎn)生F2代。在F2代，選擇含有edr2突變的野生型表型的單株，然后使其自交產(chǎn)生F3代。在F3代各株系中選擇野生型的個體，通過PCR方法及利用均勻分布在5條染色體上染色體的定位標(biāo)記(http://signal, salk. edu/ genome/SSLP_info/SSLPsordered. html)，將基因初步定位在第1條染色體斷臂的前端。隨后，又利用大約3000株F3代單株，將基因精細(xì)定位在F9H16和F26FM之間401Λ的區(qū)域 (8)(圖幻。此區(qū)域包括12個基因。通過測序發(fā)現(xiàn)在基因Atlg21327的⑶S中含有一個堿基突變A104G，而其他基因沒有任何變化，從而確定該基因?yàn)镋DTS3基因的候選基因。2.EDTS3基因的結(jié)構(gòu)EDTS3CDS全長沈4bp，不含有內(nèi)含子；EDTS3蛋白是一個絲氨酸豐富的小蛋白，其中有一個低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域由23個氨基酸組成。實(shí)施例三EDTS3基因的功能驗(yàn)證為驗(yàn)證edts3突變對edr2突變體白粉菌的抗性抑制是否由于Atlg21327堿基突變引起，我們構(gòu)建了帶自身啟動子的Atlg21327的遺傳轉(zhuǎn)化載體，利用花侵染的方法轉(zhuǎn)化雙突變體edts3/edr2植株，在Tl代，轉(zhuǎn)基因株系恢復(fù)了 edr2突變體的表型。我們以野生型col-Ο的DNA為模板，用一對PCR引物F :5 ‘ -AACTGCAGAAGTGGTGC TCACGTTGTTGTATTT-3 ‘和 R:5' -AACTGCAGAAGTGGTGCTCACGTTGTTGTATTT-3 ‘?dāng)U增出帶有 KpnI 和 PstI 的 5. 7kb 的 Atlg21327 基因片段。PCR反應(yīng)體系
DNA 2.Oul
IOxbuffer 5.Oul
dNTPs (2. OmM)5.Oul
MgS04(25mM)2.Oul
引物 F(IOuM) 1. 6ul引物 R(IOuM) 1. 6ulKOD Taq(IU) 1. OulH20 31. 8ulPCR反應(yīng)程序預(yù)變性，95°C 3分鐘；熱循環(huán)，變性95°C 30秒鐘，退火55°C 30秒鐘， 延伸72 °C 5分鐘，循環(huán)數(shù)30個。整個片段包括3. 6Kb的啟動子區(qū)、0.261Λ的編碼區(qū)和1.8Kb的3' -UTR。擴(kuò)增的片段與pCAMBIA1300(9)同時雙酶切(KpnI和I^stl，購自TaKaRa公司，37°C )、連接CT4連接酶(購自NEB公司)，16°C)和熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Ε· coli DHlOB (購自全式金公司)后， 經(jīng)測序(華大基因公司)鑒定正確的質(zhì)粒，隨后用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 (9)。用花浸染的方法(10)轉(zhuǎn)化雙突變體edtS3/edr2植株，7周后獲得Tl代種子。對種子消毒、清洗，然后播種到添加潮霉素(80yg/ml)的MS培養(yǎng)基中。7-10天后，選出Tl代轉(zhuǎn)基因陽性植株。在22°C，9h light/15h dark條件下，當(dāng)幼苗長到4_6周，我們同時把野生型、突變體和轉(zhuǎn)基因Tl代接種白粉菌，8天后觀察表型。結(jié)果Atlg21327基因的轉(zhuǎn)入完全互補(bǔ)了雙突變體edts3/edr2表型，表現(xiàn)為edr2表型(見圖幻。由此表明突變體的抗病表型由于 Atlg21327基因的突變引起。因此EDTS3基因即為Atlg21327基因。實(shí)施例四擬南芥白粉菌抗性相關(guān)基因EDTS3在作物抗病改良中的應(yīng)用EDTS3基因突變喪失自身功能后，表現(xiàn)出抑制edr2突變體的白粉菌抗性并抑制受白粉菌誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞死亡。根據(jù)這一特性可以通過基因工程技術(shù)使其過量或者超量表達(dá)， 從而提高蔬菜及作物的抗病性，培育具有抗病性狀的作物品種。參考文獻(xiàn)1. Chisholm ST, Coaker G, Day B， & Staskawicz BJ (2006) Host-microbeinteractions shaping the evolution of the plant immune response. Celll24(4) :803-814.2.Mudgett MB(2005)New insights to the function of phytopathogenic bacterialtype III effectors in plants. Annu Rev Plant Biol 56:509—531.3.Frye CA, Tang D, & Innes Rff(2001)Negative regulation of defense responsesin plants by a conserved MAPKK kinase. Proc Natl Acad Sci USA98 (1) 373-378.4. Tang D, Ade J, Frye CA，& Innes Rff (2005) Regulation of plant defenseresponses in Arabidopsis by EDR2, a PH and START domain-containingprotein. Plant J 44(2) :245-257.5. Tang D， Ade J, Frye CA， & Innes Rff (2006) A mutation in the GTP hydrolysissite of Arabidopsis dynamin-related protein IE confers enhanced cell death inresponse to powdery mildew infection. (Translated from eng)Plant J47(1) 75-84(in eng).6. Adam L, et al. (1999) Comparison of Erysiphe cichoracearum and E.cruciferarum and a survey of 360 Arabidopsis thaiiana accessions for resistanceto these two powdery mildew pathogens.Mol Plant MicrobeInteracts (12) :1031-1043.7. Jirage D,et al. (1999)Arabiaopsis tnaliana PAD4 encodes a lipase-like gene thatis important for salicylic acid signaling. (Translated irom eng;Proc Natl AcadSci USA 96(23) 13583-13588 (in eng) ·8. Jander G,et al. (2002)Arabidopsis Map-Based Cloning in the Post-Genome Era. Plant Physiol. 129(2) :440-450.9. Gou M， et al. (2009)An F-box gene, CPR30, functions as a negative regulator ofthe defense response in Arabidopsis. The Plant Journa丄 60(5) 757-770.10. Clough SJ & Bent AF (1998)Floral dip :a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J16(6) 735-743.
權(quán)利要求
1.一種擬南芥白粉病抗病性抑制基因EDTS3，其為下列核苷酸序列之一1)SEQ ID No. 1的核苷酸序列；2)與SEQID No. 1的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
2.一種蛋白質(zhì)，其由權(quán)利要求1的基因EDTS3編碼。
3.權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)，其為1)由SEQID No. 2的氨基酸序列所示的蛋白；或2)將(1)的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有與(1)相同的功能的由(1)衍生的蛋白。
4.權(quán)利要求1的基因EDTS3的突變基因edts3，其核苷酸序列與SEQIDNo. 1的核苷酸序列的區(qū)別在于其中發(fā)生A104G突變。
5.權(quán)利要求4的突變基因edts3編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列與SEQIDNo. 2的氨基酸序列的區(qū)別在于其中發(fā)生1 突變。
6.權(quán)利要求1的基因EDTS3或權(quán)利要求2或3的蛋白質(zhì)用于調(diào)控植物抗白粉病抗性或調(diào)控白粉菌誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞程序性死亡的應(yīng)用，其中所述植物包括擬南芥、大麥、小麥，優(yōu)選為擬南芥突變體edr2。
7.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中增強(qiáng)植物抗白粉病抗性或促進(jìn)白粉菌誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞程序性死亡的應(yīng)用通過在所述植物中過量或超量表達(dá)權(quán)利要求1的基因EDTS3或權(quán)利要求2或3 的蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)，抑制植物抗白粉病抗性或抑制白粉菌誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞程序性死亡的應(yīng)用通過在所述植物中抑制權(quán)利要求1的基因EDTS3或權(quán)利要求2或3的蛋白質(zhì)的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)， 其中抑制權(quán)利要求1的基因EDTS3或權(quán)利要求2或3的蛋白質(zhì)的表達(dá)可以通過使權(quán)利要求 1的基因EDTS3發(fā)生失功能突變來實(shí)現(xiàn)。
8.權(quán)利要求4的突變基因edts3用于抑制植物抗白粉病抗性和抑制白粉菌誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞程序性死亡的應(yīng)用，其中所述植物包括擬南芥、大麥、小麥，優(yōu)選為擬南芥突變體edr2。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種擬南芥白粉病抗病性抑制基因EDTS3的分離克隆、功能驗(yàn)證及應(yīng)用。本發(fā)明還涉及所述EDTS3基因的突變基因、所述EDTS3基因編碼的蛋白及其應(yīng)用。
文檔編號C12N15/29GK102586268SQ20111000729
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月13日
發(fā)明者唐定中, 武廣珩 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所