專(zhuān)利名稱(chēng)：一株棉酚降解菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及一株棉酚降解菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
棉籽餅粕是重要的植物蛋白質(zhì)飼料資源，在一定程度上可以彌補(bǔ)蛋白質(zhì)資源的不足，但由于棉籽餅粕中存在棉酚、氨基酸含量低且不平衡和粗纖維含量高等原因限制了其在養(yǎng)殖業(yè)中的大量廣泛使用。飼糧中包含一定量的游離棉酚(free gossypol, FG)會(huì)對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)、繁殖以及胃腸道和體組織器官產(chǎn)生負(fù)面作用。利用微生物發(fā)酵棉籽粕，不但可使re 含量大大降低而起到脫毒作用，而且可以顯著提高棉籽粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，使其在畜禽飼料中使用量顯著增加。顧賽紅等和^iang等研究表明，微生物發(fā)酵棉籽粕降低了棉粕中棉酚含量，同時(shí)提高了蛋白質(zhì)和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量及消化吸收率。mi等和Kornegay等亦有類(lèi)似的研究結(jié)果。張文舉等利用熱帶假絲酵母菌ZD-3對(duì)棉籽粕進(jìn)行固體發(fā)酵，脫毒率高達(dá)91. 91%。目前微生物發(fā)酵棉籽粕的研究，主要集中在對(duì)脫毒菌株的篩選及其脫毒效果和脫毒后粗蛋白等常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分變化的研究。但是微生物發(fā)酵棉籽粕仍存在諸多問(wèn)題發(fā)酵菌株性能不穩(wěn)定、耐受性低；微生物的脫毒機(jī)理復(fù)雜，高效脫毒菌株降解棉酚的詳細(xì)機(jī)制仍然不清楚；菌種發(fā)酵棉籽粕及其工藝條件尚缺乏充分的理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)室已篩選出棉酚降解率為71. 90%、粗蛋白提高28. 96%的復(fù)合發(fā)酵菌株，單一菌株最高脫毒率達(dá)88. 88% (夏新成，李貴強(qiáng)，滕安國(guó)，等.復(fù)合發(fā)酵棉籽粕菌種篩選、鑒定及其發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化研究，[J]中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2010，，25(1) :91-97)。優(yōu)良的菌種是發(fā)酵工業(yè)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，因此， 選育性能優(yōu)良的生產(chǎn)菌種是改善發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵。所以本試驗(yàn)通過(guò)誘變，進(jìn)一步改良、 篩選菌種，以期得到棉酚降解率更高的優(yōu)良菌株，為棉籽餅粕的廣泛安全使用提供基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中棉酚降解菌性能不穩(wěn)定的缺陷，提供一株穩(wěn)定性高、棉酚降解能力強(qiáng)的棉酚降解菌株。本發(fā)明生產(chǎn)的降解菌株可極顯著降低棉籽粕的棉酚含量，提高了棉籽粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，豐富了高效降解棉籽粕毒性的菌種資源。本發(fā)明成功地解決了飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)中棉籽粕飼用率低、蛋白質(zhì)飼料資源緊缺的問(wèn)題，為棉籽餅粕的廣泛安全使用提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明的另一目的是提供該棉酚降解菌株的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)假絲酵母GJ-D-25 (Candida railenensis)，該菌株于2010年11月洸日保藏于中國(guó)微生物菌種保存管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC)，菌種保藏號(hào)為CGMCC No.4373。假絲酵母GJ-D-25 (CGMCC No. 4373)主要形態(tài)學(xué)特性為白色，圓形，出芽增殖，白色假菌絲，邊緣整齊。假絲酵母GJ-D-25 (CGMCC No. 4373)主要培養(yǎng)學(xué)特性為該菌株能在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，能在查氏培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。假絲酵母GJ-D-25 (CGMCC No. 4373)主要生理生化特性為該菌株能發(fā)酵葡萄糖； 能以0. 4%醋酸棉酚為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。該菌株(CGMCCNo. 4373) 16srDNA 的 Genbank 登錄號(hào)為 FM178302. 1。經(jīng)菌種鑒定， GJ-D-25為酵母菌目酵母菌科假絲酵母屬Candida railenensis。在實(shí)驗(yàn)室三角瓶培養(yǎng)條件下假絲酵母GJ-D-25 (CGMCC No. 4373)對(duì)游離棉酚的降解率達(dá)90%以上，棉籽粕re含量較發(fā)酵前極顯著降低(P <o.oi)，cp含量亦極顯著提高 (P < 0. 01)。因此，本發(fā)明所述的假絲酵母GJ-D-25 (CGMCC No. 4373)可在生物降解游離棉酚中應(yīng)用。本發(fā)明所述的假絲酵母GJ-D-25 (CGMCC No. 4373)可在高濃度游離棉酚含量的棉籽粕的生物處理中應(yīng)用。有益效果本試驗(yàn)用紫外線、硫酸二乙酯誘變處理原始菌株，篩選分離到一株耐高濃度棉酚的優(yōu)勢(shì)菌假絲酵母GJ-D-25 (CGMCC No. 4373)，對(duì)其生物學(xué)特性和耐棉酚機(jī)理進(jìn)行了初步研究，并在棉籽粕的發(fā)酵工藝中得到了成功應(yīng)用。該菌株克服了現(xiàn)有棉酚降解菌性能不穩(wěn)定的缺陷，在篩選培養(yǎng)基中傳代3代后，初篩中是優(yōu)勢(shì)菌株，再傳代3代，進(jìn)行復(fù)篩，依然是優(yōu)勢(shì)菌株，說(shuō)明其具有良好的穩(wěn)定性。并且該菌株對(duì)醋酸棉酚的降解率為91. 40%，CP提高率為24. 99%，使棉籽粕達(dá)到使用標(biāo)準(zhǔn)，加大棉籽粕的利用率。該降解菌株的發(fā)酵底物可以部分代替豆粕，緩解蛋白質(zhì)資源的不足。因此，本發(fā)明對(duì)于緩解蛋白質(zhì)資源緊缺，減少大豆進(jìn)口及棉籽粕廉價(jià)出口日本，控制蛋白質(zhì)資源價(jià)格的不斷攀升，增強(qiáng)國(guó)力，具有重要的意義。使用該發(fā)明生產(chǎn)的高濃度醋酸棉酚降解菌株，具有生產(chǎn)使用成本低，使用方便，去除效果好的優(yōu)點(diǎn)，適合在動(dòng)物飼料的發(fā)酵工藝中投加使用，可以縮短生化處理系統(tǒng)的啟動(dòng)時(shí)間，并提高處理效果。菌種保藏信息假絲酵母GJ-D-25 (Candida railenensis)，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC)，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為CGMCC No. 4373，保藏日期為2010年11月沈日。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1菌種誘變及初篩1)菌種的復(fù)壯將原試驗(yàn)獲得的于4°C下保藏的菌種GJ-Y去掉液體石蠟，將其菌懸液ImL接入加有IOOmL PDA液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于恒溫汽浴搖床培養(yǎng)48h，轉(zhuǎn)速為200r/
min。2)菌株選定在超凈操作臺(tái)上，用接種環(huán)挑取復(fù)壯后菌液在PDA固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，挑選生長(zhǎng)良好、性狀穩(wěn)定并呈單一菌落生長(zhǎng)的純菌株。將純化的各單一菌株轉(zhuǎn)接在查氏培養(yǎng)基平板上，傳代5次后，保存菌種為誘變所用。
3)誘變出發(fā)菌株的預(yù)培養(yǎng)將選定的誘變出發(fā)菌株接種于0.3%棉酚無(wú)糖查氏培養(yǎng)基平板上，于30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，同時(shí)保存菌種。挑取對(duì)應(yīng)平板上的菌落，通過(guò)無(wú)菌操作配制成濃度為 IO8個(gè)/mL的菌懸液，接種ImL菌懸液于盛有IOOmLO. 3 %棉酚無(wú)糖查氏培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在30°C、200r/min下?lián)u床培養(yǎng)，在無(wú)菌條件下用pH為6. 0的無(wú)菌磷酸緩沖溶液配制菌懸液，顯微計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整菌體濃度到約IO7個(gè)/mL。4)紫外誘變時(shí)間的選擇紫外燈功率為15W，波長(zhǎng)254nm，紫外燈距培養(yǎng)皿30cm，照射時(shí)間分別為0、20、25、 30、35、45、60、90、120s。照射完后的菌液用黑布包好，并于4°C冰箱靜置30min，防止經(jīng)紫外線照射損傷的DNA被可見(jiàn)光修復(fù)。在紅外燈下分別取未照射的菌懸液(作為對(duì)照)和已經(jīng)紫外照射過(guò)的菌懸液各 0. 5mL，進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e取10-4、10_5、10-6稀釋度的稀釋液涂布于對(duì)應(yīng)的固體篩選培養(yǎng)基上，在30°C的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3-5d (用黑袋子包好平板)。通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算致死率。5)硫酸二乙酯(DES)誘變時(shí)間選擇誘變出發(fā)菌種培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加無(wú)菌磷酸緩沖液(PBQ制成菌懸液(約IO7 個(gè)/mL)。取菌懸液4mL、PBS(pH = 6. 0) 16mL、DES 0. 4mL充分混合(DES的體積分?jǐn)?shù)為 2% ),30°C 恒溫振蕩處理 0、20、25、30、35、45、60、90、120min，反應(yīng)結(jié)束后，加入 0. 5mL 25% Na2S2O3中止反應(yīng)，進(jìn)行Io-1UO-2UO-3UO-4UO-5UO-6梯度稀釋?zhuān)謩e取10_4、10_5、10_6稀釋度的稀釋液涂布于對(duì)應(yīng)的含色氨酸0. lg/100ml和咖啡堿0. 025mol/L的固體篩選培養(yǎng)基平板上，在30°C的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3-5d，通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算致死率。6)復(fù)合誘變超凈工作臺(tái)上，紅光環(huán)境下將調(diào)整好濃度的菌懸液(IO7個(gè)/mL)分別取5mL移入6 個(gè)直徑為7cm(含滅菌轉(zhuǎn)子)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中(3個(gè)為一組)，將培養(yǎng)皿置于磁力攪拌器上， 紫外燈功率為15W，波長(zhǎng)254nm，紫外燈距培養(yǎng)皿30cm，進(jìn)行攪拌；誘變時(shí)間分別為20、25、 30、45、60s，控制反應(yīng)溫度為30°C。將紫外誘變后的培養(yǎng)皿中的菌懸液分別轉(zhuǎn)入盛有PBS (pH = 6. 0) 15mL的250mL 三角瓶中(含玻璃珠10個(gè))，并于4°C冰箱靜置30min，取出，加入化學(xué)誘變劑硫酸二乙酯 0. 4mL,于氣浴搖床振蕩器上，誘變時(shí)間20min，具體反應(yīng)劑量如表3所示。恒定溫度30°C。 反應(yīng)完畢，立即加入25% Na2S2O3無(wú)菌溶液0. 5mL,以終止反應(yīng)。將誘變后的菌體轉(zhuǎn)移至有IOmL查氏液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，并加入色氨酸和咖啡堿以使突變基因穩(wěn)定，防止回復(fù)突變，菌液于30°C恒溫振蕩培養(yǎng)2h，生理鹽水適當(dāng)稀釋?zhuān)坎加诤?. 5-lg咖啡堿的0. 4%棉酚查氏培養(yǎng)基平板上，30°C恒溫、避光培養(yǎng)3-5d。 取出平板計(jì)算誘變條件下各菌株的致死率。7)篩選方法致死率在70% -80%的誘變效果較好，能得到較多的正突變，觀察單一誘變和復(fù)合誘變后篩選培養(yǎng)基中長(zhǎng)出的菌株的生長(zhǎng)情況，挑取致死率在70% -80%且生長(zhǎng)情況較好 (菌落直徑大小較大，生長(zhǎng)較迅速)的菌株和未經(jīng)誘變的對(duì)照株GJ-Y，傳代3次后接種至篩選培養(yǎng)基作初步篩選，觀察其生長(zhǎng)情況(見(jiàn)表1)。在固體篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行初篩后，經(jīng)三次傳代培養(yǎng)穩(wěn)定后，選擇生長(zhǎng)旺盛的菌株GJ-D-25和GJ-D-20進(jìn)入復(fù)篩。
表1醋酸棉酚無(wú)糖查氏培養(yǎng)基篩選菌株生長(zhǎng)情況
權(quán)利要求
1.假絲酵母GJ-D-25(Candida railenensis)，該菌株于2010年11月洸日保藏于中國(guó)微生物菌種保存管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC No. 4373。
2.權(quán)利要求1所述的假絲酵母GJ-D-25在生物降解游離棉酚中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的假絲酵母GJ-D-25在高濃度游離棉酚含量的棉籽粕的生物處理中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，公開(kāi)了一株棉酚降解菌株及其應(yīng)用。假絲酵母GJ-D-25(Candidarailenensis)，該菌株于2010年11月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保存管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC No.4373。該菌株對(duì)醋酸棉酚的降解率為91.40％，CP提高率為24.99％，并且該菌株有很好的穩(wěn)定性，使棉籽粕達(dá)到使用標(biāo)準(zhǔn)，加大棉籽粕的利用率。本發(fā)明對(duì)于緩解蛋白質(zhì)資源緊缺，減少大豆進(jìn)口及棉籽粕廉價(jià)出口日本，控制蛋白質(zhì)資源價(jià)格的不斷攀升，增強(qiáng)國(guó)力，具有重要的意義。
文檔編號(hào)A23L1/015GK102154130SQ201110004049
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月10日
發(fā)明者周光宏, 夏新成, 林海晶, 江蕓, 高峰 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)