專利名稱：一種提高丹參中丹參酮含量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術領域的方法，特別是一種關鍵酶基因DXS遺傳轉化提高丹參毛狀根中丹參酮含量的方法。
背景技術：
丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)又名紫丹參、紅根、赤參、活血參等，隸屬于唇形科鼠尾草屬，為多年生草本植物。作為一種傳統(tǒng)中藥，丹參在臨床上主要應用于對心血管疾病的治療。丹參主要藥用成分包括脂溶性的二萜醌類化合物(丹參酮類成分)和水溶性的酚酸類化合物。現(xiàn)代研究表明丹參所含的丹參酮類物質具有抗腫瘤，抗菌消炎，抗氧化，抗動脈粥樣硬化等多種藥理活性，因此具有巨大的市場需求。目前生長周期長，品質嚴重退化是丹參傳統(tǒng)植株栽培的一個弊端；丹參酮的結構復雜導致其化學合成過程十分繁瑣，成本較高且易造成環(huán)境污染；在離體條件下的細胞培養(yǎng)方法獲得的細胞其活性成分積累量很低而且穩(wěn)定性很差。代謝工程的迅速發(fā)展與毛狀根培養(yǎng)技術的日益成熟為提高丹參毛狀根中丹參酮成分的含量，解決丹參酮藥源緊缺性問題提供了一條新思路。據(jù)文獻報道，1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因(DXQ可能是丹參酮合成途徑中的限速酶基因，是丹參酮代謝工程的重要靶點。采用基因工程手段，將上述關鍵酶基因DXS遺傳轉化丹參，將打破丹參酮生物合成途徑的瓶頸效應，獲得高產丹參酮的丹參毛狀根或植株，為商業(yè)化生產丹參酮提供新途徑，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題所提及的關鍵酶基因轉化策略提高丹參毛狀根中丹參酮含量的相關報道。因此，本發(fā)明在實際解決丹參酮藥源緊缺性的問題上具有十分重要的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服常規(guī)技術中的不足，提供一種有效提高丹參毛狀根丹參酮含量的方法。一些常規(guī)生物學實驗方法如載體構建、遺傳轉化、分子檢測、半定量RT-PCR分析、丹參酮提取及含量測定、DPPH清除自由基法測定丹參轉基因毛狀根中丹參酮的抗氧化活性等應用于本發(fā)明，建立了一種有效提高丹參毛狀根丹參酮含量的方法，為丹參毛狀根商業(yè)化生產奠定堅實的基礎，對緩解丹參酮藥源的緊缺性具有一定的積極意義。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的本發(fā)明從丹參中克隆獲得DXS基因，構建含DXS基因的植物表達載體，以發(fā)根農桿菌C58C1為介導，將DXS基因導入丹參細胞中并獲得毛狀根；PCR檢測目的基因DXS的整合情況，半定量RT-PCR分析DXS在丹參轉基因毛狀根中的表達情況，高效液相色譜測定丹參轉基因毛狀根中丹參酮含量，DPPH清除自由基法測定丹參轉基因毛狀根中丹參酮的抗氧化活性。本發(fā)明包括如下具體步驟(1)采用基因克隆方法獲得丹參關鍵酶酶基因DXS ；(2)把DXS基因可操作性地連于表達調控序列，形成含DXS基因的植物表達載體；(3)將含DXS基因的植物表達載體轉化發(fā)根農桿菌，獲得用于轉化丹參的含DXS基因植物表達載體的發(fā)根農桿菌菌株；(4)利用所構建的發(fā)根農桿菌菌株遺傳轉化丹參葉片，獲得經PCR檢測為陽性的轉基因丹參毛狀根；(5)半定量RT-PCR測定丹參轉基因毛狀根中DXS基因的表達；(6)高效液相色譜法測定丹參轉基因毛狀根中丹參酮含量，篩選丹參酮含量顯著提高的轉基因丹參毛狀根株系。所述的提高丹參毛狀根丹參酮含量的方法，其特征是，所述的經PCR檢測的陽性轉基因丹參毛狀根是指在驅動插入基因(DXQ表達的組成型啟動子CaMV35S的內部及插入基因DXS的內部分別設計上游及下游特異性引物，進行DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的株系即為陽性轉基因丹參毛狀根株系。所述的提高丹參毛狀根丹參酮含量的方法，其特征是，半定量RT-PCR檢測DXS基因在丹參轉基因毛狀根中的表達情況，具體方法為對經PCR鑒定為陽性的毛狀根克隆進行總RNA的提取，并統(tǒng)一定量到0. 5 μ g RNA反轉成30 μ 1體系的cDNA第一條鏈，分別設計插入目的基因及看家基因18S rRNA的引物，以相同量的上述cDNA第一鏈為模板進行半定量RT-PCR擴增，分析DXS基因的相對表達量情況。所述的提高丹參毛狀根中丹參酮含量的方法，其特征是，所述的對經PCR檢測為陽性的轉基因毛狀根中丹參酮含量進行高效液相色譜法測定，具體測定方法如下色譜柱C-18反相硅膠柱，流動相為乙腈水(65 35)，檢測波長270nm，柱溫30°C，流速lml/min，進樣量20 μ 1。本發(fā)明的關鍵酶基因轉化策略提高丹參毛狀根丹參酮含量的方法，采用基因工程方法，將丹參酮合成途徑關鍵酶基因DXS導入丹參細胞中，獲得了高產丹參酮的丹參毛狀根株系。轉DXS基因的丹參毛狀根中所檢測的總丹參酮(隱丹參酮，丹參酮I，丹參酮IIA)含量相比于對照組顯著提高。轉DXS基因的丹參毛狀根總丹參酮的平均含量為1.02mg/g而，是對照組毛狀根(0. 49mg/g Dff)的2. 08倍。在所測試的轉DXS基因丹參毛狀根株系中，9號克隆(D9)總丹參酮含量最高(1. 42mg/g DW)，是對照組的2. 89倍。
具體實施例方式下面結合具體實施例詳細闡述本發(fā)明。應理解為這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆(Sambrook等)，或按照制造廠商所提供的試劑或試劑盒所附帶的說明書建議的條件。實施例1丹參DXS基因的克隆1. 1.丹參總RNA的提取取少量丹參(采用產于山東平邑丹參酮含量較高的丹參品種)幼嫩葉片，用液氮速凍后，迅速用研缽研碎，然后按照TIANGEN公司提供的RNA preppure plant kit使用說明提取總RNA。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量，然后在分光光度計上測定RNA含量。1.2.丹參DXS基因的克隆以所獲的0. 5 μ g丹參總RNA為起始量，用反轉錄酶XL(AMV)進行第一鏈cDNA的合成(操作步驟參照Promega公司提供的相關說明書)。根據(jù)所述丹參DXS基因的編碼序列(序列表中的序列1)，分別設計擴增出完整編碼框的上下游引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以所述的第一鏈⑶NA為模板，經PCR擴增后進行測序。DNA序列測定由上海生工生物工程技術服務有限公司采用3730自動測序儀完成。測序結果表明，所克隆的序列與GenBank中所報道的DXS基因的編碼序列一致。實施例2含DXS基因的植物表達載體的構建2.1.中間載體 pCAMBIA1304+的構建以pBI121和pCAMBIA1304為材料，構建植物表達載體pCAMBIA1304+。具體地，Hindlll/EcoRI 雙酶切 pBI121 和 pCAMBIA1304 ；回收 pBI121_GUS 表達盒及 pCAMBIA1304大片段；連接轉化，挑取單克隆菌落抽提質粒酶切驗證。結果表明，植物表達載體PCAMBIA1304+ 構建成功。2. 2.植物表達載體pCAMBIA1304+-DXS的構建在上述構建成功的pCAMBIA1304+基礎上，用從丹參中克隆到的DXS基因替換其上的GUS基因。具體地，BamHI/SacI雙酶切pMD18T_DXS和pCAMBIA1304+ ；回收DXS基因和PCAMBIA1304+大片段；連接轉化，挑取單克隆菌落PCR篩選陽性克隆；提取質粒進一步酶切驗證。結果表明，DXS基因已被成功構建到植物表達載體pCAMBIA1304+中，從而獲得含DXS基因的植物表達載體PCAMBIA1304+-DXS。本實施例將丹參酮生物合成途徑關鍵酶基因DXS可操作性地連于表達調控序列，形成含DXS基因的植物表達載體PCAMBIA1304+-DXS，該表達載體可用于通過代謝工程策略來提高丹參中丹參酮含量。實施例3發(fā)根農桿菌介導DXS基因遺傳轉化丹參獲得轉基因丹參毛狀根3. 1.含植物表達載體pCAMBIA1304+-DXS發(fā)根農桿菌工程菌的獲得將實施例2中含DXS基因的植物表達載體pCAMBIA1304+-DXS轉入發(fā)根農桿菌C58C1中，挑取單克隆菌落進行PCR驗證。結果表明，含DXS基因的植物表達載體已成功構建到發(fā)根農桿菌菌株C58C1中。3. 2.發(fā)根農桿菌介導DXS基因遺傳轉化丹參3. 2. 1.外植體的預培養(yǎng)剪取丹參健壯無菌苗葉片(0.5cm2)，接種到預培養(yǎng)培養(yǎng)基(MQ上，25°C暗培養(yǎng)2d。3. 2. 2.農桿菌與外植體的共培養(yǎng)將上述經預培養(yǎng)的丹參葉片外植體，放入含活化好的上述發(fā)根農桿菌工程菌的1/2MS懸液中浸泡10分鐘(輕輕搖晃使外植體與菌液充分接觸)后，取出浸染后的丹參葉片用無菌吸水紙吸干表面菌液，轉到共培養(yǎng)培養(yǎng)基1/2MS中，暗培養(yǎng)3-4d。3. 2. 3.毛狀根的誘導和繼代培養(yǎng)將上述的共培養(yǎng)3-4d的丹參外植體轉接到除菌固體培養(yǎng)基(1/2MS+Cef500mg/L)中，25°C暗培養(yǎng)2-3周左右，可從外植體傷口處長出毛狀根。將已發(fā)根的丹參外植體轉接到除菌固體培養(yǎng)基(1/2MS+Cef300mg/L)上，25°C暗培養(yǎng)2周待毛狀根長至3cm以上時剪取單一毛狀根作為一個無性系，繼續(xù)接種于除菌培養(yǎng)基(1/2MS+Cef 100mg/L)中暗培養(yǎng)兩周，直至無農桿菌溢出。3. 3.轉基因丹參毛狀根的PCR檢測3. 3. 1.轉基因毛狀根基因組DNA的提取本發(fā)明采用CTAB法提取轉基因毛狀根基因組DNA。剪取3. 2. 3中除菌完畢的轉基因毛狀根5cm左右放入1. 5ml離心管中，加入適量的石英砂及600 μ 1 CTAB裂解液(65°C預熱，含β巰基乙醇)，用研磨棒將材料充分磨碎。置于65°C水浴鍋中40-50分鐘，其間多次混勻樣品(次/lOmin)，冷卻至室溫后加入等入體積的苯酚，輕輕顛倒混勻乳化lOmin，12000rpm離心20min，小心吸取上清于新EP管中，加入等體積苯酚/氯仿(1 1)，輕輕混勻，12000rpm離心20min，緩慢吸取上清于新EP管中，加等體積的氯仿混勻，12000rpm離心20min，緩慢吸取上清于新EP管中，加2倍體積預冷的無水乙醇，析出沉淀。用槍頭將沉淀挑到新EP管中，加入75%乙醇4°C洗滌過夜。次日用75%乙醇再洗滌兩次，吸出上清，室溫晾干，加入30-50 μ 1水溶解沉淀，用RNA酶處理后于_80°C超低溫冰箱凍存，備用。3.3.2.引物設計及PCR檢測在pCAMBIA1304+-DXS上啟動插入目的基因表達的組成型表達啟動子CaMV35S及插入基因(DXQ上分別設計特異性上游及下游引物，用PCR方法對上述毛狀根的總DNA進行分子檢測。結果表明，利用上述特異引物，在一部分轉基因毛狀根中能檢測到和陽性對照大小相當?shù)腜CR產物。而以pCAMBIA1304+空載體遺傳轉化丹參所獲得的毛狀根及野生型丹參植株根的基因組DNA為模板時，沒有擴增出任何片段。結果說明DXS基因已經整合到丹參基因組中。本實施例將所述的植物表達載體轉化發(fā)根農桿菌，獲得用于轉化丹參的含DXS基因植物表達載體的發(fā)根農桿菌菌株C58C1，利用所構建的發(fā)根農桿菌菌株遺傳轉化丹參細胞，獲得經PCR檢測為陽性克隆的轉基因毛狀根。轉基因丹參毛狀根的獲得為篩選獲得高產丹參酮的毛狀根提供了直接素材。實施例4半定量RT-PCR檢測丹參轉基因丹參毛狀根中DXS基因的表達4. 1.毛狀根液體培養(yǎng)選擇實施例3中生長快、分枝好的毛狀根，在超凈工作臺上剪取2-3cm用無菌水蒸餾水沖洗掉其表面上的瓊脂后接入裝有200ml 1/2MS液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中100rpm，25°C黑暗下培養(yǎng)，每20天更換新鮮1/2MS液體培養(yǎng)基繼代一次，80天后收獲，取適量新鮮毛狀根用吸水紙吸干表面水分后，用錫箔紙包好浸入液氮中冷凍后保存于-80°C用于RNA提取，其余毛狀根烘干后用于丹參酮含量提取。4. 2.轉基因丹參毛狀根的半定量RT-PCR檢測根據(jù)丹參酮生物合成代謝途徑關鍵酶基因DXS的編碼序列設計引物用于檢測丹參毛狀根中總的DXS的表達情況(DXS為丹參內源基因)，而通過在DXS的3’上設計一個下游引物和該基因上的上游引物配對則可以檢測內源基因的表達情況(轉入的部分為基因的編碼序列，不帶有5’及3’非編碼序列)，看家基因18S rRNA用來作為內參。所用引物由上海生工生物工程公司合成。結果顯示，DXS基因在丹參轉基因毛狀根克隆中都過量表達且表達量都強于對照組，但不同克隆之間的表達量有一定的差異。本實施例采用半定量RT-PCR技術測定丹參轉基因毛狀根中DXS基因的表達情況，為分析DXS基因在丹參酮合成過程中所起的作用提供一定的依據(jù)。實施例5利用HPLC測定轉基因丹參毛狀根中丹參酮含量5. 1.色譜條件及標準品貯備液的配制色譜柱為C-18反相硅膠柱，流動相為乙腈水(65 35)，檢測波長270nm，柱溫30°C，流速 lml/min，進樣量 20μ 1。精密稱取隱丹參酮，丹參酮I，丹參酮II A標準品分別配置成濃度為36μ g/ml，36 μ g/ml, 22 μ g/ml標準品貯備液，保存于_20°C備用。5. 2.標準曲線的制作本發(fā)明中流動相乙腈水在體積比65 35時，隱丹參酮，丹參酮I，丹參酮II A的保留時間分別為18. 90min, 20. 53min和34. OOmin,三種丹參酮成分完全分離，且峰型良好。將上述標準品貯備液品分別取5ul，10ul,20ul,30ul,40ul在相應色譜條件下進樣，記錄圖譜及色譜參數(shù)，分別以峰面積(Y)對標準品濃度(X，μ g/ml)進行回歸分析。結果表明，本發(fā)明中隱丹參酮在9-72ug/ml、丹參酮I在9-72 μ g/ml、丹參酮II A在5. 5-44 μ g/ml范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系。5. 3.轉基因毛狀根丹參酮含量的提取及測定將實例4中收獲并烘干的轉基因丹參毛狀根放入研缽中充分研磨，取200mg毛狀根干粉加入甲醇二氯甲烷(3 1^八)161111，超聲提取601^11，室溫放置過夜，次日拿出離心(12000rpm，10min)，吸取上清萃取液真空干燥，殘余物重新用Iml的色譜甲醇二氯甲烷(3 1)混合液體溶解，樣品用0.22μΜ的濾膜過濾后各取20μ1，注入高效液相色譜儀，記錄各組分峰面積，代入線性回歸方程，計算即得樣品丹參酮含量。在本發(fā)明中轉DXS基因的毛狀根中所檢測的總丹參酮(隱丹參酮，丹參酮I，丹參酮II Α)含量相比于對照組顯著提高。轉DXS基因的丹參毛狀根總丹參酮的平均含量為1. 02mg/g DW，是對照組毛狀根(0. 49mg/g Dff)的2. 08倍。在所測試的轉DXS基因丹參毛狀根株系中，9號克隆(D9)總丹參酮含量最高(1.4aiig/g DW)，是對照組的2. 89倍。本實施例采用HPLC法測定了丹參轉基因毛狀根丹參酮含量。結果表明轉DXS基因的丹參毛狀根總丹參酮含量比對照組顯著提高。在本發(fā)明中通過轉DXS基因的代謝工程策略獲得了高產丹參酮的丹參轉基因毛狀根株系，為商業(yè)化化生產丹參酮，緩解丹參酮的藥源緊缺性問題提供了一條理想方法。
權利要求
1.一種1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因DXS遺傳轉化丹參提高丹參毛狀根丹參酮含量的方法，其特征在于，從丹參中克隆1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因DXS，構建含所述DNA分子的植物表達載體，用發(fā)根農桿菌介導法將DXS基因導入丹參葉片并獲得毛狀根，PCR檢測目的基因DXS的整合情況，半定量RT-PCR檢測目的基因DXS在丹參轉基因毛狀根中的表達情況，高效液相色譜測定丹參轉基因毛狀根丹參酮含量，篩選獲得丹參酮含量提高的轉基因丹參發(fā)根。
2.根據(jù)權利要求1所述的轉DXS基因提高丹參毛狀根中丹參酮含量的方法，其特征是，包括如下具體步驟(1)采用基因克隆方法獲得丹參關鍵酶酶基因DXS；(2)把DXS基因可操作性地連于表達調控序列，形成含DXS基因的植物表達載體；(3)將含DXS基因的植物表達載體轉化發(fā)根農桿菌，獲得用于轉化丹參的含DXS基因植物表達載體的發(fā)根農桿菌菌株；(4)利用所構建的發(fā)根農桿菌菌株遺傳轉化丹參葉片，獲得經PCR檢測為陽性的轉基因丹參毛狀根；(5)半定量RT-PCR測定丹參轉基因毛狀根中DXS基因的表達；(6)高效液相色譜法測定丹參轉基因毛狀根中丹參酮含量，篩選丹參酮含量顯著提高的轉基因丹參毛狀根株系；
3.根據(jù)權利要求2所述的提高丹參毛狀根丹參酮含量的方法，其特征是，所述的經PCR檢測的陽性轉基因丹參毛狀根是指在驅動插入基因(DXQ表達的組成型啟動子CaMV35S的內部及插入基因DXS的內部分別設計上游及下游特異性引物，進行DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的株系即為陽性轉基因丹參毛狀根株系。
4.根據(jù)權利要求2所述的提高丹參毛狀根丹參酮含量的方法，其特征是，半定量RT-PCR檢測DXS基因在丹參轉基因毛狀根中的表達情況，具體方法為對經PCR鑒定為陽性的毛狀根克隆進行總RNA的提取，并統(tǒng)一定量到0. 5 μ g RNA反轉成30 μ 1體系的cDNA第一條鏈，分別設計插入目的基因及看家基因18S rRNA的引物，以相同量的上述cDNA第一鏈為模板進行半定量RT-PCR擴增，分析DXS基因的相對表達量情況。
5.根據(jù)權利要求2所述的提高丹參毛狀根中丹參酮含量的方法，其特征是，所述的對經PCR檢測為陽性的轉基因毛狀根中丹參酮含量進行高效液相色譜法測定，具體測定方法如下色譜柱C-18反相硅膠柱，流動相為乙腈水(65 35)，檢測波長270nm,柱溫30°C，流速lml/min，進樣量20 μ 1。
全文摘要
本發(fā)明是一種提高丹參中丹參酮含量的方法。本發(fā)明從丹參中克隆出1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因的編碼框序列，并構建含DXS基因的植物高效表達載體，遺傳轉化丹參葉片獲得轉DXS基因的丹參毛狀根，半定量RT-PCR分析DXS在丹參轉基因毛狀根中的表達。高效液相色譜法測定丹參轉基因毛狀根中總丹參酮(隱丹參酮，丹參酮工和丹參酮IIA)含量。本發(fā)明獲得的轉基因丹參毛狀根中丹參酮含量顯著提高，其中表現(xiàn)最好的一個株系的總丹參酮含量為對照的2.89倍。本發(fā)明提供了一種提高丹參毛狀根中丹參酮含量的方法，也為生產具重要臨床需求的丹參酮提供了一種新型優(yōu)質原料。
文檔編號C12N15/82GK102586288SQ20111000154
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月6日 優(yōu)先權日2011年1月6日
發(fā)明者開國銀 申請人:開國銀