專(zhuān)利名稱(chēng)：用于從類(lèi)異戊二烯途徑生產(chǎn)化學(xué)和醫(yī)藥產(chǎn)品的微生物工程的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)微生物工程生產(chǎn)ー種或更多種萜類(lèi)化合物(terpenoid)。
背景技術(shù)：
紫杉醇及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物已被認(rèn)為是在過(guò)去十年推出的最有效的和商業(yè)....ヒ最成功的抗癌藥物匕紫杉醇首先是從太平洋紫杉樹(shù)的樹(shù)皮分離出來(lái)的2，早期的生產(chǎn)方法需要砍伐兩到四棵完全成熟的樹(shù)才能提供給ー個(gè)患者足夠的劑量3。紫杉醇的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性需要復(fù)雜的化學(xué)合成路線(xiàn)，其需要35-51個(gè)步驟,最高產(chǎn)率為0. 4% 4'5’6。然而,設(shè)計(jì)了半合成路線(xiàn)，其中首先從植物來(lái)源分離出生物合成的中間物巴卡亭III (baccatin III),隨后轉(zhuǎn)化為紫杉醇7。雖然這種方法和隨后基于植物細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)嘗試已減少了砍伐紫杉樹(shù)的需要,但生產(chǎn)仍依賴(lài)于以植物為基礎(chǔ)的過(guò)程8,并伴有生產(chǎn)カ和規(guī)模可擴(kuò)大性方面的限制，以及在尋找更有效藥物過(guò)程中可合成的紫杉醇衍生物數(shù)量方面的限制9''發(fā)明概述代謝工程和合成生物學(xué)的最新進(jìn)展提供了通過(guò)技術(shù)上更適用的微生物宿主來(lái)過(guò)量生產(chǎn)復(fù)雜天然產(chǎn)物的可能性U’2。盡管紫杉中紫杉醇生物合成機(jī)制的解釋已取得令人振奮的進(jìn)展13_16，但商業(yè)上相關(guān)的紫杉醇生產(chǎn)菌株還沒(méi)有過(guò)將該復(fù)雜生物合成機(jī)制轉(zhuǎn)移到微生物宿主中的嘗試17’18。然而，與其他天然產(chǎn)物一祥，通過(guò)代謝工程化菌株進(jìn)行微生物生產(chǎn)為合成多祥化的具有抗癌及其他醫(yī)藥活性的新化合物提供了有吸引力的經(jīng)濟(jì)因素和巨大的潛力19’'紫杉醇及其類(lèi)似物的代謝途徑由大腸桿菌天然的上游類(lèi)異戊ニ烯(isoprenoid)途徑和異源性的F游萜類(lèi)化合物途徑組成(圖6)。上游的甲羥戊酸(MVA)或甲基赤蘚醇磷酸(methylerythritol phosphate, MEP)途徑可產(chǎn)生兩種用于形成紫杉醇和其他類(lèi)異戊ニ烯化合物的常見(jiàn)構(gòu)建塊異戊烯基焦磷酸(isopent.enyl pyrophosphate, IPP)和ニ甲烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate, DMAPP)12。最近的研究強(qiáng)調(diào)了改造上述上游途徑來(lái)支持異源性類(lèi)異戊ニ烯(例如番茄紅素和青蒿酸)的生物合成21_23。F游紫杉ニ烯(taxadiene)途徑已在大腸桿菌中重建，但是,迄今滴度未超過(guò)I. 3mg/L24。
上述推理性代謝工程方法著眼于上游(MVA或MEP)或下游萜類(lèi)化合物途徑，隱含地假設(shè)修飾是加和性的，即線(xiàn)性行為25_27。雖然這種方法可產(chǎn)生通量的適度增長(zhǎng)，但它通常忽略非特異性的影響，如中間代謝物的毒性,用于表達(dá)的載體的細(xì)胞影響，以及可能與主要途徑競(jìng)爭(zhēng)并使通量轉(zhuǎn)移而偏離所需目標(biāo)的隱藏的未知途徑。組合性方法可避免這些問(wèn)題，因?yàn)樗鼈兲峁┝藢?duì)參數(shù)空間適當(dāng)采樣并闡明這些復(fù)雜的非線(xiàn)性相互作用的可能性21'28'29'3°。然而，它們需要高通量篩選，這通常對(duì)許多想要的自然產(chǎn)物而言是不可用的31。而另ー類(lèi)型的途徑優(yōu)化方法已探討了包含目的途徑的不同來(lái)源之異源基因的組合空間32。這些方法仍依賴(lài)高通量的測(cè)定,它們通常忽略了確定各個(gè)途徑基因的最佳表達(dá)水平的需要，并因此已證明在構(gòu)建最佳途徑方面不太有效。
toon] 在本項(xiàng)工作中，作為本發(fā)明方面的ー個(gè)實(shí)例，我們以上游IPP形成途徑與F游紫杉ニ烯合成的萜類(lèi)化合物途徑的最佳平衡為重點(diǎn)。這是通過(guò)將九個(gè)酶的途徑劃歸為兩個(gè)模塊(四個(gè)基因的上游天然MEP途徑模塊,和兩個(gè)基因的下游至紫杉ニ烯的異源途徑)來(lái)實(shí)現(xiàn)的(圖I)。利用該基本結(jié)構(gòu),評(píng)估了參數(shù)(例如質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)細(xì)胞生理學(xué)的影響、表達(dá)盒中的基因順序和啟動(dòng)子強(qiáng)度以及染色體整合)對(duì)紫杉ニ烯生產(chǎn)的影響。這種模塊化和多變量的組合方法使我們能夠有效地對(duì)影響途徑通量的主要參數(shù)進(jìn)行采樣而不需要高通量篩 選。對(duì)每個(gè)途徑模塊的多種啟動(dòng)子和拷貝數(shù)進(jìn)行的多變量檢索顯示出高度非線(xiàn)性的紫杉ニ烯通量概況,最高顯示出紫杉ニ烯產(chǎn)量比對(duì)照增加15000倍,在小規(guī)模發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生300mg/L的紫杉ニ烯產(chǎn)量。此外，我們已在大腸桿菌中設(shè)計(jì)了基于P450的氧化化學(xué)以用于紫杉醇生物合成,用我們的工程化菌株，紫杉ニ烯-5 醇的產(chǎn)量比現(xiàn)有技術(shù)提高了 2400倍。這些改進(jìn)開(kāi)啟了通過(guò)已有的微生物系統(tǒng)大規(guī)模生產(chǎn)數(shù)以千計(jì)的高價(jià)值萜類(lèi)化合物的可能性。本發(fā)明的--些方面涉及這樣的方法，其包括在過(guò)表達(dá)非甲羥戊酸(MEP)途徑中一種或更多種組分的細(xì)胞中重組表達(dá)紫杉ニ烯合酶和物牛兒基物牛兒基ニ磷酸合酶(geranyIgeranI diphosphate synthase, GGPPS)的方法。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)菌細(xì)胞是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞，如芽孢桿菌(Bacillus)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞,如酵母屬(Saccharomyces)細(xì)胞或耶氏酵母(Yarrowia)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是藻類(lèi)細(xì)胞或植物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述紫杉ニ烯合酶是紫杉(Taxus)的酶,如短葉紫杉(Taxusbrevifolia)的酶。在一些實(shí)施方案中，所述GGPPS酶是紫杉的酶,如加拿大紫杉(Taxuscanadenis)的酶。在一些實(shí)施方案中，編碼紫杉ニ烯合酶的基因和/或編碼GGPPS酶的基因和/或編碼MEP途徑中一種或更多種組分的基因是由ー種或更多種質(zhì)粒表達(dá)的。在ー些實(shí)施方案中，編碼紫杉ニ烯合酶的基因和/或編碼GGPPS酶的基因和/或編碼MEP途徑中一種或更多種組分的基因是整合入細(xì)胞基因組中的。在一些實(shí)施方案中,所述非甲羥戊酸(MEP)途徑中的ー種或更多種組分選自dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi、ispA 和 ispB。在某些實(shí)施方案中，dxs、idi、ispD和ispF被過(guò)表達(dá)。例如，dxs、idi、ispD和ispF可在操縱子dxs-idi-idpDF上過(guò)表達(dá)。在^-些實(shí)施方案中，編碼紫杉ニ烯合酶的基因和編碼GGPPS酶的基因在操縱子上一起表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞還表達(dá)紫杉ニ烯5 a -羥化酶(T5 a 0H)或其催化活性部分。在某些實(shí)施方案中，所述T5 a OH酶或其催化活性部分與細(xì)胞色素P450還原酶或其催化活性部分融合。例如，T5 a OH酶可是At24T5 a OH-tTCPR?？梢云胶庾仙讥讼┖厦?、GGPPS酶和MEP途徑中一種或更多種組分的表達(dá)，以使紫杉ニ烯的產(chǎn)量最大化。與本發(fā)明相關(guān)的方法還可包括培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生紫杉ニ烯或紫杉ニ烯-Sa-醇。在一些實(shí)施方案中，至少產(chǎn)生IOmgじ1紫杉ニ烯。在某些實(shí)施方案中，至少產(chǎn)生250mgじ1紫杉ニ烯。在一些實(shí)施方案中，至少產(chǎn)生IOmgじ1紫杉ニ烯_5 a-醇。在某些實(shí)施方案中，至少產(chǎn)生50mgじ1紫杉ニ烯-5a_醇。在一些實(shí)施方案中，紫杉ニ烯向紫杉ニ烯-5 a -醇和副產(chǎn)物5 (12)-氧-3 (U)-環(huán)紫杉烷的轉(zhuǎn)化率是至少50%，至少75%或至少95%。與本發(fā)明相關(guān)的方法還可包括從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收紫杉ニ烯或紫杉ニ烯-5a-醇。在一些實(shí)施方案中，紫杉ニ烯或紫杉ニ烯_5 a -醇是從氣相回收的，而在另ー些實(shí)施方案中，將有機(jī)層加至細(xì)胞培養(yǎng)物中，并從該有機(jī)層回收紫杉ニ烯或紫杉ニ烯-5 a —醇。
本發(fā)明一些方面涉及過(guò)表達(dá)非甲羥戊酸(MEP)途徑中一種或更多種組分并重組表達(dá)紫杉ニ烯合酶和物牛兒基攏牛兒基ニ磷酸合酶(GGPPS)的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)菌細(xì)胞是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞，如芽孢桿菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞，如酵母屬細(xì)胞或耶氏酵母屬細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中,所述細(xì)胞是藻類(lèi)細(xì)胞或植物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，紫杉ニ烯合酶是紫杉酶,如短葉紫杉酶。在一些實(shí)施方案中，GGPPS酶是紫杉酶，如加拿大紫杉酶。在一些實(shí)施方案中，編碼紫杉ニ烯合酶的基因和/或編碼GGPPS酶的基因和/或編碼MEP途徑的一種或更多種組分的基因是由ー種或更多種質(zhì)粒表達(dá)的。在'^-些實(shí)施方案中，編碼紫杉ニ烯合酶的基因和/或編碼GGPPS酶的基因和/或編碼MEP途徑的一種或更多種組分的基因是整合入細(xì)胞基因組中的。在一些實(shí)施方案中，所述非甲羥戊酸(MEP)途徑的一種或更多種組分選自dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi、ispA 和 IspB0 在某些實(shí)施方案中，dxs、idi、ispD和ispF被過(guò)表達(dá)。例如，dxs、idi、ispD和ispF可在操縱子dxs-idi-idpDF上過(guò)表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，編碼紫杉ニ烯合酶的基因和編碼GGPPS酶的基因是在操縱子上一起表達(dá)的。在一些實(shí)施方案中,可以平衡紫杉ニ烯合酶、GGPPS酶和MEP途徑的一種或更多種組分的表達(dá)以使紫杉ニ烯的產(chǎn)量最大化。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞還表達(dá)紫杉ニ烯5 a -輕化酶(T5 a 0H)或其催化活性部分。在某些實(shí)施方案中，T5 a OH酶或其催化活性部分與細(xì)胞色素P450還原酶或其催化活性部分融合。例如，T5 a OII酶可以是At24T5 a OIFtTCPR0在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞產(chǎn)生紫杉ニ烯和/或紫杉ニ烯-5 a -醇。本發(fā)明的一些方面涉及選擇表現(xiàn)出提高的萜類(lèi)化合物生產(chǎn)的細(xì)胞的方法,其包括產(chǎn)生或獲得過(guò)表達(dá)非甲羥戊酸(MEP)途徑中一種或更多種組分的細(xì)胞,從所述細(xì)胞產(chǎn)生萜類(lèi)化合物，將所述細(xì)胞的萜類(lèi)化合物產(chǎn)量與對(duì)照細(xì)胞的萜類(lèi)化合物產(chǎn)量進(jìn)行比絞，以及選擇第一改進(jìn)細(xì)胞,其比對(duì)照細(xì)胞產(chǎn)生更高量的萜類(lèi)化合物,其中比對(duì)照細(xì)胞產(chǎn)生更高量萜類(lèi)化合物的第一改進(jìn)細(xì)胞是表現(xiàn)出提高的萜類(lèi)化合物生產(chǎn)的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞重組表達(dá)貓合酶(terpenoid synthase)和/或物牛兒基櫳牛兒基ニ磷酸合酶(GGPPS)。方法還可包括在第一改進(jìn)細(xì)胞中改變非甲羥戊酸(MEP)途徑中-一種或更多種組分、萜合酶和/或櫳牛兒基櫳牛兒基ニ磷酸合酶(GGPPS)的表達(dá)水平，以產(chǎn)生第二改進(jìn)細(xì)胞，且將第二改進(jìn)細(xì)胞的萜類(lèi)化合物產(chǎn)量與第一改進(jìn)細(xì)胞的萜類(lèi)化合物產(chǎn)量進(jìn)行比較,其中比第一改進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生更高量萜類(lèi)化合物的第二改進(jìn)的細(xì)胞是表現(xiàn)出提高的萜類(lèi)化合物生產(chǎn)的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述萜類(lèi)化合物合酶是紫杉ニ烯合酶。所述細(xì)胞還可重組表達(dá)與本發(fā)明相關(guān)的任何多肽。本發(fā)明的ー些方面涉及分離的多肽,其包含與細(xì)胞色素P450還原酶或其催化活性部分融合的紫杉ニ烯5 a -羥化酶(T5 a 0H)或其催化活性部分。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞色素P450還原酶是紫杉的細(xì)胞色素P450還原酶(TCPR)。在某些實(shí)施方案中，紫杉ニ烯5 a-羥化酶和TCPR通過(guò)接頭連接,例如GSTGS (SEQ ID NO :50)。在一些實(shí)施方案中，紫杉ニ烯5 a -羥化酶和/或TCPR被截短以去除全部或部分跨膜區(qū)。在某些實(shí)施方案中，紫杉ニ烯5 a -羥化酶N-端的8、24或42個(gè)氨基酸被截短。在某些實(shí)施方案中，TCPR的74個(gè)氨基酸被截短。在一些實(shí)施方案中，還將其他肽與紫杉ニ烯Sa-羥化酶融合。在某些實(shí)施方案中，所述其他肽來(lái)自牛17 a羥化酶。在某些實(shí)施方案中，所述肽是MALLLAYF(SEQ IDNO :51)。在某些實(shí)施方案中，所述分離的多肽是At.24T5 a OH-tTCPR。本發(fā)明的方面還包括 編碼與本發(fā)明相關(guān)的任何多肽的核酸分子和重組表達(dá)與本發(fā)明相關(guān)的任何多肽的細(xì)胞。本發(fā)明的ー些方面涉及在產(chǎn)生ー種或更多種萜類(lèi)化合物的細(xì)胞中提高萜類(lèi)化合物生產(chǎn)的方法。所述方法包括控制細(xì)胞中或細(xì)胞培養(yǎng)物中的吲哚積累，從而提高細(xì)胞中萜類(lèi)化合物的生產(chǎn)。本文所述的任何細(xì)胞均可用于該方法，包括細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞；革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞,如芽孢桿菌細(xì)胞；酵母細(xì)胞，如酵母屬細(xì)胞或耶氏酵母屬細(xì)胞；藻類(lèi)細(xì)胞；植物細(xì)胞；以及本文所述的任何工程化細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，控制細(xì)胞中或細(xì)胞培養(yǎng)物中吲哚積累的步驟包括使上游非甲羥戊酸類(lèi)異戊ニ烯途徑與下游產(chǎn)物合成途徑相平衡和/或改變或調(diào)節(jié)吲哚途徑。在另ー些實(shí)施方案中，控制細(xì)胞中或細(xì)胞培養(yǎng)物中吲哚積累的步驟包括或還包括通過(guò)化學(xué)方法從發(fā)酵中除去積累的吲哚，例如用吸附劑或清除劑。由細(xì)胞或在培養(yǎng)物中產(chǎn)生的一種或更多種萜類(lèi)化合物可以是單萜、倍半萜、ニ萜、三萜或四萜。在某些實(shí)施方案中，所述萜類(lèi)化合物是紫杉ニ烯或任何紫杉醇前體。本發(fā)明方面涉及包括在產(chǎn)生ー種或更多種萜類(lèi)化合物的細(xì)胞中或在產(chǎn)生ー種或更多種萜類(lèi)化合物的細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)量吲哚的量或濃度的方法。所述方法可包括兩次或更多次測(cè)量吲哚的量或濃度。在一些實(shí)施方案中,測(cè)得的吲哚量或濃度用于指導(dǎo)生產(chǎn)一種或更多種萜類(lèi)化合物的過(guò)程。在一些實(shí)施方案中，測(cè)得的吲哚量或濃度用于指導(dǎo)菌株構(gòu)建。參考附圖和對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明,本發(fā)明的這些和其他方面及其各種實(shí)施方案將會(huì)更清楚。


附圖并不是按比例繪制。在附圖中，多個(gè)圖中相同的或幾乎相同的組分由相似的數(shù)字代表。為了清楚起見(jiàn),沒(méi)有在每幅附圖中標(biāo)出每個(gè)組分。在附圖中圖I.多變量模塊化類(lèi)異戊ニ烯途徑工程揭示了在萜類(lèi)化合物積累中的強(qiáng)非線(xiàn)性反應(yīng)。為了增加通過(guò)上游MEP途徑的通量，我們以報(bào)道的瓶頸酶促步驟(dxs, idi, ispD和ispF)為靶標(biāo)來(lái)通過(guò)操縱子(dxs-idi-ispDF)進(jìn)行過(guò)表達(dá)。28為了從通用類(lèi)異戊ニ烯前體(IPP和DMAPP)向紫杉醇生物合成輸送過(guò)量的通量,構(gòu)建了下游基因GGPP合酶(G)和紫杉ニ烯合酶(T)16的合成操縱子。上游類(lèi)異戊ニ烯和下游紫杉ニ烯合成途徑置于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下以控制其相對(duì)基因表達(dá)。(a)兩個(gè)模塊的示意圖,天然上游MEP類(lèi)異戊ニ烯途徑(左)和合成的紫杉ニ烯途徑(右)。在大腸桿菌中的生物合成網(wǎng)絡(luò)中,MEP類(lèi)異戊ニ烯途徑是由來(lái)自糖酵解的前體甘油醛-3磷酸(G3P)與丙酮酸(PYR)的縮合開(kāi)始的。紫杉醇途徑分支從通用類(lèi)異戊ニ烯前體IPP和DMAPP開(kāi)始,首先形成“直鏈”前體物牛兒基物牛兒基ニ磷酸，接著是“環(huán)狀”紫杉ニ烯——確定的和關(guān)鍵的紫杉醇中間體。環(huán)烯烴紫杉ニ烯經(jīng)過(guò)多輪的立體特異性氧化,?；?與側(cè)鏈組分苯酰化,最終形成紫杉醇。(b)用于對(duì)來(lái)自上游和下游途徑工程化細(xì)胞的萜類(lèi)化合物積累的非線(xiàn)性反應(yīng)的多變量模塊化類(lèi)異戊ニ烯途徑エ程策略的示意圖。上游和下游途徑的表達(dá)通過(guò)改變啟動(dòng)子強(qiáng)度(Trc，T5和T7)或用不同質(zhì)粒提高拷貝數(shù)來(lái)調(diào)節(jié)。上游和下游途徑表達(dá)的變化產(chǎn)生不同的紫杉ニ烯最高積累。
圖2.通過(guò)調(diào)節(jié)上游和下游模塊途徑的表達(dá)來(lái)優(yōu)化紫杉ニ烯生產(chǎn)。(a)紫杉ニ烯積累對(duì)上游途徑強(qiáng)度增加而下游途徑恒定值的反應(yīng)。(b)下游途徑對(duì)上游途徑強(qiáng)度恒定增加的依賴(lài)性。觀察到的多個(gè)紫杉ニ烯反應(yīng)局部最大值取決于—ヒ游或下游途徑表達(dá)強(qiáng)度的増加。(c)來(lái)自改造成具有高上游途徑過(guò)表達(dá)(20-100)和兩種不同下游表達(dá)( 30和 60)的工程化菌株(17-24)的紫杉ニ烯反應(yīng)，以鑒定具有平衡表達(dá)的紫杉ニ烯反應(yīng)。用來(lái)自低拷貝質(zhì)粒(P5和P10)的強(qiáng)啟動(dòng)T7TG操縱子控制下的下游途徑表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)這些表達(dá)。需要注意的是，從不同質(zhì)粒用不同啟動(dòng)子表達(dá)____ヒ游和下游兩個(gè)途徑可導(dǎo)致質(zhì)粒帶來(lái)的代謝負(fù)擔(dān)。(d)用増加來(lái)自染色體的啟動(dòng)子強(qiáng)度和兩個(gè)不同的下游表達(dá)( 30和 60)來(lái)調(diào)節(jié)上游途徑，以鑒定具有減少的毒副作用(菌株25-32)的錯(cuò)過(guò)的搜索空間。(e)紫杉ニ烯產(chǎn)生菌株的遺傳細(xì)節(jié)。對(duì)應(yīng)于不同菌株及其相應(yīng)基因型的數(shù)字，E :大腸桿菌K12mG1655 A recA A endA, EDE3 :大腸桿菌 K12mG1655 A recA A endA,在染色體中具有 T7RNA聚合酶DE3構(gòu)建體，MEP :dxs-idi-ispDF操縱子,GT =GPPS-TS操縱子，TG =TS-GPPS操縱子，Chl :染色體中ー個(gè)拷貝，Trc =Trc啟動(dòng)子，T5 T5啟動(dòng)子，T7 T7啟動(dòng)子，p5、pl()、p20 5(SC101), 10(pl5)和 20(pBR322)個(gè)拷貝的質(zhì)粒。圖3.代謝物與紫杉ニ烯生產(chǎn)呈負(fù)相關(guān)。(a)檢測(cè)到代謝物的質(zhì)譜與圖2的菌株構(gòu)建體中紫杉ニ烯生產(chǎn)呈負(fù)相關(guān)。觀察到的代謝物特征峰是233, 207,178,117,89和62。(b)圖3a類(lèi)異戊ニ烯副產(chǎn)物與紫杉ニ烯的相關(guān)性。選擇菌株26-29和30-32 (均有染色體整合的上游途徑表達(dá))來(lái)進(jìn)行一致性比較。在菌株26-29和30-32中，通過(guò)將啟動(dòng)子由Trc分別變?yōu)門(mén)5和17來(lái)提高上游表達(dá)。這兩組菌株僅在F游途徑的表達(dá)上有不同，其中第二組(30-32)的表達(dá)水平是第一組的兩倍。對(duì)第一組,菌種26實(shí)現(xiàn)了最佳平衡,其使用Trc啟動(dòng)子來(lái)表達(dá)上游途徑,而且也顯示了最低的代謝物積累。對(duì)菌株30-32,菌株31顯示了最低的代謝物積累和最高的紫杉ニ烯產(chǎn)量。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了未知代謝物與紫杉ニ烯生產(chǎn)之間觀察到的負(fù)相關(guān)。圖4.工程化菌株中上游和下游途徑的轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)水平和細(xì)胞生理變化。通過(guò)qPCR定量上游(DXS)和下游(TS)途徑操縱子中第一組基因的相對(duì)表達(dá)。操縱子下游途徑的基因也觀察到了類(lèi)似的表達(dá)譜。圖中顯示了相應(yīng)的菌株號(hào)。(a)在兩種不同下游表達(dá)下，使用啟動(dòng)子和質(zhì)粒調(diào)節(jié)不同上游表達(dá)，從而定量DXS基因表達(dá)的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。(b)在不同的上游表達(dá)下，使用P5T7和P10T7質(zhì)粒來(lái)調(diào)節(jié)兩種不同的下游表達(dá)，從而定量TS基因表達(dá)的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。我們的基因表達(dá)分析直接支持了該假說(shuō),隨著質(zhì)?？截悢?shù)(5,10和20)和啟動(dòng)子強(qiáng)度(Trc,T5和H)的増加,可調(diào)節(jié)上游和下游途徑的表達(dá)。(c)工程化菌株25-29的細(xì)胞生長(zhǎng)。類(lèi)異戊ニ烯代謝的活化(菌株26)、重組蛋白質(zhì)的表達(dá)(菌株25)和質(zhì)粒帶來(lái)的代謝負(fù)擔(dān)(對(duì)照與工程化菌株相比)影響了生長(zhǎng)表型。以及(d)菌株17、22、25-32的生長(zhǎng)表型。黑 色線(xiàn)是生產(chǎn)紫杉ニ烯的工程化菌株,而灰色線(xiàn)是沒(méi)有下游表達(dá)的對(duì)照菌株，攜帯具有啟動(dòng)子和多克隆位點(diǎn)的空質(zhì)粒。生長(zhǎng)與萜類(lèi)化合物代謝的活化、質(zhì)粒帶來(lái)的代謝負(fù)擔(dān)以及重組蛋白質(zhì)的表達(dá)相關(guān)。圖5.大腸桿菌中紫杉醇p450氧化化學(xué)的改造。(a)紫杉ニ烯轉(zhuǎn)化至紫杉ニ烯5a-醇至紫杉醇的示意圖。(b)跨膜工程和來(lái)自紫杉ニ烯5a-醇羥化酶(T5 a 0H)和紫杉細(xì)胞色素P450還原酶(TCPR)的單組分嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)建。I和2表示T5 a OH和TCPR的全長(zhǎng)蛋白，其鑒定為分別具有42和74個(gè)氨基酸的TM區(qū)。3-嵌合體酶,其產(chǎn)生自三種不同TM改造的T5 a OH構(gòu)建體，(通過(guò)將8殘基合成肽(A)融合至8、24和42個(gè)氨基酸截短的T5 a OH而構(gòu)建的At8T5 a OH、At24T5 a OH和At42T5 a OH)通過(guò)用5殘基的GSTGS接頭肽而與74AA截短的TCPR(tTCPR)進(jìn)行翻譯融合。(c)轉(zhuǎn)化到紫杉ニ烯生產(chǎn)菌株18中的At8T5 a Oil-tTCPR、At24T5 a OIFtTCPR 和 At42T5 a OIFtTCPR 構(gòu)建體的功能活性。(d)在 IL生物反應(yīng)器發(fā)酵的菌株18-At24T5a0H-tTCPR的紫杉ニ烯5 a -醇積累時(shí)間過(guò)程譜和生長(zhǎng)レ曰。圖6.在大腸桿菌中生產(chǎn)紫杉醇的生物合成方案。兩個(gè)模塊的原理圖，天然的上游類(lèi)異戊ニ烯途徑(左)和合成的紫杉醇途徑(右)。在大腸桿菌生物合成網(wǎng)絡(luò)中,MEP類(lèi)異戊ニ烯途徑的分支起始自來(lái)自糖酵解(I-V)的前體甘油醛三磷酸(G3P)和丙酮酸(PYR)。紫杉醇途徑的分支從大腸桿菌類(lèi)異戊ニ烯前體IPP和DMAPP開(kāi)始,至“直鏈”前體櫳牛兒基櫳牛兒基ニ磷酸(VIII)環(huán)狀”紫杉ニ烯(IX)氧化的”紫杉ニ烯5 a -醇⑴，至多輪的立體特異性氧化，?；?苯甲?；驮缙谇绑w巴卡亭III (XII)的環(huán)氧化作用，并最終與側(cè)鏈組裝成紫杉醇(XII I)。DXP :ト脫氧-D-木酮糖-5-磷酸,MEP :2C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸,CDP-ME :4_ニ磷酸胞苷-2C甲基-D-赤蘚糖醇,CDP-MEP :4_ニ磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚糖醇-2-磷酸，ME-cPP 2C-甲基-D-赤蘚糖醇-2,4-環(huán)ニ磷酸，IPP :異戊烯基ニ磷酸，DMAPP :ニ甲基烯丙基ニ磷酸。從G3P和PYR至紫杉醇的生物合成途徑中涉及的基因。DXS 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶,ispC :1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶,IspD :4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚糖醇合酶，IspE :4_ ニ磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶，IspF 2C-甲基-D-赤蘚糖醇-2,4-環(huán)ニ磷酸合酶,IspG :1_輕基-2-甲基-2_(E)_—]烯基-4- ニ磷酸合酶,IspII :4-羥基-3-甲基-2- (E) - 丁烯基-4- ニ磷酸還原酶,IDI :異戊烯基ニ磷酸異構(gòu)酶，GGPPS :櫳牛兒基櫳牛兒基ニ磷酸合酶，紫杉ニ烯合酶，紫杉烷5 a -羥化酶,紫杉烷5 a -0-乙酰轉(zhuǎn)移酶,紫杉烷13 a -羥化酶,紫杉烷10ト羥化酶,紫杉烷2 a -羥化酶，紫杉烷2-0-苯甲?；D(zhuǎn)移酶，紫杉烷7 ^ -羥化酶，紫杉烷10-0-こ酰轉(zhuǎn)移酶，紫杉烷I運(yùn)-羥化酶士，紫杉焼9 a -羥化酶,紫杉烷9-酮-氧化酶*，紫杉烷C4，C20- 0 -環(huán)氧化酶* ,苯丙氨酸氨基變位酶，側(cè)鏈CoA-連接酶*，紫杉烷13-0-苯基丙酰基轉(zhuǎn)移酶,紫杉烷2’ -羥化酶紫杉烷:V -N-苯?；D(zhuǎn)移酶。216’219 *標(biāo)記的基因尚未被鑒定或表征。圖7.來(lái)自模塊途徑表達(dá)搜索的紫杉ニ烯生產(chǎn)的改善倍數(shù)。(a)與菌株I相比,在圖2a，b和c中所有觀察到的紫杉ニ烯反應(yīng)最大值的改善倍數(shù)。兩個(gè)最高的最大值(菌株17和26)之間相差2. 5倍,而與最低值相差23倍(菌株26和10),表明最佳反應(yīng)的缺失導(dǎo)致滴度顯著降低。圖8.代謝物(a)紫杉ニ烯與代謝物積累之間的相關(guān)性。來(lái)自基因工程化菌株的代謝物積累與紫杉ニ烯生產(chǎn)是以指數(shù)的方式成反比的。該相關(guān)性的相關(guān)系數(shù)為().92。(b)來(lái)自菌株26-28的代表性GC譜,證明紫杉ニ烯和代謝物積累的變化。色譜圖中的數(shù)字I和2分別對(duì)應(yīng)于代謝物和紫杉ニ烯峰。(c)代謝物(I)和紫杉ニ烯(2)各自的GC-MS譜。觀察到的代謝物特征峰是233、207、178、117、89和62。紫杉-4(20), 11，12- ニ烯的特征離子m/z 272 (P+)，257 (P+-CH3)，229 (P.-C3H7) -,121,122,123 (C-環(huán)片段簇)。60 星號(hào)標(biāo)記的峰是內(nèi)標(biāo)物石竹烯。圖9.菌株26中改造的人工嵌合體酶的GC-MS譜和紫杉ニ烯/紫杉ニ烯_5 a -醇生產(chǎn)。(a)三個(gè)構(gòu)建體(A-At8T5 a OIFtTCPR, t24T5 a OIFtTCPR 和 At42T5 a OIFtTCPR)轉(zhuǎn)化至菌株26并發(fā)酵5天的己烷乙醚(8 : 2)提取物的GC譜。峰中的1、2和3號(hào)標(biāo)記分別對(duì)應(yīng)于紫杉ニ烯,紫杉ニ烯-5a-醇和5(12)-氧-3(11)-環(huán)紫杉烷(OCT)。(b)在三種菌株中定量的紫杉_4 (20)，11，12- ニ烯-5 a -醇和OCT的產(chǎn)量。(c)和(d)紫杉_4 (20)， 11,12- ニ烯-5 a -醇和OCT的GC-MS譜，并且就對(duì)應(yīng)于片段化的峰與可信標(biāo)準(zhǔn)品和之前報(bào)告的42’47進(jìn)行比較比較。GC-MS分析證實(shí)了質(zhì)樸身份是紫杉-4 (20), 1.1,12- ニ烯-5 a -醇，其特征離子 m/z 288 (P+), 273 (P+-H2O), 255 (P+-H2O-CH3)。圖10展現(xiàn)了描述萜類(lèi)化合物生物合成途徑和由該途徑產(chǎn)生的天然產(chǎn)物的示意圖。圖1.1展現(xiàn)了描述為擴(kuò)大紫杉ニ烯生產(chǎn)而調(diào)節(jié)上游途徑的示意圖。圖12展現(xiàn)了描述為擴(kuò)大紫杉ニ烯生產(chǎn)而調(diào)節(jié)下游途徑的示意圖。圖13展現(xiàn)了表明新發(fā)現(xiàn)的途徑分支不是F游合成途徑之特征的示意圖。圖14.途徑強(qiáng)度與轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)水平相關(guān)。(C)使用逐漸增加的上游途徑強(qiáng)度和31任意單位(arbitrary unit)的下游強(qiáng)度，idi、ispl)和ispF基因的相對(duì)表達(dá),和(d)使用逐漸增加的上游途徑強(qiáng)度和61任意単位的下游強(qiáng)度，idi, ispD和ispF基因的相對(duì)表達(dá)。正如預(yù)期的，基因表達(dá)隨著上游途徑強(qiáng)度的増加而增加。條形圖中顯示了相應(yīng)的菌株號(hào)。用看家基因rrsA的表達(dá)來(lái)定量相對(duì)表達(dá)。數(shù)據(jù)是四次重復(fù)的平均值+/-SD。圖15.代謝副產(chǎn)物吲哚的積累對(duì)紫杉ニ烯生產(chǎn)和生長(zhǎng)的影響。(a)紫杉ニ烯和吲哚之間的負(fù)相關(guān)。選擇菌株26-28以及30-32(均有染色體整合的上游途徑表達(dá))來(lái)進(jìn)行一致性比絞。這兩組菌株僅在下游途徑的表達(dá)____ヒ有不同，其中第二組(30-32)的表達(dá)水平是第一組的兩倍。在菌株26-28和30-32中，通過(guò)將啟動(dòng)子由Trc分別變?yōu)門(mén)5和17來(lái)増加上游表達(dá)。對(duì)第一組，菌種26達(dá)到最佳平衡,其使用Trc啟動(dòng)子來(lái)表達(dá)上游途徑,而且也顯示了最低的吲哚積累。對(duì)菌株30-32,菌株31顯示了最低的吲哚積累和最高的紫杉ニ烯生產(chǎn)。對(duì)于這兩組菌株，改善倍數(shù)是分別相對(duì)于菌株25和29而言的。(b)對(duì)于高產(chǎn)菌株26,外部加入吲哚對(duì)紫杉ニ烯生產(chǎn)的影響。不同濃度的吲哚被加入到在含有0. 5%酵母提取物的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物中。隨著吲哚濃度從50mg/L增加至100mg/L,紫杉ニ烯的生產(chǎn)顯著減少。(c)對(duì)大腸桿菌工程化菌株,外部加人吲哚對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。數(shù)據(jù)是三次重復(fù)的平均值+/-SD。選擇缺少下游途徑和有不同強(qiáng)度....ヒ游途徑(1,2，6,21，40和100)的菌株。菌株26 (局紫杉_■稀廣生菌)顯不了最強(qiáng)的抑制作用。
圖16.未知代謝物被鑒定為吲哚。(A)和(a)用己烷從細(xì)胞培養(yǎng)物中提取的未知代謝物的氣相色譜和質(zhì)譜。(B)和(b)對(duì)應(yīng)于溶解于己烷的純吲哚的氣相色譜和質(zhì)譜。另夕卜，為確認(rèn)化學(xué)身份，用己烷從發(fā)酵液中提取代謝物，并使用正己烷乙酸乙酯(8 2)作為洗脫劑的硅膠柱層析法純化。用TlX和GC-MS證實(shí)該化合物的純度。1HNMR和13CNMR譜證實(shí)了該代謝物的化學(xué)身份是吲哚。(c)從細(xì)胞培養(yǎng)物中提取的吲哚的1HNMR譜(CDC13,400MHz) 8 6. 56(d,1H, Ar C-H), 7. 16(m,3H, Ar C-H),7. 38(d,1H, Ar C-H),7. 66(d,1H,Ar C-II)，8.05(b，lH,吲哚 Nil)。(d) 13CNMR 6 :135. 7,127. 8，124. 2,122,120. 7，119. 8, 111,102. 6。(e)是純吲哚的1HNMR譜。圖17. IL生物反應(yīng)器中工程化菌株的補(bǔ)料分批培養(yǎng)。對(duì)于菌株22、17和26,在控制PH值和氧氣條件的IL生物反應(yīng)器中，用基本培養(yǎng)基和0. 5%酵母提取物進(jìn)行補(bǔ)料分批生物反應(yīng)器培養(yǎng)5天，紫杉ニ烯積累(a)，細(xì)胞生長(zhǎng)(b)，こ酸積累(c)和總底物(甘油)添加(d)的時(shí)間進(jìn)程。在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵罐中的甘油消耗至 0.5-lg/L之后向生物反應(yīng)器中加人3g/L的甘油。數(shù)據(jù)是生物反應(yīng)器兩次重復(fù)的平均值。發(fā)明詳述 紫杉醇是強(qiáng)效的抗癌藥物,其最先作為天然產(chǎn)物從短葉紫杉太平洋紫杉樹(shù)中分離出來(lái)。然而,通過(guò)傳統(tǒng)方法從植物提取物中可靠且具有成本效益地生產(chǎn)紫杉醇或紫杉醇類(lèi)似物是有限的。在這里，我們報(bào)告一種代謝途徑工程的多變量模塊化方法，將紫杉ニ烯產(chǎn)量在大腸桿菌工程菌中擴(kuò)大 15000倍。紫杉ニ烯(第一個(gè)確定的紫杉醇中間體)是非甲羥戊酸途徑的生物合成產(chǎn)物，該途徑在大腸桿菌中包括兩個(gè)模塊形成異戊烯基焦磷酸(IPP)的天然上游途徑，和異源性的下游萜類(lèi)化合物形成途徑。系統(tǒng)性多變量搜索鑒定出了最大限度地平衡兩個(gè)途徑模塊以盡量減少抑制性中間體的積累和通量轉(zhuǎn)向至副產(chǎn)物的條件。我們還設(shè)計(jì)了在紫杉醇生物合成中紫杉ニ烯之后的下一歩，基于P450的氧化步驟，其獲得了 >98%的底物轉(zhuǎn)化,并提出了在大腸桿菌中生產(chǎn)任何功能性紫杉醇中間體的第一個(gè)實(shí)例。該模塊化途徑工程方法不僅突出了多步驟途徑的復(fù)雜性,也使小規(guī)模發(fā)酵中高滴度紫杉ニ烯和紫杉ニ烯_5 a -醇(分別為 300mg/L和60mg/L)的積累成為可能,從而為微生物生產(chǎn)紫杉醇及其衍生物的潛力提供了示范。本發(fā)明的應(yīng)用不僅限于其在如下描述或附圖中所描述的構(gòu)建細(xì)節(jié)和組分的排列。本發(fā)明能用于其他實(shí)施方案,井能以各種方式實(shí)施或進(jìn)行。此外，本文所用的用語(yǔ)和術(shù)語(yǔ)目的是描述而不應(yīng)被視為限制。本文使用的“包括”、“包含”或“有” “含有”、“涉及”及其變體是指包含其后所列項(xiàng)目及其等同方案以及其他項(xiàng)目。本文展示了萜類(lèi)化合物如紫杉ニ烯的微生物生產(chǎn)。當(dāng)以令人滿(mǎn)意的水平表達(dá)時(shí)，微生物路線(xiàn)大幅減少了這種化合物的生產(chǎn)成本。此外,它們利用廉價(jià)、豐富并可再生的原料(如糖和其他碳水化合物)，并可作為合成眾多可有遠(yuǎn)優(yōu)于原始化合物之特性的衍生物的來(lái)源。使用微生物路線(xiàn)生產(chǎn)類(lèi)異戊ニ烯途徑化合物的成本競(jìng)爭(zhēng)カ的關(guān)鍵因素是增強(qiáng)這ー途徑，以便使這些分子過(guò)量生產(chǎn)。本文所述的方法是增強(qiáng)或擴(kuò)大大腸桿菌(E. coli)中通向萜類(lèi)化合物的通量。具體地,提供了增強(qiáng)通向合成以下化合物的代謝通量的方法異戊烯基焦磷酸(IPP)(生產(chǎn)類(lèi)異戊ニ烯化合物的關(guān)鍵中間體)、ニ甲基烯丙基ニ磷酸(DMAPP)、物牛兒基ニ磷酸(GPP)、法呢基ニ磷酸(FPP)、 牛兒基 牛兒基ニ磷酸(GGPP)和法呢基物牛兒基ニ磷酸(FGPP)、紫杉醇(泰素)、銀杏內(nèi)酷、櫳牛兒醇、法呢醇、櫳牛兒基櫳牛兒醇、沉香醇、異戊ニ烯、單萜如薄荷醇、類(lèi)胡蘿卜素如番茄紅素、聚類(lèi)異戊ニ烯如聚異戊ニ烯或天然橡膠、ニ疏如eleutherobin以及倍半砲如青蒿素。本發(fā)明的ー些方面涉及萜類(lèi)化合物的生產(chǎn)。本文所用的萜類(lèi)化合物(也稱(chēng)為類(lèi)異戊ニ烯)是衍生自五碳異戊ニ烯單元的有機(jī)化學(xué)品。萜類(lèi)化合物的ー些非限定性實(shí)施例(根據(jù)它們所含的異戊ニ烯單元的數(shù)目分類(lèi))包括半萜(I個(gè)異戊ニ烯單元)、單萜(2個(gè)異戊ニ烯單元)、倍半萜(3個(gè)異戊ニ烯單元)、ニ萜(4個(gè)異戊ニ烯單元)、二倍半萜(5個(gè)異戊ニ烯單元)、三萜(6個(gè)異戊ニ烯單元)、四萜(8個(gè)異戊ニ烯單元)和具有更大數(shù)目異戊ニ烯單元的多萜。在一些實(shí)施方案中,產(chǎn)生的萜類(lèi)化合物是紫杉ニ烯。在ー些實(shí)施方案中，產(chǎn)生的職類(lèi)化合物是香茅醇、蓽澄爺醇(cubebol)、諾卡酮、桉樹(shù)腦(cineol)、朽1 樣烯、eleutherobin、匍枝珊瑚醇(Sarcodictyin)、偽藏素(Pseudopterosin)、銀杏內(nèi)酷、甜菊苷、舌甘葉菊,A (Rebaudioside A)、香紫蘇醇、Iabdenediol、左旋海松ニ烯、sandracopimaradiene 或 isopemaradiene。
本文描述了通過(guò)控制參與上游途徑和下游途徑的基因或蛋白質(zhì)表達(dá)而優(yōu)化細(xì)胞中萜類(lèi)化合物生產(chǎn)的方法和組合物?！矣瓮緩缴婕吧a(chǎn)異戊基焦磷酸(IPP)和ニ甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP),其可通過(guò)兩種不同的代謝途徑實(shí)現(xiàn)甲羥戊酸(MVA)途徑和MEP (2-C-甲基-D-赤蘚糖醇4-磷酸)途徑，也被稱(chēng)為MEP/D0XP(2-C-甲基-D-赤蘚糖醇4-磷酸/I-脫氧-D-木酮糖5-磷酸)途徑、非甲羥戊酸途徑或甲羥戊酸非依賴(lài)途徑。下游途徑是合成途徑,導(dǎo)致萜類(lèi)化合物生產(chǎn)，并涉及萜類(lèi)化合物合酶(也被稱(chēng)為萜環(huán)化酶)和櫳牛兒基物牛兒基ニ磷酸合酶(GGPPS)的重組基因表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，職類(lèi)化合物合酶是ニ職合酶。ニI 合酶的若干非限定性實(shí)施例包括蓖麻烯(casbene)合酶、紫杉ニ烯合酶、左旋海松ニ烯合酶、冷杉ニ烯(abietadiene)合酶、異海松ニ烯合酶、ent-焦磷酸古巴酷(ent-copalyl diphosphate)合酶、syn-stemar-13-ene 合酶、syn-stemod-13 (17) -ene 合酶、syn-pimara-7,15-diene 合酶、ent-隱海松 ニ 烯合酶、ent-cassa-12，15-diene 合 _、ent-pimara-8 (14), 15-diene 合酶、ent-Kaur-15-ene 合酶、ent-kaur-16-ene 合酶、aphidicolan-16 f3 _ol 合酶、phyllocladan-16 a -ol 合酶、fusicocca-2,10(14) -diene 合酶，以及 t.erpentet.riene 環(huán)化酶。出人意料地,如在實(shí)施例部分所示，通過(guò)如本文所述操作上游和下游途徑而對(duì)萜類(lèi)化合物合成的優(yōu)化并不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性或加和過(guò)程。相反,通過(guò)復(fù)雜的組合分析,通過(guò)平衡上游和下游途徑的組分而完成了優(yōu)化。出人意料地,如圖I和2所示,紫杉ニ烯的積累對(duì)上游MEP和下游合成紫杉ニ烯途徑的相對(duì)強(qiáng)度表現(xiàn)出強(qiáng)非線(xiàn)性依賴(lài)性。本發(fā)明的ー些方面涉及控制MEP途徑中基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)以?xún)?yōu)化萜類(lèi)化合物如紫杉ニ烯的生產(chǎn)。優(yōu)化的萜類(lèi)化合物生產(chǎn)是指在采用優(yōu)化策略后產(chǎn)生了比沒(méi)有此種策略時(shí)量更高的萜類(lèi)化合物。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，本文所述的方法和組合物包括MEP途徑中的任何基因和/或蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，MEP途徑中的基因是下列之一 dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi、ispA或ispB。MEP途徑中的ー個(gè)或更多個(gè)基因和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)可被上調(diào)和/或下調(diào)。在某些實(shí)施方案中，MEP途徑中ー個(gè)或更多個(gè)基因和/或蛋白質(zhì)的上調(diào)可與MEP途徑中'"一個(gè)或更多個(gè)基因和/或蛋白質(zhì)的下調(diào)相結(jié)合。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到,基因和/或蛋白質(zhì)可單獨(dú)調(diào)節(jié)或聯(lián)合調(diào)節(jié)。例如，dxs的表達(dá)可被單獨(dú)上調(diào)或下調(diào)，或者與ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi、ispA和ispB中的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)結(jié)合上調(diào)或下調(diào)。ispC的表達(dá)可單獨(dú)上調(diào)或下調(diào)，或者與dxs、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi、ispA和ispB中的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)結(jié)合.....ヒ調(diào)或F調(diào)。ispD的表達(dá)可單獨(dú)上調(diào)或下調(diào)，或者與dxs、ispC、ispE、ispF、ispG、ispH、idi、ispA和ispB中的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)結(jié)合上調(diào)或下調(diào)。ispE的表達(dá)可單獨(dú)上調(diào)或下調(diào),或者與dxs、ispC、ispD、ispF、ispG、ispH、idi、ispA和ispB中的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)結(jié)合上調(diào)或下調(diào)。ispF的表達(dá)可單獨(dú)上調(diào)或下調(diào)，或者與dxs、ispC、ispD、ispE、ispG、ispH、idi、ispA和ispB中的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)結(jié)合上調(diào)或下調(diào)。ispG的表達(dá)可單獨(dú)上調(diào)或下調(diào)，或者與dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispH、idi、ispA和ispB中的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)結(jié)合上調(diào)或下調(diào)。ispH的表達(dá)可單獨(dú)上調(diào)或下調(diào)，或者與dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、idi、ispA和ispB中的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)結(jié)合上調(diào)或下調(diào)。idi的表達(dá)可單獨(dú)上調(diào)或下調(diào),或者與dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、ispA和ispB中的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)結(jié)合上調(diào)或下調(diào)。ispA的表達(dá)可單獨(dú)上調(diào)或下調(diào)，或者與dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi和ispB中的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)結(jié)合上調(diào)或下調(diào)。ispB的表達(dá)可單獨(dú)上調(diào)或下調(diào)，或者與dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi和ispA中的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)結(jié)合上調(diào)或下調(diào)。在一些實(shí)施方案 中，dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH和idi中的ー個(gè)或多個(gè)基因和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)被上調(diào)，而ispA和/或ispB的基因和/或蛋白)貞表達(dá)被下調(diào)。MEP途徑中基因的表達(dá)可在模塊化方法中調(diào)節(jié)。本文所用的通過(guò)模塊化方法進(jìn)行調(diào)節(jié)是指多個(gè)基因的共同調(diào)節(jié)。例如，在一些實(shí)施方案中，MEP途徑中的多個(gè)基因在連續(xù)的DNA區(qū)域(例如作為操縱子)上重組表達(dá)。應(yīng)該理解，表達(dá)這種模塊的細(xì)胞也可重組或內(nèi)源性表達(dá)MEP途徑中的一個(gè)或更多個(gè)其他基因。MEP途徑中基因模塊的非限定性實(shí)施例是包括基因dxs、idi、ispD和ispF的模塊，其在實(shí)施例部分有介紹，并在本文被稱(chēng)為dxs-idi-ispDF。應(yīng)該理解,與本發(fā)明的方面相一致地，MEP途徑中的基因模塊可以任何順序包含MEP途徑中的任何基因。也可調(diào)節(jié)合成的下游萜類(lèi)化合物合成途徑中的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)，以?xún)?yōu)化萜類(lèi)化合物的生產(chǎn)。合成的下游萜類(lèi)化合物合成途徑涉及萜合酶和GGPPS酶的重組表達(dá)。如上所迷，任何萜合酶均可根據(jù)要產(chǎn)生的F游產(chǎn)物而與GGPPS —起表達(dá)。例如,紫杉ニ烯合酶用于生產(chǎn)紫杉ニ烯。紫杉ニ烯合酶和GGPPS酶的重組表達(dá)可被獨(dú)立調(diào)節(jié)或共同調(diào)節(jié)。在ー些實(shí)施方案中,這兩種酶以模塊化的方式被共同調(diào)節(jié)。例如這兩種酶可在操縱子中以任意順序表達(dá)(GGPPS-TS,被稱(chēng)為 “GT”,或 TS-GGPPS,被稱(chēng)為 “TG”)。對(duì)基因和/或蛋白質(zhì)表達(dá)的操作(包括如dxs-idi-ispDF操縱子和TS-GGPPS操縱子的模塊)可通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法實(shí)現(xiàn)。例如,基因或操縱子的表達(dá)可通過(guò)選擇有不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子(如誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)來(lái)調(diào)節(jié)。啟動(dòng)子的幾個(gè)非限定性實(shí)施例包括Trc、T5和T7。此外,基因或操縱子的表達(dá)可通過(guò)操作基因或操縱子在細(xì)胞中的拷貝數(shù)來(lái)調(diào)節(jié)。例如，在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于僅過(guò)表達(dá)合成的下游途徑的菌株，在其染色體____ヒ額外包含Trc啟動(dòng)子控制下的操縱子dxs-idi-ispDF拷貝的菌株產(chǎn)生更多量的紫杉ニ烯。在一些實(shí)施方案中,基因或操縱子的表達(dá)可通過(guò)操作模塊內(nèi)基因的順序來(lái)調(diào)節(jié)。例如,在某些實(shí)施方案中，將下游合成操縱子的基因順序由GT改變?yōu)門(mén)G導(dǎo)致紫杉ニ烯生產(chǎn)提高了 2-3倍。在一些實(shí)施方案中，基因或操縱子的表達(dá)通過(guò)將ー個(gè)或更多個(gè)基因或操縱子整合到染色體上來(lái)調(diào)節(jié)。例如，在某些實(shí)施例中，將上游dxs-idi-ispDF操縱子整合到細(xì)胞染色體上導(dǎo)致紫杉ニ烯生產(chǎn)提高。應(yīng)該理解,本發(fā)明相關(guān)基因可從多種來(lái)源獲得。在一些實(shí)施方案中,MEP途徑中的基因是細(xì)菌基因，例如大腸桿菌基因。在一些實(shí)施方案中，編碼GGPPS的基因是植物基因。例如,編碼GGPPS的基因可來(lái)自紫杉屬(Taxus)物種,如加拿大紫杉(T. canadenis)。在一些實(shí)施方案中，編碼紫杉ニ烯合酶的基因是植物基因。例如,編碼紫杉ニ烯合酶的基因可來(lái)自紫杉屬物種如短葉紫杉(T. brevifolia)。加拿大紫杉GGPPS和短葉紫杉ニ烯合酶的代表性GenBank登記號(hào)以AF081514和U48796提供,其序列通過(guò)參考整體并入本文。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到,本發(fā)明相關(guān)方法中使用的同源基因可從其他物種獲得，并可通過(guò)同源性檢索來(lái)鑒定,例如通過(guò)由國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)站(www. ncbi. nlm. nih. gov)提供的蛋白質(zhì)BLAST搜索。本發(fā)明相關(guān)的基因和/或操縱子可從來(lái)自任何來(lái)源的包含給定基因的DNA中克隆出來(lái)，例如通過(guò)PCR擴(kuò)增和/或限制性酶切。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明相關(guān)的基因和/或操縱子是合成的。任何獲得發(fā)明相關(guān)的基因和/或操縱子的方法都是與本發(fā)明相容的。
在一些實(shí)施方案中，萜類(lèi)化合物生產(chǎn)的進(jìn)一步優(yōu)化是通過(guò)基因在細(xì)胞中重組表達(dá)之前對(duì)它進(jìn)行修飾而完成的。在一些實(shí)施方案中，GGPPS酶具有以下突變中的一個(gè)或更多個(gè):A162V、G1.40C、L182M、F218Y、D160G、C1.84S、K367R、A151T、M1851、D264Y、E368D、C184R、L331I、G262V、R365S、A114D、S239C、G295D、I276V、K343N、P183S、I172T、D267G、I149V、T234I、E153D和T259A。在一些實(shí)施方案中，GGPPS酶在S239殘基和/或G295殘基含有突變。在某些實(shí)施方案中，GGPPS酶含有S239C和/或G295D突變。在一些實(shí)施方案中，基因在細(xì)胞中重組表達(dá)之前的修飾包括針對(duì)細(xì)菌細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化。多種物種的密碼子使用可訪(fǎng)問(wèn)密碼子使用數(shù)據(jù)庫(kù)(WWW. kazusa. or. jp/codon/) 密碼子優(yōu)化(包括鑒定多種生物的最佳密碼子，以及實(shí)現(xiàn)密碼子優(yōu)化的方法)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的,而且可使用標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)完成。在一些實(shí)施方案中，基因在細(xì)胞中重組表達(dá)之前的修飾包括基因在細(xì)胞中重組表達(dá)之前對(duì)其產(chǎn)生一個(gè)或更多個(gè)突變。例如,突變可包括單個(gè)核苷酸或多個(gè)核苷酸的替換或缺失。在一些實(shí)施方案中，基因中一個(gè)或更多個(gè)核苷酸的突變會(huì)導(dǎo)致從該基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的突變，例如一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的替換或缺失。在一些實(shí)施方案中，用已針對(duì)萜類(lèi)化合物生產(chǎn)進(jìn)行了優(yōu)化的細(xì)胞可以是有利的。例如，在'^-些實(shí)施方案中，使用過(guò)表達(dá)非甲羥戊酸(MEP)途徑中一種或更多種組分的細(xì)胞，來(lái)至少部分增強(qiáng)異戊基ニ磷酸(IPP)和ニ甲基烯丙基ニ磷酸(DMAPP)，它們是GGPPS的底物。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)增加非甲羥戊酸(MEP)途徑中一種或更多種組分的拷貝數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)非甲羥戊酸(MEP)途徑中一種或更多種組分的過(guò)表達(dá)。例如，MEP途徑中限速步驟組分如(dxs、ispD、ispF、idi)的拷貝數(shù)可被擴(kuò)增,例如通過(guò)額外的附加體表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建蛋白質(zhì)(如酶)中特定突變包括“推理性設(shè)計(jì)(rationaldesign) ”。如本文所用的“推理性設(shè)計(jì)”是指將酶或相關(guān)酶的知識(shí)(例如它的三維結(jié)構(gòu),它的活性位點(diǎn)，它的底物和/或酶與底物之間的相互作用)整合入特定突變的設(shè)計(jì)中。基于推理性的設(shè)計(jì)方法,可在酶中產(chǎn)生突變,之后可針對(duì)與對(duì)照水平相比的萜類(lèi)化合物產(chǎn)量增加進(jìn)行篩選。在一些實(shí)施方案中，可根據(jù)同源性建模來(lái)推理性設(shè)計(jì)突變。本文所用的“同源性建?！笔侵笇?duì)ー個(gè)蛋白質(zhì)從其氨基酸序列和相關(guān)同源蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)來(lái)構(gòu)建原子分辨率模型的過(guò)程。在一些實(shí)施方案中,可在基因(如編碼酶的基因)中制造隨機(jī)突變，而且從這些突變中可篩選與對(duì)照水平相比萜類(lèi)化合物生產(chǎn)提高的突變。例如,對(duì)MEP途徑組分或其他途徑組分中導(dǎo)致萜類(lèi)化合物生產(chǎn)提高之突變的篩選可通過(guò)隨機(jī)誘變篩選或通過(guò)已知突變的篩選來(lái)進(jìn)行。在'^-些實(shí)施方案中,可使用基因組片段的鳥(niǎo)槍克隆來(lái)確定導(dǎo)致萜類(lèi)化合物生產(chǎn)提高的基因組區(qū)域，這通過(guò)在具有這些片段的細(xì)胞或生物中篩選萜類(lèi)化合物生產(chǎn)的提高來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些情況下，可在同一細(xì)胞或生物中組合一個(gè)或更多個(gè)突變。在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)對(duì)與本發(fā)明相關(guān)酶在同一途徑中起作用的酶進(jìn)行操作來(lái)提高細(xì)胞中萜類(lèi)化合物在的生產(chǎn)。例如,在'^-些實(shí)施方案中,提高作用于靶標(biāo)酶(如本發(fā)明相關(guān)酶)上游的酶或其他因子的表達(dá)可以是有利的。這可通過(guò)使用任何標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)過(guò)表達(dá)該上游因子來(lái)實(shí)現(xiàn)。蛋白質(zhì)表達(dá)的優(yōu)化也可通過(guò)選擇合適的啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在ー些 實(shí)施方案中，這可包括選擇高拷貝數(shù)的質(zhì)粒,或者低或中等拷貝數(shù)的質(zhì)粒。也可以靶向轉(zhuǎn)錄終止的步驟來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，這通過(guò)引入或消除諸如莖環(huán)的結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的ー些方面涉及重組基因在細(xì)胞中的表達(dá)。本發(fā)明包括重組表達(dá)本發(fā)明相關(guān)基因的任何類(lèi)型的細(xì)胞,包括原核和真核細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，{列5ロ埃希氏菌(Escherichia spp.)、鏈霉—困.(Streptomyces spp. )、Zymonas spp.、醋酸菌(Acetobacter spp.)、朽1 樣酸菌(Citrobacter spp. )、Synechocystis spp.、根瘤菌(Rhizobium spp.)、梭狀芽孢桿菌(Clostridium spp.)、棒狀桿菌(Corynebacteriumspp. ノ、鏈球-菌(Streptococcus spp.)、黃單胞..菌(Xanthoinonas spp.)、字L 桿 H(Lactobacillus spp.)、乳球菌(Lactococcus spp.)、芽抱桿菌(Bacillus spp.)、產(chǎn)喊桿菌(Alcaligenes spp.)、假單胞菌(Pseudomonas spp.)、氣單.胞菌(Aeromonasspp.)、固氣菌(Azotobacter spp.)、叢毛單胞菌(Comamonas spp.)、結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium spp.)、紅球菌(Rhoaococcus spp ノ、葡糖桿囷(Gluconobacter spp.)、雷爾氏: (Ralstonia spp ノ、硫桿菌(Acidithiobacillus spp. )、Microlunat'us spp.、地桿菌(Geobacter spp.)、地芽孢桿菌(Geobacillus spp.)、節(jié)樸菌(Arthrobacterspp.)、黃桿菌(Flavobacterium spp.)、沙雷氏菌(Serratia spp.)、糖多抱菌(Saccnaropolyspora spp ノ、棲務(wù)1；.菌(Thermus spp ノ、寡養(yǎng)單胞— 菌(Stenotrophomonasspp)、色桿菌(Chromobacterium spp)、中華根瘤菌(Sinorhizobium spp)、糖多抱菌(Saccharopolyspora spp)、農(nóng)桿菌(Agrobacterium spp)和y之菌(Pant'oea sppj。細(xì)菌細(xì)胞可是革蘭氏陰性細(xì)胞，如大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞，或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞，如芽孢桿菌種。在另一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是真菌細(xì)胞,例如酵母細(xì)胞，如酵母菌(Saccharomyces spp.)、裂埴酵母(Schizosaccharomyces spp.)、畢赤酵母(Pichia spp. )、Paffia spp.、克魯維酵母(Kluyveromyces spp.)、念珠菌(Candida spp.)、藍(lán)狀菌(Talaromyces spp.)、酒香酵母(Brettanomycesspp.)、管囊酵母(Pachysolen spp.)、德巴利酵母(Debaryomycesspp.)、耶氏酵母(Yarrowia spp.)和エ業(yè)上的多倍體酵母菌株。優(yōu)選地,所述酵母菌株是釀酒酵母(S. cerevisiae)菌株或耶氏酵母菌株。真菌的其他實(shí)例包括曲霉(Aspergillusspp ノ、(Pennicilium spp.) x I 3 1*1 (Fusarium spp ノ 、豐艮# (Rhizopus spp.)、頂抱霉(Acremonium spp.)、脈抱霉(Neurospora spp.)、類(lèi)殼菌(Sordaria spp.)、稻媼柄菌(Magnaporthe spp.)、異水霉(Allomyces spp.)、黑粉菌(Ustilago spp.)、葡萄孢霉(Botrytisspp.)和木霉(Trichoderma spp)。在另ー些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是藻類(lèi)細(xì)胞，或植物細(xì)胞。應(yīng)該理解,與本發(fā)明相容的ー些細(xì)胞可表達(dá)ー種或更多種本發(fā)明相關(guān)基因的內(nèi)源性拷貝，以及重組拷貝。在一些實(shí)施方案中,若細(xì)胞有一種或更多種本發(fā)明相關(guān)基因的內(nèi)源性拷貝，那么該方法將不一定需要增加該內(nèi)源性表達(dá)基因的重組拷貝。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞可內(nèi)源性表達(dá)來(lái)自本文所述途徑的一種或更多種酶，而且可重組表達(dá)來(lái)自本文所述途徑的ー種或更多種其他酶，以高效的生產(chǎn)萜類(lèi)化合物。本發(fā)明的另ー些方面還涉及篩選顯示出優(yōu)化的職類(lèi)化合物生產(chǎn)的細(xì)菌細(xì)胞或菌株。如上所述,本發(fā)明相關(guān)的方法包括產(chǎn)生過(guò)表達(dá)MEP途徑中--種或更多種基因的細(xì)胞。可測(cè)量培養(yǎng)該細(xì)胞所得的萜類(lèi)化合物生產(chǎn)并與對(duì)照細(xì)胞比較，其中選擇相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞表現(xiàn)出更高萜類(lèi)化合物生產(chǎn)量的細(xì)胞作為第一改進(jìn)細(xì)胞。該細(xì)胞可通過(guò)萜合酶和GGPPS酶的重組表達(dá)來(lái)進(jìn)ー步修飾。接著可操作非甲羥戊酸(MEP)途徑的一種或更多種組分、萜合酶和/或GGPPS酶在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平,并可再次測(cè)量萜類(lèi)化合物的生產(chǎn),從而選擇第二改進(jìn)細(xì)胞，其產(chǎn)生比第一改進(jìn)細(xì)胞更大量的萜類(lèi)化合物。在一些實(shí)施方案中，所述萜合酶是紫杉ニ 烯合酶。本發(fā)明的另ー些方面還涉及鑒定和(通過(guò)GC-MS)表征大腸桿菌細(xì)胞細(xì)胞之前未知的代謝物(圖3和6)。可通過(guò)由過(guò)表達(dá)、下調(diào)或突變異戊ニ烯途徑基因的方法對(duì)微生物途徑進(jìn)行遺傳操作，來(lái)控制新鑒定的代謝物(吲哚)的積累水平。在工程化菌株中，代謝物吲哚作為直接變量與紫杉ニ烯的產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)(圖3，6和15)。在細(xì)菌系統(tǒng)(特別是在細(xì)胞中，如大腸桿菌細(xì)胞)或其他細(xì)胞中，為改善流向職類(lèi)化合物生物合成的流量而對(duì)吲噪積累的迸'^-步控制可通過(guò)平衡上游非甲羥戊酸異戊ニ烯途徑與下游產(chǎn)物合成途徑或者通過(guò)修飾或調(diào)節(jié)吲哚途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。這樣,本領(lǐng)域技術(shù)人員可減少或控制吲哚的積累，從而減少吲哚對(duì)紫杉ニ烯和其他衍生自所述途徑的萜類(lèi)化合物(例如單萜、倍半萜(包括紫穗槐ニ烯(amorph.adi.ene))、ニ職(包括左旋海松ニ烯)、三職和四職)生產(chǎn)的抑制作用。減少或控制吲哚積累的其他方法包括通過(guò)化學(xué)方法如用吸收劑、清除劑等將累積的吲哚從發(fā)酵中除去。在另ー些實(shí)施方案中，提供了包括在產(chǎn)生ー種或更多種萜類(lèi)化合物的細(xì)胞中或在產(chǎn)生ー種或更多種萜類(lèi)化合物的細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)量吲哚的量或濃度的方法。只要合適，吲哚的量或濃度可用本領(lǐng)域已知的方法和本文所述的方法測(cè)量一次，或兩次或更多次。這種方法可用于指導(dǎo)一種或更多種萜類(lèi)化合物的生產(chǎn)方法，例如エ藝改迸。這種方法可用于指導(dǎo)菌株構(gòu)建，例如菌株改進(jìn)。對(duì)實(shí)現(xiàn)這ー平衡之方法的鑒定導(dǎo)致與野生型細(xì)菌細(xì)胞相比,用異源性紫杉ニ烯生物合成途徑表達(dá)的萜類(lèi)化合物(如紫杉ニ烯)過(guò)量生產(chǎn)提高了 15000倍。通過(guò)修改的發(fā)酵方法進(jìn)ー步提高了生產(chǎn)，其產(chǎn)生的濃度約2g/L，比任何之前報(bào)道的紫杉ニ烯生產(chǎn)高1500倍。如本文所示，通過(guò)對(duì)大腸桿菌中非甲羥戊酸異戊ニ烯途徑的遺傳改造，現(xiàn)在可控制這種代謝物的積累,在細(xì)菌大腸桿菌細(xì)胞中它調(diào)節(jié)朝向異戊ニ烯生物合成的通量。本文還顯示，將紫杉ニ烯生產(chǎn)進(jìn)一步引導(dǎo)至紫杉醇的下一個(gè)關(guān)鍵前體——紫杉ニ烯_5 a -醇,這通過(guò)對(duì)紫杉醇生物合成的氧化化學(xué)進(jìn)行改造來(lái)實(shí)現(xiàn)。實(shí)施例5顯示了首次將合成途徑從紫杉ニ烯延伸至紫杉ニ烯-5 a -醇。與大多數(shù)其他萜類(lèi)化合物類(lèi)似，紫杉醇生物合成遵照如下統(tǒng)ー方式的“兩階段”的生物合成過(guò)程，⑴“環(huán)化酶階段”，異戊ニ烯基前體(IPP和DMAPP)與GGPP線(xiàn)性偶聯(lián),接著分子環(huán)化并重排以形成紫杉ニ烯前體(圖6, VIII-IX)57’58。形成前體之后，(ii) “氧化階段”，接著被7個(gè)細(xì)胞色素P450加氧酶及其氧化還原伴侶一起使環(huán)烯烴紫杉ニ烯的核心結(jié)構(gòu)官能化,通過(guò)酰基和芳?；鵆oA依賴(lài)性轉(zhuǎn)移酶用兩個(gè)乙酸基和苯甲酸基修飾,通過(guò)酮氧化酶用酮基團(tuán)修飾，以及通過(guò)環(huán)氧酶用環(huán)氧基團(tuán)修飾,形成后-一中間體巴卡亭III，紫杉醇C13側(cè)鏈結(jié)合于其....ヒ(圖6，X-XIID150雖然預(yù)測(cè)了早期氧化階段反應(yīng)的大體順序，但ー些羥基化、?；捅郊柞７磻?yīng)的確切時(shí)間/順序是不確定的。但明確的是，早期的分支起始自細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的紫杉ニ烯核心C5位置的羥基化反應(yīng),接著是下游的羥基化反應(yīng)，其使用細(xì)胞色素P450酶的同源家族,彼此之間有高度推定相似性(> 70% ),但與其他植物P450的相似之處十分有限(< 30% )41’59。此外，結(jié)構(gòu)和功能的多祥性和可能的進(jìn)化分析提示，紫杉ニ烯-5 a -醇的基因可是親本基因，由此進(jìn)化出紫杉醇生物合成途徑中的其他羥化酶基因，反映了羥基化作用的順序15。本發(fā)明的另一些方面涉及嵌合體P450酶。由于細(xì)菌平臺(tái)固有的局限性,例如缺少電子傳遞機(jī)制、細(xì)胞色素P450還原酶和由于缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而導(dǎo)致的P450酶膜信號(hào)模塊的翻 譯不兼容性，植物細(xì)胞色素P450的功能性表達(dá)一直被認(rèn)為具有挑戰(zhàn)性。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)N-端跨膜工程和/或通過(guò)與CPR氧化還原伴侶融合翻譯而產(chǎn)生嵌合酶,對(duì)本發(fā)明方法相關(guān)的紫杉ニ烯_5 a -羥化酶進(jìn)行了優(yōu)化。在一些實(shí)施方案中，CPR氧化還原伴侶是紫杉的細(xì)胞色素P450還原酶(TCPR ；圖5b)。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞色素P450紫杉ニ烯-5 a -羥化酶(T5 a OH)從東北紫杉(Taxus cuspidate)獲得(GenBank登錄號(hào)AY289209,其序列通過(guò)參考并入本文)。在一些實(shí)施方案中，NADPH :細(xì)胞色素P450還原酶(TCPR)從東北紫杉獲得(GenBank登錄號(hào)AY571340,其序列通過(guò)參考并入本文)。紫杉ニ烯5 a -羥化酶和TCPR可通過(guò)如GSTGS (SEQ ID NO 50)的接頭連接在一起。在一些實(shí)施方案中，紫杉ニ烯5 a -羥化酶和/或TCPR被截短以除去ー個(gè)或兩個(gè)蛋白質(zhì)的全部或部分跨膜區(qū)。例如,在一些實(shí)施方案中的紫杉ニ烯5a-羥化酶被截短以除去8、24或42個(gè)N端氨基酸。在一些實(shí)施方案中，TCPR的N端74個(gè)氨基酸被截去。也可將額外的肽與紫杉ニ烯5 a-羥化酶融合。例如，來(lái)自牛17 a羥化酶的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸可添加到紫杉ニ烯5 a-羥化酶。在某些實(shí)施方案中，肽MALLLAVF(SEQ ID NO :51)被添加到紫杉ニ烯5 a -羥化酶。含有融合至TCPR的紫杉ニ烯5 a -羥化酶的非限定性實(shí)例是At.24T5 a OH-tTCPR。在一些實(shí)施方案中，該嵌合酶能進(jìn)行第一個(gè)氧化步驟，有超過(guò)10%的紫杉ニ烯轉(zhuǎn)化成紫杉ニ烯-5 a —醇和副產(chǎn)物5(12) -氧-3(11) -環(huán)紫杉烷。例如，紫杉ニ烯至紫杉ニ烯-5 a-醇和副產(chǎn)物5(12)-氧-3(11)-環(huán)紫杉烷的轉(zhuǎn)化率可是至少20%,至少30%,至少40%,至少50%,至少60%,至少有70%,至少80%,至少90%,至少95%,至少98%,約99% 或約 100%。 在某些實(shí)施方案中,所述嵌合酶是At245 a OH-tTCPR,發(fā)現(xiàn)其能夠進(jìn)行第一個(gè)氧化步驟，將超過(guò)98 %的紫杉ニ烯轉(zhuǎn)化至紫杉ニ烯_5 a -醇和副產(chǎn)物5 (12)-氧-3 (I I)-環(huán)紫杉烷(0CT ;圖9a)。對(duì)紫杉ニ烯-5 a -醇生產(chǎn)步驟的改造是生產(chǎn)紫杉醇的關(guān)鍵，并在之前酵母中構(gòu)建這一途徑的嘗試中發(fā)現(xiàn)是限速步驟。本文開(kāi)發(fā)的工程構(gòu)建體顯示，在體內(nèi)超過(guò)98%的紫杉ニ烯發(fā)生轉(zhuǎn)化，比以前在酵母中異源性表達(dá)改善了 2400倍。因此,除了合成顯著更大量的關(guān)鍵紫杉醇中間體之外，本研究還提供了通過(guò)類(lèi)似的P450化學(xué)來(lái)合成途徑中后續(xù)代謝物的基礎(chǔ)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”和“多肽”可互換使用，因此術(shù)語(yǔ)多肽可用于指全長(zhǎng)多肽，也可用于指全長(zhǎng)多肽的一個(gè)片段。在本文中用于多肽、蛋白質(zhì)或其片段時(shí)分離的”是指從其天然環(huán)境中分離出來(lái)，并以足以滿(mǎn)足其鑒定或使用的量存在。當(dāng)涉及蛋白質(zhì)或多肽吋，“分離的”是指，例如(i)通過(guò)克隆表達(dá)而選擇性產(chǎn)生的或(ii)通過(guò)色譜或電泳純化的。分離的蛋白質(zhì)或多肽可以是(但不一定是)基本純的。術(shù)語(yǔ)“基本純”是指在實(shí)際和與其預(yù)期用途相適應(yīng)的程度上，蛋白質(zhì)或多肽中基本上不含有可見(jiàn)于其生產(chǎn)中、自然界中或體內(nèi)系統(tǒng)中的其他物質(zhì)?；炯兊亩嚯目商烊猾@得或使用本文所 述的方法產(chǎn)生，并可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)純化。因?yàn)榉蛛x的蛋白質(zhì)在制備中可與其他組分混合，因此蛋白質(zhì)可僅占制劑重量的一小部分。所述蛋白質(zhì)仍然是分離的,其中它已從活系統(tǒng)中可與之相關(guān)的物質(zhì)中分離，即從其他蛋白質(zhì)中分離出來(lái)。本發(fā)明還包括編碼任何本文所述多肽的核酸，含有任何本文所述的核酸和/或多肽的文庫(kù)，和含有任何本文所述的核酸和/或多肽的組合物。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或更多個(gè)本發(fā)明相關(guān)的基因在重組表達(dá)載體中表達(dá)。本文所用的“載體”可是大量核酸中的任何一種,其中可通過(guò)限制性酶切和連接來(lái)插入所需的ー個(gè)或更多個(gè)序列，以便在不同的遺傳環(huán)境中運(yùn)送或在宿主細(xì)胞中表達(dá)。載體通常是由DNA組成，但RNA載體也是可用的。載體包括但不限于質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、病毒基因組和人工染色體?？寺≥d體能自主復(fù)制或整合在宿主細(xì)胞基因組中，其還以一個(gè)或更多個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)為特征，可以在該位點(diǎn)以確定的方式切割載體并可將期望的DNA序列連接到載體中，從而新的重組質(zhì)粒保留了它在宿主細(xì)胞中復(fù)制的能力。在質(zhì)粒的情況下，期望序列的復(fù)制可隨著質(zhì)粒在宿主細(xì)胞(如細(xì)菌宿主)中的拷貝數(shù)增加而多次發(fā)生,或僅在宿主通過(guò)有絲分裂繁殖前在每個(gè)宿主中發(fā)生一次。在噬菌體的情況下,復(fù)制可在裂解期過(guò)程中主動(dòng)發(fā)生或在溶原期過(guò)程中被動(dòng)發(fā)生。表達(dá)載體是這樣的載體,可通過(guò)限制性酶切和連接將期望的DNA序列插入其中，以使其與調(diào)控序列有效連接中并可表達(dá)為RNA轉(zhuǎn)錄本。載體還可包含適合用于鑒定細(xì)胞是否已被載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的一種或更多種標(biāo)記序列。標(biāo)記包括如編碼提高或降低其對(duì)抗生素或其他化合物之抗性或敏感性的蛋白質(zhì)的基因，編碼可通過(guò)本領(lǐng)域已知標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)活性的酶的基因(例如0 -半乳糖苷酶、螢光素酶或堿性磷酸酶)，以及對(duì)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞、宿主、菌落或菌斑的表型有可見(jiàn)影響的基因(例如綠色熒光蛋白)。優(yōu)選的載體是那些能夠自主復(fù)制和表達(dá)與其有效連接的DNA片段中所存在的結(jié)構(gòu)基因之產(chǎn)物的載體。本文所用的編碼序列和調(diào)控序列在以這種方式連接時(shí)被稱(chēng)為是“有效”連接，即使得編碼序列的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄處于調(diào)控序列的影響或控制之下。若想要將編碼序列翻譯成功能性蛋白質(zhì),則兩個(gè)DNA序列在這種情況下被稱(chēng)為有效連接，即對(duì)5'調(diào)控序列中啟動(dòng)子的誘導(dǎo)引起編碼序列的轉(zhuǎn)錄,并且兩個(gè)DNA序列之間的連接性質(zhì)不會(huì)(I)導(dǎo)致引人移碼突變，(2)千擾啟動(dòng)子區(qū)指導(dǎo)編碼序列轉(zhuǎn)錄的能力，或(3)千擾相應(yīng)的RNA轉(zhuǎn)錄本被翻譯成蛋白質(zhì)的能力。因此，如果啟動(dòng)子區(qū)能實(shí)現(xiàn)DNA序列的轉(zhuǎn)錄,使得由此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本可翻譯成所需的蛋白質(zhì)或多肽，則啟動(dòng)子區(qū)是與編碼序列有效連接的。當(dāng)編碼本發(fā)明任何酶的核酸分子在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，多種轉(zhuǎn)錄控制序列(例如啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列)可用于指導(dǎo)其表達(dá)。啟動(dòng)子可是天然的啟動(dòng)子，即基因的啟動(dòng)子在其內(nèi)源環(huán)境中，這提供了基因表達(dá)的正常調(diào)節(jié)。在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子可是組成型的，即啟動(dòng)子持續(xù)轉(zhuǎn)錄其相關(guān)基因而不受調(diào)節(jié)。也可用多種條件啟動(dòng)子,例如由分子的存在與否控制的啟動(dòng)子?；虮磉_(dá)所需調(diào)控序列的確切性質(zhì)在物種或細(xì)胞類(lèi)型之間可能會(huì)有所不同，但ー般按需要應(yīng)包括，分別涉及轉(zhuǎn)錄和翻譯起始的5'非轉(zhuǎn)錄和5'非翻譯序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等等。尤其是,這種5'非轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列將包括啟動(dòng)子區(qū)域,其包括控制對(duì)有效連接的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄控制的啟動(dòng)子序列。調(diào)控序列也可包括增強(qiáng)子序列或所需的上游激活子序列。本發(fā)明載體可任選地包括5'前導(dǎo)或信號(hào)序列。合適載體的選擇和設(shè)計(jì)是在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力和判斷范圍內(nèi)的。包含所有必需表達(dá)元件的表達(dá)載體是市售的，而且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。 例如見(jiàn) Sambrook Molecular Cloning A Laooratory Manual,弟Zl版，Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989。通過(guò)將外源性DNA(RNA)導(dǎo)入細(xì)胞而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳エ程。該外源性DNA (RNA)被置于轉(zhuǎn)錄元件的有效控制下，以允許外源性DNA在宿主細(xì)胞中表達(dá)。實(shí)施例部分闡明了用大腸桿菌來(lái)異源表達(dá)本發(fā)明的相關(guān)基因，以生產(chǎn)萜類(lèi)化合物如紫杉ニ烯。生產(chǎn)萜類(lèi)化合物的新方法也可在其他細(xì)菌細(xì)胞、真菌(包括酵母細(xì)胞)、植物細(xì)胞等中表達(dá)?？捎帽绢I(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法和技術(shù)將編碼本發(fā)明相關(guān)酶的核酸分子引入細(xì)胞中。例如，核酸分子可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方案引入，如轉(zhuǎn)化(包括化學(xué)轉(zhuǎn)化和電穿孔)、轉(zhuǎn)染、粒子轟擊等。編碼本發(fā)明酶的核酸分子的表達(dá)也可通過(guò)將該核酸分子整合入基因組中來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明相關(guān)的ー個(gè)或更多個(gè)基因在細(xì)菌細(xì)胞中重組表達(dá)。本發(fā)明的細(xì)菌細(xì)胞可培養(yǎng)在任何類(lèi)型(豐富或基本)和任何組成的培養(yǎng)基中。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將可以理解,常規(guī)優(yōu)化將允許使用多種類(lèi)型的培養(yǎng)基。選定的培養(yǎng)基可補(bǔ)充多種額外組分。補(bǔ)充組分的ー些非限定性實(shí)例包括葡萄糖、抗生素、用于基因誘導(dǎo)的IPTG'ATCC微量礦物質(zhì)補(bǔ)充劑和こ醇酸。同樣，培養(yǎng)基的其他方面和本發(fā)明細(xì)胞的生長(zhǎng)條件可通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)優(yōu)化。例如，pH和溫度是可優(yōu)化因素的非限定性實(shí)例。在一些實(shí)施方案中，如培養(yǎng)基選擇、培養(yǎng)基補(bǔ)充和溫度等因素可影響萜類(lèi)化合物如紫杉ニ烯的生產(chǎn)水平。在一些實(shí)施方案中，可優(yōu)化補(bǔ)充性組分的濃度和量。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)化了用一種或更多種補(bǔ)充性組分來(lái)補(bǔ)充培養(yǎng)基的頻率和在收獲萜類(lèi)化合物如紫杉ニ烯之前培養(yǎng)基的培養(yǎng)時(shí)間。根據(jù)本發(fā)明的ー些方面,高滴度的萜類(lèi)化合物如紫杉ニ烯通過(guò)本發(fā)明相關(guān)基因在細(xì)胞中的重組表達(dá)而產(chǎn)生。本文所用的“高滴度”是指毫克每升(mgじ1)級(jí)的滴度。給定產(chǎn)物產(chǎn)生的滴度將受多種因素影響，包括培養(yǎng)基的選擇。在一些實(shí)施方案中，總的紫杉ニ烯滴度至少是Imgじ1。在一些實(shí)施方案中，總的紫杉ニ烯滴度至少是IOmgじ1。在一些實(shí)施方案中，總的紫杉ニ烯滴度至少是250mg [ノ。例如、總的紫杉ニ烯滴度可至少是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或超過(guò)900mgじ1，包括任何中間值。在一些實(shí)施方案中、總的紫杉ニ烯滴度可至少是 1.0,1. 1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2. I、2. 2,2. 3,2. 4,2. 5,2. 6,2. 7,2. 8,2. 9,3. 0,3. U3. 2,3. 3,3. 4,3. 5,3. 6,3. 7,3. 8,3. 9,4. 0、4. 1,4. 2,4. 3,4. 4,4. 5,4. 6,4. 7,4. 8,4. 9,5. 0 或超過(guò) 5. Og じ1,包括任何中間值。在一些實(shí)施方案中，總的紫杉ニ烯5 a -醇滴度至少是Imgじ1。在一些實(shí)施方案中，總的紫杉ニ烯5 a -醇滴度至少是IOmgじ1。在一些實(shí)施方案中，總的紫杉ニ烯5 a -醇滴度至少是50mg I:1。例如，總的紫杉ニ烯5a-醇滴度至少是I、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或超過(guò)70mgじ1，包括任何中間值。
用于本發(fā)明相關(guān)細(xì)胞生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)物可儲(chǔ)于任何本領(lǐng)域已知和使用的培養(yǎng)容器中。在'^-些實(shí)施方案中，通氣反應(yīng)容器(如撹拌反應(yīng)釜)中的大規(guī)模生產(chǎn)可用于產(chǎn)生大量的萜類(lèi)化合物如紫杉ニ烯，其可從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收。在一些實(shí)施方案中，萜類(lèi)化合物是從細(xì)胞培養(yǎng)物的氣相中回收的，例如通過(guò)向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入有機(jī)層如十二烷并從有機(jī)層中回收萜類(lèi)化合物。通過(guò)本文所述方法產(chǎn)生的萜類(lèi)化合物如紫杉ニ烯有廣泛的應(yīng)用，包括藥物如紫杉醇(泰素)、青蒿素、銀杏內(nèi)酷、eleutherobin和偽蕨素(pseudopterosin),以及許多其他潛在的藥物化合物。其他應(yīng)用包括用于香料和化妝品的化合物，如香葉醇、法尼醇、物牛兒基物牛兒醇、芳樟醇、檸檬烯、菔烯、桉油素和異戊ニ烯。其他應(yīng)用包括用作生物燃料的化合物,如5、10和15個(gè)碳原子長(zhǎng)度的醇。需要指出的是,上述化合物目前是由多種植物提取而產(chǎn)生的。植物提取為基礎(chǔ)的方法是冗長(zhǎng)的，產(chǎn)量極低，并且能夠這樣獲得的實(shí)際分子是有限的，即它們不容易生產(chǎn)可比原來(lái)化合物有更優(yōu)越性能的衍生物。
實(shí)施例方法菌株、旗粒、寡核昔酸和基因大腸桿菌K12MG1655菌株是用于所有紫杉ニ烯菌株構(gòu)建的宿主菌。大腸桿菌 K12MG1655A (recA, endA)和大腸桿菌 K12MG1655A (recA, endA) ED3 菌株由MIT(Cambridge, MA)的Kristala Prather教授實(shí)驗(yàn)室提供。本研究所有質(zhì)粒構(gòu)建的細(xì)節(jié)如表2所不。本研究中使用的所有寡核苷酸不于表3。櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合酶(GGPPS)5'紫杉ニ烯合酶(TS)51、細(xì)胞色素P450紫杉ニ烯5a-羥化酶(T5 a 0H)和紫杉NADPH :細(xì)胞色素P450還原酶(TCPR)46序列來(lái)自加拿大紫杉、短葉紫杉、東北紫杉(GenBank登記號(hào)AF081514、U48796、AY289209和AY571340)?；蚴怯肒odumal等報(bào)道的質(zhì)粒和方案52 (補(bǔ)充附錄I)自行合成的，以引入大腸桿菌翻譯密碼子并除去用于克隆目的的限制性酶切位點(diǎn)。去除了對(duì)應(yīng)于GGPPS和TS的N端98和60個(gè)氨基酸的核苷酸(質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽)，并插人翻譯插入序列Met。17MEP途徑的構(gòu)建(dxs-idi-idpDF操縱子)通過(guò)用引物dxs (S)、dxs (a)、idi (s)、idi (a)、ispDF(s)和 ispDFI (a)從大腸桿菌K12MG1655的基因組中克隆各個(gè)基因，首先在帶有17啟動(dòng)子的pET21C+質(zhì)粒上構(gòu)建了 dxs-idi-idpDF 操縱子(p20T7MEP)。03 用引物 dxsidiispDFNcoI (s)和dxsidiispDFKpnl (a),將 dxs-idi-ispDF 操縱子亞克隆到 pTrcHis2B 質(zhì)粒(Invitrogen)經(jīng)NcoI和KpnI消化得到的pTrcMEP質(zhì)粒(p20TrcMEP)。p20TrcMEP質(zhì)粒用MIuI和PineI酶切并克隆入經(jīng)MluI和PmeI消化的pACYC184-melA (P2A)質(zhì)粒,來(lái)構(gòu)建pIOTrcMEP質(zhì)粒。pTrcMEP質(zhì)粒用BstZ17I和ScaI消化并克隆到經(jīng)PvuII消化的pCL1920質(zhì)粒中來(lái)構(gòu)建p5TrcMEP質(zhì)粒。為了構(gòu)建 p20T5MEP 質(zhì)粒，首先用引物 dxsidiispDFNcoI (s)和 dxsidiispDFXhoI (a)將dxs-idi-idpDF操縱子克隆到帶有T5啟動(dòng)子的pQE質(zhì)粒中(pQE-MEP)。用引物TSAgeI (s)和T5NheI (a)從pQEMEP質(zhì)粒擴(kuò)增帶有T5啟動(dòng)子的操縱子DNA片段。該DNA片段用AgeI/NheI消化并克隆到經(jīng)SGrAI/Nhel酶消化的p20T7MEP質(zhì)粒中。紫杉ニ烯途徑的構(gòu)建(GT和TG操縱子)通過(guò)用引物GGPPSNcoI (s)、GGPPSEcoRI (a)、TSEcoRI (s)、TSsal I (a)、TSKcoI (s)、TSEcoRI (a)、GGPPSEcoRI (s)和 GGPPSSalI (a)將 GGPS 和 TS 的 PCR 片段克隆人 pTrcHIS2B 質(zhì)粒的NocI-EcoRI和EcoRI-SalI位點(diǎn)來(lái)產(chǎn)生p20TrcGT和p20TrcTG,以構(gòu)建下游紫杉ニ烯途徑(GT和TG操縱子)。為構(gòu)建P20T5GT,操縱子首先用引物GGPPSNcoI (s)和TSXhoI (a)擴(kuò)增，并克隆入用Ncol/Xhol消化的帶有T5啟動(dòng)子的pQE質(zhì)粒中。然后將序列用XbaI和XhoI消化并克隆到用引物pTrcSal (s)和pTrcXba(a)擴(kuò)增的pTrc質(zhì)粒骨架中。通過(guò)將來(lái)自p20TrcTG的經(jīng)Ncol/Sall消化的TG操縱子亞克隆到經(jīng)Ncol/Sall消化的pACYC-DUETl質(zhì)粒來(lái)構(gòu)建P10T7TG。通過(guò)將BspEI/Xbal消化的片段克隆至用引物pCLBspEI (s)和pCLXbal (a)從pCL1920質(zhì)粒擴(kuò)增的經(jīng)Xbal/BspEI消化的DNA來(lái)構(gòu)建p5T7TG。MEP途徑質(zhì)粒的染色體整合的構(gòu)建為構(gòu)建用于擴(kuò)增整合序列的帶有FRP-Km-FRP盒的質(zhì)粒,p20T7MEP和p20T5MEP用Xhol/Scal消化。用引物KmFRPXhoI (s)和KmFRPScaI (a),從帶有來(lái)自pkD13質(zhì)粒的FRP序列的Km盒擴(kuò)增FRP-Km-FRP盒。擴(kuò)增的DNA用Xhol/Scal消化并克隆入Xhol/Scal消化的 p20T7MEP 和 p20T5MEP 質(zhì)粒(p2OTTMEPKmFRP 和 p20T5MEPKmFRP)。同樣，p20TrcMEP 質(zhì)粒用Sacl/Scal消化,而用引物KmFRPSacI (s)和KmFRPScaI (a)擴(kuò)增的DNA被消化,并克隆到p20TrcMEP 質(zhì)粒中(p20TrcMEPKm-FRP)。MEP 途徑盒(Lac I q-MEP-FRP-Km-FRP)盒的染色體整合將在啟動(dòng)子H、T5和Trc下構(gòu)建的MEP途徑定位于染色體中的帶有Kan標(biāo)記的ara操縱子區(qū)域。用引物 IntT7T5 (s)、IntTrc (s)和 Int (a)，從 p20T7MEPKmFRP、p20T5MEPKmFRP和 p20TrcMEPKm-FRP 擴(kuò)增 PCR 片段，然后電穿孔入 E. coli MG1655recA-end-和 E. coliMG1655reCA-end-EDE3細(xì)胞中，以通過(guò)入:Red整合技術(shù)來(lái)進(jìn)行染色體整合。54確認(rèn)了位點(diǎn)特異性定位,在基因成功整合后通過(guò)FLP重組酶的作用去除Km標(biāo)記。紫杉ニ烯5 a -醇途徑的構(gòu)建用PredictProtein 軟件(www. predictprotein. org)確定紫杉ニ烯 5 a -醇輕化酶(T5 a OH)和紫杉細(xì)胞色素P450還原酶(TCPR)的跨膜區(qū)(TM) 55。為進(jìn)行跨膜工程，對(duì)紫杉ニ烯5 a -醇羥化酶(T5 a 0H) N端跨膜區(qū)的8、24和42個(gè)氨基酸殘基和TCPR中74個(gè)氨基酸的區(qū)域進(jìn)行選擇性截短。紫杉ニ烯5 a -醇羥化酶(T5 a OH)N端8、24和42個(gè)氨基酸殘基的去除、替換了一個(gè)氨基酸的牛17a羥化酶N端8個(gè)肽殘基MALLLAVF(SEQ IDNO 51)與N端截短的T5 a OH序列44以及GSTGS肽接頭的整合是用引物CYP17At8AANdeI (s)、CYP17At24AANdeI (s)、CYP 17At.42AANdeI (s)和 CYPLinkBamHI (a)完成的。用這些引物擴(kuò)增每個(gè)修飾的DNA, NdeI/BamIII消化并克隆入Ndel/BamHI消化的pACYC DUETl質(zhì)粒，以構(gòu)建 P 10At8T5 a OH、pl()At24T5 a OH 和 plOAt42T5 a OH 質(zhì)粒。用引物 CPRBamHI: (s)和CPRSal I (a)擴(kuò)增74個(gè)氨基酸截短的TC'PR (t.TCPR)序列。擴(kuò)增的tTC'PR序列和質(zhì)粒plOAt8T5 a OH、plOAt.24T5 a OH 和 plOAt42T5 a OH 用 BamHI/Sall 消化并克隆以構(gòu)建質(zhì)粒p 10At8T5 a OIFtTCPR, p!0At24T5 a OIFtTCPR 和 plOAt42T5 a OIFtTCPR0用于篩選紫杉ニ烯和紫杉ニ烯-5a -醇分析的培養(yǎng)物培養(yǎng)將之前改造的攜帯具有上游(MEP)、下游紫杉ニ烯途徑和紫杉ニ烯5 a -醇之合適質(zhì)粒的大腸桿菌菌株的單個(gè)轉(zhuǎn)化體在Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基中(補(bǔ)充適當(dāng)?shù)目股?，lOOmg/mL羧節(jié)青霉素、34mg/mL氯霉素、25mg/L卡那霉素或50mg/mL大觀霉素)以30"€培養(yǎng)18h。對(duì)于用于篩選工程化菌株的小規(guī)模培養(yǎng),用這些預(yù)接種物接種新鮮的2mL豐富培養(yǎng)基(5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，15g/L葡萄糖，10g/L NaCLlOOmM HEPs, 3mL/L消泡劑·B，pH 7. 6，lOOug/mL羧芐青霉素和34ug/mL氯霉素)，其起始的A600為0. I。將培養(yǎng)物以適當(dāng)?shù)目股睾陀糜诨蛘T導(dǎo)的IOOmM IPTG在22°C下維持5天。紫杉ニ烯5 a -醇生產(chǎn)菌株的生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)。按照制造商的指示組裝3-L Bioflo生物反應(yīng)器(New Brunswick)。在一升含有1%甘油(V/V)的豐富培養(yǎng)基中接種以相同濃度培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基(含有抗生素(IOOmg/mL羧芐青霉素,34mg/mL氯霉素))中的菌株26At24T5 a OIFtTCPR的8h培養(yǎng)物(A600 2. 2) SOmL0帶有液-液雙相發(fā)酵的IL生物反應(yīng)器使用20% V/V卜ニ烷。用() 5v/v/in的過(guò)濾空氣提供氧氣，并調(diào)整攪拌以保持溶氧水平高于50%。用10% NaOH將培養(yǎng)物的pH控制在7. O。發(fā)酵罐中培養(yǎng)物的溫度控制在30°C，直到細(xì)胞生長(zhǎng)到用波長(zhǎng)600nm(OD600)測(cè)量的吸光度為約0.8。發(fā)酵罐的溫度降低到22°C，用0. ImM IPTG誘導(dǎo)細(xì)胞。無(wú)菌地加入十二烷至培養(yǎng)基體積的20% (V/V)。在發(fā)酵過(guò)程中甘油和醋酸積累的濃度用恒定的時(shí)間間隔來(lái)監(jiān)測(cè)。在發(fā)酵過(guò)程中當(dāng)甘油濃度低于0.5g/L時(shí)，向生物反應(yīng)器中引人甘油(3g/L)。用帶有確定補(bǔ)料培養(yǎng)基的補(bǔ)料分批培養(yǎng)來(lái)進(jìn)ー步優(yōu)化發(fā)酵，所述補(bǔ)料培養(yǎng)基含有0. 5%酵母提取物和 20% (V/V)十二烷(13. 3g/L KH2PO4,4g/L (NH4) ,O4’ I. 7g/L 檸檬酸，0. 0084g/L EDTA, 0. 0025g/L CoCl2,0. 015g/L MnCl2,0. 0015g/L CuCl2, 0. 003g/L H3BO3,
0.0025g/LNa2Mo04,0 . 008g/L Zn (CH3COO) 2，0. 06g/L 檸檬酸鐵(III), 0. 0045g/L 硫胺素，
1.3g/L MgS04，10g/じ甘油，5g/l/酵母提取物，pH 7.0)。相同的培養(yǎng)基組合物用于菌株17和26的發(fā)酵，其含有適當(dāng)?shù)目股?菌株17 :lOOug/mL羧芐青霉素和50ug/mL大觀霉素；菌株26 50ug/mL大觀霉素)。對(duì)于紫杉ニ烯-5 a -醇生產(chǎn)菌株,菌株26-At24T5 a OH-tTCPR在含有50ug/mL大觀霉素和34ug/mL氯霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),將50mL 8h培養(yǎng)物(0D 2. 2)接種至一升含有1%甘油(V/V)的復(fù)合培養(yǎng)基中。用0.5(vvm)的過(guò)濾空氣提供氧氣,并調(diào)整攪拌以保持溶氧水平高于30%。用10% NaOH將培養(yǎng)物的pH控制在7. O。發(fā)酵罐中培養(yǎng)物的溫度控
制在30°C,直到細(xì)胞生長(zhǎng)到用波長(zhǎng)600nm(0D6。。)測(cè)量的吸光度為約0. 8。發(fā)酵罐的溫度降低到22で，用0. ImM IPTG對(duì)途徑進(jìn)行誘導(dǎo)。無(wú)菌地加入十二烷至培養(yǎng)基體積的20% (V/V)。在發(fā)酵過(guò)程中，甘油和醋酸積累的濃度用恒定的時(shí)間間隔來(lái)監(jiān)測(cè)。在發(fā)酵過(guò)程中當(dāng)甘油濃度低于o. 5-lg/L時(shí),向生物反應(yīng)器中引入3g/L的甘油。紫杉ニ烯和紫杉ニ烯-5 a-醇的GC-MS分析為分析小規(guī)模培養(yǎng)物中的紫杉ニ烯積累，將I.SmL的培養(yǎng)物用ImL己燒振蕩30mino將混合物離心以分離有機(jī)層。對(duì)生物反應(yīng)器,用正己烷將IuL的十二烷層稀釋至200uL。用 GC-MS (Varian saturn 3800GC 連接至 Varian 2000MS)分析 IuL 的己烷層。將樣品注入到 HP5ms 柱中(30mX250uMX0. 25uM 厚度)(Agilent Technologies USA)。流速為I. Oml/min的氦氣(超純)用作載氣。爐溫首先在50°C保持恒定Imin,然后以10°C /min遞增上升到220°C,最后在此溫度下保持lOmin。注入器和傳輸線(xiàn)溫度分別設(shè)置在2()()°C和250。。。對(duì)于紫杉ニ烯和紫杉ニ烯5 a -醇,生物或合成來(lái)源的標(biāo)準(zhǔn)化合物尚未投放市場(chǎng)。因此，我們?cè)?L生物反應(yīng)器中對(duì)產(chǎn)生紫杉ニ烯的大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵以提取純的物質(zhì)。用己烷通過(guò)溶劑萃取來(lái)提取紫杉ニ烯,隨后經(jīng)多輪硅膠柱層析來(lái)獲得純的物質(zhì),用于構(gòu)建GC-MS 分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。我們已將純紫杉ニ烯的GC和MS譜與文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行了比絞，以確認(rèn)該化合物的真實(shí)性6°。為檢測(cè)純度，我們進(jìn)行了紫杉ニ烯的1HNMR。由于紫杉ニ烯_5 a-醇積累的水平非常低，我們用紫杉ニ烯作為定量該分子生產(chǎn)的手段，以及來(lái)自以前報(bào)告的真實(shí)質(zhì)譜斷裂特征。42用于工程化菌株的轉(zhuǎn)錄分析的qPCR測(cè)量通過(guò)對(duì)從適當(dāng)菌株分離出的mRNA進(jìn)行qPCR來(lái)檢測(cè)每個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)水平。為防止降解，在細(xì)胞裂解前用RNAprotect細(xì)菌試劑(Qiagen)來(lái)穩(wěn)定RNA。隨后，用RNeasy mini試劑盒(Qiagen)與基于核酸酶的基因組DNA污染物去除相結(jié)合來(lái)提取總RNAd用 iScriptcDNA 合成試劑盒(Biorad)來(lái)擴(kuò)增 cDNA。用 iQ SYBR Green Supermix (Biorad)在Bio-Rad iCycler ....ヒ進(jìn)行qPCR。將表達(dá)恒定的rrsA基因的表達(dá)水平用于對(duì)qPCR值進(jìn)行歸ー化ob。表3有用于qPCR的引物。對(duì)于姆對(duì)引物，用大腸桿菌的mRNA為模板構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。實(shí)施例I :紫杉ニ烯積累顯示出對(duì)上游MEP和下游合成紫杉ニ烯途徑的相對(duì)強(qiáng)度有強(qiáng)非線(xiàn)性依賴(lài)性。圖Ib描繪了將啟動(dòng)子和基因拷貝數(shù)相結(jié)合以通過(guò)紫杉ニ烯合成的上游和下游途徑來(lái)調(diào)節(jié)相對(duì)通量(或強(qiáng)度)的多種方法。為解決MEP途徑的瓶頸，以及將其與下游紫杉ニ烯途徑達(dá)到最佳平衡,共構(gòu)建了 16種菌株。圖2a, b總結(jié)了這些菌株中每一種的紫杉ニ烯積累結(jié)果，其中圖2a強(qiáng)調(diào)了在下游途徑是恒定值時(shí)紫杉ニ烯積累對(duì)上游途徑的依賴(lài)性，而圖2b是上游途徑的強(qiáng)度恒定時(shí)對(duì)下游途徑的依賴(lài)性(從報(bào)道的啟動(dòng)子強(qiáng)度和質(zhì)?？截悢?shù)來(lái)計(jì)算上游和下游途徑的表達(dá)33_36，也見(jiàn)表I)。顯然,有關(guān)上游和下游途徑二者的表達(dá)均有最大值。對(duì)恒定的下游途徑表達(dá)(圖2a),隨著上游途徑的表達(dá)從非常低水平増加,紫杉ニ烯產(chǎn)量首先由于整個(gè)途徑的前體供應(yīng)增加而增加。然而，經(jīng)過(guò)ー個(gè)中間值后，下游途徑的能力無(wú)法滿(mǎn)足上游途徑的進(jìn)ー步増加。該途徑的不平衡導(dǎo)致中間體(如下)的積累,其可抑制細(xì)胞或簡(jiǎn)單地將通量轉(zhuǎn)移至競(jìng)爭(zhēng)途徑,最終導(dǎo)致紫杉ニ烯積累的減少。對(duì)恒定的上游途徑表達(dá)(圖2b),同樣觀察到有關(guān)下游途徑表達(dá)水平的最大值。這是由于下游途徑的低水平表達(dá)對(duì)紫杉ニ烯生產(chǎn)的初始限制，因此是紫杉ニ烯生產(chǎn)的限速途徑。在下游途徑高水平表達(dá)時(shí)，我們同樣看到高拷貝數(shù)對(duì)細(xì)胞生理上的負(fù)面影響，因此下游途徑表達(dá)存在最大值。這些結(jié)果表明，紫杉ニ烯積累的顯著變化可從上游和下游途徑表達(dá)水平在狹窄窗ロ內(nèi)改變而獲得。例如，在其染色體____ヒ含有Trc啟動(dòng)子控制下上游途徑之額外拷貝的菌株(菌株8，圖2a)比僅過(guò)表達(dá)合成的下游途徑的菌株(菌株1，圖2a)產(chǎn)生了多2000倍的紫杉ニ烯。此外,將下游合成操縱子中的基因順序從GT (GPPS-TS)變?yōu)門(mén)G(TS-GPPS)引起2-3倍的增加(菌株1_4與5、8、11和14相比)。觀察到的結(jié)果顯示,紫杉ニ烯過(guò)量生產(chǎn)的關(guān)鍵是充足的下游途徑能力以及上游前體途徑與F游合成的紫杉ニ烯途徑之間的小心平衡?？傊@些工程化菌株證明，如果同時(shí)捜索內(nèi)源性上游和合成下游途徑的廣泛表達(dá)水平，則MEP途徑通量可以是顯著的。實(shí)施例2 :上游和下游途徑的染色體整合和微調(diào)，以進(jìn)一步增強(qiáng)紫杉ニ烯生產(chǎn)。為提供充足的F游途徑強(qiáng)度，同時(shí)盡可能減少質(zhì)粒帶來(lái)的代謝負(fù)擔(dān)37,設(shè)計(jì)了新的兩組菌株,每組4個(gè)菌株(菌株25-28和29-32),其中下游途徑置于強(qiáng)啟動(dòng)子(T7)的控制下，而分別保持相對(duì)低的5和10個(gè)拷貝數(shù)?？梢钥闯?圖2c)，在高下游強(qiáng)度時(shí)保持紫杉ニ烯的最大值(菌株21-24),而在低下游途徑強(qiáng)度時(shí)獲得單調(diào)響應(yīng)(菌株17-20,圖2c)。這ー觀察促使我們構(gòu)建了額外的兩組菌株，每組4個(gè)菌株，其保持了與之前相同的下游途 徑強(qiáng)度水平,但表達(dá)非常低水平的上游途徑(菌株25-28和29-32株’圖2d)。此外，后ー組菌株上游途徑的操縱子是染色體整合的?？梢钥闯?，不僅恢復(fù)了紫杉ニ烯最大值(盡管上游途徑水平非常低)，而且得到了更大的紫杉ニ烯最大值(300mg/L)。我們認(rèn)為,這種顯著増加可歸因于減少了細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)。這是通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn)的1)通過(guò)將途徑整合到染色體中而消除質(zhì)粒依賴(lài)性和2)在上游和下游途徑表達(dá)之間達(dá)到良好平衡。32種重組構(gòu)建體使我們能充分研究模塊化途徑的表達(dá)空間并將紫杉ニ烯產(chǎn)量提高了約15000倍。這是迄今為止報(bào)告的來(lái)自大腸桿菌MEP異戊ニ烯途徑的遙遙領(lǐng)先的最高萜類(lèi)化合物生產(chǎn)(圖3a)。此外,觀察到的萜類(lèi)化合物生產(chǎn)的改善倍數(shù)顯著高于那些已報(bào)道的組合代謝工程方法，該方法捜索了包含多達(dá)十億種異戊ニ烯途徑組合變體的廣泛基因空間。3°這表明，比起多來(lái)源的組合基因優(yōu)化，途徑優(yōu)化更依賴(lài)于途徑模塊的精細(xì)平衡。圖I的表型譜中顯示的多個(gè)最大值強(qiáng)調(diào)了用足夠分辨率來(lái)檢測(cè)表達(dá)空間以確定最佳整體途徑性能區(qū)域的重要性。圖7描繪了來(lái)自模塊化途徑表達(dá)搜索的紫杉ニ烯生產(chǎn)的改善倍數(shù)。實(shí)施例3 :代謝物與紫杉ニ烯產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)以及代謝物的鑒定。對(duì)先前工程化菌株的代謝組分析鑒定出了與途徑表達(dá)水平和紫杉ニ烯生產(chǎn)強(qiáng)烈相關(guān)的代謝副產(chǎn)物(圖3和圖8)。雖然該代謝物的化學(xué)身份是未知的,但我們推測(cè)它是異戊ニ烯副產(chǎn)物，引起途徑分流并已作為直接變量與工程菌的紫杉ニ烯生產(chǎn)負(fù)相關(guān)(圖3和圖8)。我們最佳菌株的關(guān)鍵屬性是減少該代謝物積累引起更高紫杉ニ烯生產(chǎn)的精細(xì)平衡。該平衡可通過(guò)從染色體或不同的質(zhì)?？截悢?shù)、使用不同的啟動(dòng)子的不同水平來(lái)調(diào)節(jié),獲得顯著不同的紫杉ニ烯積累。隨后,通過(guò)GC-MS、1H和13C核磁共振(NMR)譜研究,在氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)譜圖中相應(yīng)峰被確定為吲哚(圖16)。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)吲哚水平高于 100mg/L時(shí)，菌株26的紫杉ニ烯合成受到外源性吲哚的嚴(yán)重抑制(圖1.5b)。進(jìn)ー步提高吲哚濃度還抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，其抑制水平是高度菌株依賴(lài)性的(圖15c)。雖然吲哚與異戊ニ烯途徑相互作用的生化機(jī)理目前尚不清楚，但在圖15中的結(jié)果提示,吲哚和異戊ニ烯途徑的萜類(lèi)化合物之間可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有協(xié)同作用。菌株26看來(lái)有緩解吲哚的作用,但并不清楚具體機(jī)制，這要我們接下來(lái)進(jìn)一步研究。 實(shí)施例4 :工程化菌株的培養(yǎng)。為了研究工程化菌株在受控條件下的紫杉ニ烯生產(chǎn)潛力，在IL生物反應(yīng)器中對(duì)三個(gè)最高紫杉ニ烯積累菌株(菌株22, 60mg/L ;菌株17, 125mg/L ;菌株26, SOOmg/D進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)(圖17)。在用20% (V/V)十二烷覆蓋層進(jìn)行液-液兩相發(fā)酵的情況下進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)的研究。引入有機(jī)溶劑以防止分泌的紫杉ニ烯像初歩研究中那樣從發(fā)酵培養(yǎng)基中吹脫(air stripping)出來(lái)。在甘油供給受控的確定培養(yǎng)基中，菌株22、17和 26 的紫杉ニ烯生產(chǎn)力分別提高到 174±5mg/L(SD)、210±7mg/L(SD)、1020±80mg/L(SD)(圖17a)。此外,紫杉ニ烯的生產(chǎn)明顯影響了生長(zhǎng)表型、乙酸積累和甘油消耗(圖17b-17d)。圖17c顯示，酸最初在所有菌株中積累，而 60小時(shí)后乙酸在菌株17和26中減少，而在菌種22中繼續(xù)增加。這種現(xiàn)象凸現(xiàn)出高M(jìn)EP通量菌株(26和17)和低MEP通量菌株(22)之間中央碳代謝的差異。此外，該觀察結(jié)果再次證明了作為精細(xì)平衡的功能性菌株之特征的良好生理機(jī)能。由于用于發(fā)酵的高起始甘油濃度和相應(yīng)的高甘油途徑流量,最 初所有菌株均產(chǎn)生作為溢出代謝產(chǎn)物的乙酸。該流量也足以供應(yīng)MEP途徑，以及細(xì)胞內(nèi)的其他代謝途徑。在 48小時(shí)，初始甘油耗盡,培養(yǎng)切換至補(bǔ)料分批培養(yǎng)模式，在此期間，維持低但恒定的甘油水平。這導(dǎo)致低的總甘油通量,這對(duì)于有高M(jìn)EP通量(菌株26和17)的菌株而言，其大部分被分流至MEP途徑而最大限度地減少溢出代謝。因此乙酸生產(chǎn)減少或甚至完全消除。對(duì)于乙酸濃度的下降，可能是在一定程度上發(fā)生了こ酸的同化作用，雖然這沒(méi)有從流量分析角度進(jìn)ー步研究。一定程度的蒸發(fā)和由于甘油補(bǔ)料所致的稀釋進(jìn)一歩促進(jìn)了觀察到的乙酸濃度下降。相比之下,對(duì)低MEP通量的菌株(菌株22)而言,流量分流至MEP途徑并不明顯，因此甘油通量仍供應(yīng)了所有必要的碳源和能量需求。溢出代謝繼續(xù)發(fā)生，引起乙酸分泌。顯然，菌株26的高生產(chǎn)カ和更強(qiáng)的生長(zhǎng)使得紫杉ニ烯的積累非常高。通過(guò)優(yōu)化生物反應(yīng)器中的條件、平衡培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)以及優(yōu)化碳源運(yùn)送來(lái)進(jìn)一步改善應(yīng)該是可能的。實(shí)施例5 :....ヒ游和F游途徑表達(dá)水平和細(xì)胞生長(zhǎng)揭示了潛在的復(fù)雜性。為更詳細(xì)地了解改造后的途徑表達(dá)平衡,我們將從圖2c和d的最高紫杉ニ烯生產(chǎn)菌株和鄰近菌株(菌株17、22和25-32)的dxs (上游途徑)和TS (下游途徑)的轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)水平進(jìn)行定量(圖4a,b)。像我們推測(cè)的--樣,上游途徑的表達(dá)從天然啟動(dòng)子Trc、T5、T7和10拷貝和20拷貝質(zhì)粒隨著啟動(dòng)子強(qiáng)度和MEP載體的拷貝數(shù)單調(diào)遞增，如DXS表達(dá)中所見(jiàn)(圖4a)。因此我們發(fā)現(xiàn)，dxs表達(dá)水平與上游途徑強(qiáng)度的相關(guān)性很好。對(duì)上游途徑的其他基因idi、ispl)和ispF也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的相關(guān)性(圖14a,b)。在下游基因表達(dá)中，將途徑從5拷貝質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到10拷貝質(zhì)粒(25-28系列和29-32系列)后，定量了 2倍的改善(圖 4b)。盡管啟動(dòng)子和拷貝數(shù)效應(yīng)影響基因表達(dá)，但對(duì)其他途徑表達(dá)的次級(jí)效應(yīng)也很突出。圖4a顯示,對(duì)于相同的dxs表達(dá)盒,通過(guò)將TS質(zhì)粒的拷貝數(shù)從5增加至10, dxs的表達(dá)増加。有趣的是，與10拷貝TS質(zhì)粒相比,5拷貝TS質(zhì)粒(菌株25-28系列)含有顯著更高的紫杉ニ烯生產(chǎn)(圖2d)和更少的生長(zhǎng)(圖4c，d)。不包含紫杉ニ烯異源性途徑的對(duì)照質(zhì)粒為2倍的生長(zhǎng)密度,提示菌株25-28系列中的生長(zhǎng)抑制直接與紫杉ニ烯代謝途徑和紫杉ニ烯及其直接中間體的累積相關(guān)(圖4c)。然而,紫杉ニ烯表達(dá)菌株與空白對(duì)照質(zhì)粒相比，菌株29-32系列僅表現(xiàn)出生長(zhǎng)量的中等増加(圖4d)。在質(zhì)粒為基礎(chǔ)的上游表達(dá)載體(菌株17和22)中也可以看到生長(zhǎng)、紫杉ニ烯生產(chǎn)和表達(dá)水平之間的這種互作。與20拷貝的更低紫杉ニ烯生產(chǎn)菌株(菌株22)相比，10拷貝的局紫杉ニ烯生產(chǎn)菌株(菌株17)的生長(zhǎng)抑制要高得多。因此,產(chǎn)物毒性和碳轉(zhuǎn)移到異源性途徑很可能阻礙生長(zhǎng)而不是質(zhì)粒維持。也出人意料的是，上游表達(dá)載體對(duì)F游表達(dá)產(chǎn)生明顯的影響。如果途徑之間沒(méi)有串?dāng)_，圖4b將有兩條直線(xiàn)。然而,對(duì)不同的MEP表達(dá)載體,TS表達(dá)觀察到了 3倍的變化。這很可能是由于四個(gè)上游和兩個(gè)下游基因的過(guò)表達(dá)對(duì)從宿主代謝中得到的資源(原材料和能量)的明顯競(jìng)爭(zhēng)。38與對(duì)照菌株25c相比，菌株25觀察到了 4倍的生長(zhǎng)抑制,提示與天然途徑的過(guò)表達(dá)相比，合成的紫杉ニ烯途徑的高過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)毒性，改變了生長(zhǎng)表型(圖4c)。然而，在我們的情況下，隨著上游表達(dá)増加,下游表達(dá)無(wú)意中減少至理想水平，以平衡上游和下游途徑,最大限度地減少了生長(zhǎng)抑制(菌株26)。在蛋白過(guò)表達(dá)的極端情況下，由于四個(gè)蛋白質(zhì)的高水平合成(菌株28和32), T7 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的MEP途徑導(dǎo)致嚴(yán)重的生長(zhǎng)抑制。由TZ啟動(dòng)的TS基因表達(dá)沒(méi)有出現(xiàn)對(duì)自身的重大影響。17誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)的高速率合成(圖4ab)可導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成機(jī)制的下調(diào),包括來(lái)自早期生長(zhǎng)相的看家基因組分，損害細(xì)胞生長(zhǎng)并降低生物質(zhì)的增加39''我們推測(cè)，我們觀察到的復(fù)雜生長(zhǎng)表型是以下方面的累積效應(yīng)(1)異戊ニ烯/紫杉ニ烯代謝活化所誘導(dǎo)的毒性，和(2)高重組蛋白質(zhì)表達(dá)的影響?？傊?我們的多變量模塊化途徑工程方法在萜類(lèi)化合物代謝以及它與途徑表達(dá)和細(xì)胞生理的相關(guān)性方面產(chǎn)生了意想不到的多祥性。對(duì)用于次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的微生物的理性設(shè)計(jì)將需要對(duì)途徑表達(dá)有超出啟動(dòng)子強(qiáng)度和拷貝數(shù)之線(xiàn)性/非依賴(lài)性了解的理解。然而,本文所用的簡(jiǎn)單的多變量的方法可引入必要的多祥性以(1)尋找高產(chǎn)菌株，和(2)提供對(duì)代謝途徑工程中占主導(dǎo)地位但尚不了解的更高階效應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)性研究的前景。 實(shí)施例6 :在大腸桿菌中改造基于紫杉醇P450的氧化化學(xué)。紫杉醇生物合成中的核心特征是在紫杉烷核心結(jié)構(gòu)多個(gè)位點(diǎn)的氧化作用，反應(yīng)被認(rèn)為是由細(xì)胞色素P450依賴(lài)性的單加氧酶介導(dǎo)的。41途徑中專(zhuān)門(mén)的環(huán)化步驟完成后，母體烯烴(紫杉烷-4 (5), 11(12) - ニ烯)接著由細(xì)胞色素P450酶在C5位氧化，代表到紫杉醇路線(xiàn)的8個(gè)(紫杉烷核心的)氧化步驟中的第一歩(圖6)。42因此,對(duì)紫杉醇生產(chǎn)工程微生物的關(guān)鍵步驟是在體內(nèi)發(fā)生基于P450的氧化。第一個(gè)氧化步驟是由細(xì)胞色素P450(紫杉ニ烯5 a -羥化酶)催化的，它是ー種不常見(jiàn)的單加氧酶，催化ニ萜前體紫杉ニ烯中的羥化反應(yīng)和雙鍵遷移(圖5a)。我們報(bào)道了首次成功地將合成途徑從紫杉ニ烯延伸至紫杉ニ烯-5 a -醇，并展示了首次在大腸桿菌體內(nèi)生產(chǎn)任何功能性紫杉醇中間體的實(shí)例。在一般情況下，由于細(xì)菌平臺(tái)固有的局限性(例如缺少電子傳遞機(jī)制、細(xì)胞色素P450還原酶和由于缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而導(dǎo)致的P450酶膜信號(hào)模塊的翻譯不兼容性)，植物細(xì)胞色素P450的功能性表達(dá)具有挑戰(zhàn)性。43最近，通過(guò)跨膜(I'M)工程以及P450和CPR還原酶的嵌合酶的產(chǎn)生,ー些植物P450已在大腸桿菌中表達(dá),用于功能性模塊的生物合成.22’44然而,每一種植物細(xì)胞色素P450的跨膜信號(hào)序列和從其還原酶對(duì)應(yīng)物的電子轉(zhuǎn)移特性都是獨(dú)特的。45我們的初歩研究主要著眼于通過(guò)N-端跨膜工程和通過(guò)與來(lái)自紫杉物種的CPR氧化還原伴侶(紫杉細(xì)胞色素P450還原酶(TCPR))翻譯融合以產(chǎn)生嵌合酶來(lái)對(duì)密碼子優(yōu)化的合成紫杉ニ烯5a-羥化酶進(jìn)行表達(dá)優(yōu)化(圖5b)42’44’46。產(chǎn)生的嵌合酶之一是At24T5 a OH-tTCPR,在第一個(gè)氧化步驟中有很高效率,有超過(guò)98 %的紫杉ニ烯轉(zhuǎn)換為紫杉ニ烯-5 a -醇和副產(chǎn)物5 (12)-氧-3 (11)-環(huán)紫杉烷(OCT)(圖9a)。與其他P450嵌合體相比，At24T5 a OH-tTCPR獲得了 2倍的紫杉ニ烯-5 a —醇生產(chǎn)(21mg/L)。此外,At.8T5 a OH-tTCPR和At24T5 a OH-tTCPR的更弱活性導(dǎo)致了最近表征的副產(chǎn)物(紫杉ニ烯發(fā)生復(fù)雜的結(jié)構(gòu)重排成環(huán)醚5(12)-氧-3(11)環(huán)紫杉烷(OCT))的積累(圖9)47。副產(chǎn)物累積的量與所需的產(chǎn)物紫杉ニ烯 -5 a-醇大致相等。OCT的形成是之前沒(méi)有的紫杉細(xì)胞色素P450反應(yīng)序列(包括氧化和后續(xù)環(huán)化)介導(dǎo)的47。因此,很可能通過(guò)紫杉ニ烯5 a -羥化酶的蛋白質(zhì)工程,在環(huán)化前終止反應(yīng)將防止這些不良副產(chǎn)物的積累，并可實(shí)現(xiàn)將通量引導(dǎo)至紫杉ニ烯_5 a -醇。相對(duì)于親本菌株26的紫杉ニ烯生產(chǎn)( 300mg/L),菌株26-At24T5 a OH-tTCPR的生產(chǎn)カ顯著降低,先前描述的未表征代謝物的積累隨之增加。未觀察到紫杉ニ烯的積累。顯然，引入帶有At24T5 a OH-tTCPR構(gòu)建體的額外中等拷貝質(zhì)粒(10拷貝，plOT7)破壞了菌株26中上游和下游途徑精心設(shè)計(jì)的平衡。在生物反應(yīng)器中進(jìn)行小規(guī)模發(fā)酵以定量菌株26-At24T5 a OIFtTCPR產(chǎn)生的醇。紫杉ニ烯-5 a -醇的時(shí)間過(guò)程譜(圖5d)表明醇生產(chǎn)高達(dá)58土3mg/L,帶有等量的OCT副產(chǎn)物產(chǎn)生。觀察到的醇生產(chǎn)比之前釀酒酵母中的生產(chǎn)高 2400倍17。紫杉ニ烯-5 a -醇生產(chǎn)的進(jìn)一步提高很可能是通過(guò)途徑優(yōu)化和蛋白質(zhì)工程實(shí)現(xiàn)的。途徑優(yōu)化的多變量模塊化方法己取得了關(guān)鍵紫杉醇前體的極高產(chǎn)菌株。此外,重組構(gòu)建體在轉(zhuǎn)移通量至其他復(fù)雜藥物化合物的合成上同樣有效，例如由相同途徑工程產(chǎn)生的單萜、倍半萜和ニ萜(香葉醇，芳樟醇,紫穗槐ニ烯和左旋海松ニ烯)(結(jié)果未公開(kāi))。因此，我們的途徑工程開(kāi)辟了生物合成天然產(chǎn)物的新途徑，尤其是微生物來(lái)源的萜類(lèi)化合物，用作化學(xué)品或來(lái)自可再生資源的燃料。通過(guò)著眼于通用的萜類(lèi)化合物前體IPP和DMAPP，可以首先確定關(guān)鍵途徑模塊，然后調(diào)節(jié)表達(dá)以使途徑模塊的達(dá)到最佳平衡,使前體無(wú)縫轉(zhuǎn)換并且中間體積累盡可能少。這種做法看來(lái)比大遺傳空間的組合檢索更有效,也并不依賴(lài)于高通量篩選。MEP途徑在能量上是平衡的,從而整體上將葡萄糖或甘油轉(zhuǎn)換至異戊ニ烯更有效。然而,在過(guò)去的10年里，在大腸桿菌中改造MEP途徑以提高用于類(lèi)胡蘿卜素28'47、倍半萜23和ニ萜61過(guò)表達(dá)的關(guān)鍵前體IPP和DMAPP之供應(yīng)的許多嘗試取得的成功十分有限。這種低效率歸因于與大腸桿菌中MEP途徑表達(dá)特異性相關(guān)的調(diào)節(jié)作用是未知的。23在這里，我們提供的證據(jù)表明，這種限制與由于途徑表達(dá)不是最佳而導(dǎo)致的代謝物吲哚的積累有關(guān)，這抑制了異戊ニ烯途徑的活性。紫杉ニ烯過(guò)量生產(chǎn)(在吲哚形成抑制的條件下)確定了 MEP途徑是對(duì)異戊ニ烯家族的藥物和化學(xué)產(chǎn)品的生物合成的非常有效的路線(xiàn)。人們只需要像我們的多變量模塊化途徑工程方法提出的那樣仔細(xì)地平衡模塊化途徑。對(duì)于成功的紫杉醇微生物生產(chǎn)，紫杉ニ烯核心的以P450為基礎(chǔ)的氧化化學(xué)修飾作用是必要的41。在紫杉醇生物合成途徑的19個(gè)不同酶促步驟中，細(xì)胞色素P450單加氧酶貢獻(xiàn)了大約一半的步驟。特征性的是,這些基因彼此之間顯示了不尋常的高序列相似性(> 70% )，但與其他植物P450之間顯示了低相似性(< 30% )14。由于紫杉醇單加氧酶之間的明顯的相似性，因此表達(dá)合適的活性以用于特異性的P450氧化化學(xué)特別有挑戰(zhàn)。通過(guò)TM工程和用氧化還原伴侶(TCPR)構(gòu)建人工嵌合酶,紫杉醇細(xì)胞色素P450 (紫杉ニ烯5 a -羥化酶)在大腸桿菌中功能性表達(dá)，并顯示在體內(nèi)有效地將紫杉ニ烯轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的醇產(chǎn)物。先前的體外研究已描述了由天然紫杉ニ烯5 a -羥化酶將紫杉ニ烯轉(zhuǎn)換為紫杉ニ烯-5 a -醇的機(jī)制,但并未在體內(nèi)討論過(guò)同樣的轉(zhuǎn)換42。該氧化和重排反應(yīng)涉及氫從紫杉ニ烯的C20位抽離以形成烯丙基自由基中間體,接著在C5位發(fā)生部位和立體特異性的氧插入以形成醇衍生物(圖5a)。在紫杉細(xì)胞中觀察到的中等豐度的酶以及低kcat值提示，相對(duì)于紫杉醇途徑中下游氧化和?；饔茫仙即忌锖铣傻? a -羥基化步驟速度是慢的41。因此，對(duì)該步驟的改造對(duì)紫杉醇合成是關(guān)鍵的,尤其是紫杉醇P450在原核宿主如大腸桿菌中進(jìn)行功能性改造的情況下。此外,該步驟在酵母中構(gòu)建途徑的前期努力是限制性步驟。17本研究中的工程構(gòu)建體顯示了紫杉ニ烯在體內(nèi)> 98%的轉(zhuǎn)化率,產(chǎn)物積累達(dá) 60mg/L，比先前在酵母中的異源表達(dá)改善了 2400倍。因此本研究不僅成功合成明顯更高量的關(guān)鍵紫杉醇中間體,而且也提供了通過(guò)類(lèi)似的P450化學(xué)對(duì)途徑中后續(xù)代謝物進(jìn)行合成的基礎(chǔ)。此前對(duì)紫杉醇構(gòu)效關(guān)系的研究已表明，通過(guò)去除或添加一些功能性基團(tuán)進(jìn)行的改變不會(huì)實(shí)質(zhì)性改變紫杉醇的活性⑶。然而，由于通過(guò)化學(xué)合成引入改變的能力有限，因此 該研究是受限制的。紫杉醇合成的微生物路徑的可用性將大幅擴(kuò)大了可被檢測(cè)的化學(xué)修飾的空間,從而増加了鑒定更有效的候選藥物的可能性。這為藥物開(kāi)發(fā)提供了激動(dòng)人心的新機(jī)遇,尤其是考慮到這些候選藥物也將與高效的生產(chǎn)路線(xiàn)相關(guān)。在過(guò)去的幾十年中，與任何其他天然產(chǎn)物候選藥物相比,紫杉醇已在科學(xué)界和廣大市民中催生了更多的興趣 ' 由于將紫杉醇或紫杉醇類(lèi)似物用作癌癥化學(xué)治療的大幅增長(zhǎng)，預(yù)計(jì)會(huì)出現(xiàn)重大的供應(yīng)危機(jī),這需要新的生產(chǎn)途徑，如在微生物中改造生物合成機(jī)制8。雖然紫杉物種一些能生產(chǎn)天然紫杉醇的內(nèi)生真菌已被分離,但這些微生物系統(tǒng)尚未證實(shí)適合可持續(xù)性地生產(chǎn)該藥物49。本文報(bào)道的結(jié)果掲示了對(duì)來(lái)自微生物的紫杉醇或紫杉醇前體的革命性步驟,這通過(guò)消除專(zhuān)門(mén)前體途徑中的瓶頸來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，合成途徑的裝配提供了通過(guò)途徑的選擇性改造來(lái)改變紫杉ニ烯結(jié)構(gòu)而提供了改造紫杉醇類(lèi)似物的的新可能性。這些發(fā)展為紫杉醇或合適的紫杉醇前體生產(chǎn)提供了成本效益樂(lè)觀的微生物路線(xiàn)。表I.上游和下游途徑的表達(dá)排序，以任意単位(a. u.)計(jì)。MEP途徑和GGPP合酶/紫杉ニ烯合酶途徑的表達(dá)水平用啟動(dòng)子強(qiáng)度和拷貝數(shù)的公布值來(lái)估計(jì)。啟動(dòng)子強(qiáng)度計(jì)算是 Trc = I, T5 = I. 96, T7 = 4. 97,以 Brosius 等和 Brunner 等為基礎(chǔ) 33’3% 基因拷貝數(shù)通過(guò)所用不同質(zhì)粒的公布復(fù)制起點(diǎn)的拷貝數(shù)來(lái)分配,整合的情況為I個(gè)拷貝35_37。共表達(dá)由啟動(dòng)子強(qiáng)度和基因拷貝數(shù)的乘積計(jì)算。MEP途徑的天然表達(dá)任意指定一個(gè)值,并改變GGPP合酶和紫杉ニ烯的操縱子順序來(lái)實(shí)現(xiàn)紫杉ニ烯合酶表達(dá)的20% 35。這些對(duì)共表達(dá)的估計(jì)用于指導(dǎo)改造嘗試。E :大腸桿菌K12MG1655,帶有兩個(gè)缺失ArecA A endA ；EI)E3 K12MG1655ArecAAendA,帶有整合的 T7RNA 聚合酶(DE3) ;MEP :dxs-idi_ispDF 操縱子；GT :GPPS-TS操縱子；TG :TS_GPPS操縱子；Chl :染色體中一個(gè)拷貝；Trc :t.rc啟動(dòng)子；T5 :T5啟動(dòng)子；T7 :T7啟動(dòng)子；p5 : 5拷貝的質(zhì)粒(pSClOl) ；pl0 :10拷貝的質(zhì)粒(pl5A) ;P20 : 20拷貝的質(zhì)粒(pBR322)。表I
- If Wi
上游MEP
'...........................I...........................................』
1 構(gòu)建體 I
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權(quán)利要求
1.ー種方法,其包括 在過(guò)表達(dá)非甲羥戊酸(MEP)途徑中'^-種或更多種組分的細(xì)胞中重組表達(dá)紫杉ニ烯合酶和攏牛兒基攏牛兒基ニ磷酸合酶(GGPPS)。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
3.權(quán)利要求2的方法,其中所述細(xì)胞是大腸桿菌(Escherichiacoli)細(xì)胞。
4.權(quán)利要求2的方法,其中所述細(xì)胞是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述細(xì)胞是芽孢桿菌(Bacillus)細(xì)胞。
6.權(quán)利要求I的方法，其中所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述酵母細(xì)胞是酵母屬(Saccharorayces)細(xì)胞。
8.權(quán)利要求6的方法,其中所述酵母細(xì)胞是耶氏酵母屬(Yarrowia)細(xì)胞。
9.權(quán)利要求I的方法，其中所述細(xì)胞是藻類(lèi)細(xì)胞。
10.權(quán)利要求I的方法，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
11.權(quán)利要求I的方法,其中所述紫杉ニ烯合酶是紫杉屬(Taxus)的酶。
12.權(quán)利要求11的方法,其中所述紫杉ニ烯合酶是短葉紫杉(Taxusbrevifolia)的酶。
13.權(quán)利要求1-12中任ー項(xiàng)的方法,其中所述GGPPS酶是紫杉屬的酶。
14.權(quán)利要求13的方法,其中所述GGPPS酶是加拿大紫杉(Taxuscanadenis)的酶。
15.權(quán)利要求1-14中任--項(xiàng)的方法,其中編碼所述紫杉ニ烯合酶的基因和/或編碼所述GGPPS酶的基因和/或編碼所述MEP途徑中一種或更多種組分的基因是由ー種或更多種質(zhì)粒表達(dá)。
16.權(quán)利要求1-15中任ー項(xiàng)的方法，其中編碼所述紫杉ニ烯合酶的基因和/或編碼所述GGPPS酶的基因和/或編碼所述MEP途徑中一種或更多種組分的基因整合到所述細(xì)胞的基因組中。
17.權(quán)利要求1-16中任ー項(xiàng)的方法,其中所述非甲羥戊酸(MEP)途徑中ー種或更多種組分選自 dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi、ispA 和 ispB。
18.權(quán)利要求17的方法,其中dxs、idi、ispD和ispF被過(guò)表達(dá)。
19.權(quán)利要求18的方法,其中dxs、idi、ispD和ispF在操縱子dxs-idi-idpDF上過(guò)表達(dá)。
20.權(quán)利要求1-19中任ー項(xiàng)的方法,其中編碼所述紫杉ニ烯合酶的基因和編碼所述GGPPS酶的基因在操縱子上一起表達(dá)。
21.權(quán)利要求1-20中任ー項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞還表達(dá)紫杉ニ烯5a-羥化酶(T5 a 0H)或其催化活性部分。
22.權(quán)利要求21的方法,其中所述T5a OH酶或其催化活性部分與細(xì)胞色素P450還原酶或其催化活性部分融合。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述T5a OH酶是At24T5 a OH-tTCPR。
24.權(quán)利要求1-23中任ー項(xiàng)的方法,其中使紫杉ニ烯合酶、GGPPS酶和MEP途徑中ー種或更多種組分的表達(dá)相平衡，以使紫杉ニ烯的產(chǎn)量最大化。
25.權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的方法,還包括培養(yǎng)所述細(xì)胞。
26.權(quán)利要求1-25中任ー項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生紫杉ニ烯或紫杉ニ烯_5a -醇。
27.權(quán)利要求26的方法,其中產(chǎn)生至少I(mǎi)Omgじ1的紫杉ニ烯。
28.權(quán)利要求27的方法,其中產(chǎn)生至少250mgじ1的紫杉ニ烯。
29.權(quán)利要求26的方法，其中產(chǎn)生至少I(mǎi)Omgじ1的紫杉ニ烯-5a -醇。
30.權(quán)利要求29的方法,其中產(chǎn)生至少50mgI:1的紫杉ニ烯-5 a -醇。
31.權(quán)利要求26,29或30的方法,其中紫杉ニ烯轉(zhuǎn)化成紫杉ニ烯-5a-醇和副產(chǎn)物5 (12)-氧-3 (I I)-環(huán)紫杉烷的百分比是至少50 %。
32.權(quán)利要求31的方法，其中紫杉ニ烯轉(zhuǎn)化成紫杉ニ烯-5a -醇和副產(chǎn)物5 (12)-氧-3 (I I)-環(huán)紫杉烷的百分比是至少75 %。
33.權(quán)利要求32的方法，其中紫杉ニ烯轉(zhuǎn)化成紫杉ニ烯_5a -醇和副產(chǎn)物5 (12)-氧-3(11)-環(huán)紫杉烷的百分比是至少95 %。
34.權(quán)利要求25-33中任ー項(xiàng)的方法,還包括從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收紫杉ニ烯或紫杉ニ烯-5 a -醇。
35.權(quán)利要求34的方法,其中從氣相回收紫杉ニ烯或紫杉ニ烯_5a -醇。
36.權(quán)利要求34的方法，其中向細(xì)胞培養(yǎng)物添加有機(jī)層，并從所述有機(jī)層回收紫杉ニ烯或紫杉—烯~~5 a -醇。
37.細(xì)胞，其過(guò)表達(dá)非甲羥戊酸(MEP)途徑中的一種或更多種組分,并且重組表達(dá)紫杉ニ烯合酶和物牛兒基物牛兒基ニ磷酸合酶(GGPPS)。
38.權(quán)利要求37的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
39.權(quán)利要求38的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
40.權(quán)利要求38的細(xì)胞,其中所述細(xì)胞是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞。
41.權(quán)利要求40的細(xì)胞,其中所述細(xì)胞是芽孢桿菌細(xì)胞。
42.權(quán)利要求37的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
43.權(quán)利要求42的細(xì)胞,其中所述酵母細(xì)胞是酵母屬細(xì)胞。
44.權(quán)利要求42的細(xì)胞，其中所述酵母細(xì)胞是耶氏酵母屬細(xì)胞。
45.權(quán)利要求37的細(xì)胞,其中所述細(xì)胞是藻類(lèi)細(xì)胞。
46.權(quán)利要求37的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
47.權(quán)利要求37的細(xì)胞，其中所述紫杉ニ烯合酶是紫杉屬的酶。
48.權(quán)利要求47的細(xì)胞,其中所述紫杉ニ烯合酶是短葉紫杉的酶。
49.權(quán)利要求37-48中任一項(xiàng)的細(xì)胞,其中所述GGPPS酶是紫杉屬的酶。
50.權(quán)利要求49的細(xì)胞，其中所述GGPPS酶是加拿大紫杉的酶。
51.權(quán)利要求37-50中任ー項(xiàng)的細(xì)胞，其中編碼所述紫杉ニ烯合酶的基因和/或編碼所述 GGPPS酶的基因和/或編碼所述MEP途徑中一種或更多種組分的基因由一種或更多種質(zhì)粒表達(dá)。
52.權(quán)利要求37-51中任ー項(xiàng)的細(xì)胞，其中編碼所述紫杉ニ烯合酶的基因和/或編碼所述GGPPS酶的基因和/或編碼所述MEP途徑中一種或更多種組分的基因整合到所述細(xì)胞的基因組中。
53.權(quán)利要求37-52中任一項(xiàng)的細(xì)胞,其中所述非甲羥戊酸(MEP)途徑中的一種或更多種組分選自 dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi、ispA 和 ispB。
54.權(quán)利要求53的細(xì)胞,其中dxs、idi、ispD和ispF被過(guò)表達(dá)。
55.權(quán)利要求54的細(xì)胞,其中dxs、idi、ispD和ispF在操縱子dxs-idi-idpDF上過(guò)表達(dá)。
56.權(quán)利要求37-55中任ー項(xiàng)的細(xì)胞，其中編碼紫杉ニ烯合酶的基因和編碼GGPPS酶的基因在操縱子上一起表達(dá)。
57.權(quán)利要求37-56中任--項(xiàng)的細(xì)胞,其中所述細(xì)胞還表達(dá)紫杉ニ烯5a-羥化酶(T5 a OH)或其催化活性部分。
58.權(quán)利要求57的細(xì)胞,其中所述T5a OH酶或其催化活性部分與細(xì)胞色素P450還原酶或其催化活性部分融合。
59.權(quán)利要求58的細(xì)胞,其中所述T5a OH酶作為At24T5 a OH-tTCPR表達(dá)。
60.權(quán)利要求37-59中任ー項(xiàng)的細(xì)胞,其中使所述紫杉ニ烯合酶、GGPPS酶和MEP途徑中一種或更多種組分的表達(dá)相平衡，以使紫杉ニ烯的產(chǎn)量最大化。
61.權(quán)利要求37-60中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生紫杉ニ烯或紫杉ニ烯-5 a-醇。
62.選擇表現(xiàn)出增強(qiáng)的萜類(lèi)化合物生產(chǎn)之細(xì)胞的方法,所述方法包括: 產(chǎn)生或獲得過(guò)表達(dá)非甲羥戊酸(MEP)途徑中一種或更多種組分的細(xì)胞， 從所述細(xì)胞產(chǎn)生職類(lèi)化合物， 將所述細(xì)胞的萜類(lèi)化合物產(chǎn)量與對(duì)照細(xì)胞的萜類(lèi)化合物產(chǎn)量進(jìn)行比較,和 選擇第一改進(jìn)細(xì)胞，其比對(duì)照細(xì)胞產(chǎn)生更高量的萜類(lèi)化合物，其中比對(duì)照細(xì)胞產(chǎn)生更高量萜類(lèi)化合物的第一改進(jìn)細(xì)胞就是表現(xiàn)出增強(qiáng)的萜類(lèi)化合物生產(chǎn)的細(xì)胞。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述細(xì)胞重組表達(dá)萜合酶。
64.權(quán)利要求62或63的方法,其中所述細(xì)胞重組表達(dá)櫳牛兒基物牛兒基ニ磷酸合酶(GGPPS)。
65.權(quán)利要求62-64中任一項(xiàng)的方法，還包括 在第一改進(jìn)細(xì)胞中改變非甲羥戊酸(MEP)途徑中一種或更多種組分、萜合酶和/或櫳牛兒基物牛兒基ニ磷酸合酶(GGPPS)的表達(dá)水平，以產(chǎn)生第二改進(jìn)細(xì)胞,和 將第二改進(jìn)細(xì)胞的萜類(lèi)化合物產(chǎn)量與第一改進(jìn)細(xì)胞的萜類(lèi)化合物產(chǎn)量進(jìn)行比較，其中比第一改進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生更高量萜類(lèi)化合物的第二改進(jìn)細(xì)胞就是表現(xiàn)出增強(qiáng)的萜類(lèi)化合物生產(chǎn)的細(xì)胞。
66.權(quán)利要求62-65中任一項(xiàng)的方法,其中所述萜合酶是紫杉ニ烯合酶。
67.分離的多肽，其包含與細(xì)胞色素P450還原酶或其催化活性部分相融合的紫杉ニ烯5 a -羥化酶(T5 a 011)或其催化活性部分。
68.權(quán)利要求67的分離多肽，其中所述細(xì)胞色素P450還原酶是紫杉屬細(xì)胞色素P450還原酶(TCPR)。
69.權(quán)利要求68的分離多肽，其中紫杉ニ烯5a -羥化酶和TCPR通過(guò)接頭連接在一起。
70.權(quán)利要求69的分離多肽，其中所述接頭是GSTGS(SEQIDNO 50)。
71.權(quán)利要求67-70中任一項(xiàng)的分離多肽，其中紫杉ニ烯5a -羥化酶和/或TCPR被截短以去除全部或部分跨膜區(qū)。
72.權(quán)利要求71的分離多肽，其中紫杉ニ烯5a -羥化酶的8、24或42個(gè)N端氨基酸被截去。
73.權(quán)利要求71或72的分離多肽,其中TCPR的74個(gè)氨基酸被截去。
74.權(quán)利要求67-73中任一項(xiàng)的分離多肽，其中紫杉ニ烯5a -羥化酶與其他肽融合。
75.權(quán)利要求74的分離多肽，其中所述其他肽來(lái)自牛17a羥化酶。
76.權(quán)利要求75的分離多肽,其中所述肽是MALLLAVF(SEQIDNO :51)。
77.權(quán)利要求67的分離多肽,其中所述分離多肽是At24T5a OH-tTC'PR。
78.編碼權(quán)利要求67-77中任一項(xiàng)所述多肽的核酸分子。
79.重組表達(dá)權(quán)利要求67-77中任一項(xiàng)所述多肽的細(xì)胞。
80.在產(chǎn)生ー種或更多種萜類(lèi)化合物的細(xì)胞中提高萜類(lèi)化合物生產(chǎn)的方法,包括控制細(xì)胞中或細(xì)胞培養(yǎng)物中的吲哚積累,從而提高細(xì)胞中萜類(lèi)化合物的生產(chǎn)。
81.權(quán)利要求80的方法，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
82.權(quán)利要求81的方法，其中所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
83.權(quán)利要求81的方法,其中所述細(xì)胞是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞。
84.權(quán)利要求83的方法,其中所述細(xì)胞是芽孢桿菌細(xì)胞。
85.權(quán)利要求80的方法，其中所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
86.權(quán)利要求85的方法,其中所述酵母細(xì)胞是酵母屬細(xì)胞。
87.權(quán)利要求85的方法，其中所述酵母細(xì)胞是耶氏酵母屬細(xì)胞。
88.權(quán)利要求80的方法,其中所述細(xì)胞是藻類(lèi)細(xì)胞。
89.權(quán)利要求80的方法，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
90.權(quán)利要求80的方法，其中所述細(xì)胞是權(quán)利要求37-61中任一項(xiàng)所述細(xì)胞。
91.權(quán)利要求80-90中任ー項(xiàng)的方法，其中所述控制細(xì)胞中或細(xì)胞培養(yǎng)物中吲哚積累的步驟包括使上游非甲羥戊酸異戊ニ烯途徑與下游產(chǎn)物合成途徑相平衡和/或改變或調(diào)節(jié)吲哚途徑。
92.權(quán)利要求80-91中任ー項(xiàng)的方法，其中所述控制細(xì)胞中或細(xì)胞培養(yǎng)物中吲哚積累的步驟包括或者還包括通過(guò)化學(xué)方法從發(fā)酵物中除去積累的吲哚，任選地使用吸附劑或清除劑。
93.權(quán)利要求80-92中任ー項(xiàng)的方法，其中所述ー種或更多種萜類(lèi)化合物是單萜、倍半貓、ニ職、三萜或四貓。
94.權(quán)利要求93的方法，其中所述ー種或更多種萜類(lèi)化合物是紫杉ニ烯或任何紫杉醇前體。
95.ー種方法,包括在產(chǎn)生ー種或更多種萜類(lèi)化合物的細(xì)胞中或在產(chǎn)生ー種或更多種萜類(lèi)化合物的細(xì)胞的培養(yǎng)物中測(cè)量吲哚的量或濃度。
96.權(quán)利要求95的方法，其中所述方法包括兩次或更多次測(cè)量吲哚的量或濃度。
97.權(quán)利要求95或權(quán)利要求96的方法,其中所測(cè)得的吲哚量或濃度用于指導(dǎo)生產(chǎn)一種或更多種萜類(lèi)化合物的方法。
98.權(quán)利要求95或權(quán)利要求96的方法，其中所測(cè)得的吲哚量或濃度用于指導(dǎo)菌株構(gòu)建。
99.權(quán)利要求62-66中任一項(xiàng)的方法,其中所述細(xì)胞還重組表達(dá)權(quán)利要求67-77中任一項(xiàng)的多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及紫杉二烯合酶和牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶(GGPPS)在細(xì)胞中的重組表達(dá)以及萜類(lèi)化合物的生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P23/00GK102812129SQ201080061010
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2010年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日
發(fā)明者帕拉伊·K·阿吉庫(kù)馬爾, 格里戈里·斯特凡諾普洛斯, 亨格·蓬·圖 申請(qǐng)人:麻省理工學(xué)院, 新加坡國(guó)立大學(xué)