專(zhuān)利名稱(chēng)：自由漂浮鏈漿膜癌干細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及漿膜癌干細(xì)胞(CSC)的克隆純?nèi)后w、產(chǎn)生和培養(yǎng)CSC的方法、以及它們的應(yīng)用。CSC形成自由漂浮鏈(細(xì)胞的自 由漂浮鏈)，其具有透明質(zhì)酸和蛋白聚糖的糖萼外被。此發(fā)現(xiàn)已導(dǎo)致用于治療漿膜和卵巣癌的方法的開(kāi)發(fā)，其中通過(guò)靶向糖萼形成的去除或抑制，包括利用化療療法并連同糖萼抑制劑一起的聯(lián)合療法。本發(fā)明還提供了藥物篩選測(cè)定，用于確定有效對(duì)抗這些CSC以及其它漿膜癌細(xì)胞的化合物。提供了應(yīng)用自由漂浮鏈基因標(biāo)簽、蛋白質(zhì)和表面抗原的方法，用于監(jiān)測(cè)患者樣品中漿膜癌干細(xì)胞的存在。
背景技術(shù)：
癌癥干細(xì)胞(CSC)假說(shuō)提示，在癌癥中，正常組織干細(xì)胞變成惡性的或更加分化的組織可以被轉(zhuǎn)化并發(fā)展干細(xì)胞特性。人CSC通常定義為惡性細(xì)胞的“稀有”群體，其可以進(jìn)行無(wú)限制的自我更新并具有對(duì)稱(chēng)分裂能力。當(dāng)被連續(xù)移植時(shí)，這些“腫瘤原始細(xì)胞”或癌癥干細(xì)胞可以再生原始腫瘤的所有成分。癌癥干細(xì)胞的概念對(duì)我們對(duì)如何治療癌癥的理解已產(chǎn)生重大影響。不幸的是，除非可以根除CSC，否則它們可以再次增殖并生成癌癥，從而導(dǎo)致復(fù)發(fā)。認(rèn)為CSC特別耐化學(xué)療法和放射療法，這使得特別難以消除它們，甚至用可以有效地破壞大部分腫瘤并產(chǎn)生緩解的治療也是如此。CSC假說(shuō)取決于具有腫瘤起始能力的細(xì)胞的前瞻性純化，而與頻率無(wú)關(guān)。癌癥干細(xì)胞假說(shuō)認(rèn)識(shí)到，相對(duì)于更加分化的腫瘤細(xì)胞，CSC的發(fā)生率可以顯著不同，從0. 001%至100%，其取決于腫瘤類(lèi)型、腫瘤的發(fā)展階段(例如，轉(zhuǎn)移性的與非轉(zhuǎn)移性的)，或如果對(duì)選自原發(fā)性腫瘤的腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行了研究，則在從一開(kāi)始就具有高CSC含量。針對(duì)CSC，已開(kāi)發(fā)了若干體外測(cè)定，如在半固體培養(yǎng)基中的克隆、致癌球形體(oncospheroid)形成、有限稀釋連續(xù)再克隆、基質(zhì)集落形成。然而，體外CSC測(cè)定受限于未知和可能變量“平板效率”的問(wèn)題，其取決于提供例如，生長(zhǎng)因子、形態(tài)發(fā)生素和/或交互生態(tài)位成分的適當(dāng)組合和濃度。目前的用于人CSC的“金標(biāo)準(zhǔn)”是在免疫缺陷小鼠(裸鼠、SCID鼠或NOD-SCID鼠)中的腫瘤起始有限稀釋測(cè)定，然而，這些受體具有先天免疫抗性(天然殺傷(NK)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)。另外，任何體內(nèi)測(cè)定具有“接種效率”，其取決于細(xì)胞如何有效地定位于它們的正確的“生態(tài)位”。如果將CSC注入缺乏適當(dāng)“生態(tài)位”或微環(huán)境(間充質(zhì)微環(huán)境，內(nèi)皮微環(huán)境)的非同位部位(例如，皮下)，則它們的數(shù)目可以被低估，這是由于死亡或終末分化。如果靜脈注射，例如，在轉(zhuǎn)移性模型中，CSC離開(kāi)脈管系統(tǒng)并發(fā)現(xiàn)適當(dāng)生態(tài)位的能力可以通過(guò)歸巢受體(例如，整聯(lián)蛋白)和趨化因子受體(例如，CXCR4)的可變表達(dá)來(lái)確定，而與細(xì)胞的干細(xì)胞狀態(tài)無(wú)關(guān)。如果CSC依賴(lài)于生長(zhǎng)因子或形態(tài)發(fā)生素(例如，IL-6、GM-CSF、M-CSF、IL-3HGF)的旁分泌刺激，則可以存在物種特異性。在大多數(shù)組織中已確立了轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)增祖細(xì)胞群體的存在并且這樣的群體可以產(chǎn)生數(shù)十億的分化細(xì)胞。因此，除非可以證明再傳代能力，否則腫瘤發(fā)展的原初體內(nèi)測(cè)定并不是先驗(yàn)的CSC測(cè)定。在婦女的癌癥死亡中卵巣癌癥名列第五并且比任何其它婦科癌引起更多死亡。據(jù)估計(jì)，在美國(guó)，每年將診斷22，430例新病例，并具有15，280例死亡[Jemal, 2008]。在至少兩個(gè)重要方面，卵巣癌仍然是令人困惑的。首先，此癌癥的起源的組織學(xué)區(qū)域仍然是模糊的，其次，由癌癥病理學(xué)家一般公認(rèn)的可辨認(rèn)的癌前病變尚未確定。大多數(shù)(80%)患者顯示癌細(xì)胞存在于整個(gè)腹腔的晩期疾病，從而直接導(dǎo)致高死亡率(5年存活率為15-45%)。相比之下，對(duì)于癌限于卵巢的早期疾病而言，存活率是、5%。鑒于在早期疾病和后期疾病之間在存活結(jié)果方面的差異，便于在早期檢出卵巣癌的策略將有希望顯著改善存活。不幸的是，目前用于檢測(cè)早期卵巣癌的篩查方法是不適當(dāng)?shù)??；加袝娖诼褞z癌的患者的中位總生存期已從1975年的大約I年提高到目前的超 過(guò)3年，并且對(duì)于具有最佳減體治療的疾病并用基于紫杉烷和鉬的組合化學(xué)療法加以治療的亞類(lèi)，存活期現(xiàn)超過(guò)5年
。然而，病程緩解和復(fù)發(fā)之一，其需要間歇性再治療。理解了 CSC的生物特性和上述細(xì)胞存活的機(jī)制，因而針對(duì)轉(zhuǎn)移和再生腫瘤的多輪化學(xué)療法是重要的，以發(fā)現(xiàn)早期檢測(cè)方法和根除卵巣癌。用來(lái)改善總存活期和生活質(zhì)量的機(jī)會(huì)將包括開(kāi)發(fā)專(zhuān)門(mén)用來(lái)靶向卵巣CSC或其它漿膜CSC的新療法。根除癌癥干細(xì)胞以及分化的癌細(xì)胞可以增加對(duì)卵巢或其它漿膜癌(包括轉(zhuǎn)移性漿膜癌)的治療效率。在漿膜(腹膜、胸膜、和心包)腔內(nèi)的滲漏液中癌細(xì)胞的存在是晚期癌癥的臨床表現(xiàn)并伴有較差的存活期。在滲漏液中的腫瘤細(xì)胞最常來(lái)源于卵巢、胸、和肺的原發(fā)癌，以及來(lái)源于惡性間皮瘤，此解剖部位的ー種原生腫瘤[Di Maria, 2007; Davidson, 2007]。不同于大多數(shù)的實(shí)體瘤，尤其是在原發(fā)部位，在滲漏液中的癌細(xì)胞不適合于手術(shù)清除，并且它們的根除失敗是治療失敗的主要原因之一 [Davidson，2007]。腫瘤球形體(還稱(chēng)作致癌球形體)的形成是腫瘤細(xì)胞適應(yīng)在滲出液中生長(zhǎng)的機(jī)制。在來(lái)自漿膜癌患者的胸膜、心包積液和腹水樣品中發(fā)現(xiàn)腫瘤球形體。在卵巣癌中最好說(shuō)明了腫瘤球形體的病理生理意義，這是因?yàn)樵诟鼓じ顾酗@著比例的癌細(xì)胞存在為球形體。在癌癥治療方面的進(jìn)展將取決于可以靶向CSC的新治療劑的鑒定，其中上述CSC存在為個(gè)別實(shí)體或存在為這些多細(xì)胞球形體。另外，篩查系統(tǒng)將便于開(kāi)發(fā)對(duì)處于靜止GO狀態(tài)的周期運(yùn)行干細(xì)胞和CSC具有毒性的化合物。雖然最近一些報(bào)道已報(bào)道了從卵巢癌來(lái)分離細(xì)胞的亞群體，當(dāng)移植到免疫缺陷小鼠中時(shí)，其似乎富集能夠誘發(fā)腫瘤的細(xì)胞[Szotek，2006;Zhang, 2008;Bapat, 2005]，但沒(méi)有報(bào)道這樣的克隆純細(xì)胞，其可以在組織培養(yǎng)體系中保持在它們的干細(xì)胞狀態(tài)。用來(lái)保持和擴(kuò)大克隆純細(xì)胞而沒(méi)有分化的體外體系的缺乏已阻礙漿膜癌干細(xì)胞的基因表達(dá)譜和蛋白質(zhì)組學(xué)分析。另外，用于CSC擴(kuò)大的體外培養(yǎng)體系的缺乏已放慢了高通量藥物篩查方法的開(kāi)發(fā)，其中上述方法具有確定特異性地靶向CSC的新化合物的潛力。

發(fā)明內(nèi)容
在ー個(gè)方面，本發(fā)明提供了用來(lái)漿膜癌干細(xì)胞的方法，該方法包括(a)在腹膜內(nèi)(ip)腫瘤的條件下用一定量的漿膜上皮腫瘤細(xì)胞腹膜內(nèi)注射免疫減弱的、非人哺乳動(dòng)物；
(b)從攜帶ip腫瘤的非人哺乳動(dòng)物收獲腹水；(C)將腹水分流成包含漿膜自由漂浮鏈和白細(xì)胞的第一流分以及包含漿膜球形體的第二流分；(d)從所述第一流分去除白細(xì)胞以獲得富含自由漂浮鏈流分；以及(e)在產(chǎn)生粘附間充質(zhì)細(xì)胞以及富集有漿膜癌干細(xì)胞的漿膜自由漂浮鏈的懸浮液的條件下，培養(yǎng)富含自由漂浮鏈流分一定時(shí)間。此方法可以進(jìn)一歩包括
(f)收集漿膜自由漂浮鏈的懸浮液，；(g)分離漿膜自由漂浮鏈與可能已經(jīng)形成的任何漿膜球形體；以及(h)在產(chǎn)生包含至少50至100%漿膜癌干細(xì)胞的自由漂浮漿膜自由漂浮鏈的穩(wěn)定培養(yǎng)物的條件下，在懸浮液中連續(xù)傳代這些自由漂浮鏈一定時(shí)間。在另ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及用來(lái)產(chǎn)生漿膜癌干細(xì)胞的方法，該方法包括(a)在產(chǎn)生腹膜內(nèi)(ip)腫瘤的條件下用一定量的漿膜上皮腫瘤細(xì)胞腹膜內(nèi)注射免疫減弱的、非人哺乳動(dòng)物；(b)從攜帶ip腫瘤的非人哺乳動(dòng)物收獲腹水；(C)將腹水分流分包含漿膜自由漂浮鏈和白細(xì)胞的第一腹水流分以及包含漿膜球形體的第二腹水流分；(d)在產(chǎn)生粘附間充質(zhì)細(xì)胞以及自由漂浮鏈和腫瘤球形體的懸浮培養(yǎng)物的條件下培養(yǎng)第二流分一定時(shí)間；以及(e)將懸浮培養(yǎng)物分流成包含富集有漿膜癌干細(xì)胞的自由漂浮鏈的第一培養(yǎng)流分和包含富集有漿膜癌干細(xì)胞的自由漂浮腫瘤球形體的第二培養(yǎng)流分。此方法可以進(jìn)一歩包括
(f)在產(chǎn)生自由漂浮鏈和腫瘤球形體的另外的懸浮培養(yǎng)物的條件下培養(yǎng)所述第二培養(yǎng)流分一定時(shí)間；(g)將所述另外的懸浮培養(yǎng)物分流成自由漂浮鏈和腫瘤球形體流分；以及(h)在產(chǎn)生包含至少10-30%漿膜癌干細(xì)胞(如通過(guò)體外再克隆能力所確定的)的自由漂浮腫瘤球形體的(穩(wěn)定)懸浮培養(yǎng)物的條件下，對(duì)自由漂浮球形體流分重復(fù)步驟(f)和(g) —定時(shí)間。在又ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及用來(lái)分離漿膜自由漂浮鏈的方法，該方法包括(a)在產(chǎn)生腹膜內(nèi)(ip)腫瘤的條件下用一定量的漿膜上皮腫瘤細(xì)胞腹膜內(nèi)注射免疫減弱的、非人哺乳動(dòng)物；(b)從攜帶ip腫瘤的非人哺乳動(dòng)物收獲腹水；(C)將腹水分流成包含漿膜自由漂浮鏈和白細(xì)胞的第一流分以及包含漿膜球形體的第二流分；以及(d)從所述第一流分去除白細(xì)胞以獲得富含自由漂浮鏈流分。按照本發(fā)明，可以通過(guò)以下步驟來(lái)分離球形體(a)在產(chǎn)生腹膜內(nèi)(ip)腫瘤的條件下用一定量的卵巣上皮腫瘤細(xì)胞腹膜內(nèi)注射免疫減弱的、非人哺乳動(dòng)物；(b)從攜帶ip腫瘤的非人哺乳動(dòng)物收獲腹水；(C)將腹水分流成包含漿膜自由漂浮鏈和白細(xì)胞的第一流分以及包含漿膜球形體的第二流分；以及(d)分離漿膜球形體。在本發(fā)明的前述方法中，可以在利用本領(lǐng)域已知的方法注射細(xì)胞以前、同時(shí)或以后誘導(dǎo)腹膜內(nèi)炎癥。用于這些方法的免疫減弱的非人哺乳動(dòng)物包括缺乏T細(xì)胞、B細(xì)胞和/或天然殺傷(NK)細(xì)胞的小鼠。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，有用的小鼠包括但不限于N0D/SCID小鼠、NSG小鼠和NOG小鼠。如在實(shí)施例中所示，通過(guò)30-60 u m過(guò)濾器、以及甚至更優(yōu)選地通過(guò)40 過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，來(lái)方便地完成腹水的分流，以獲得包含自由漂浮鏈和白細(xì)胞的流過(guò)流分以及包含較大的球形體的保留流分。利用這些方法，可以獲得在自由漂浮鏈中的分離的克隆純漿膜癌干細(xì)胞。這些克隆純漿膜癌干細(xì)胞是細(xì)胞的自我更新群體，其包含細(xì)胞的對(duì)稱(chēng)分裂的自由漂浮鏈并具有約三至四(3-4)至約七十ニ(72)個(gè)細(xì)胞、或更多細(xì)胞。上述鏈由透明質(zhì)烷(透明質(zhì)酸糖胺多糖，hyaluixman)、膠原蛋白和其它細(xì)胞外成分的糖萼所包圍。這些細(xì)胞是E-鈣黏著蛋白陰、性，具有相對(duì)于漿膜上皮腫瘤細(xì)胞的增加的植活潛力，以及具有至少50%的體外再克隆能力。在某些實(shí)施方式中，漿膜細(xì)胞是卵巣細(xì)胞。這些自由漂浮鏈被稱(chēng)為自由漂浮鏈或漿膜癌干細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面提供了用來(lái)篩查測(cè)試化合物的抗增殖效應(yīng)的方法，其中通過(guò)(a)培養(yǎng)解離的漿膜自由漂浮鏈細(xì)胞、解離的漿膜球形體細(xì)胞或解離的漿膜癌黏附細(xì)胞的任何ー種，所有上述細(xì)胞能夠發(fā)熒光或發(fā)光；(b)使細(xì)胞接觸測(cè)試化合物；(c)通過(guò)檢測(cè)由培養(yǎng)物發(fā)射的熒光或發(fā)光來(lái)檢測(cè)細(xì)胞是否作為響應(yīng)進(jìn)行増殖；以及(d)確定測(cè)試化合物是否已抑制自由漂浮鏈、球形體或黏附細(xì)胞的増殖。在一些實(shí)施方式中，上述方法包括確定測(cè)試化合物是否相對(duì)于球形體或黏附細(xì)胞不同地抑制自由漂浮鏈的増殖。另外，這些方法可以適應(yīng)于篩查化合物對(duì)漿膜癌干細(xì)胞的形態(tài)效應(yīng)，其中通過(guò)使步驟(c)檢測(cè)形態(tài)變化(例如，如自由漂浮鏈到球形體的變化、球形體到自由漂浮鏈的變化、自由漂浮鏈到上皮單層的變化、自由漂浮鏈到間充質(zhì)單層的變化、球形體到上皮單層的變化、球形體到間充質(zhì)單層的變化，或細(xì)胞形態(tài)形狀的改變，在特定細(xì)胞周期階段的阻滯等)。這些方法可以容易適應(yīng)于高通量篩查(HTS)，其中通過(guò)例如在384或1536孔板中生長(zhǎng)細(xì)胞，并利用用于操作試劑的機(jī)器人系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定，然后收集和分析數(shù)據(jù)。上述系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是已知的。 在用測(cè)試化合物進(jìn)行篩查測(cè)定吋，發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的敏感性，在許多但不是所有情況下，取決于在自由漂浮鏈和球形體上建立的糖萼的存在。因此，如果在接種細(xì)胞以后立即或不久(通常在I天內(nèi))添加測(cè)試化合物，則細(xì)胞對(duì)化合物是敏感的。然而，如果若干天(通過(guò)3-7天)以后添加化合物，則糖萼具有足夠的時(shí)間來(lái)重新建立，并且細(xì)胞會(huì)變得越來(lái)越耐化合物。在一些情況下，抗性可以是若干數(shù)量級(jí)大于化合物對(duì)細(xì)胞的最敏感效應(yīng)。如果除去糖萼，則這種效應(yīng)是可逆的，從而使細(xì)胞變得再次對(duì)化合物敏感的。獲得的抗藥性超時(shí)提示，它涉及細(xì)胞外周糖萼的再合成和組織。因此，糖萼可以提供對(duì)化合物的選擇性屏障，其取決于它們的化學(xué)性能(尺寸、極性、疏水性、擴(kuò)散)。這些觀(guān)測(cè)結(jié)果導(dǎo)致本發(fā)明的兩個(gè)另外的方面(I)另ー種篩查方法和(2)用于治療漿膜癌的新方法。因此，本發(fā)明的又一方面提供了用來(lái)篩查測(cè)試化合物的抗增殖或形態(tài)效應(yīng)的方法，該方法包括(a)解離漿膜自由漂浮鏈和制備單細(xì)胞的同質(zhì)群體；(b)在產(chǎn)生具有建立的糖萼外被的自由漂浮鏈的條件下接種和培養(yǎng)那些細(xì)胞一定時(shí)間；(C)使培養(yǎng)物接觸至少ー種測(cè)試化合物一定時(shí)間，其將足以使未經(jīng)處理的培養(yǎng)物可以增殖而沒(méi)有達(dá)到匯合，即，在篩查測(cè)定過(guò)程中，培養(yǎng)物應(yīng)仍然是亞匯合的；以及(d)確定在經(jīng)處理的培養(yǎng)物中測(cè)試化合物是否抑制自由漂浮鏈的増殖或改變自由漂浮鏈的形態(tài)。在ー種優(yōu)選實(shí)施方式中，在接種后第3、4、5、6或7天，并且更優(yōu)選在第5或6天，將測(cè)試化合物加入培養(yǎng)物。在這種方法的一種變通方式中，在步驟(b)以后但在步驟(C)以前，可以用一定量的透明質(zhì)酸酶、膠原酶或兩者溫育培養(yǎng)物一定時(shí)間，以足以去除或破壞所述自由漂浮鏈的糖萼外被。通過(guò)在37° C下進(jìn)行上述處理約5-30分鐘，并且優(yōu)選約10分鐘。在測(cè)定的其余時(shí)間中并不需要除去這些酶。上述酶的修飾和聚こニ醇化變體也可以用于本發(fā)明的方法。這些測(cè)定也可以容易地適應(yīng)于HTS格式(如上述)。為了確定測(cè)試化合物是否影響增殖，可以在有或沒(méi)有染色或熒光信號(hào)、發(fā)光信號(hào)或測(cè)得吸光率的情況下來(lái)人工計(jì)數(shù)細(xì)胞。由于自由漂浮鏈存在于懸浮液中，所以檢測(cè)方法需要相應(yīng)地加以調(diào)整并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)進(jìn)行。ー種優(yōu)選的檢測(cè)方法是利用alamarBlue 染色，接著測(cè)量培養(yǎng)物的突光或吸光率，其正比于在培養(yǎng)物中存在的活細(xì)胞并且獨(dú)立于細(xì)胞是粘連的或在懸浮液中。還提供了用于漿膜球形體的類(lèi)似的測(cè)定系統(tǒng)。對(duì)于球形體，在產(chǎn)生足夠數(shù)量和大小并具有建立的糖萼外被的球形體的條件下，培養(yǎng)解離的細(xì)胞一定時(shí)間。由于球形體是許多細(xì)胞的較大聚集體，所以和自由漂浮鏈相比，它需要更長(zhǎng)時(shí)間來(lái)重新建立外被。球形體的時(shí)間范圍通常是約8至約14天，以致在上述時(shí)間范圍內(nèi)添加測(cè)試化合物，并且優(yōu)選在接種后的第11天。本發(fā)明的又ー個(gè)方面涉及用于在接受化學(xué)療法或放射治療的患者中治療漿膜癌的方法，該方法包括給予一定量的透明質(zhì)烷合酶抑制劑、透明質(zhì)酸酶、膠原酶、或其它酶或其它制劑(其可以除去或降解糖萼)一定時(shí)間，以增強(qiáng)所述治療方案或治療，或改善或増加患者的存活時(shí)間，或引起癥狀的緩解。上述方法包括共同給予放射治療或化學(xué)療法和透明質(zhì)烷合酶抑制劑或酶或其它制劑(其可以除去或降解糖萼)。這些酶和制劑可以被聚こニ醇化或用其它方式被修飾以増加它們的體內(nèi)半衰期。另ー種實(shí)施方式涉及用于在患者中抑制癌癥干細(xì)胞自我更新或形成的方法，該方 法包括將一定量的糖萼形成的抑制劑或降解糖萼的制劑給予所述患者一定時(shí)間，從而抑制CSC的自我更新或形成或引起CSC的分化并使它們?nèi)菀资艿綒＿@樣的方法可以防止自由漂浮鏈進(jìn)行球形體形成，其本身又可以防止CSC獲得對(duì)標(biāo)準(zhǔn)癌癥治療方案的抗性。本發(fā)明的另ー個(gè)方面涉及在自由漂浮鏈和在患者樣品中發(fā)現(xiàn)HAS2剪接變體和HAS2的突變形式。因此，本發(fā)明提供了編碼哺乳動(dòng)物HAS2剪接變體的分離的核酸，包括mRNA和cDNA以及以5’至3’的次序包含相鄰核苷酸序列的核酸，其基本上包括HAS2基因的全部或部分的外顯子2和全部的外顯子3，即，缺乏外顯子I的剪接變體。ー種mRNA HAS2剪接變體編碼ー種蛋白質(zhì)，其開(kāi)始于野生型(wt)人HAS2的氨基酸215并結(jié)束于正常停止信號(hào)，即，氨基酸552。本發(fā)明還包括包含本發(fā)明的任何核酸的載體，包含這些載體的細(xì)胞，以及利用重組表達(dá)系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生編碼的蛋白，和編碼的蛋白。本發(fā)明的其它實(shí)施方式涉及分離的核酸探針，其具體用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物HAS2剪接變體RNA或任何ー種或多種HAS2突變，包括SNP突變，并且優(yōu)選檢測(cè)在表17和18中確定的突變。因此本發(fā)明還包括野生型HAS2和HAS2剪接變體的突變和等位基因形式。本發(fā)明的又ー個(gè)方面涉及用于在主體中監(jiān)測(cè)和/或分期漿膜癌的方法，該方法包括(a)從獲自癌癥患者的腹水制備自由漂浮鏈；(b)檢測(cè)自由漂浮鏈?zhǔn)欠窬哂些`種或多種HAS2突變和/或表達(dá)ー種或多種HAS2剪接變體；以及(c)關(guān)聯(lián)那些突變和/或變體與在所述患者中癌癥的存在和/或進(jìn)展。另外，可以在患者樣品中確定或監(jiān)測(cè)漿膜癌干細(xì)胞的存在，其中通過(guò)(a)從患者獲得細(xì)胞樣品；(b)可選地，除盡樣品的白細(xì)胞；(C)從樣品的其余部分制備DNA、RNA或兩者；以及(d)檢測(cè)DNA、RNA或兩者是否具有HAS2突變或表達(dá)HAS2剪接變體，其中突變或剪接變體的鑒定表明在樣品中存在漿膜癌干細(xì)胞。通過(guò)量化上述DNA或RNA的量，可以關(guān)聯(lián)上述調(diào)查結(jié)果與在患者中漿膜癌的存在和/或漿膜癌的進(jìn)展。自由漂浮鏈的廣泛表征已導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)多種方式來(lái)確定自由漂浮鏈，包括通過(guò)鑒定特異性表面抗原、自由漂浮鏈基因標(biāo)簽、表面基因組相關(guān)自由漂浮鏈基因標(biāo)簽(signature)、表面基因組相關(guān)自由漂浮鏈蛋白質(zhì)標(biāo)簽、miRNA相關(guān)自由漂浮鏈標(biāo)簽、自由漂浮鏈簇限定基因(catena cluster-defining gene)標(biāo)簽、夕卜染色體自由漂浮鏈蛋白質(zhì)標(biāo)簽、分泌體自由漂浮鏈蛋白質(zhì)標(biāo)簽、糖萼標(biāo)簽、激活磷蛋白表達(dá)，以及鑒定結(jié)合于抗C0L1A2抗體的膠原蛋白和透明質(zhì)烷的低分子量復(fù)合物。這些性能已導(dǎo)致各種方法來(lái)確定和/或監(jiān)測(cè)在患者樣品中漿膜癌干細(xì)胞的存在并為漿膜癌治療提供個(gè)性化藥物方式的能力，包括回應(yīng)漿膜癌干細(xì)胞的存在來(lái)改變治療方案的能力?？梢杂脕?lái)自哺乳動(dòng)物的漿膜液、腹水、血液或腫瘤組織并利用各種檢測(cè)技術(shù)來(lái)實(shí)施這些方法，上述檢測(cè)技術(shù)包括但不限于檢測(cè)在這些測(cè)定中的核酸或確定它們的表達(dá)水平，其中通過(guò)微陣列分析、通過(guò)RNA或DNA測(cè)序技術(shù)、通過(guò)RT-PCR或通過(guò)Q-RT-PCR。蛋白質(zhì)檢測(cè)方法包括但不限于質(zhì)譜法、Western印跡法 、抗體結(jié)合FACS和在技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)的其它技術(shù)或后來(lái)開(kāi)發(fā)的技木。另外，基于確定和/或監(jiān)測(cè)漿膜癌干細(xì)胞，此信息便于開(kāi)發(fā)本發(fā)明的另外方法，包括用來(lái)檢測(cè)漿膜癌、監(jiān)測(cè)癌癥治療方案的效力、分類(lèi)需要治療的患者、監(jiān)測(cè)藥物療效、在漿膜癌患者中預(yù)測(cè)患者對(duì)癌癥治療方案的反應(yīng)的方法，該方法包括用來(lái)自患者的樣品定期進(jìn)行這些方法的ー種或多種，并關(guān)聯(lián)結(jié)果與患者的狀態(tài)，從而檢測(cè)漿膜癌、監(jiān)測(cè)癌癥治療方案的效力、分類(lèi)需要治療的患者、監(jiān)測(cè)藥物療效或預(yù)測(cè)患者對(duì)癌癥治療方案的反應(yīng)。類(lèi)似地，本發(fā)明涉及用來(lái)治療漿膜癌的方法，該方法包括(a)將抗癌治療方案給予漿膜癌患者；(b)定期審查用來(lái)自所述患者的樣品進(jìn)行這些方法的一種或多種所獲得的結(jié)果，以及(C)根據(jù)需要并符合(as consistent)結(jié)果或由結(jié)果所預(yù)測(cè)的，改變治療方案。本發(fā)明的又ー個(gè)方面涉及利用體內(nèi)動(dòng)物模型來(lái)篩查轉(zhuǎn)移性抑制劑或轉(zhuǎn)移性效應(yīng)物的方法。該方法包括(a)用自由漂浮鏈或自由漂浮鏈細(xì)胞的制劑靜脈注射免疫減弱的、非人哺乳動(dòng)物，(b)在注射以前、以后或同吋，將ー種或多種測(cè)試化合物給予哺乳動(dòng)物，以及(C)相對(duì)于對(duì)照哺乳動(dòng)物，評(píng)估在哺乳動(dòng)物中的腫瘤生產(chǎn)和/或腫瘤位置的時(shí)間進(jìn)程，從而確定能夠抑制自由漂浮鏈細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的化合物尤其確定那些減少或抑制腫瘤生產(chǎn)或腫瘤位置變化的化合物。本發(fā)明的又ー個(gè)方面提供了利用動(dòng)物模型來(lái)篩查藥物療效的另ー種體內(nèi)方法。該方法包括(a)用自由漂浮鏈或自由漂浮鏈細(xì)胞的制劑腹膜內(nèi)注射免疫減弱的、非人哺乳動(dòng)物；(b)在注射以前、以后或同吋，將ー種或多種測(cè)試化合物給予哺乳動(dòng)物；以及(C)相對(duì)于對(duì)照哺乳動(dòng)物，評(píng)估(i)在所述哺乳動(dòng)物中腫瘤生產(chǎn)的時(shí)間進(jìn)程，(ii)在所述哺乳動(dòng)物中漿膜液生產(chǎn)的時(shí)間進(jìn)程，(iii)在所述哺乳動(dòng)物中腫瘤的形態(tài)，(iv)在所述哺乳動(dòng)物的腹水中漿膜癌干細(xì)胞生產(chǎn)的量和/或時(shí)間進(jìn)程，或它們的任何組合，從而確定藥物化合物治療漿膜癌的潛在或?qū)嶋H效力。在另ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及從源自原發(fā)性漿膜腫瘤的自由漂浮鏈或從轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)球形體的方法，該方法包括在補(bǔ)充有一定量的Matrigel (基質(zhì)膠)(足以誘導(dǎo)球形體形成和產(chǎn)生球形體培養(yǎng)體系)的第一含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)自由漂浮鏈或細(xì)胞的懸浮液一定時(shí)間。這些培養(yǎng)物定期補(bǔ)充不含額外的Matrigel的含血清培養(yǎng)基(通常在每周一次的基礎(chǔ)上)。優(yōu)選地，第一含血清培養(yǎng)基與Matrigel的比例為50:1。本發(fā)明的又ー個(gè)方面涉及從患者的漿膜液來(lái)生產(chǎn)自由漂浮鏈的方法。在此方法中，從癌癥患者獲得漿膜液的樣品，從漿膜液收獲細(xì)胞以及在補(bǔ)充有無(wú)細(xì)胞漿膜液的含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)那些細(xì)胞。將在懸浮培養(yǎng)物中的細(xì)胞定期傳代到(轉(zhuǎn)移到，passaging)補(bǔ)充有無(wú)細(xì)胞漿膜液的新鮮的含血清培養(yǎng)基中，從而獲得自由漂浮鏈。在ー種優(yōu)選實(shí)施方式中，漿膜液來(lái)自相同癌癥患者并以1:1的比例補(bǔ)充培養(yǎng)基。
本發(fā)明還提供了 PCR引物組，該P(yáng)CR引物組包括通過(guò)自由漂浮鏈的廣泛表征所確定的用于哺乳動(dòng)物基因的PCR引物。本發(fā)明的另一方面提供了用來(lái)制備用于電子顯微鏡檢查的自由漂浮鏈細(xì)胞和球形體、或任何具有糖萼外被的細(xì)胞的方法。最后，如果適用，在任何上述方法和產(chǎn)物中，漿膜可以是卵巢漿膜。同樣地，表示為哺乳動(dòng)物的那些方法、細(xì)胞、核酸、載體、蛋白質(zhì)或基因包括或可以是人、鼠科動(dòng)物、豬、牛科動(dòng)物或綿羊哺乳動(dòng)物(如果適用)。


圖I示出NSG小鼠的原位卵巢癌模型。用50，000個(gè)0vcar3_GTL細(xì)胞i. p.注射N(xiāo)SG小鼠。用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)或用36mg/kg的脂化寡核苷酸(oligo) i. p.注射小鼠，一周三次，時(shí)間為12周。在經(jīng)PBS處理組(▲)中腫瘤生長(zhǎng)在12周以后達(dá)到平衡。經(jīng)寡核苷酸處理小鼠( )具有連續(xù)的腫瘤生長(zhǎng)。圖2是生物發(fā)光圖像，其示出巰基こ酸鹽對(duì)腹膜內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響。用IO6個(gè) 0vcar3-GTL細(xì)胞i. p.注射N(xiāo)SG小鼠。四周以后，用PBS或ImL巰基こ酸鹽溶液i. p.注射小鼠。在第8周獲得圖像。圖3示出來(lái)自用50，000個(gè)0vcar3_GTL細(xì)胞i. p注射的NSG小鼠的腹水并在用脂化寡核苷酸處理以后的第8周收獲的細(xì)胞流分的照片。使腹水通過(guò)40 過(guò)濾器。
(a)>40 u m流分包含較大的預(yù)成形球形體；(b)流過(guò)流分包含細(xì)胞的較小的預(yù)成形鏈(自由漂浮鏈)；以及(c)蔗聚糖(ficoll，菲可)分流從自由漂浮鏈流分除去RBC。在(b)中，糖萼明顯分隔在腹水中的自由漂浮鏈與RBC。圖4是用于富集自由漂浮鏈的體外培養(yǎng)體系的示意圖。(a)在組織培養(yǎng)處理板上并在10%FCS中培養(yǎng)來(lái)自腹水的0vcar3-GTL腫瘤細(xì)胞；(b)和(c)每周再傳代懸浮流分；(d)在連續(xù)傳代以后，使培養(yǎng)物富集自由漂浮鏈。圖5示出自由漂浮鏈的免疫熒光染色(a)緊密連接蛋白ZO-I和E-鈣黏著蛋白，以及(b)巨蛋白(高爾基體標(biāo)記)和人波形蛋白。圖片(C)是在培養(yǎng)物中發(fā)展的非連接自由漂浮鏈的照片。在(a)中，在細(xì)胞連接處的明亮的點(diǎn)狀染色是來(lái)自Z0-1。在(b)中，明亮的球狀染色來(lái)自巨蛋白以及淺灰色染色來(lái)自波形蛋白。圖6示出源自0vcar3-GTL的自由漂浮鏈培養(yǎng)物(伴隨球形體形成)的照片。通過(guò)以高細(xì)胞密度卷起(箭頭所指)，0vcar3-GTL自由漂浮鏈形成球形體。圖7是球形體和自由漂浮鏈形成的照片和示意圖。0vcar3_GTL球形體形成(sphere-forming)細(xì)胞(紅色)堆積在間充質(zhì)單層(白色)上[階段1_2],并通過(guò)芽埴形成有組織的球形體[階段3]。自由漂浮鏈(藍(lán)色)在內(nèi)部被觀(guān)測(cè)到[階段4]或遷移出發(fā)展中的球形體[階段5]。已發(fā)展的球形體脫離自單層并在懸浮液中繼續(xù)生長(zhǎng)[階段6]，其中更多自由漂浮鏈被擠入懸浮液。圖8以圖形方式示出來(lái)自對(duì)Ovcarf-GTL自由漂浮鏈、球形體和單層進(jìn)行的體外促克隆形成測(cè)定的克隆發(fā)生百分比(分別為左、中和右條)。為了第一促克隆形成測(cè)定，將自由漂浮鏈/球形體混合培養(yǎng)物分離成MOum(球形體)和<40um(自由漂浮鏈和小球形體)流分。在第2周對(duì)克隆的數(shù)目加以評(píng)分。在第三單細(xì)胞再克隆傳代以后，自由漂浮鏈、球形體和單層分別具有55%、10%和1%的克隆發(fā)生。
圖9以圖形方式示出在免疫缺陷小鼠中的引發(fā)腫瘤的有限稀釋測(cè)定的結(jié)果，其用來(lái)評(píng)估在自由漂浮鏈和球形體中的CSC。左圖片示出來(lái)自用相同數(shù)目的解離的0vcar3-GTL單層細(xì)胞、解離的0vcar3-GTL自由漂浮鏈細(xì)胞和未解離的0vcar3球形體(球體)i. p.注射小鼠的NOD-SCID (實(shí)心條)和NSG(空心條)的生物發(fā)光。右圖片示出來(lái)自用不同數(shù)量的相同單層和自由漂浮鏈細(xì)胞i. P.注射的NSG小鼠的生物發(fā)光。圖10示出生物發(fā)光圖像，其來(lái)自在NSG小鼠中的皮下有限稀釋實(shí)驗(yàn)，其中NSG小鼠注射有在Matrigel 中的200、20和2個(gè)源自0vcar3的自由漂浮鏈細(xì)胞。在注射以后的第3周獲得圖像。圖11示出，在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的間充質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生自由漂浮鏈和球形體。頂部圖片示出0vcar3 (上皮細(xì)胞)、0vcar5 (間充質(zhì)細(xì)胞)和A2780 (間充質(zhì))細(xì)胞的典型的培養(yǎng)的單層。中間圖片示出來(lái)自懸浮培養(yǎng)物的0vcar5細(xì)胞，其中(a)凝集在單層細(xì)胞上，
(b)具有囊性結(jié)構(gòu)的球形體，(C)在懸浮液中的自由漂浮鏈，以及⑷擠出自由漂浮鏈的球 形體。底部圖片示出來(lái)自A2780-G懸浮培養(yǎng)物的細(xì)胞，其中(e)集體的變形過(guò)渡和(f)自由漂浮鏈。圖12以圖形方式示出自由漂浮鏈-球形體概念的模型。圖13是條形圖，其示出通過(guò)亞匯合的Ovcarf-GTL上皮單層和自由漂浮鏈分泌進(jìn)入培養(yǎng)基的CA125(MUC16)的量(如通過(guò)ELISA測(cè)得的)。圖14示出利用RBC進(jìn)行的顆粒排除測(cè)定的照片，其中(a)機(jī)械解離的Ovcar3-GTL自由漂浮鏈和(b)經(jīng)透明質(zhì)酸酶處理的Ovcar3-GTL自由漂浮鏈。圖15是顯示糖萼的自由漂浮鏈的一系列掃描電鏡(SEM)圖像。艾茜藍(lán)(AB)用來(lái)可視化透明質(zhì)烷糖鏈以及西吡氯銨(CPC)用來(lái)可視化蛋白聚糖。自由漂浮鏈和糖萼示于(a)中，其中條表示IOii m。相對(duì)于在(a)中的圖像，在(b)中相同圖像被放大2x，在(C)中相同圖像被放大5x以及在(d)中相同圖像被放大10x。箭頭指向在自由漂浮鏈中的單細(xì)胞。圖16是自由漂浮鏈和糖萼(僅用艾茜藍(lán)染色)的放大的SEM圖像，其示出在細(xì)胞上的透明質(zhì)烷外被以及糖萼的網(wǎng)絡(luò)樣特性。透明質(zhì)酸集中在不同點(diǎn)。圖17是在用透明質(zhì)酸酶進(jìn)行處理以除去糖萼外被以后自由漂浮鏈的SEM圖像。用艾茜藍(lán)和CPC進(jìn)行染色。圖18是在用透明質(zhì)酸酶進(jìn)行處理以除去糖萼外被以后自由漂浮鏈的SEM圖像。存在于樣品中的其它細(xì)胞是RBC。在沒(méi)有染色的情況下獲得圖像。圖19示出自由漂浮鏈細(xì)胞的沒(méi)有染色的SEM顯微照片(a, b, c)。(a)自由漂浮鏈的SEM，其示出在兩個(gè)細(xì)胞之間具有廣泛的微絨毛連接的附著區(qū)域。(b)通過(guò)納米管加以連接的兩個(gè)自由漂浮鏈細(xì)胞。注意，微絨毛將細(xì)胞附著于表面(invadopodia)。通過(guò)微絨毛和較大質(zhì)膜泡來(lái)表征細(xì)胞。(c)具有長(zhǎng)(20-30um)偽足的自由漂浮鏈細(xì)胞的SEM，其中上述偽足延伸超出透明質(zhì)酸糖萼10-15um。圖20是在圖19(a)中的照片的大致3倍放大，其中有尾白色箭頭指向微絨毛，黑色箭頭指向偽足以及無(wú)尾白色箭頭指向表面泡(surface blebs)。圖21是SEM，其示出側(cè)視圖(a)在自由漂浮鏈表面上的噴發(fā)“火山”和(b)火山的放大，其示出顆粒從火山的火山ロ的釋放。
圖22是表格,其示出在0vcar3上皮單層、0vcar5間充質(zhì)單層以及在0vcar3和0vcar5自由漂浮鏈中透明質(zhì)烷合成途徑的差別調(diào)節(jié)(如通過(guò)微陣列分析確定的)。下調(diào)基因?yàn)榛疑?；上調(diào)基因?yàn)楹谏?。在自由漂浮鏈?*)中的數(shù)值表示通過(guò)454深度測(cè)序確定的mRNA拷貝數(shù)。圖23是斑點(diǎn)印跡,其示出在上皮(0vcar3單層)、間充質(zhì)(0vcar5單層)和自由漂浮鏈細(xì)胞(0vcar3和0vcar5)中的RTK憐酸化模式(如借助于Human Phospho-RTK ArrayKit確定的)。圖24示出對(duì)于0vcar3自由漂浮鏈(CSC 65%)和0vcar3上皮單層(CSC1%)所選CD蛋白的差異表達(dá)。圖25說(shuō)明野生型(wt)HAS2基因的基因組結(jié)構(gòu)，其示出內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)并指出限定每個(gè)元件和核苷酸(頂部)。底部圖片示出稱(chēng)作Greenwich變體的HAS2剪接的mRNA結(jié)構(gòu)，其中上述變體包含外顯子I和部分外顯子2的框內(nèi)缺失。
具體實(shí)施例方式I.概述本發(fā)明提供了漿膜癌干細(xì)胞(CSC)的克隆純?nèi)后w、以及制備和培養(yǎng)這些CSC的方法。由于可獲得純CSC，所以細(xì)胞的廣泛表征是可能的，并已導(dǎo)致澄清了細(xì)胞標(biāo)記物、細(xì)胞的形態(tài)、特異表達(dá)基因的鑒定、表面基因組標(biāo)志的鑒定、分泌體標(biāo)志物，并且根據(jù)此信息，可以引向開(kāi)發(fā)療法和新治療方案的途徑。經(jīng)純化的CSC獲得為細(xì)胞的自由漂浮鏈(free-floating chains),其在本文中被稱(chēng)為自由漂浮鏈(catenae),具有自我更新和分化的能力。除漿膜自由漂浮鏈以外，本發(fā)明還提供了經(jīng)純化的漿膜球形體和分離這些細(xì)胞實(shí)體的方法，從而便于在分子水平中球形體的類(lèi)似的表征研究。漿膜腔是包括和包圍身體的腹膜腔、胸膜腔、和心包腔的封閉體腔，填充有流體(漿膜液)并由漿膜加以限制。漿膜癌包括在漿膜腔內(nèi)產(chǎn)生的原發(fā)癌和通過(guò)其它癌細(xì)胞轉(zhuǎn) 移到漿膜腔所產(chǎn)生的繼發(fā)癌。在不同漿膜部位的主要漿膜癌包括那些在(I)胸腔積液中的漿膜癌，即間皮瘤、支氣管源性肺癌、乳癌、膀胱癌、卵巣癌、輸卵管癌、子宮頸癌和肉瘤；那些在(2)腹腔積液中的漿膜癌，即卵巢癌、輸卵管癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、腎癌和膀胱癌；以及那些在(3)心包積液中的漿膜癌，即間皮瘤、支氣管源性肺癌、乳癌、膀胱癌、卵巣癌、輸卵管癌、子宮頸癌和肉瘤。上述清單并不是詳盡的，并且轉(zhuǎn)移到任何漿膜腔并形成腫瘤的任何其它癌癥可以看作為“漿膜癌”。2.其它定義漿膜細(xì)胞是源自漿膜腔或在漿膜腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)的、或形成漿膜或附著于漿膜的任何細(xì)胞，并且包括但不限于卵巢細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、胃細(xì)胞、腸細(xì)胞、肛門(mén)細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺細(xì)胞和心臟細(xì)胞。如在本文中所使用的，NSG和NSG小鼠是指NOD scid-y (NSG，N0D scid gamma)小鼠，或等效小鼠，可獲自 The Jackson Laboratory,以及其是 NOD. Cg-Prkdcseld I12rgtmlWj1/SzJJAX 小鼠品系。小鼠的NOG品系類(lèi)似于NSG小鼠，但具有截短的IL-2受體、鏈而不是NSG小鼠的無(wú)效等位基因。如在本文中所使用的，“化學(xué)療法”包括任何形式的癌癥治療，其中出于任何及所有與癌癥相關(guān)的目的，將ー種或多種藥物給予癌癥患者，上述藥物包括但不限于抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞(或其它惡性細(xì)胞)和癌癥干細(xì)胞的細(xì)胞毒性劑以及以細(xì)胞靜止方式作用于上述細(xì)胞的制劑。上述藥物包括但不限于小分子、抗體、蛋白質(zhì)、核酸、目標(biāo)途徑抑制劑等。為免生疑問(wèn)，如在本文中所使用的，化學(xué)療法還包括途徑抑制劑療法，如當(dāng)主體具有在特定基因中的基因突變并被給予靶向上述基因或代謝或調(diào)節(jié)途徑(上述基因形成其一部分)的治療劑時(shí)所發(fā)生的?？s寫(xiě)“ip”和“i.p. ”可互換用于腹膜內(nèi)的或腹膜內(nèi)地。如在本文中所使用的，‘聚こニ醇化的”是指連接于感興趣的蛋白或其它分子的聚こニ醇基團(tuán)(PEG)。聚こニ醇化是指將PEG附著于蛋白或其它分子的過(guò)程。用于上述修飾的方法在本領(lǐng)域中是已知的。3.自由漂浮鏈(catenae)克隆純漿膜CSC是能夠分化的自我更新漿膜細(xì)胞，并且根據(jù)此準(zhǔn)則，滿(mǎn)足干細(xì)胞的定義。CSC包括細(xì)胞的自由漂浮鏈，其具有每鏈3至4個(gè)細(xì)胞至約72個(gè)細(xì)胞，但這不是精確的上限，因?yàn)榕紶栍^(guān)測(cè)到更長(zhǎng)的自由漂浮鏈。自由漂浮鏈被包含透明質(zhì)烷的糖萼包圍并抵抗附著于組織培養(yǎng)板。如在本發(fā)明的方法中所描述的，可以在懸浮培養(yǎng)物中無(wú)限地増殖自由漂浮鏈。每個(gè)自由漂浮鏈?zhǔn)强寺〉牟⑶已刂嗤S對(duì)稱(chēng)地進(jìn)行細(xì)胞分裂，其中觀(guān)測(cè)到偶爾分支。對(duì)稱(chēng)分裂的能力獨(dú)立于細(xì)胞在鏈中的位置，這意味著，在分裂結(jié)束和中間時(shí)，細(xì)胞沿著鏈軸對(duì)稱(chēng)和獨(dú)立地分裂。這種在培養(yǎng)物中分裂和増殖的能力確立了，自由漂浮鏈細(xì)胞是自我更新的。經(jīng)由緊密接頭，細(xì)胞彼此連接，其中上述接頭對(duì)于Z0-1，染色為陽(yáng)性，但對(duì)于E-鈣黏著蛋白的存在則為陰性。定時(shí)間隔照相已表明，自由漂浮鏈并不彼此融合，但似乎相互排斥。
當(dāng)體外評(píng)估時(shí)，在有限稀釋測(cè)定中，自由漂浮鏈顯示至少50%的連續(xù)再克隆能力。相對(duì)于漿膜上皮腫瘤細(xì)胞，単獨(dú)的自由漂浮鏈細(xì)胞具有大大增加的體內(nèi)植活潛力。在適當(dāng)?shù)臈l件下，在小鼠癌癥模型中，ー個(gè)或兩個(gè)自由漂浮鏈細(xì)胞可以導(dǎo)致腫瘤的植活。例如，在皮下植入有在Matrigel中的單個(gè)自由漂浮鏈細(xì)胞的某些小鼠模型(NSG小鼠)中體內(nèi)植活為50-100%。和上皮單層相比，自由漂浮鏈移入好10，000倍以上。這種在體內(nèi)移植以后形成腫瘤的能力確立了，自由漂浮鏈具有分化潛力。另外，形成的腫瘤與從其最初獲得細(xì)胞的那些腫瘤具有類(lèi)似形態(tài)。類(lèi)似地，在適當(dāng)?shù)臈l件下，自由漂浮鏈具有體外產(chǎn)生上皮和間充質(zhì)單層的能力。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，去除糖萼(例如，通過(guò)透明質(zhì)酸酶處理)會(huì)引起自由漂浮鏈在懸浮培養(yǎng)物中停止生長(zhǎng)，沉降于組織培養(yǎng)板上并開(kāi)始分化成上皮和間充質(zhì)細(xì)胞的混合培養(yǎng)物。在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的自由漂浮鏈將持續(xù)產(chǎn)生自由漂浮鏈，即，自由漂浮鏈能夠在培養(yǎng)物中連續(xù)傳代為非連接細(xì)胞。然而，在適當(dāng)?shù)臈l件下，如當(dāng)培養(yǎng)物趨于飽和吋，自由漂浮鏈可以聚攏并形成球形體。這種卷起作用可以提供物理屏障方式，以當(dāng)球形體包含約10-30%CSC時(shí)使CSC免受不利條件的影響。自由漂浮鏈可以產(chǎn)生自漿膜上皮癌細(xì)胞或漿膜間充質(zhì)癌細(xì)胞(下文詳細(xì)討論)。上皮細(xì)胞具有極化形態(tài)并且是E-鈣黏著蛋白陽(yáng)性和波形蛋白陰性。間充質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)紡錘形態(tài)并且是E-鈣黏著蛋白陰性和波形蛋白陽(yáng)性。自由漂浮鏈細(xì)胞是圓形的，并且和間充質(zhì)細(xì)胞ー樣是E-鈣黏著蛋白陰性和波形蛋白陽(yáng)性。自由漂浮鏈的透明質(zhì)烷的糖萼外被是主要形態(tài)特征并且可以通過(guò)用透明質(zhì)酸酶進(jìn)行處理來(lái)除去。圍繞自由漂浮鏈細(xì)胞，糖萼延伸多達(dá)大致20 Pm。當(dāng)糖萼存在時(shí)，自由漂浮鏈在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)并且并不相互作用于細(xì)胞外基質(zhì)成分。當(dāng)酶促去除糖萼時(shí)，自由漂浮鏈細(xì)胞連接于表面，形成絲足延伸并呈現(xiàn)多譜系分化潛力。機(jī)械解離的自由漂浮鏈細(xì)胞保留在懸浮液中并快速增殖以形成自由漂浮鏈。自由漂浮鏈細(xì)胞的掃描電子顯微術(shù)(SEM)已顯示除糖萼以外的各種細(xì)胞外周結(jié)構(gòu)，包括微絨毛、納米管、偽足、觸角和絲足。在一些情況下，微絨毛已在遍及細(xì)胞上被觀(guān)測(cè)至IJ，并且在其它情況下它們傾向于位于細(xì)胞連接處，這提示在細(xì)胞間粘附中的作用。納米管是CSC的新穎細(xì)胞特點(diǎn)并且似乎參與細(xì)胞間通訊，從而可能便于在細(xì)胞之間生物分子的通過(guò)。偽足、觸角和絲足可能在納米管的形成中發(fā)揮作用以及便于監(jiān)測(cè)附著面的環(huán)境和細(xì)胞 因子、生長(zhǎng)因子和免疫細(xì)胞的存在。此外，SEM已顯示，自由漂浮鏈細(xì)胞具有表面泡和結(jié)構(gòu)，其似乎爆發(fā)從細(xì)胞表面并釋放較小顆粒。這些噴發(fā)結(jié)構(gòu)顯示為“火山”或內(nèi)陷的“火山ロ”。釋放的顆粒在外觀(guān)和尺寸方面類(lèi)似于表面泡并且似乎是外染色體。透射電鏡術(shù)(TEM)表明，自由漂浮鏈細(xì)胞具有為干細(xì)胞的特征的未分化細(xì)胞形態(tài)(高核質(zhì)比例)。TEM還便于觀(guān)測(cè)細(xì)胞之間的緊密接頭并且顯示存在完整功能的線(xiàn)粒體。觀(guān)測(cè)到表面泡相鄰于細(xì)胞膜并包含核糖體。具有細(xì)胞的克隆純?nèi)后w便于卵巢自由漂浮鏈(即，卵巣CSC)的分子表征。利用基因表達(dá)，本發(fā)明提供了與表5中所示的卵巢間充質(zhì)單層癌細(xì)胞相關(guān)的卵巣自由漂浮鏈的基因標(biāo)簽?；驑?biāo)簽具有26個(gè)上調(diào)基因和69個(gè)下調(diào)基因，并具有透明質(zhì)烷合酶(HAS2)，在自由漂浮鏈/CSC中最高表達(dá)的基因。第二最高表達(dá)的基因是TOGFRA，其表明TOGF途徑在自由漂浮鏈/CSC中的顯著作用。利用差異miRNA表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)，和卵巣上皮單層相比，在卵巣自由漂浮鏈中miR-200 家族(miR-141、miR_200a、miR_200b、miR_200c 和 miR-429)以及 Let-7 家族miRNA被顯著下調(diào)。另外,和卵巢間充質(zhì)單層相比,在卵巢自由漂浮鏈中，hsa-miR-23b和hsa-miR-27b被顯著下調(diào)。利用受體酪氨酸激酶(RTK)磷酸化測(cè)定，表明，卵巣自由漂浮鏈細(xì)胞和卵巢間充質(zhì)癌細(xì)胞具有性質(zhì)相似的磷酸-RTK分布。利用細(xì)胞表面標(biāo)記分析并借助于市售抗體和FACS，卵巣自由漂浮鏈對(duì)于標(biāo)記CD49f (a 6-整聯(lián)蛋白)、CD90、GM2和CD166是陽(yáng)性的，而對(duì)于標(biāo)記EpCam (CD326)、Mucl6(CA125)和CD44則是陰性的。4.球形體漿膜球形體是由上萬(wàn)細(xì)胞構(gòu)成的較大細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并被觀(guān)測(cè)為不會(huì)通過(guò)40 ii m過(guò)濾器的實(shí)體。球形體可能在轉(zhuǎn)移和腫瘤形成中發(fā)揮作用。球形體還在懸浮培養(yǎng)物中自我更新并具有分化能力。當(dāng)體外評(píng)估時(shí)，在有限稀釋測(cè)定中，球形體具有約10%的連續(xù)再克隆能力。通過(guò)“卷起”過(guò)程，球形體發(fā)展自自由漂浮鏈，這提示在細(xì)胞培養(yǎng)的匯合階段在營(yíng)養(yǎng)匱乏期間，球形體為自由漂浮鏈存活提供保護(hù)性環(huán)境。另外，細(xì)胞可以積聚在附著間充質(zhì)單層上并開(kāi)始球形體。這種細(xì)胞團(tuán)塊在相對(duì)于附著面的垂直方向生長(zhǎng)，類(lèi)似于來(lái)自附著細(xì)胞的“芽殖”，然后發(fā)展成具有有組織的囊性結(jié)構(gòu)的球形體。球形體最終脫離自附著單層并在懸浮液中持續(xù)快速増殖，同時(shí)保持球體形態(tài)。此過(guò)程的示意圖示于圖7。發(fā)展中的球形體將新鮮自由漂浮鏈擠入懸浮液，其反過(guò)來(lái)又可以快速增殖以形成新的自由漂浮鏈。5.自由漂浮鏈和球形體的制備本發(fā)明涉及用于制備自由漂浮鏈和球形體的方法。本文描述兩種主要方法。在一種方法中，將漿膜上皮或間充質(zhì)癌細(xì)胞腹膜內(nèi)(ip)注入動(dòng)物腫瘤模型(優(yōu)選小鼠)，優(yōu)選在添加炎癥刺激的條件下。在用來(lái)發(fā)展腹水和/或?qū)嶓w瘤的足夠時(shí)間以后，從攜帶ip腫瘤的動(dòng)物收獲腹水，并將其分離成兩種或更多種大小流分，優(yōu)選兩種流分。較小尺寸的流分包含自由漂浮鏈和單細(xì)胞，通常白細(xì)胞?？梢匀菀兹コ准?xì)胞并在懸浮培養(yǎng)物中連續(xù)傳代剩余細(xì)胞以獲得克隆漿膜自由漂浮鏈的自我更新群體。較大流分包括保留在過(guò)濾器上的球形體。收集這些球形體并在懸浮培養(yǎng)物中連續(xù)傳代以獲得球形體的自我更新群體。
漿膜上皮細(xì)胞的來(lái)源可以是來(lái)自原發(fā)性漿膜癌細(xì)胞、或永生化上皮或間充質(zhì)漿膜癌細(xì)胞系。原發(fā)性癌細(xì)胞或細(xì)胞系可以是來(lái)自原發(fā)癌或轉(zhuǎn)移性腫瘤。優(yōu)選地，漿膜癌細(xì)胞是卵巢癌細(xì)胞。如在本文中所使用的，動(dòng)物腫瘤模型是這樣的動(dòng)物，其能夠便于腫瘤形成并且是高度免疫缺陷的，即，缺乏至少B細(xì)胞和T細(xì)胞并且優(yōu)選還缺乏NK細(xì)胞。例如，優(yōu)選的動(dòng)物是NOD-SCID ILR y (-/-)小鼠(本文中稱(chēng)作“NSG”小鼠)，其缺乏B細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞。NOD-SCID小鼠缺乏B細(xì)胞和T細(xì)胞，并且雖然是有用的，但需要注射更多數(shù)目的細(xì)胞以發(fā)展腫瘤。炎癥刺激包括在動(dòng)物中刺激炎癥的任何制劑、藥物或因子(在本文中統(tǒng)稱(chēng)為炎性劑)，并且優(yōu)選i.p.給予。炎性劑包括但不限于脂化寡核苷酸、巰こ酸鹽^hemerin ;巨噬細(xì)胞遷移誘導(dǎo)趨化因子如趨化因子(C-C基序)配體1(CCL1)、CCL2、CCL4、CCL7、CCL8、CCL12、CCL13、CCL15、CCL16、CCL23和CCL25 ;巨噬細(xì)胞激活趨化因子如CCL14 ;細(xì)菌來(lái)源的各種制齊U，包括釀酒硫こ酸鹽肉湯(3%.)、熱滅活BCG (來(lái)自牛分枝桿菌的細(xì)胞壁)、吡喃共聚物、小隱孢子蟲(chóng)熱殺死全細(xì)胞、小隱孢子蟲(chóng)的吡啶提取物、來(lái)自鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌的脫毒內(nèi)毒素；以及偏過(guò)碘酸鈉。脂化寡核苷酸通常是約8至約30個(gè)核苷酸的較小低聚物并且以序列獨(dú)立方式起作用。脂質(zhì)成分可以是任何方便基團(tuán)如豆蘧酸酯、棕櫚酸酯等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于給予炎性劑的適當(dāng)劑量?？梢酝ㄟ^(guò)使腹水通過(guò)ー個(gè)或多個(gè)過(guò)濾器來(lái)完成尺寸分流。有用的過(guò)濾器尺寸為約20-60 ym，其中較大尺寸便于更多球形體通過(guò)。優(yōu)選的過(guò)濾器尺寸為40 Pm。在另ー種方法中，可以通過(guò)體外培養(yǎng)技術(shù)從永生化漿膜間充質(zhì)癌細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生自由漂浮鏈和球形體。在此方法中，間充質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)為單層，收獲培養(yǎng)上清，并通過(guò)溫和離心作用(例如，在300g下1-5分鐘)來(lái)沉淀懸浮細(xì)胞。將沉淀的細(xì)胞重懸浮于新鮮培養(yǎng)基(通常以先前培養(yǎng)密度的十分之一)，并轉(zhuǎn)移到新鮮懸浮培養(yǎng)燒瓶供生長(zhǎng)。重復(fù)此周期若干次以產(chǎn)生漿膜自由漂浮鏈和球形體的自我更新群體。通常，生長(zhǎng)細(xì)胞直到它們達(dá)到約200，000個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度或可以被每周傳代。同樣地，此過(guò)程似乎去除由間充質(zhì)單層產(chǎn)生的抑制因子，其可以防止自由漂浮鏈和球形體形成。可以尺寸分流(如上述)這些培養(yǎng)物以分開(kāi)自由漂浮鏈和球形體。
用于這些方法的生長(zhǎng)培養(yǎng)基是補(bǔ)充有10%胎牛血清(FCS)的任何方便的培養(yǎng)基。通常在37° C和5%C02下生長(zhǎng)細(xì)胞。用于自由漂浮鏈的優(yōu)選的生長(zhǎng)培養(yǎng)基是M5，其包含10%FCS (Hyclone)和 1%P/S (Pen-Str印 Solution, 10, 000U/mL 青霉素 G 和 10mg/mL 鏈霉素；Gemini Bio-Products)，以后稱(chēng)為 M5-FCS。M5 培養(yǎng)基是 DME:F12、6g/L HEPES 和 2. 2g/L 碳酸氫鈉。還可以在補(bǔ)充有胰島素的無(wú)血清、無(wú)蛋白培養(yǎng)基中生長(zhǎng)自由漂浮鏈。一種這樣的優(yōu)選培養(yǎng)基是包含1%P/S和0. lU/mL重組胰島素的M5。胰島素源應(yīng)相同于細(xì)胞源，即，如果正培養(yǎng)人自由漂浮鏈，那么無(wú)血清培養(yǎng)基補(bǔ)充有重組人胰島素等。用于球形體的優(yōu)選生長(zhǎng)培養(yǎng)基是ES培養(yǎng)基，并且優(yōu)選補(bǔ)充的mTeSRl培養(yǎng)基[Ludwig et al. 2006]。6.用于確定CSC的基因標(biāo)簽和其它方法在表5中提供的基因表達(dá)信息可以作為用于鑒定卵巣CSC的診斷標(biāo)記。例如，可以利用基因微陣列、RNA測(cè)序、RT-PCR、Q-RT-PCR、454深度測(cè)序、或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的·其它方法，來(lái)測(cè)定來(lái)自患者的腹水或卵巢組織樣品，以確定表5中的ー種或多種基因的表達(dá)水平?？梢詫?duì)這些水平和在正常組織、卵巣間充質(zhì)癌細(xì)胞或卵巣上皮癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的表達(dá)水平進(jìn)行比較。表達(dá)水平還可以用作標(biāo)記，用于監(jiān)測(cè)疾病狀態(tài)、疾病進(jìn)展、尤其是轉(zhuǎn)移，或用作用于評(píng)估候選藥物或制劑對(duì)細(xì)胞或在患者中的影響的標(biāo)簽。監(jiān)測(cè)特定基因標(biāo)記的表達(dá)的測(cè)定可以利用監(jiān)測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)水平的變化的任何可獲得的方式。如在本文中所使用的，如果制劑能夠上調(diào)或下調(diào)在細(xì)胞中的基因的mRNA表達(dá)水平，則認(rèn)為上述制劑可以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。本發(fā)明提供了以下方法來(lái)確定和/或監(jiān)測(cè)在患者樣品中漿膜癌干細(xì)胞的存在。關(guān)于自由漂浮鏈表面基因組，提供了ー種方法來(lái)確定和/或監(jiān)測(cè)在患者樣品中漿膜癌干細(xì)胞的存在，該方法包括(a)從患者獲得細(xì)胞樣品；(b)除盡樣品的白細(xì)胞；(C)反應(yīng)樣品和一系列的可檢測(cè)的表面抗原抗體；(d)將經(jīng)反應(yīng)的細(xì)胞分類(lèi)成單細(xì)胞或多細(xì)胞樣品；以及(e)檢測(cè)任何所述單細(xì)胞或多細(xì)胞樣品是否對(duì)于⑶49f、⑶90、⑶166、TOGFRA、和GM2蛋白質(zhì)的存在是陽(yáng)性的，以及對(duì)于⑶34、⑶133、MUC16和EPCAM蛋白質(zhì)的存在是陰性的，其中所述蛋白質(zhì)的存在和不存在可以將經(jīng)反應(yīng)的細(xì)胞確定為包含漿膜癌干細(xì)胞或?qū)渭?xì)胞確定為漿膜癌干細(xì)胞。例如，通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)并利用適當(dāng)可區(qū)分標(biāo)記抗體，可以分揀細(xì)胞，包括至單細(xì)胞水平?？商鎿Q地,表面體(surfacesome)特點(diǎn)可以用于用來(lái)確定和/或監(jiān)測(cè)在患者樣品中漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，該方法包括(a)從患者獲得細(xì)胞樣品；(b)除盡樣品的白細(xì)胞；(c)從樣品的其余部分中提取RNA ； (d)針對(duì)人mRNA轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)水平來(lái)分析RNA ；以及(e)將具有表面基因組相關(guān)自由漂浮鏈基因標(biāo)簽的樣品確定為那些具有上調(diào)HAS2和TOGFRA、下調(diào)MUC16和EPCAM并且具有上調(diào)的至少7種另外的表11所列的基因的樣品，其中具有那些特點(diǎn)表明患者樣品包含漿膜癌干細(xì)胞。同樣地，表面基因組性能可以用于用來(lái)確定和/或監(jiān)測(cè)在患者樣品中漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，該方法包括(a)從患者的細(xì)胞樣品獲得整合膜蛋白流分，其中細(xì)胞樣品已可選地除盡白細(xì)胞；(b)通過(guò)質(zhì)譜法來(lái)分析所述膜流分的蛋白質(zhì)含量；(c)將具有表面基因組相關(guān)自由漂浮鏈蛋白質(zhì)標(biāo)簽的樣品確定(identify，鑒定)為那些其中光譜數(shù)據(jù)表明存在表16所列的至少40種蛋白質(zhì)的樣品，其中那些蛋白質(zhì)的存在表明患者樣品包含漿膜癌干細(xì)胞。用來(lái)制備完整膜流分的ー種方法是分離細(xì)胞并利用借助于曲通X-114 (TritonX-114)的相分配過(guò)程來(lái)制備可以通過(guò)質(zhì)譜法加以分析的洗滌劑可溶性流分。基于來(lái)自已表征的自由漂浮鏈miRNA的信息，本發(fā)明提供了用來(lái)確定和/或監(jiān)測(cè)在患者樣品中漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，該方法包括(a)從患者獲得細(xì)胞樣品；(b)除盡樣品的白細(xì)胞；(c)從樣品的其余部分提取RNA ； (d)針對(duì)人miRNA的表達(dá)水平來(lái)分析RNA ；以及(e)將具有miRNA相關(guān)自由漂浮鏈標(biāo)簽的樣品確定為那些樣品，其具有下調(diào)的miRNA的let-7和200家族、下調(diào)的hsa-miR-23b和hsa_miR-27b，并且具有上調(diào)的表8所列的至少4種另外的miRNA，其中具有那些特征表明患者樣品包含漿膜癌干細(xì)胞。利用所述自由漂浮鏈mRNA的表達(dá)的分析，確立了自由漂浮鏈基因標(biāo)簽。因此，本發(fā)明的另ー種實(shí)施方式還涉及用來(lái)確定和/或監(jiān)測(cè)在患者樣品中漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，該方法包括(a)從患者獲得細(xì)胞樣品；(b)除盡樣品的白細(xì)胞；(C)從樣品的其余部分提取RNA ； (d)針對(duì)人mRNA轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)的表達(dá)水平來(lái)分析RNA ；以及(e)將 具有自由漂浮鏈基因標(biāo)簽的樣品確定為那些具有上調(diào)的HAS2和TOGFRA并且具有上調(diào)的表5所列的至少5種另外的基因的樣品，其中具有那些特性表明患者樣品包含漿膜癌干細(xì)胞。另ー種實(shí)施方式使用自由漂浮鏈簇限定基因標(biāo)簽并提供用來(lái)確定和/或監(jiān)測(cè)在患者樣品中漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，該方法包括(a)從患者獲得細(xì)胞樣品；(b)可選地，除盡樣品的白細(xì)胞；(c)從樣品的其余部分提取RNA; (d)針對(duì)人mRNA轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)水平來(lái)分析RNA;以及(e)將具有自由漂浮鏈簇限定基因標(biāo)簽的樣品確定為那些樣品，其具有上調(diào)的至少6種基因(在表7清單I中的9種基因)并具有上調(diào)的在表7清單2中的至少5種基因，其中具有自由漂浮鏈簇限定基因標(biāo)簽表明患者樣品包含漿膜癌干細(xì)胞。在本發(fā)明的一種相關(guān)方法中，通過(guò)下述方法可以確定在主體中的漿膜癌干細(xì)胞，該方法包括(a)在組織樣品中檢測(cè)來(lái)自表5的10種或更多種基因的表達(dá)水平，其中相對(duì)于在漿膜間充質(zhì)單層細(xì)胞中的表達(dá)，按照表5的基因的增大或減小表達(dá)表明漿膜癌干細(xì)胞的存在。自由漂浮鏈外染色體和分泌體特別可用于確定和/或監(jiān)測(cè)漿膜癌干細(xì)胞的方法。例如，在一種實(shí)施方式中，外染色體自由漂浮鏈蛋白質(zhì)標(biāo)簽可以用于用來(lái)確定和/或監(jiān)測(cè)在患者樣品中漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，該方法包括(a)從患者樣品獲得分離的外染色體；(b)通過(guò)質(zhì)譜法、通過(guò)抗體結(jié)合或通過(guò)其它方法來(lái)分析所述外染色體的蛋白質(zhì)含量；(C)將具有外染色體自由漂浮鏈蛋白質(zhì)標(biāo)簽的樣品確定為那些樣品，其中光譜數(shù)據(jù)或其它數(shù)據(jù)表明CD63、C0L1A2和表13所列的至少5種另外的蛋白質(zhì)的存在，其中所述蛋白質(zhì)的存在表明患者樣品包含漿膜癌干細(xì)胞。在另ー種實(shí)施方式中，外染色體自由漂浮鏈蛋白質(zhì)標(biāo)簽可以用于用來(lái)確定和/或監(jiān)測(cè)在患者樣品中漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，該方法包括(a)從患者樣品獲得分離的外染色體；(b)反應(yīng)所述外染色體和一和或多種抗體，其中上述抗體對(duì)于CD63、C0L1A2和表13所列的至少5種另外的蛋白質(zhì)是特異的；以及(c)將具有外染色體自由漂浮鏈蛋白質(zhì)標(biāo)簽的樣品確定為那些樣品，其中對(duì)于⑶63、C0L1A2和表13所列的至少5種另外的蛋白質(zhì)的存在是陽(yáng)性的，其中所述蛋白質(zhì)的存在表明患者樣品包含漿膜癌干細(xì)胞。在又一種實(shí)施方式中，分泌體自由漂浮鏈蛋白質(zhì)標(biāo)簽可以用于用來(lái)確定和/或監(jiān)測(cè)在患者樣品中漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，該方法包括(a)從患者樣品獲得上清流分，其中從患者樣品已除去細(xì)胞、細(xì)胞碎片和外染色體；(b)通過(guò)質(zhì)譜法來(lái)分析所述上清流分的蛋白質(zhì)含量；(C)將具有分泌體自由漂浮鏈蛋白質(zhì)標(biāo)簽的樣品確定為那些樣品，其中光譜數(shù)據(jù)表明表15所列的至少20種蛋白質(zhì)的存在，其中那些蛋白質(zhì)的存在表明患者樣品包含漿膜癌干細(xì)胞。又一種實(shí)施方案使用糖萼標(biāo)記和提供了用來(lái)確定和/或監(jiān)測(cè)在患者樣品中漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，該方法包括(a)從患者樣品獲得上清流分，其中從患者樣品已除去細(xì)胞、細(xì)胞碎片和外染色體；(b)通過(guò)質(zhì)譜法來(lái)分析所述上清流分的蛋白質(zhì)含量；(C)將具有糖萼標(biāo)記的樣品確定為那些樣品，其中光譜數(shù)據(jù)表明存在如表4所列的在糖萼中發(fā)現(xiàn)的至少6種蛋白質(zhì)以及不存在ELN、FN1和如表4所列的在自由漂浮鏈中下調(diào)的至少2種蛋白，其中那些蛋白質(zhì)的存在和不存在表明患者樣品包含漿膜癌干細(xì)胞?；诶野彼峒っ甘荏w(RTK)的磷酸化，本發(fā)明的另ー種實(shí)施方式涉及用來(lái)確定和/或監(jiān)測(cè)在患者樣品中漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，該方法包括(a)從患者獲得細(xì)胞樣品 或來(lái)自細(xì)胞樣品的細(xì)胞裂解液，其中所述樣品已除盡白細(xì)胞；(b)用一系列的人酪氨酸激酶受體特異性抗體和泛磷酸酪氨酸抗體溫育所述樣品或所述裂解液；以及(c)檢測(cè)所述樣品或裂解液是否對(duì)于激活磷蛋白是陽(yáng)性的，其中上述磷蛋白選自由TOGFRA和至少6種蛋白質(zhì)組成的組，而其中上述蛋白質(zhì)選自由PDGFRP、EGFR、ERBB4、FGFR2、FGFR3、胰島素-R、IGF1R、DTK/TYR03、MER/MERTK、MSPR/RON、Flt_3、c-rRET、R0R1、R0R2、Tie-1, Tie-2, TrkA/NTRK1、VEGFR3、EphAl、EphA3、EphA4、EphA7、EphB2、EphB4、和 EphB6 組成的組，其中所述激活磷蛋白的檢出可以將患者樣品確定為包含漿膜癌干細(xì)胞?；谔禽嗟慕M成和表征，通過(guò)ー種方法，可以確定和/或監(jiān)測(cè)在患者樣品中漿膜癌干細(xì)胞的存在，上述方法包括(a)從患者樣品獲得上清流分，其中從患者樣品已除去細(xì)胞和細(xì)胞碎片；(b)反應(yīng)樣品和抗C0L1A2抗體；(c)檢測(cè)所述抗體是否結(jié)合透明質(zhì)酸和膠原蛋白的小于20，000道爾頓的低分子量復(fù)合物，其中檢出所述復(fù)合物表明所述樣品包含漿膜癌干細(xì)胞。用于此部分的方法的樣品可以是哺乳動(dòng)物漿膜液、腹水、血液或腫瘤組織。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物是人。可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)、確定、分析等的各種步驟。例如，借助于適當(dāng)方法，可以通過(guò)微陣列分析、通過(guò)RNA或DNA測(cè)序技術(shù)、通過(guò)RT-PCR、通過(guò)Q-RT-PCR等來(lái)完成核酸的檢測(cè)或確定表達(dá)水平。另外，上述方法形成本發(fā)明的另外的實(shí)施方式的基礎(chǔ)。例如，本發(fā)明提供了ー種方法，用來(lái)在漿膜癌患者中檢測(cè)漿膜癌、監(jiān)測(cè)癌癥治療方案的效力、對(duì)需要治療的患者進(jìn)行分類(lèi)、監(jiān)測(cè)藥物療效、預(yù)測(cè)患者對(duì)癌癥治療方案的反應(yīng)，上述方法包括(a)對(duì)來(lái)自患者的樣品定期進(jìn)行上述方法的ー種或多種(例如，如在原始權(quán)利要求48-67中所陳述的)以及(b)關(guān)聯(lián)結(jié)果與患者的狀態(tài)，從而檢測(cè)漿膜癌、監(jiān)測(cè)癌癥治療方案的效力、對(duì)需要治療的患者進(jìn)行分類(lèi)、監(jiān)測(cè)藥物療效或預(yù)測(cè)患者對(duì)癌癥治療方案的反應(yīng)。本發(fā)明的另一方面提供了 PCR引物組，用于確定漿膜CSC，其中通過(guò)在本領(lǐng)域已知的用于DNA、RNA或兩者的眾多的PCR擴(kuò)增方法的任何ー種。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從人類(lèi)基因組的已知序列選擇適當(dāng)?shù)男蛄?，用于PCR引物。本發(fā)明的用于哺乳動(dòng)物基因的PCR引物組是以下組合(每個(gè)組合是PCR引物組，用于組內(nèi)指定基因的擴(kuò)增和檢測(cè))(&)0)4910)90、0)166、？06卩狀和612基因；(b) CD49f、CD90、CD166、PDGFRA, GM2、CD34、CD133、MUC16 和 EPCAM 基因；(c) HAS2、PDGFRA和表11所列的至少10種上調(diào)基因；(d)HAS2、PDGFRA、MUC16、EPCAM 和表 11 所列的至少 10 種上調(diào)基因；(e)表16所列的至少40種蛋白質(zhì)的基因；(f) let-7 和 200miRNA 家族、hsa_miR-23b 和 hsa_miR-27b、以及表 8 所列的至少 4種另外的miRNA ；(g)HAS2、PDGFRA和表5所列的至少5種另外的基因； (h)表7清單I中的9種基因和表I清單2中的至少5種基因；(i)來(lái)自表5的10種或更多種基因；(j)⑶63、C0L1A2和用于表13所列的蛋白質(zhì)的至少5種另外的基因；(k)表15所列的至少20種蛋白質(zhì)的基因；(I)如表4所列的至少6種糖萼蛋白質(zhì)的基因；(m) ELN、FNl、如表4所列的至少6種糖萼蛋白質(zhì)的基因、和在表4中列為下調(diào)的至少2種蛋白質(zhì)的基因；以及(n)roGFRA和至少6種蛋白質(zhì)的基因，上述蛋白質(zhì)選自由TOGFRP、EGFR、ERBB4、FGFR2、FGFR3、胰島素-R、IGF1R、DTK/TYR03、MER/MERTK、MSPR/RON、Flt_3、c-rRET、RORl、R0R2、Tie-1、Tie-2、TrkA/NTRK I、VEGFR3、EphAl、EphA3、EphA4、EphA7、EphB2、EphB4、和EphB6組成的組。7.藥物篩查方法在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括用來(lái)篩查測(cè)試化合物的抗增殖效應(yīng)的方法，該方法包括(a)培養(yǎng)解離的漿膜自由漂浮鏈或漿膜球形體細(xì)胞，通過(guò)熒光或發(fā)光，其是可檢測(cè)的；(b)使所述自由漂浮鏈或球形體接觸測(cè)試化合物；(c)通過(guò)相對(duì)于對(duì)照培養(yǎng)物，測(cè)量由培養(yǎng)物產(chǎn)生的熒光或發(fā)光，來(lái)檢測(cè)所述自由漂浮鏈或球形體的增殖；以及(d)確定測(cè)試化合物是否抑制所述自由漂浮鏈或球形體的增殖。類(lèi)似地，用于篩查測(cè)試化合物對(duì)漿膜癌干細(xì)胞的抗增殖效應(yīng)的另一種方法包括(a)培養(yǎng)解離的漿膜自由漂浮鏈細(xì)胞、解離的漿膜球形體細(xì)胞和解離的漿膜癌黏附細(xì)胞，通過(guò)熒光或發(fā)光，其各自是可檢測(cè)的(平行地)；(b)使所述細(xì)胞接觸所述測(cè)試化合物；(c)通過(guò)相對(duì)于對(duì)照培養(yǎng)物，測(cè)量由培養(yǎng)物產(chǎn)生的熒光或發(fā)光，來(lái)檢測(cè)自由漂浮鏈、球形體和黏附細(xì)胞的增殖；(d)確定，相對(duì)于球形體和單層，測(cè)試化合物是否不同地抑制自由漂浮鏈的增殖。在本發(fā)明的這些方法中，可以方便地在多孔板如96孔、384孔或1536孔板中生長(zhǎng)細(xì)胞。用來(lái)添加培養(yǎng)基、接種平板、添加測(cè)試化合物和對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)分的各種操作可以通過(guò)手動(dòng)或自動(dòng)機(jī)械操作并借助于為此目的設(shè)計(jì)的儀器來(lái)完成。類(lèi)似地，可以手動(dòng)或通過(guò)自動(dòng)化或機(jī)器人分析儀來(lái)確定測(cè)定結(jié)果。為了檢測(cè)抗增殖效應(yīng)，可以在離散的時(shí)間點(diǎn)評(píng)估或連續(xù)監(jiān)測(cè)(當(dāng)適合于測(cè)定時(shí))來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物的熒光信號(hào)。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用來(lái)篩查測(cè)試化合物(或制劑)對(duì)漿膜自由漂浮鏈、球形體和單層的表型或其它效應(yīng)的方法。以和上述測(cè)定類(lèi)似的方式(除檢測(cè)方法之夕卜)進(jìn)行這些方法以評(píng)估測(cè)試化合物的抗增殖效應(yīng)。在這些實(shí)施方式中，檢測(cè)方法取決于待評(píng)估的和明顯可檢測(cè)的特定性能。對(duì)于分化抑制劑，檢測(cè)方法可以評(píng)估在暴露于化合物以后自由漂浮鏈細(xì)胞在培養(yǎng)物中是否未能分化。在用測(cè)試化合物進(jìn)行篩查測(cè)定中，發(fā)現(xiàn)，糖萼的完整性可以在藥物敏感性或抗性方面發(fā)揮重要作用。雖然一些化合物可以容易穿透糖萼，但其它化合物則不能。對(duì)于在患者中最終不再是有效的用于化學(xué)療法的化合物，由可能的重新存在引起的藥物或化療已失去效力的知識(shí)意味著，如果可以除去漿膜癌干細(xì)胞的糖萼，則上述藥物可以保持效力，因而被再次使用。這種認(rèn)識(shí)使得需要另一種方式來(lái)篩查測(cè)試化合物或藥物、知道化療療法等，以在這些細(xì)胞實(shí)體具有建立的和/或顯著的糖萼的條件下，能夠抑制自由漂浮鏈和球形體的增殖或改變其形態(tài)。因此，本發(fā)明的另一種實(shí)施方式提供了用來(lái)篩查測(cè)試化合物的抗增殖或形態(tài)效應(yīng)的方法，該方法包括(a)解離漿膜自由漂浮鏈并制備單細(xì)胞的同質(zhì)群體；(b)在產(chǎn)生具有建立的糖萼外被的自由漂浮鏈的條件下接種和培養(yǎng)那些細(xì)胞一定時(shí)間；(C)使培養(yǎng)物接觸至少一種測(cè)試化合物一定時(shí)間，其將足以允許未經(jīng)處理的培養(yǎng)物增殖而沒(méi)有達(dá)到匯合，即，在篩查測(cè)定期間，培養(yǎng)物將保持亞匯合；以及(d)確定在經(jīng)處理的培養(yǎng)物中測(cè)試化合物是否 抑制自由漂浮鏈的增殖或改變自由漂浮鏈的形態(tài)。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，在接種后的第3、4、5、6或7天，將測(cè)試化合物加入培養(yǎng)物，并且更優(yōu)選在第5或6天。在這種方法的一種變通方式中，以步驟(b)以后但在步驟(C)以前，可以用一定量的透明質(zhì)酸酶、膠原酶或兩者溫育培養(yǎng)物一定時(shí)間，以足以去除或破壞所述自由漂浮鏈的糖萼外被。通過(guò)在37° C下進(jìn)行上述處理約5-30分鐘，并且優(yōu)選約10分鐘。在測(cè)定的其余部分期間，并不需要除去這些酶。在本發(fā)明的方法中還可以使用酶的修飾和聚乙二醇化變體。這些測(cè)定還可以容易適應(yīng)于HTS格式(如上述)。為了確定測(cè)試化合物是否影響增殖，可以在有或沒(méi)有染色或測(cè)得熒光信號(hào)、發(fā)光信號(hào)或吸光率的情況下人工計(jì)數(shù)細(xì)胞。由于自由漂浮鏈存在于懸浮液中，所以檢測(cè)方法需要相應(yīng)加以調(diào)整并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)進(jìn)行。一種優(yōu)選的檢測(cè)方法是利用alamarBlue 染色，接著測(cè)量培養(yǎng)物的突光或吸光率，其正比于在培養(yǎng)物中存在的活細(xì)胞并且與細(xì)胞是粘連的或在懸浮液中無(wú)關(guān)。還提供了用于漿膜球形體的類(lèi)似的測(cè)定系統(tǒng)。對(duì)于球形體，在產(chǎn)生足夠數(shù)量和大小的具有建立的糖萼外被的球形體的條件下，培養(yǎng)解離的細(xì)胞一定時(shí)間。和自由漂浮鏈相t匕，由于球形體是許多細(xì)胞的較大聚集體，所以它需要更長(zhǎng)時(shí)間來(lái)重新建立外被。球形體的時(shí)間范圍通常是約8至約14天，所以在上述時(shí)間范圍內(nèi)添加測(cè)試化合物，并且優(yōu)選在接種后的第11天。因此，這些方法便于相對(duì)于具有未受干擾的保護(hù)性細(xì)胞外周外被的漿膜(包括卵巢)癌癥干細(xì)胞(自由漂浮鏈)來(lái)篩查化合物的毒性和化學(xué)性能，并且是一種體外系統(tǒng)，和常規(guī)篩查方法相比，其更相關(guān)于臨床環(huán)境。體內(nèi)和體外數(shù)據(jù)提示，自由漂浮鏈?zhǔn)沁m應(yīng)于生長(zhǎng)在懸浮液中、在腹水中的卵巢癌干細(xì)胞，以及糖萼形成(不限于一種機(jī)制)可能是癌癥干細(xì)胞在腹水中的生長(zhǎng)和擴(kuò)大以及繼續(xù)作為癌癥干細(xì)胞所需要的。數(shù)據(jù)還解釋了在具有腹膜轉(zhuǎn)移的晚期卵巢癌和其它漿膜癌類(lèi)型中對(duì)治療的抗性。在此篩查中，確定為對(duì)具有完整的細(xì)胞外周外被的自由漂浮鏈具有毒性的任何化合物可潛在地用于晚期卵巢癌的治療。8.治療方法
A.靶向糖萼自由漂浮鏈的透明質(zhì)酸糖萼外被是主要形態(tài)特點(diǎn)。靶向此特點(diǎn)(為除去)，可以提供一種方法來(lái)治療漿膜癌、將癌癥維持在可管理的疾病狀態(tài)、在其它標(biāo)準(zhǔn)癌癥護(hù)理(例如，連同化學(xué)療法或放射治療一起)以后或期間根除癌癥干細(xì)胞以及延長(zhǎng)在發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移以前的時(shí)間。 可以通過(guò)各種途徑，包括透明質(zhì)烷的降解、防止透明質(zhì)烷結(jié)合于它的受體(例如⑶44、RHAMM)、防止透明質(zhì)烷輸出或相互作用于透明質(zhì)烷的蛋白質(zhì)(例如Aggregan、Versican)，來(lái)靶向透明質(zhì)烷和/或其它糖萼成分。另外，通過(guò)靶向產(chǎn)生透明質(zhì)烷的合成途徑成分可以抑制或減少透明質(zhì)烷表達(dá)，其中通過(guò)各種技術(shù)，包括RNAi或反義技術(shù)或添加酶抑制劑。可以通過(guò)抑制其化學(xué)結(jié)構(gòu)的若干部分的形成(例如靶向重復(fù)雙糖單元或糖苷鍵)來(lái)破壞透明質(zhì)烷合成。另外，可以通過(guò)在DNA、RNA、或蛋白質(zhì)水平上靶向透明質(zhì)烷合酶(HAS)(例如，酶抑制劑)來(lái)抑制透明質(zhì)烷合成。HAS抑制劑的實(shí)例包括但不限于4-甲基傘形酮(4-MU或MU)、4-甲基七葉亭(ME)、布雷菲德菌素A、甘露糖、相對(duì)于透明質(zhì)烷合酶的SiRNA、相對(duì)于透明質(zhì)烷合酶的胞外或胞內(nèi)域的抗體、透明質(zhì)酸酶(細(xì)菌或動(dòng)物來(lái)源，天然或重組的)、以及任何上述實(shí)例的聚乙二醇化或化學(xué)修飾衍生物(視情況而定)?？梢酝ㄟ^(guò)抗體、小分子、酶或其它方式來(lái)靶向透明質(zhì)烷以達(dá)到降解和除去的目的。最常見(jiàn)通過(guò)透明質(zhì)酸酶，一種糖蛋白，來(lái)降解透明質(zhì)烷。透明質(zhì)酸酶已被視為在治療癌癥方面具有潛在治療應(yīng)用?？梢杂糜趧?dòng)物的這種酶或修飾在本文中可以首次用來(lái)選擇性地靶向漿膜癌干細(xì)胞。例如，通常用標(biāo)準(zhǔn)療法，包括手術(shù)、化學(xué)療法、放射療法、或它們的組合，來(lái)治療卵巢癌。上述治療可以包括鉬為基礎(chǔ)的療法、托泊替康、口服依托泊苷、多西他賽、吉西他濱、5-FU、亞葉酸、脂質(zhì)體多柔比星。本發(fā)明提供了這些治療的補(bǔ)充，以在治療期間除去或抑制糖萼形成。例如，在一種治療方案中，除去原發(fā)癌(通過(guò)任何方式或治療)，接著透明質(zhì)酸酶治療以根除耐治療或逃避治療的任何自由漂浮鏈或CSC。還可以和癌癥治療的標(biāo)準(zhǔn)療程同時(shí)進(jìn)行透明質(zhì)酸酶治療。另外，上述兩種治療方式可以接著是另外回合的標(biāo)準(zhǔn)療法(例如，化療)(如果需要的話(huà))。本發(fā)明設(shè)想其它護(hù)理方法，其根除自由漂浮鏈、破壞自由漂浮鏈的形態(tài)、迫使自由漂浮鏈分化、或降低自由漂浮鏈的克隆發(fā)生，該方法包括透明質(zhì)酸酶治療作為治療的一部分。本發(fā)明的某些實(shí)施方式提供了在接受化療方案或放射治療的患者中治療漿膜癌的方法，該方法包括給予一定量的透明質(zhì)烷合酶抑制劑、透明質(zhì)烷途徑的另一種抑制劑、或降解透明質(zhì)烷的酶一定時(shí)間，以增強(qiáng)或補(bǔ)充治療方案或治療或改善患者的存活時(shí)間?？梢栽诨瘜W(xué)療法方案或放射治療以前、以后或同時(shí)給予抑制劑。此方法可以接著是另外回合的化學(xué)療法或放射療法。本方法會(huì)緩解癌癥癥狀，例如，包括腫瘤消退、較少的胃氣脹或腹水形成。這些方法還抑制在患者中的癌癥干細(xì)胞自我更新和/或形成，不限于一種機(jī)制，其中通過(guò)抑制所述CSC的糖萼形成，從而抑制自我更新并引起CSC的分化。這種分化可以使細(xì)胞再次可以接受本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)癌癥治療方案。漿膜癌包括但不限于卵巢癌和出現(xiàn)在漿膜腔中的任何癌癥，不管是原發(fā)性或繼發(fā)性(例如，轉(zhuǎn)移性)起源。
催化透明質(zhì)烷分解(降解透明質(zhì)酸)的酶包括透明質(zhì)酸酶(例如，EC3. 2. I. 35)。人類(lèi)具有6種相關(guān)基因，包括HYALl、HYAL2、HYAL3、HYAL4、MGEA5和PH-20/SPAM1。任何透明質(zhì)酸酶可以用于本發(fā)明。用于本發(fā)明的優(yōu)選的透明質(zhì)酸酶是源自基因PH20的重組人透明質(zhì)酸酶Hylenex (Halozyme Theraputics)。聚乙二醇化PH20透明質(zhì)酸酶也是有用的。透明質(zhì)酸酶可以是人、其它動(dòng)物或細(xì)菌來(lái)源、以及人工制得(重組/合成的)。它可以被修飾(聚乙二醇化，添加低聚物的 轉(zhuǎn)運(yùn)體，用來(lái)修飾酶的其它眾所周知的方式)并可以以向患者遞送有效劑量的任何劑型加以提供。確定劑量和制定化療療法的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用來(lái)在患者中抑制癌癥干細(xì)胞自我更新或形成的方法，該方法包括將一定量的糖萼形成的抑制劑或降解糖萼的制劑給予所述患者一定時(shí)間，以在患者中抑制糖萼形成或降解CSC的糖萼，從而抑制所述CSC的自我更新或形成、引起CSC的分化、使CSC容易受到其它化療方案的殺傷、或防止自由漂浮鏈進(jìn)行球形體形成。在本發(fā)明的方法中使用的抑制劑和酶可以提供為以注射用無(wú)菌溶液、混懸劑或其它方便制劑的形式供腹膜內(nèi)或漿膜內(nèi)遞送的藥物組合物。腹膜內(nèi)遞送是特別有用的。當(dāng)口服給予時(shí)，抑制劑和酶可以，例如，具有丸劑、片劑、包衣片劑、膠囊劑、顆粒劑或酏劑的形式。還可以直腸給予，例如以栓劑的形式，或胃腸外給予，例如以注射用無(wú)菌溶液或混懸劑的形式靜脈內(nèi)給予、肌內(nèi)給予、鞘內(nèi)給予或皮下給予，或局部給予，例如以溶液或透皮貼劑的形式，或用其它方式給予，例如以氣霧劑或鼻腔噴霧劑的形式。取決于給予的特性，藥物組合物可以進(jìn)一步包含，例如，藥用添加劑、賦形劑、載體等，其可以改善，例如，可制造性、給予、味道、攝入、攝取等。B.其它治療方法本發(fā)明的其它治療方法包括用來(lái)治療漿膜癌的方法，該方法包括(a)將抗癌治療方案給予漿膜癌患者；(b)審查用來(lái)自所述患者的樣品定期進(jìn)行上述部分5中的一種或多種方法所獲得的結(jié)果，以及(C)根據(jù)需要并與提供自那些方法的信息一致來(lái)改變治療方案，即，通過(guò)監(jiān)測(cè)在患者中存在的漿膜癌干細(xì)胞，開(kāi)業(yè)醫(yī)生可以作出告知和個(gè)性化的決定何種治療方案將用于特定患者。9.潛在療法除自由漂浮鏈的基因標(biāo)簽信息以外，基因表達(dá)分析還給出關(guān)于活躍于自由漂浮鏈細(xì)胞中的分子途徑的重大信息?；诖诵畔ⅲ鞩提供了活躍于自由漂浮鏈中的一系列途徑和靶向那些途徑的化合物，作為用于漿膜CSC、以及更特別是用于卵巢CSC的潛在有效療法。已測(cè)試了下劃線(xiàn)化合物相對(duì)于自由漂浮鏈的效力。表I :靶向自由漂浮鏈途徑的化合物
權(quán)利要求
1.一種用于產(chǎn)生漿膜癌干細(xì)胞的方法，所述方法包括 (a)在產(chǎn)生腹膜內(nèi)(ip)腫瘤的條件下，用一定量的哺乳動(dòng)物漿膜上皮腫瘤細(xì)胞腹膜內(nèi)注射免疫減弱的、非人哺乳動(dòng)物； (b)從攜帶ip腫瘤的非人哺乳動(dòng)物收獲腹水； (c)將所述腹水分流成包含漿膜自由漂浮鏈和白細(xì)胞的第一流分以及包含漿膜球形體的第二流分； (d)從所述第一流分中去除所述白細(xì)胞以獲得富含自由漂浮鏈的流分； (e)在產(chǎn)生粘附間充質(zhì)細(xì)胞以及富集漿膜癌干細(xì)胞的漿膜自由漂浮鏈的懸浮液的條件下，培養(yǎng)所述富含自由漂浮鏈的流分一定時(shí)間。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，所述方法進(jìn)ー步包括 (f)收集所述漿膜自由漂浮鏈的懸浮液； (g)分離所述漿膜自由漂浮鏈與可能已經(jīng)形成的任何漿膜球形體； (h)在產(chǎn)生包含至少50-100%的漿膜癌干細(xì)胞的自由漂浮漿膜自由漂浮鏈的培養(yǎng)物的條件下，在懸浮液中連續(xù)傳代所述自由漂浮鏈一定時(shí)間。
3.一種用于產(chǎn)生漿膜癌干細(xì)胞的方法，所述方法包括 (a)在產(chǎn)生腹膜內(nèi)(ip)腫瘤的條件下，用一定量的哺乳動(dòng)物漿膜上皮腫瘤細(xì)胞腹膜內(nèi)注射免疫減弱的非人哺乳動(dòng)物； (b)從攜帶ip腫瘤的非人哺乳動(dòng)物收獲腹水； (c)將所述腹水分流成包含漿膜自由漂浮鏈和白細(xì)胞的第一腹水流分以及包含漿膜球形體的第二腹水流分； (d)在產(chǎn)生粘附間充質(zhì)細(xì)胞以及自由漂浮的自由漂浮鏈和腫瘤球形體的懸浮培養(yǎng)物的條件下，培養(yǎng)所述第二流分一定時(shí)間；以及 (e)將所述懸浮培養(yǎng)物分流成包含富集漿膜癌干細(xì)胞的自由漂浮的自由漂浮鏈的第一培養(yǎng)流分以及包含富集漿膜癌干細(xì)胞的自由漂浮腫瘤球形體的第二培養(yǎng)流分。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述方法進(jìn)ー步包括 (f)在產(chǎn)生自由漂浮鏈和腫瘤球形體的另外的懸浮培養(yǎng)物的條件下，培養(yǎng)所述第二培養(yǎng)流分一定時(shí)間； (g)將所述另外的懸浮培養(yǎng)物分流成自由漂浮鏈流分和腫瘤球形體流分； (h)在產(chǎn)生包含至少10-30%漿膜癌干細(xì)胞的自由漂浮腫瘤球形體的懸浮培養(yǎng)物的條件下，使用所述自由漂浮腫瘤球形體流分重復(fù)步驟(f)和(g) —定時(shí)間。
5.一種用于分離漿膜自由漂浮鏈的方法，所述方法包括 (a)在產(chǎn)生腹膜內(nèi)(ip)腫瘤的條件下，用一定量的哺乳動(dòng)物漿膜上皮腫瘤細(xì)胞腹膜內(nèi)注射免疫減弱的非人哺乳動(dòng)物； (b)從攜帶ip腫瘤的非人哺乳動(dòng)物收獲腹水； (c)將所述腹水分流成包含漿膜自由漂浮鏈和白細(xì)胞的第一流分以及包含漿膜球形體的第二流分；以及 (d)從所述第一流分中去除所述白細(xì)胞以獲得富含自由漂浮鏈的流分。
6.一種用來(lái)分離漿膜球形體的方法，所述方法包括 (a)在產(chǎn)生腹膜內(nèi)(ip)腫瘤的條件下，用一定量的哺乳動(dòng)物漿膜上皮腫瘤細(xì)胞腹膜內(nèi)注射免疫減弱的非人哺乳動(dòng)物； (b)從攜帶ip腫瘤的非人哺乳動(dòng)物收獲腹水； (c)將所述腹水分流成包含漿膜自由漂浮鏈和白細(xì)胞的第一流分以及包含漿膜球形體的第二流分；以及 (d)分離所述漿膜球形體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法進(jìn)ー步包括在注射所述細(xì)胞一段足以產(chǎn)生ip腫瘤的時(shí)間以前、同時(shí)或以后，誘導(dǎo)腹膜內(nèi)炎癥。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述非人哺乳動(dòng)物是缺乏T細(xì)胞、B細(xì)胞和/或天然殺傷細(xì)胞的小鼠。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述小鼠是NOD/SCID小鼠、NSG小鼠或NOG小鼠。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、3、5或6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，分流包括通過(guò)30-60um過(guò)濾器過(guò)濾所述腹水以獲得包含所述漿膜自由漂浮鏈和白細(xì)胞的流過(guò)流分以及包含漿膜球形體的保留流分。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，漿膜是卵巢的。
12.分離的克隆純漿膜癌干細(xì)胞。
13.一種漿膜癌干細(xì)胞的克隆純、自我更新群體，包含細(xì)胞的對(duì)稱(chēng)分裂的自由漂浮鏈，其中所述鏈包含約四(4)至約七十ニ(72)個(gè)細(xì)胞，或更多，并被包含透明質(zhì)烷的糖萼包圍，以及其中所述細(xì)胞是E-鈣黏著蛋白陰性的，具有相對(duì)于漿膜上皮腫瘤細(xì)胞的增加的植活潛力，保留連續(xù)再克隆潛力，并且在體外呈現(xiàn)至少50%再克隆能力。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的漿膜癌干細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞是卵巢癌干細(xì)胞。
15.ー種用來(lái)篩查測(cè)試化合物對(duì)漿膜癌干細(xì)胞的抗增殖效應(yīng)的方法，所述方法包括 (a)培養(yǎng)任何一種或多種的解離的漿膜自由漂浮鏈細(xì)胞、解離的漿膜球形體細(xì)胞和解離的漿膜癌黏附細(xì)胞，所述細(xì)胞能夠發(fā)熒光或發(fā)光； (b)使所述細(xì)胞接觸所述測(cè)試化合物； (c)通過(guò)檢測(cè)由所述培養(yǎng)物發(fā)射的熒光或發(fā)光來(lái)檢測(cè)所述細(xì)胞是否増殖自由漂浮鏈、球形體和黏附細(xì)胞；以及 (d)確定所述測(cè)試化合物是否抑制所述自由漂浮鏈、球形體或黏附細(xì)胞的増殖。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，所述方法進(jìn)ー步包括 (e)確定所述測(cè)試化合物是否相對(duì)于球形體或黏附細(xì)胞不同地抑制所述自由漂浮鏈的増殖。
17.ー種用來(lái)篩查測(cè)試化合物對(duì)漿膜癌干細(xì)胞的形態(tài)效應(yīng)的方法，所述方法包括 (a)培養(yǎng)任何一種或多種的解離的漿膜自由漂浮鏈細(xì)胞、解離的漿膜球形體細(xì)胞和解離的漿膜癌黏附細(xì)胞，所述細(xì)胞能夠發(fā)熒光或發(fā)光； (b)使所述細(xì)胞接觸所述測(cè)試化合物； (c)通過(guò)檢測(cè)由所述培養(yǎng)物發(fā)射的熒光或發(fā)光來(lái)檢測(cè)所述細(xì)胞是否増殖自由漂浮鏈、球形體和黏附細(xì)胞；以及 (d)確定所述測(cè)試化合物是否抑制所述自由漂浮鏈、球形體或黏附細(xì)胞的増殖。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，所述方法進(jìn)ー步包括(e)確定所述測(cè)試化合物是否相對(duì)于球形體或黏附細(xì)胞不同地改變所述自由漂浮鏈的形態(tài)。
19.ー種用來(lái)篩查測(cè)試化合物的抗增殖效應(yīng)或形態(tài)效應(yīng)的方法，所述方法包括 (a)解離漿膜自由漂浮鏈并制備單細(xì)胞的同質(zhì)群體； (b)在產(chǎn)生具有建立的糖萼外被的自由漂浮鏈的條件下接種和培養(yǎng)所述細(xì)胞一定時(shí)間； (C)使所述培養(yǎng)物接觸至少ー種測(cè)試化合物足夠的時(shí)間，以允許未經(jīng)處理的培養(yǎng)物增殖但沒(méi)有達(dá)到匯合；以及 (d)確定在所述經(jīng)處理的培養(yǎng)物中所述測(cè)試化合物是否抑制所述自由漂浮鏈的増殖或改變所述自由漂浮鏈的形態(tài)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，在接種約3、4、5、6或7天以后，使所述培養(yǎng)物接觸所述測(cè)試化合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的方法，所述方法進(jìn)ー步包括，在步驟(b)以后但在步驟(c)以前，用一定量的透明質(zhì)酸酶、膠原酶或兩者，溫育所述培養(yǎng)物一定時(shí)間，以足以去除或破壞所述自由漂浮鏈的所述糖萼外被。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述溫育時(shí)間是在37°C下約10分鐘。
23.根據(jù)權(quán)利要求19-22中任一項(xiàng)所述的方法，其中，通過(guò)在染色或沒(méi)有染色的情況下人工計(jì)數(shù)細(xì)胞，測(cè)量熒光信號(hào)、發(fā)光信號(hào)，或通過(guò)alamarBlue染色和檢測(cè)，來(lái)確定化合物的增殖效應(yīng)。
24.根據(jù)權(quán)利要求19-23中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在384孔或1536孔板中進(jìn)行培養(yǎng)以便于高通量篩查。
25.ー種用來(lái)篩查測(cè)試化合物的抗增殖效應(yīng)或形態(tài)效應(yīng)的方法，所述方法包括 (a)解離漿膜球形體和制備單細(xì)胞的同質(zhì)群體； (b)在產(chǎn)生具有足夠數(shù)量和大小并具有建立的糖萼外被的球形體的條件下，接種和培養(yǎng)所述細(xì)胞一定時(shí)間； (C)使所述培養(yǎng)物接觸至少ー種測(cè)試化合物足夠的時(shí)間以使未經(jīng)處理的培養(yǎng)物增殖但沒(méi)有達(dá)到匯合；以及 (d)確定在所述經(jīng)處理的培養(yǎng)物中所述測(cè)試化合物是否抑制所述球形體的増殖或改變所述球形體的形態(tài)。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，在接種約8至約14天以后，使所述培養(yǎng)物接觸所述測(cè)試化合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的方法，所述方法進(jìn)ー步包括，在步驟(b)以后但在步驟(C)以前，用一定量的透明質(zhì)酸酶、膠原酶或兩者，溫育所述培養(yǎng)物一定時(shí)間，以足以去除或破壞所述球形體的所述糖萼外被。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述溫育時(shí)間是在37°C下的約10分鐘。
29.根據(jù)權(quán)利要求25-28中任一項(xiàng)所述的方法，其中，通過(guò)在染色或沒(méi)有染色的情況下人工計(jì)數(shù)細(xì)胞，測(cè)量熒光信號(hào)、發(fā)光信號(hào)，來(lái)確定化合物的増殖效應(yīng)。
30.根據(jù)權(quán)利要求25-29中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在384孔或1536孔板中進(jìn)行培養(yǎng)以便于高通量篩查。
31.一種用來(lái)在接受化學(xué)療法或放射治療的患者中治療漿膜癌的方法，所述方法包括給予一定量的透明質(zhì)烷合酶抑制劑、透明質(zhì)酸酶、膠原酶、或它們的組合一定時(shí)間，以增強(qiáng)所述療法或治療，或改善或增加患者存活時(shí)間，或引起癥狀的緩解。
32.—種用來(lái)在患者中治療漿膜癌的方法，所述方法包括共同給予一定量的放射治療以及透明質(zhì)烷合酶抑制劑、透明質(zhì)酸酶、膠原酶、或它們的組合一定時(shí)間，以引起癥狀的緩解和/或癌癥消除或減小的其它度量。
33.根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的方法，其中，所述透明質(zhì)烷合酶抑制劑、透明質(zhì)酸酶或膠原酶中的任何一種被聚こニ醇化或用其它方式修飾以増加其體內(nèi)半衰期。
34.一種用來(lái)在患者中抑制癌干細(xì)胞自我更新或形成的方法，所述方法包括給予所述患者一定量的糖萼形成的抑制劑或降解糖萼的試劑一定時(shí)間，以在所述患者中抑制糖萼形成或降解CSC的糖萼，從而抑制所述CSC的自我更新或形成，或引起CSC的分化并使它們?nèi)菀资艿綒?，防止所述自由漂浮鏈進(jìn)行球形體形成，或它們的任何組合。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述抑制劑或試劑被聚こニ醇化或用其它方式修飾以増加其體內(nèi)半衰期。
36.ー種用于編碼哺乳動(dòng)物HAS2剪接變體的分離的核酸。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的核酸，具有編碼HAS2剪接變體的mRNA或cDNA序列。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的核酸，其中，所述核酸包含相鄰核苷酸序列，以5’至3’次序，基本上包括HAS2基因的外顯子2的全部或部分以及外顯子3的全部。
39.根據(jù)權(quán)利要求36所述的分離的核酸，其中，所述HAS2剪接變體基本上包括人HAS2編碼序列的氨基酸215至552。
40.一種載體,包含權(quán)利要求36-39中任一項(xiàng)所述的核酸。
41.一種細(xì)胞,包含權(quán)利要求40所述的載體。
42.一種分離的核酸探針，用于特異性檢測(cè)哺乳動(dòng)物HAS2剪接變體RNA或選自在表17和18中確定的突變的任何ー種或多種HAS2突變。
43.一種分離的哺乳動(dòng)物HAS2蛋白，由HAS2剪接變體mRNA或相應(yīng)cDNA編碼。
44.一種由根據(jù)權(quán)利要求36-39中任一項(xiàng)所述的核酸編碼的分離的HAS2蛋白。
45.一種分離的核酸，編碼哺乳動(dòng)物突變體HAS2或哺乳動(dòng)物突變體HAS2剪接變體。
46.ー種載體，包含根據(jù)權(quán)利要求45所述的核酸。
47.一種細(xì)胞，包含根據(jù)權(quán)利要求46所述的載體。
48.一種用于在主體中監(jiān)測(cè)和/或分期漿膜癌的方法，所述方法包括 (a)從獲自癌癥患者的腹水制備自由漂浮鏈； (b)檢測(cè)所述自由漂浮鏈?zhǔn)欠窬哂些`個(gè)或多個(gè)HAS2突變和/或表達(dá)ー種或多種HAS2剪接變體；以及 (c)將所述突變和/或變體與在所述患者中的癌癥的存在和/或進(jìn)展相關(guān)聯(lián)。
49.一種用來(lái)在患者樣品中確定或監(jiān)測(cè)漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，所述方法包括 (a)從患者獲得細(xì)胞樣品； (b)可選地，除盡所述樣品的白細(xì)胞； (c)由所述樣品的其余部分制備DNA、RNA或兩者； (d)檢測(cè)所述DNA、RNA或兩者是否具有HAS2突變或表達(dá)HAS2剪接變體，其中突變或剪接變體的鑒定表明在所述樣品中存在漿膜癌干細(xì)胞。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，所述方法進(jìn)ー步包括量化具有HAS2突變或表達(dá)HAS2剪接變體的DNA、RNA或兩者的量，并將所述量與在所述患者中癌癥的存在和/或癌癥的進(jìn)展相關(guān)聯(lián)。
51.ー種用來(lái)確定和/或監(jiān)測(cè)在患者樣品中漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，所述方法包括 (a)從患者獲得細(xì)胞樣品； (b)除盡所述樣品的白細(xì)胞； (c)使所述樣品和一系列的可檢測(cè)的表面抗原抗體反應(yīng)； (d)將所述經(jīng)反應(yīng)的細(xì)胞分類(lèi)成單細(xì)胞或多細(xì)胞樣品；以及 (e)檢測(cè)任何所述單細(xì)胞或多細(xì)胞樣品是否對(duì)于CD49f、CD90、CD166、roGFRAjPGM2蛋白的存在是陽(yáng)性的，以及對(duì)于CD34、CD133、MUC16和EPCAM蛋白的存在是陰性的，其中所述蛋白的存在和不存在將所述經(jīng)反應(yīng)的細(xì)胞確定為包含漿膜癌干細(xì)胞或?qū)渭?xì)胞確定為漿膜癌干細(xì)胞。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中，分選是通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)。
53.一種用來(lái)在患者樣品中確定和/或監(jiān)測(cè)漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，所述方法包括 (a)從患者獲得細(xì)胞樣品； (b)除盡所述樣品的白細(xì)胞； (c)從所述樣品的其余部分中提取RNA； (d)針對(duì)人mRNA轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)水平來(lái)分析所述RNA；以及 (e)將具有表面基因組相關(guān)自由漂浮鏈基因標(biāo)簽的樣品鑒定為那些具有上調(diào)HAS2和TOGFRA、下調(diào)MUC16和EPCAM以及具有上調(diào)的至少7種另外的表11所列基因的樣品，其中具有那些特征則表明所述患者樣品包含漿膜癌干細(xì)胞。
54.一種用來(lái)在患者樣品中確定和/或監(jiān)測(cè)漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，所述方法包括 (a)從患者的細(xì)胞樣品中獲得整合膜蛋白流分，其中所述細(xì)胞樣品已可選地除盡白細(xì)胞； (b)通過(guò)質(zhì)譜法來(lái)分析所述膜流分的蛋白質(zhì)含量； (C)將具有表面基因組相關(guān)自由漂浮鏈蛋白質(zhì)標(biāo)簽的樣品鑒定為那些其中光譜數(shù)據(jù)表明存在至少40種表16所列蛋白的樣品，其中那些蛋白質(zhì)的存在表明所述患者樣品包含漿膜癌干細(xì)胞。
55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中，通過(guò)相分配過(guò)程并利用曲通X-114來(lái)制備所述整合膜蛋白流分。
56.一種用來(lái)在患者樣品中確定和/或監(jiān)測(cè)漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，所述方法包括 (a)從患者獲得細(xì)胞樣品； (b)除盡所述樣品的白細(xì)胞； (c)從所述樣品的其余部分中提取RNA;(d)針對(duì)人miRNA的表達(dá)水平來(lái)分析所述RNA；以及 (e)將具有miRNA相關(guān)自由漂浮鏈標(biāo)簽的樣品鑒定為那些具有下調(diào)miRNA的let_7和200家族、下調(diào)hsa-miR-23b和hsa_miR-27b、以及具有上調(diào)的至少4種另外的表8所列的miRNA的樣品，其中具有那些特征表明所述患者樣品包含漿膜癌干細(xì)胞。
57.一種用來(lái)在患者樣品中確定和/或監(jiān)測(cè)漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，所述方法包括 (a)從患者獲得細(xì)胞樣品； (b)除盡所述樣品的白細(xì)胞； (c)從所述樣品的其余部分中提取RNA； (d)針對(duì)人mRNA轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)水平來(lái)分析所述RNA；以及 (e)將具有自由漂浮鏈基因標(biāo)簽的樣品鑒定為那些具有上調(diào)的HAS2和TOGFRA以及具有上調(diào)的至少5種另外的表5所列的基因的樣品，其中具有那些特征表明所述患者樣品包含漿膜癌干細(xì)胞。
58.一種用來(lái)在患者樣品中確定和/或監(jiān)測(cè)漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，所述方法包括 (a)從患者獲得細(xì)胞樣品； (b)可選地，除盡所述樣品的白細(xì)胞； (c)從所述樣品的其余部分中提取RNA； (d)針對(duì)人mRNA轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)水平來(lái)分析所述RNA；以及 (e)將具有自由漂浮鏈簇限定基因標(biāo)簽的樣品鑒定為那些具有在表7清單I中的上調(diào)的9種基因中的至少6種基因以及具有在表7清單2中的上調(diào)的至少5種基因的樣品，其中具有自由漂浮鏈簇限定基因標(biāo)簽表明所述患者樣品包含漿膜癌干細(xì)胞。
59.一種用于在主體中確定漿膜癌干細(xì)胞的方法，所述方法包括 (a)在組織樣品中檢測(cè)來(lái)自表5的10種或更多種基因的表達(dá)水平，其中相對(duì)于在漿膜間充質(zhì)單層細(xì)胞中的表達(dá)，按照表5的基因的增大或減小的表達(dá)表明漿膜癌干細(xì)胞的存在。
60.一種用來(lái)在患者樣品中確定和/或監(jiān)測(cè)漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，所述方法包括 (a)從患者樣品中獲得分離的外染色體； (b)通過(guò)質(zhì)譜法、通過(guò)抗體結(jié)合或其它方式，來(lái)分析所述外染色體的蛋白質(zhì)含量； (C)將具有外染色體自由漂浮鏈蛋白質(zhì)標(biāo)簽的樣品鑒定為那些其中光譜數(shù)據(jù)或其它數(shù)據(jù)表明存在CD63、COL1A2和至少5種另外的表13所列的蛋白質(zhì)的樣品，其中所述蛋白質(zhì)的存在表明所述患者樣品包含漿膜癌干細(xì)胞。
61.一種用來(lái)在患者樣品中確定和/或監(jiān)測(cè)漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，所述方法包括 (a)從患者樣品中獲得分離的外染色體； (b)使所述外染色體與對(duì)于CD63、COL1A2和至少5種另外的表13所列的蛋白具有特異性的ー種或多種抗體進(jìn)行反應(yīng)；以及 (c)將具有外染色體自由漂浮鏈蛋白質(zhì)標(biāo)簽的樣品確定為那些其中對(duì)于CD63、COL1A2和至少5種另外的表13所列的蛋白質(zhì)的存在呈陽(yáng)性的樣品，其中所述蛋白質(zhì)的存在表明所述患者樣品包含漿膜癌干細(xì)胞。
62.一種用來(lái)在患者樣品中確定和/或監(jiān)測(cè)漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，所述方法包括 (a)從其中已除去細(xì)胞、細(xì)胞碎片和外染色體的患者樣品中獲得上清流分； (b)通過(guò)質(zhì)譜法來(lái)分析所述上清流分的蛋白質(zhì)含量；(C)將具有分泌體自由漂浮鏈蛋白質(zhì)標(biāo)簽的樣品確定為那些其中光譜數(shù)據(jù)表明存在至少20種表15所列蛋白的樣品，其中那些蛋白的存在表明所述患者樣品包含漿膜癌干細(xì)胞。
63.一種用來(lái)在患者樣品中確定和/或監(jiān)測(cè)漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，所述方法包括 (a)從其中已除去細(xì)胞、細(xì)胞碎片和外染色體的患者樣品中獲得上清流分； (b)通過(guò)質(zhì)譜法來(lái)分析所述上清流分的蛋白質(zhì)含量； (C)將具有糖萼標(biāo)簽的樣品確定為那些其中光譜數(shù)據(jù)表明存在至少6種在如表4所列糖萼中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)以及不存在ELN、FN1和至少2種在如表4所列的自由漂浮鏈中下調(diào)的蛋白質(zhì)的樣品，其中那些蛋白質(zhì)的存在和不存在表明所述患者樣品包含漿膜癌干細(xì)胞。
64.一種用來(lái)在患者樣品中確定和/或監(jiān)測(cè)漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，所述方法包括 (a)從患者獲得細(xì)胞樣品或來(lái)自細(xì)胞樣品的細(xì)胞裂解液，其中所述樣品已除盡白細(xì)胞； (b)用一系列的人酪氨酸激酶受體特異性抗體和泛磷酸酪氨酸抗體溫育所述樣品或所述裂解液；以及 (c)檢測(cè)是否所述樣品或裂解液對(duì)于激活磷蛋白是陽(yáng)性的，其中所述激活磷蛋白選自由TOGFRA和至少6種蛋白組成的組，而所述蛋白選自由I3DGFRP、EGFR、ERBB4、FGFR2、FGFR3、胰島素-R、IGF1R、DTK/TYR03、MER/MERTK、MSPR/RON、Flt_3、c-rRET、RORl、R0R2、Tie-1、Tie-2、TrkA/NTRKI、VEGFR3、EphAI、EphA3、EphA4、EphA7、EphB2、EphB4、和 EphB6 組成的組，其中檢測(cè)出所述激活磷蛋白將所述患者樣品確定為包含漿膜癌干細(xì)胞。
65.一種用來(lái)在患者樣品中確定和/或監(jiān)測(cè)漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法，所述方法包括 (a)從其中已除去細(xì)胞和細(xì)胞碎片的患者樣品中獲得上清流分； (b)使所述樣品和抗C0L1A2抗體反應(yīng)； (c)檢測(cè)是否所述抗體結(jié)合透明質(zhì)烷和膠原蛋白的小于20，000道爾頓的低分子量復(fù)合物，其中檢測(cè)出所述復(fù)合物表明所述樣品包含漿膜癌干細(xì)胞。
66.根據(jù)權(quán)利要求49-65中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述樣品是哺乳動(dòng)物漿膜液、腹水、血液或腫瘤組織。
67.根據(jù)權(quán)利要求48、49、50、53、或56-59中任一項(xiàng)所述的方法，其中，通過(guò)微陣列分析、通過(guò)RNA或DNA測(cè)序技術(shù)、通過(guò)RT-PCR或通過(guò)Q-RT-PCR，來(lái)完成核酸的檢測(cè)或表達(dá)水平的確定。
68.一種用來(lái)在漿膜癌患者中檢測(cè)漿膜癌、監(jiān)測(cè)癌癥治療方案的效力、對(duì)需要治療的患者進(jìn)行分類(lèi)、監(jiān)測(cè)藥物療效、預(yù)測(cè)患者對(duì)癌癥治療方案的反應(yīng)的方法，所述方法包括(a)對(duì)來(lái)自患者的樣品定期進(jìn)行權(quán)利要求48-67所述的ー種或多種方法，以及(b)關(guān)聯(lián)來(lái)自所述方法的結(jié)果與所述患者的狀態(tài)，從而檢測(cè)漿膜癌、監(jiān)測(cè)癌癥治療方案的效力、對(duì)需要治療的患者進(jìn)行分類(lèi)、監(jiān)測(cè)藥物療效或預(yù)測(cè)患者對(duì)癌癥治療方案的反應(yīng)。
69.一種用來(lái)治療漿膜癌的方法，所述方法包括(a)將抗癌治療方案給予漿膜癌患者；(b)定期審查對(duì)來(lái)自所述患者的樣品進(jìn)行權(quán)利要求48-67所述的ー種或多種方法所獲得的結(jié)果，以及(c)根據(jù)需要并符合所述結(jié)果來(lái)改變所述治療方案。
70.一種用來(lái)篩查轉(zhuǎn)移性抑制劑或轉(zhuǎn)移性效應(yīng)物的方法，所述方法包括(a)用自由漂浮鏈或自由漂浮鏈細(xì)胞的制劑靜脈注射免疫減弱的、非人哺乳動(dòng)物，(b)將ー種或更多種測(cè)試化合物給予所述哺乳動(dòng)物，其中能夠在注射以前、以后或同時(shí)進(jìn)行給予，以及(C)相對(duì)于對(duì)照哺乳動(dòng)物評(píng)估在所述哺乳動(dòng)物中腫瘤生產(chǎn)和/或腫瘤位置的時(shí)間進(jìn)程，從而確定抑制自由漂浮鏈細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的化合物。
71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中，腫瘤生產(chǎn)的減少或腫瘤位置的變化將所述ー種或多種化合物確定為轉(zhuǎn)移性抑制劑或轉(zhuǎn)移性效應(yīng)物。
72.—種體內(nèi)篩查藥物療效的方法，所述方法包括 (a)用自由漂浮鏈或自由漂浮鏈細(xì)胞的制劑腹膜內(nèi)注射免疫減弱的、非人哺乳動(dòng)物； (b)將ー種或多種測(cè)試化合物給予所述哺乳動(dòng)物，其中能夠在注射以前、以后或同時(shí)進(jìn)行給予；以及 (C)相對(duì)于對(duì)照哺乳動(dòng)物，評(píng)估 (i)在所述哺乳動(dòng)物中腫瘤生產(chǎn)的時(shí)間進(jìn)程， (ii)在所述哺乳動(dòng)物中漿膜液生產(chǎn)的時(shí)間進(jìn)程， (iii)在所述哺乳動(dòng)物中腫瘤的形態(tài)，和/或 (iv)在所述哺乳動(dòng)物的腹水中漿膜癌干細(xì)胞生產(chǎn)的量和/或時(shí)間進(jìn)程， 從而確定藥物化合物在治療漿膜癌中的潛在或?qū)嶋H效力。
73.一種用來(lái)從源自原發(fā)性漿膜腫瘤的自由漂浮鏈或從轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞生產(chǎn)球形體的方法，所述方法包括在包含一定量的Matrigel的第一含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述自由漂浮鏈或所述細(xì)胞的懸浮液一定時(shí)間，以足以誘導(dǎo)球形體形成和產(chǎn)生球形體培養(yǎng)體系，以及定期用不含額外的Matrigel的含血清培養(yǎng)基來(lái)補(bǔ)充所述培養(yǎng)體系。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中，第一含血清培養(yǎng)基與Matrigel的比例是50:1并且每周補(bǔ)充所述培養(yǎng)體系。
75.一種用來(lái)從漿膜液生產(chǎn)自由漂浮鏈的方法，所述方法包括(a)從癌癥患者獲得漿膜液的樣品，(b)從所述液中收獲細(xì)胞，(c)在補(bǔ)充有無(wú)細(xì)胞漿膜液的含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞，(d)將由所述細(xì)胞產(chǎn)生的懸浮培養(yǎng)物定期傳代到補(bǔ)充有無(wú)細(xì)胞漿膜液的新鮮的含血清培養(yǎng)基中，從而獲得自由漂浮鏈。
76.根據(jù)權(quán)利要求75所述的方法，其中，所述漿膜液來(lái)自相同癌癥患者并且以I:I的比例補(bǔ)充培養(yǎng)基。
77.根據(jù)權(quán)利要求75或76所述的方法，其中，每周傳代所述細(xì)胞。
78.—種PCR引物組，包含用于哺乳動(dòng)物基因的PCR引物，其中所述基因選自由下述組成的組(a)CD49f、CD90、CD166、PDGFRA 和 GM2 基因；(b)CD49f、CD90、CD166、PDGFRA, GM2、CD34、CD133、MUC16 和 EPCAM 基因； (c)HAS2、PDGFRA和至少10種表11所列的上調(diào)基因； (d)HAS2、PDGFRA、MUC16、EPCAM和至少10種表11所列的上調(diào)基因； (e)至少40種表16所列的蛋白的基因； (f)let-7和200miRNA家族、hsa_miR-23b和hsa_miR-27b、以及至少4種另外的表8所列的mi RN ； (g)HAS2、PDGFRA和至少5種另外的表5所列的基因； (h)在表7的清單I中的9種基因和至少5種在表7的清單2中的基因； (i)來(lái)自表5的10種或更多種基因； (j)⑶63、C0L1A2和至少5種另外的表13所列的蛋白的基因； (k)至少20種表15所列蛋白的基因； (I)至少6種如列于表4中的糖萼蛋白的基因； (m)ELN、FNl、至少6種如在表4中所列的糖萼蛋白的基因，和至少2種在表4中列出的下調(diào)的蛋白的基因；以及 (n) PDGFRA和至少6種蛋白的基因，其中所述蛋白選自由TOGFR ^、EGFR、ERBB4、FGFR2、FGFR3、胰島素-R、IGF1R、DTK/TYR03、MER/MERTK、MSPR/RON、Flt_3、c-rRET、RORl、R0R2、Ti e-1、Ti e-2、TrkA/NTRKI、VEGFR3、EphAI、EphA3、EphA4、EphA7、EphB2、EphB4、和 EphB6 組成的組。
79.ー種用來(lái)制備具有糖萼外被、用于電子顯微鏡檢查的細(xì)胞的方法，所述方法包括 (a)將所述細(xì)胞等分在適用于電子顯微鏡的陽(yáng)離子表面上； (b)使所述細(xì)胞沉降于和粘附于所述陽(yáng)離子表面； (c)將固定劑、和可選的ー種或多種染色劑加入所述細(xì)胞的等分部分中，然后在固定所述細(xì)胞和糖萼的條件下溫育一定時(shí)間；以及 (d)從所述表面，沖洗所述固定劑和，如果使用的話(huà)，染色劑。
80.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，漿膜是卵巢漿膜。
81.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法、細(xì)胞、核酸、載體、蛋白質(zhì)或基因，其中哺乳動(dòng)物是人、鼠科動(dòng)物、豬、?？苿?dòng)物或綿羊。
全文摘要
本發(fā)明涉及漿膜癌干細(xì)胞(CSC)的克隆純?nèi)后w、產(chǎn)生和培養(yǎng)CSC的方法、以及它們的應(yīng)用。CSC形成自由漂浮鏈(細(xì)胞的自由漂浮鏈)，其具有透明質(zhì)烷和蛋白聚糖的糖萼外被。此發(fā)現(xiàn)已導(dǎo)致開(kāi)發(fā)了用于治療漿膜癌和卵巢癌的方法，其中通過(guò)靶向糖萼形成的去除或抑制，包括利用化療療法并連同糖萼抑制劑一起的聯(lián)合療法。本發(fā)明還提供了藥物篩選測(cè)定，用于確定有效對(duì)抗這些CSC以及其它漿膜癌細(xì)胞的化合物。提供了利用自由漂浮鏈基因標(biāo)簽、蛋白、和表面抗原來(lái)監(jiān)測(cè)患者樣品中漿膜癌干細(xì)胞的存在的方法。
文檔編號(hào)C12N15/12GK102770530SQ201080060755
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月5日
發(fā)明者塞爾韋爾·A·埃特姆, 馬爾科姆·A·S·穆?tīng)?申請(qǐng)人:斯隆-凱特林癌癥研究院