專利名稱：經(jīng)工程改造的抗-tslp抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)特異性的抗體及其用途，特別是在炎性障礙和變應(yīng)性炎性障礙中的用途。
背景技術(shù)：
TSLP是一種誘導(dǎo)樹突細(xì)胞介導(dǎo)的⑶4+ T細(xì)胞應(yīng)答的免疫細(xì)胞因子，其中由TSLP活化的前同種異體(proallogenic)表型樹突細(xì)胞(DC)在變應(yīng)性炎性Th2和肥大細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)和維持中起重要作用，這通過前變應(yīng)原的(proallergenic)細(xì)胞因子、趨化因子和共 刺激分子的生成而實(shí)現(xiàn)，它們指導(dǎo)原初T細(xì)胞變成Th2細(xì)胞，生成變應(yīng)性炎癥的IL-4、IL-5和IL-13關(guān)鍵介質(zhì)。TSLP在特應(yīng)性皮炎(AtD)、內(nèi)瑟頓綜合征和哮喘中的過表達(dá)，指示該細(xì)胞因子在這些變應(yīng)性炎性疾病的發(fā)病機(jī)制中的重要作用。這得到動物模型的支持，在所述動物模型中，TSLP在皮膚或肺中的轉(zhuǎn)基因過表達(dá)以及通過TSLP的負(fù)調(diào)節(jié)子的基因靶效應(yīng)的去除會導(dǎo)致與人特應(yīng)性皮炎或哮喘非常類似的變應(yīng)性炎性疾病。本發(fā)明提供了經(jīng)工程改造的TSLP抗體及其用于治療炎性障礙、特別是變應(yīng)性炎性障礙(包括哮喘和特應(yīng)性皮炎)的用途。本發(fā)明避免了現(xiàn)有技術(shù)抗體的潛在去酰胺化(deamidation)問題。Asn(N)殘基的去酰胺化是蛋白質(zhì)的常見降解，它可以顯著影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能。在抗體中，位于CDR中的Asn (N)可以快速地發(fā)生去酰胺化，且可以導(dǎo)致抗體-抗原相互作用的變化，并因此代表在基于抗體的治療劑的開發(fā)過程中的一個嚴(yán)重問題。參見,例如,Vlaska等人，AnalyticalBiochemistry 392:145-154 (2009)。因而，重要的是，在意圖開發(fā)用于人類使用的抗體中，避免這些潛在的去酰胺化問題。此外，重要的是，避免這些問題，并且不改變抗體的任何重要特征(諸如結(jié)合親和力)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種特異性地結(jié)合人TSLP的結(jié)合化合物，所述結(jié)合化合物包含至少一個抗體重鏈可變區(qū)或其TSLP結(jié)合片段，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:2。本發(fā)明也提供了一種特異性地結(jié)合人TSLP的結(jié)合化合物，所述結(jié)合化合物包含至少一個抗體重鏈可變區(qū)或其TSLP結(jié)合片段，所述重鏈可變區(qū)至少包含SEQ ID N0:2和SEQ ID NO: 1，或者 SEQ ID NO: 2 和 SEQ ID NO: 3。本發(fā)明也提供了一種特異性地結(jié)合人TSLP的結(jié)合化合物，所述結(jié)合化合物包含至少一個抗體重鏈可變區(qū)或其TSLP結(jié)合片段，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: USEQ IDNO:2 和 SEQ ID NO:3。
本發(fā)明的結(jié)合化合物可以另外包含一個抗體輕鏈可變區(qū)或其TSLP結(jié)合片段。在一個實(shí)施方案中，所述抗體輕鏈可變區(qū)或其TSLP結(jié)合片段包含至少一個選自下述的序列SEQ ID NO: 4、5和6。在另一個實(shí)施方案中，所述抗體輕鏈可變區(qū)或其TSLP結(jié)合片段包含至少2個選自下述的序列SEQ ID NO: 4、5和6。在其它實(shí)施方案中，所述抗體輕鏈可變區(qū)或其TSLP結(jié)合片段具有在SEQ ID NO: 4、5和6中所述的3個序列。在上述的結(jié)合化合物的一些實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)的全部或基本上全部剩余部分(remainder)完全是或基本上完全是人Ig區(qū)；輕鏈可變區(qū)的全部或基本上全部剩余部分完全是或基本上完全是人Ig區(qū)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)的剩余部分是人重鏈氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)的剩余部分是人輕鏈氨基酸序列。本發(fā)明也提供了一種特異性地結(jié)合人TSLP的結(jié)合化合物，所述結(jié)合化合物包含，包含選自下述的序列的重鏈可變區(qū)(i)SEQ ID NO: 7 ；(ii)SEQ ID N0:7或包含最多3個修飾的氨基酸殘基的變體；和(iii)與SEQ ID NO: 7具有至少97%同源性的序列。在一個實(shí)施方案中，所述重鏈可變區(qū)包含在SEQ ID N0:7中所示的序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā) 明的結(jié)合化合物另外包含輕鏈可變區(qū)。在一個實(shí)施方案中，所述輕鏈可變區(qū)包含選自下述的序列(i) SEQ ID NO: 8 ; (ii) SEQ ID NO:8或包含最多3個修飾的氨基酸殘基的變體；和(iii)與SEQ ID NO: 8具有至少97%同源性的序列。在一個實(shí)施方案中，所述輕鏈可變區(qū)包含在SEQ ID N0:8中所示的序列。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述結(jié)合化合物包含包含在SEQ ID N0:7中所示的序列的重鏈可變區(qū)和包含在SEQ ID N0:8中所示的序列的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合化合物還包含重鏈恒定區(qū)和/或輕鏈恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述重鏈恒定區(qū)包含Yl、Y2, y3或Y4人重鏈恒定區(qū)或其變體。在其它實(shí)施方案中，所述輕鏈恒定區(qū)包含X或K人輕鏈恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合化合物是抗體或其抗原結(jié)合片段。在不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其片段是多克隆的、單克隆的、嵌合的、食蟹猴源化的(cynoized)、人源化的或全人的。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述抗體是人源化抗體或其片段。本發(fā)明還設(shè)想到，所述結(jié)合片段是選自Fab、Fab，、Fab’ _SH、Fv、scFv、F(ab，)2和雙體的抗體片段。本發(fā)明還設(shè)想到，所述結(jié)合化合物是納米抗體(nanobody)、親和體(avimer)或適體(aptimer)。在一個實(shí)施方案中，所述結(jié)合化合物是抗體，所述抗體含有包含SEQ ID NO: 11的重鏈。在一個實(shí)施方案中，所述結(jié)合化合物含有包含SEQ ID NO: 11的重鏈和包含SEQ IDNO: 12的輕鏈。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合化合物結(jié)合人和食蟹猴TSLP。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合化合物可以由在ATCC保藏號PTA-10482下保藏的表達(dá)載體來表達(dá)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合化合物包含可以由在ATCC保藏號PTA-10482下保藏的表達(dá)載體來表達(dá)的重鏈和輕鏈。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合化合物包含可以由在ATCC保藏號PTA-10482下保藏的表達(dá)載體來表達(dá)的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合化合物包含由在ATCC保藏號PTA-10482下保藏的表達(dá)載體表達(dá)的抗體的 CDR-Hl、CDR-H2 和 CDR-H3 和 CDR-Ll、CDR-L2 和 CDR-L3 區(qū)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合化合物包含可以由在ATCC保藏號PTA-10482下保藏的表達(dá)載體來表達(dá)的重鏈。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合化合物包含可以由在ATCC保藏號PTA-10482下保藏的表達(dá)載體來表達(dá)的重鏈可變區(qū)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合化合物包含由在ATCC保藏號PTA-10482下保藏的表達(dá)載體表達(dá)的抗體的CDR-Hl、CDR-H2 和 CDR-H3 區(qū)。本發(fā)明也提供了分離的核酸，其編碼本發(fā)明的結(jié)合化合物。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種核酸，所述核酸編碼本發(fā)明的結(jié)合化合物(例如抗體或抗體片段)的重鏈可變區(qū)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種核酸，所述核酸編碼一種包含重鏈可變區(qū)的結(jié)合化合物，其中所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: U SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種核酸，所述核酸編碼SEQ ID NO: 7。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種核酸，所述核酸編碼SEQ ID NO: 2。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種核酸,所述核酸編碼重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)由在ATCC保藏號PTA-10482下保藏的表達(dá)載體編 碼。本發(fā)明也提供了表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含與控制序列可操作地相連的本發(fā)明的核酸，當(dāng)用所述載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞時，所述控制序列會被宿主細(xì)胞識別。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在ATCC保藏號PTA-10482下保藏的表達(dá)載體。還提供了包含這些表達(dá)載體的宿主細(xì)胞和使用這些表達(dá)載體來生產(chǎn)多肽的方法。在一個實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞包含在ATCC保藏號PTA-10482下保藏的表達(dá)載體。所述生產(chǎn)多肽的方法包括下述步驟在表達(dá)所述核酸序列的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，從而生產(chǎn)包含輕鏈和重鏈可變區(qū)的多肽；并從所述宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基回收所述多肽。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括生產(chǎn)多肽的方法，所述方法包括下述步驟在表達(dá)所述載體的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含在ATCC保藏號PTA-10482下保藏的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，從而生產(chǎn)包含輕鏈和重鏈可變區(qū)的多肽；并從所述宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基回收所述多肽。本發(fā)明包括抑制人受試者中的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括以有效地阻斷TSLP的生物活性的量，將特異性地結(jié)合人TSLP的根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合化合物施用給有此需要的受試者。本發(fā)明還設(shè)想到，施用另外的免疫抑制劑或抗炎劑。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫應(yīng)答是哮喘。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫應(yīng)答是變應(yīng)性炎癥。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變應(yīng)性炎癥是變應(yīng)性鼻竇炎、變應(yīng)性哮喘、變應(yīng)性結(jié)膜炎或特應(yīng)性皮炎。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫應(yīng)答是纖維化、炎性腸病或霍奇金淋巴瘤。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，將結(jié)合化合物與另一種免疫調(diào)節(jié)劑組合施用。本發(fā)明的結(jié)合化合物可以是在組合物中，所述組合物包含與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合的本發(fā)明的結(jié)合化合物(例如抗體或其片段)。在又一個實(shí)施方案中，所述組合物另外包含免疫抑制劑或抗炎劑。在不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的結(jié)合化合物(例如抗體或其片段)的藥物。例如，本發(fā)明包括特異性地結(jié)合人TSLP的結(jié)合化合物用于制備抑制免疫應(yīng)答的藥物的用途。本發(fā)明包括特異性地結(jié)合人TSLP的結(jié)合化合物(例如，根據(jù)本發(fā)明的任一種結(jié)合化合物)用于制備治療哮喘的藥物的用途。本發(fā)明包括特異性地結(jié)合人TSLP的結(jié)合化合物用于制備治療炎性障礙的藥物的用途。在一個實(shí)施方案中，所述炎性障礙是變應(yīng)性炎性障礙。在一個實(shí)施方案中，所述變應(yīng)性炎性障礙是變應(yīng)性鼻竇炎、變應(yīng)性哮喘、變應(yīng)性結(jié)膜炎或特應(yīng)性皮炎。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變應(yīng)性炎性障礙是變應(yīng)性哮喘。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述變應(yīng)性炎性障礙是特應(yīng)性皮炎。例如，本發(fā)明的抗體和片段可以用于治療人。


圖 I.本申請的 SEQ ID NO: 11 與 W02008/076321 的 SEQ ID NO: 14 的比對。
具體實(shí)施例方式在本文及所附權(quán)利要求書中用到的詞語的單數(shù)形式，諸如“一個”、“一種”和“所述”，包括它們的相應(yīng)的復(fù)數(shù)指代，除非上下文另外清楚地指明。在本文中引述的所有參考文獻(xiàn)都通過引用并入本文，其程度如同具體地且單獨(dú)地指出每篇單獨(dú)的出版物、專利申請或?qū)＠ㄟ^引用并入本文。I.定義
“活化”、“刺激”和“治療”當(dāng)應(yīng)用于細(xì)胞或受體時，可具有相同的含義，例如用配體對細(xì) 胞或受體進(jìn)行的活化、刺激或治療，除非上下文另外指示或者明確地指示?！芭潴w”包括天然的和合成的配體，例如細(xì)胞因子、細(xì)胞因子變體、類似物、突變蛋白和衍自抗體的結(jié)合組合物(binding composition)?！芭潴w”還包括小分子，例如細(xì)胞因子的肽模擬物和抗體的肽模擬物?！盎罨笨芍赣蓛?nèi)部機(jī)制調(diào)節(jié)的細(xì)胞活化，以及由外部或環(huán)境因素調(diào)節(jié)的細(xì)胞活化。例如，細(xì)胞、組織、器官或生物體的“應(yīng)答”，包括生化或生理行為的變化，所述生化或生理行為是例如，生物區(qū)室(compartment)中的濃度、密度、黏附或遷移，基因表達(dá)的速度，或者分化的狀態(tài)，其中所述變化與活化、刺激或治療相關(guān)，或者與內(nèi)部機(jī)制如遺傳編程相關(guān)。分子的“活性”可描述或者指分子與配體或與受體的結(jié)合，指催化活性；指刺激基因表達(dá)或細(xì)胞信號傳遞、分化或成熟的能力；指抗原活性，指對其它分子的活性的調(diào)節(jié)，等等?！盎钚浴币部芍副然?，例如[催化活性]/[mg蛋白質(zhì)]或[免疫活性]/[mg蛋白質(zhì)]，生物區(qū)室中的濃度,等等?！笆┯谩焙汀爸委煛碑?dāng)應(yīng)用于動物、人、實(shí)驗(yàn)受試者、細(xì)胞、組織、器官或生物流體時，指外源性的藥物、治療劑、診斷劑或組合物與所述動物、人、受試者、細(xì)胞、組織、器官或生物流體進(jìn)行接觸?！笆┯谩焙汀爸委煛笨芍咐缰委煼椒ā⑺幋鷦恿W(xué)方法、診斷方法、研究方法和實(shí)驗(yàn)方法。細(xì)胞的治療包括使試劑(reagent)與細(xì)胞接觸以及使試劑與流體接觸，其中所述流體與所述細(xì)胞接觸?！笆┯谩焙汀爸委煛边€意指體夕Ki/ ritro)和離體(ez vivo)治療，例如，用試劑、診斷劑、結(jié)合組合物或另一種細(xì)胞對一種細(xì)胞的體外和離體治療?！爸委煛碑?dāng)應(yīng)用于人受試者、獸醫(yī)受試者或研究受試者時，指醫(yī)療性治療、預(yù)防性或防止性措施，指研究和診斷應(yīng)用?！敖Y(jié)合化合物”指包含一個或多個特異性地結(jié)合人TSLP的氨基酸序列的分子。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述結(jié)合化合物是抗體，優(yōu)選分離的抗體。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述結(jié)合化合物包含抗體的抗原結(jié)合片段?！敖Y(jié)合組合物”指與穩(wěn)定劑、賦形劑、鹽、緩沖劑、溶劑或添加劑相組合的、能夠結(jié)合靶標(biāo)的TSLP結(jié)合化合物。本發(fā)明的范圍也包括復(fù)合物，其包含與TSLP多肽或其抗原片段絡(luò)合的本發(fā)明的任意抗體或其抗原結(jié)合片段。通過使所述抗體或片段接觸TSLP多肽或抗原片段，可以制備復(fù)合物。本文所用的術(shù)語“抗體”指，能顯示期望的生物活性的任何形式的抗體或其片段。因此，它以最廣義的含義使用，具體覆蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們能顯示期望的生物活性。“分離的抗體”指結(jié)合化合物的純化狀態(tài)，且在這樣的背景下，指基本上不含有其它生物分子(諸如核酸、蛋白、脂類、碳水化合物)或其它物質(zhì)(諸如細(xì)胞碎片和生長培養(yǎng)基)的分子。通常，術(shù)語“分離的”無意表示完全沒有這樣的物質(zhì)，也無意表示沒有水、緩沖劑或鹽，除非它們以實(shí)質(zhì)上干擾本文所述的結(jié)合化合物的實(shí)驗(yàn)或治療用途的量存在?！癋ab片段”包含I個輕鏈以及I個重鏈的CHl和可變區(qū)。Fab分 子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵?！癋e”區(qū)含有2個重鏈片段，所述重鏈片段包含抗體的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。所述2個重鏈片段通過2個或更多個二硫鍵且通過CH3結(jié)構(gòu)域的疏水相互作用而保持在一起?！癋ab’片段”含有I個輕鏈以及一個重鏈的部分或片段，所述部分或片段含有VH結(jié)構(gòu)域和CHl結(jié)構(gòu)域以及在CHl和CH2結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域，使得在2個Fab’片段的2個重鏈之間可以形成鏈間二硫鍵，以形成F(ab’)2分子。“F (ab’) 2片段”含有2個輕鏈和2個重鏈，所述重鏈含有在CHl和CH2結(jié)構(gòu)域之間的恒定區(qū)的一部分，使得在2個重鏈之間形成鏈間二硫鍵。F(ab’)2片段因而由2個Fab’片段組成，所述Fab’片段通過2個重鏈之間的二硫鍵保持在一起。“Fv區(qū)”包含來自重鏈和輕鏈的可變區(qū)，但是缺少恒定區(qū)。本文所用的術(shù)語“TSLP結(jié)合片段”或者“其結(jié)合片段”包括抗體的仍基本上保留它的抑制TSLP活性的生物活性的片段或衍生物(或其它結(jié)合物質(zhì))。因此，術(shù)語“抗體片段”或TSLP結(jié)合片段指全長抗體的一部分，通常是其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段和Fv片段；雙體；線性抗體；單鏈抗體分子，例如sc-Fv ；結(jié)構(gòu)域抗體(domain antibody);和從抗體片段形成的多特異性抗體。通常,結(jié)合片段或衍生物保留它的TSLP抑制活性的至少10%。優(yōu)選地，結(jié)合片段或衍生物保留它的TSLP抑制活性的至少25%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100% (或更多)，盡管具有足夠親和力以發(fā)揮期望生物作用的任何結(jié)合片段也將是有用的。還認(rèn)為，TSLP結(jié)合片段可包括不會實(shí)質(zhì)上改變其生物活性的保守氨基酸置換。本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”指，獲自基本上均一抗體的群體的抗體，即構(gòu)成所述群體的各個抗體除了可能少量存在的天然突變外是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，針對單個抗原表位。相反，常規(guī)(多克隆)抗體制品通常包括許多針對不同表位的(或?qū)Σ煌砦惶禺愋缘?抗體。修飾語“單克隆”表示，所述抗體是從基本上均一的抗體群體獲得的特征，不能解釋為要求通過任何特定的方法來生產(chǎn)所述抗體。例如，要根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過由Kohler等人，iWH)Nature 256: 495首先描述的雜交瘤方法制備，或者可通過重組DNA卞法海\備{參見，例如，美國專利號4，816，567)?！皢慰寺】贵w”還可用例如 Clackson 等人，(1991)A^tor<9 352: 624-628 和 Marks 等人，(1991)J Mol.Biol. 222: 581-597中描述的技術(shù)，從噬菌體抗體文庫中分離出。本文的單克隆抗體具體地包括這樣的“嵌合”抗體(免疫球蛋白):其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍自特定物種或者屬于特定抗體類(class)或亞類(subclass)的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而所述鏈的其余部分與衍自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，且還具體地包括這種抗體的片段，只要它們顯示期望的生物活性(美國專利號 4，816，567 ;和 Morrison 等人，(1984)/^6^. Natl. AcacI Sci. USA81: 6851-6855)?！敖Y(jié)構(gòu)域抗體”是僅含重鏈的可變區(qū)或輕鏈的可變區(qū)的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情況下，兩個或更多個Vh區(qū)與肽接頭共價連接，產(chǎn)生二價結(jié)構(gòu)域抗體。二價結(jié)構(gòu)域抗體的兩個Vh區(qū)可靶向相同的或不同的抗原?！岸r抗體”包含兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)。在一些情況下，所述兩個結(jié)合位點(diǎn)具有相同的抗原特異性。但是，二價抗體可以是雙特異性的。
本文所用的術(shù)語“單鏈Fv”或“scFv”抗體，是指包含抗體的Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域的抗體片段，其中這些結(jié)構(gòu)域以單一多肽鏈形式存在。通常，F(xiàn)v多肽還包含Vh結(jié)構(gòu)域和'結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，所述接頭使sFv能夠形成期望的結(jié)構(gòu)以進(jìn)行抗原結(jié)合。有關(guān)sFv的綜述，參見 Pluckthun (1994) The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113卷，Rosenburg 和 Moore 編，Springer-Verlag, New York,第 269_；315 頁。本文的單克隆抗體還包括駱騎源化單結(jié)構(gòu)域抗體(camelized single domainantibody)。參見，例如，Muyldermans 4r yi (2001) Trends Biochem. Sci. 26:230;Reichmann 等人(1999)7； Immunol. Methods 231:25 ；W0 94/04678; WO 94/25591 ;美國專利號6，005，079，它們通過引用整體并入本文)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的單結(jié)構(gòu)域抗體其包含兩個具有修飾的Vh結(jié)構(gòu)域,所述修飾能使單結(jié)構(gòu)域抗體得以形成。本文所用的術(shù)語“雙體”指具有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，所述片段在同一多肽鏈中包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)和與之連接的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(')(Vh-'或VH)。通過使用短得不能讓同一鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間發(fā)生配對的接頭，各結(jié)構(gòu)域被迫與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域發(fā)生配對，從而產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)。在例如EP 404，097、W0 93/11161和 Holliger 等人(1993)Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 中，對雙體有更充分的描述。有關(guān)經(jīng)工程改造的抗體變體的綜述，通常參見Holliger和Hudson (2005)艙tBi otechno1. 23:1126-1136。本文所用的術(shù)語“人源化抗體”指含有非人(例如鼠)抗體的序列以及人抗體的序列的抗體形式。這種抗體含有最小限度的衍自非人免疫球蛋白的序列。一般來說，人源化抗體會包含至少一個、通常兩個可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部(substantially all),其中超可變環(huán)的全部或基本上全部對應(yīng)于非人免疫球蛋白的全部或基本上全部，而FR區(qū)的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的全部或基本上全部。人源化抗體任選還會包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)的至少一部分，所述恒定區(qū)通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。當(dāng)有必要將人源化抗體(例如“hu23B12”)與親本嚙齒動物抗體(例如大鼠23B12或“r23B12”)加以區(qū)分時，在抗體克隆標(biāo)號前加上前綴“h”、“hu”或“hum”。嚙齒動物抗體的人源化形式，通常會包含親本嚙齒動物抗體的相同CDR序列，不過可包括某些氨基酸置換，以提高親和力或增加人源化抗體的穩(wěn)定性。本發(fā)明的抗體還包括具有經(jīng)修飾的(或經(jīng)封閉的)Fe區(qū)以提供改變了的效應(yīng)子功能的抗體。參見，例如，美國專利號5，624，821; W02003/086310; W02005/120571;W02006/0057702; Presta (2006)Ac/v. Drug Delivery Rev. 58:640-656。這種修飾可用來增強(qiáng)或抑制免疫系統(tǒng)的各種反應(yīng)，在診斷和治療中有可能有益的作用。Fe區(qū)的變更包括氨基酸變化(置換、缺失和插入)、糖基化或去糖基化，和加入多個Fe區(qū)。對Fe的變化還可改變治療性抗體中的抗體的半衰期，而更長的半衰期會導(dǎo)致給藥頻率更少，伴隨而來的是方便性的提高和材料耗費(fèi)的減少。參見Presta (2005)/ Allergy Clin. Immunol. 116:731第 734-35 頁。術(shù)語“全人抗體”指僅包含人免疫球蛋白序列的抗體。全人抗體如果是在小鼠中、在小鼠細(xì)胞中或在衍自小鼠細(xì)胞的雜交瘤中產(chǎn)生，那么可含有鼠碳水化合物鏈。類似地，“小鼠抗體”指僅包含小鼠免疫球蛋白序列的抗體。本文所用的術(shù)語“超可變區(qū)”指抗體的負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。超可變區(qū)包含來自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基24-34(CDRLl)、50-56 (CDRL2)和 89-97 (CDRL3)和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基 31-35 (CDRH1)、50-65 (CDRH2)和 95-102 (CDRH3) ;Kabat 等人，(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, Md.)，和/或來自“超可變環(huán)”的氨基酸殘基(即輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32 (LI),50-52 (L2)和91-96 (L3)和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32 (HO,53-55(H2)和 96-101 (H3) ;Chothia 和 Lesk, (1987)7； Mol. BioL 196: 901-917)。本文所用的術(shù)語“構(gòu)架”或“FR”殘基，是指本文定義為CDR殘基的超可變區(qū)殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。以上殘基編號涉及Kabat編號系統(tǒng)，并不一定在細(xì)節(jié)上對應(yīng)于本文所附序列表中的序列編號?！敖Y(jié)合”指結(jié)合組合物與靶標(biāo)的締合，其中在結(jié)合組合物可溶于或懸浮于溶液中的情況下，所述締合導(dǎo)致結(jié)合組合物的正常布朗運(yùn)動的減少?！氨Ｊ匦揎椀淖凅w”或“保守置換”指本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的、通?？勺鞒龅植粫淖兯a(chǎn)生的分子的生物活性的氨基酸置換。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到，一般來說，多肽的非必需區(qū)域中的單一氨基酸置換不會實(shí)質(zhì)上改變生物活性(廣疋，例如，Watson等人，Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co.,第 224 頁(1987 年第4版))。這種示例性的置換優(yōu)選按照下表I所示的那些置換來作出
表I
示例性的保守氨基酸置換
權(quán)利要求
1.一種特異性地結(jié)合人TSLP的結(jié)合化合物，所述結(jié)合化合物包含重鏈可變區(qū)或其TSLP-結(jié)合片段，所述重鏈可變區(qū)包含含有SEQ ID NO:2的⑶R-H2序列；和任選的第二種治療劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)合化合物，所述結(jié)合化合物另外包含 ⑴含有SEQ ID NO: I的CDR-Hl序列；和 (ii)含有 SEQ ID NO:3 的 CDR-H3 序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)合化合物，所述結(jié)合化合物另外包含抗體輕鏈可變區(qū)或其TSLP-結(jié)合片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的結(jié)合化合物，其中所述輕鏈可變區(qū)包含 ⑴含有SEQ ID NO:4的CDR-Ll序列； (ii)含有SEQ ID NO:5 的 CDR-L2 序列；和 (iii)含有SEQ ID NO:6 的 CDR-L3 序列。
5.一種特異性地結(jié)合人TSLP的結(jié)合化合物，所述結(jié)合化合物包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含選自下述的序列(i)SEQ ID NO: 7 ； (ii)SEQ ID NO:7或其變體；和 (iii)與SEQID NO: 7具有至少97%同源性的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的結(jié)合化合物，其中所述變體包含最多3個修飾的氨基酸殘基。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的結(jié)合化合物，其中所述重鏈可變區(qū)包含SEQID NO: 7的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的結(jié)合化合物，所述結(jié)合化合物另外包含輕鏈可變區(qū)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的結(jié)合化合物，其中所述輕鏈可變區(qū)包含選自下述的序列(i)SEQID NO: 8 ； (ii)SEQ ID NO:8或其變體；和 (iii)與SEQID NO: 8具有至少97%同源性的序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的結(jié)合化合物，其中所述輕鏈可變區(qū)包含SEQID NO: 8。
11.一種分離的核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)合化合物的重鏈可變區(qū)。
12.—種表達(dá)載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求11所述的核酸，所述核酸與控制序列可操作地相連，當(dāng)用所述載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞時，所述控制序列會被宿主細(xì)胞識別。
13.—種宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求12所述的表達(dá)載體。
14.一種生產(chǎn)多肽的方法，所述方法包括 在表達(dá)所述核酸序列的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，從而生產(chǎn)包含輕鏈和重鏈可變區(qū)的多肽；和從所述宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基回收所述多肽。
15.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)合化合物，其中所述結(jié)合化合物是人源化抗體或其TSLP-結(jié)合片段。
16.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)合化合物，其中所述結(jié)合化合物是選自下述的TSLP-結(jié)合抗體片段Fab、Fab’、Fab’ _SH、Fv、scFv、F (ab，) 2 和雙體。
17.—種抑制人受試者中的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括以有效地阻斷TSLP的生物活性的量，將根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)合化合物或其TSLP結(jié)合片段施用給有此需要的受試者。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答是炎癥應(yīng)答。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述受試者具有選自下述的病癥變應(yīng)性鼻竇炎、變應(yīng)性哮喘、變應(yīng)性結(jié)膜炎或特應(yīng)性皮炎。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述受試者具有哮喘。
21.一種組合物，其包含與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑相組合的根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)合化合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)合化合物，其中所述結(jié)合化合物會阻斷TSLP介導(dǎo)的活性。
23.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)合化合物，其中所述結(jié)合化合物能夠在交叉阻斷試驗(yàn)中阻斷TSLP與TSLPR的結(jié)合。
24.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)合化合物或其TSLP結(jié)合片段用于制備藥物的用途，所述藥物用于抑制免疫應(yīng)答。
25.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)合化合物或其TSLP結(jié)合片段用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療炎癥。
26.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)合化合物或其TSLP結(jié)合片段用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療變應(yīng)性炎癥。
27.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)合化合物或其TSLP結(jié)合片段用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療變應(yīng)性鼻竇炎、變應(yīng)性哮喘、變應(yīng)性結(jié)膜炎或特應(yīng)性皮炎。
28.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)合化合物或其TSLP結(jié)合片段用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療哮喘。
29.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)合化合物，其中所述結(jié)合化合物是包含SEQID NO: 11和SEQ ID NO: 12 的抗體。
30.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)合化合物，其中所述結(jié)合化合物可以由在ATCC保藏號PTA-10482下保藏的載體來表達(dá)。
31.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)合化合物，其中所述結(jié)合化合物包含可以由在ATCC保藏號PTA-10482下保藏的載體表達(dá)的重鏈。
32.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)合化合物，其中所述結(jié)合化合物包含可以由在ATCC保藏號PTA-10482下保藏的載體表達(dá)的重鏈可變區(qū)。
33.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)合化合物，其中所述結(jié)合化合物包含由在ATCC保藏號PTA-10482下保藏的載體表達(dá)的抗體的CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3區(qū)。
34.根據(jù)權(quán)利要求11所述的分離的核酸，其中所述核酸編碼由在ATCC保藏號PTA-10482下保藏的載體編碼的重鏈可變區(qū)。
35.在ATCC保藏號PTA-10482下保藏的表達(dá)載體。
36.一種宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求35所述的表達(dá)載體。
37.一種分離的多肽，其包含在SEQ ID NO: 7、8、11或12中所述的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及特異性地結(jié)合人TSLP的結(jié)合化合物及其用途，例如在治療炎性障礙和變應(yīng)性炎癥應(yīng)答中的用途。
文檔編號C12P21/08GK102782149SQ201080060560
公開日2012年11月14日 申請日期2010年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月4日
發(fā)明者L.G.普雷斯塔 申請人:先靈公司