專利名稱：螢火蟲熒光素酶、其基因和螢火蟲熒光素酶的制造法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及突變型螢火蟲熒光素酶、突變型螢火蟲熒光素酶基因、新的重組體DNA 和突變型螢火蟲熒光素酶的制造法，具體而言，涉及穩(wěn)定性提高了的螢火蟲熒光素酶、其基因和穩(wěn)定性螢火蟲熒光素酶的制造法。
背景技術(shù)：
螢火蟲熒光素酶是在鎂離子和氧的存在下將腺苷三磷酸(ATP)、D-熒光素和氧轉(zhuǎn)化為腺苷一磷酸(AMP)、氧化熒光素和二氧化碳并產(chǎn)生光的酶。應(yīng)用螢火蟲熒光素酶的發(fā)光原理可以以極高靈敏度測定微量酶反應(yīng)底物。因此，螢火蟲熒光素酶被廣泛用于如以ATP 為指標(biāo)的飲食品中的微生物檢測、手指和器具類上所附著的食物殘渣和污垢的判定，或利用各種抗體技術(shù)、基因擴(kuò)增技術(shù)的高靈敏度測定法等。然而，通常螢火蟲熒光素酶等甲蟲類熒光素酶對熱不穩(wěn)定，因此具有制成試劑保存時易失活的缺點。此外，通常甲蟲類熒光素酶在剛反應(yīng)后發(fā)光量達(dá)到頂峰，此后發(fā)光量急劇衰減，因此具有難以通過長時間反應(yīng)進(jìn)行高靈敏度測定的問題。因此，為克服這一缺點， 持續(xù)進(jìn)行嘗試以期獲得具有良好的發(fā)光持續(xù)性或穩(wěn)定性(熱穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性)、進(jìn)而期望兩者兼?zhèn)涞臒晒馑孛浮Ｔ搰L試之一是在配合組成方面下功夫，即，在測定試劑中添加鹽等，確保某種程度的發(fā)光持續(xù)性和保存穩(wěn)定性。但該方法具有如下缺點伴隨著試劑組成上的各種制約，無法廣泛用于各種用途、試劑；此外，多數(shù)情況下，鹽類的添加容易帶來熒光素酶反應(yīng)某種程度的反應(yīng)障礙。在試劑組成方面的其它嘗試的更優(yōu)選方案之一，是探索具有優(yōu)選性質(zhì)的突變熒光素酶。并且，在這些嘗試之中，已報道了獲得了第342位的氨基酸突變成丙氨酸的北美產(chǎn)螢火蟲熒光素酶，該螢火蟲熒光素酶的發(fā)光持續(xù)性提高(例如，參照非專利文獻(xiàn)1)。此外，申請人獲得了相當(dāng)于該第342位的氨基酸的突變體的平家螢熒光素酶的突變體、即第344位的氨基酸(亮氨酸)突變成丙氨酸的平家螢熒光素酶(以下稱為344A熒光素酶)，確認(rèn)了該突變螢火蟲熒光素酶發(fā)光持續(xù)性也同樣地提高。但是，另一方面，該突變螢火蟲熒光素酶的穩(wěn)定性與導(dǎo)入突變前相比變得非常低。因此，344A熒光素酶雖然被賦予了發(fā)光持續(xù)性這一產(chǎn)業(yè)上有用的性質(zhì)，但是由于穩(wěn)定性極低，以這種現(xiàn)狀難以很好地應(yīng)用于高靈敏度檢測等。綜上，在具有優(yōu)選性質(zhì)的突變熒光素酶的探索方面，雖然發(fā)現(xiàn)了使某一種性質(zhì)得以提高的突變，但大多觀察到該突變反而使其它性質(zhì)變差。即，即使分別導(dǎo)入多個被認(rèn)為有用的突變，也難說簡單地疊加或協(xié)同地賦予這些優(yōu)選性質(zhì)，這樣的背景使得兼具如發(fā)光持續(xù)性和穩(wěn)定性等實用中優(yōu)選的多個性質(zhì)的突變熒光素酶的取得變得更加困難。非專利文獻(xiàn)1 =Biochemistry 2003 年，42 卷，pl0429_1043
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的課題在于，通過對螢火蟲熒光素酶基因序列中的特定的堿基導(dǎo)入突變， 而提供穩(wěn)定性優(yōu)異的螢火蟲熒光素酶。進(jìn)而，課題在于提供一種螢火蟲熒光素酶，其即使在與有助于發(fā)光持續(xù)性等的其它突變組合的情況下，也能夠不受損害地發(fā)揮穩(wěn)定性和發(fā)光持續(xù)性這兩個優(yōu)選的性質(zhì)。此外，課題在于，對雖然能夠獲得某種特定優(yōu)選的效果但其弊端在于降低螢火蟲熒光素酶的穩(wěn)定性的突變，加入進(jìn)一步的突變，從而提供穩(wěn)定性的降低獲得充分恢復(fù)的螢火蟲熒光素酶。用于解決問題的方案本發(fā)明人等為了解決上述課題，進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將平家螢熒光素酶或源氏螢熒光素酶的第287位的氨基酸置換成丙氨酸的突變(以下稱為2狐突變)、和將第 392位的氨基酸置換成異亮氨酸的突變(以下稱為3921突變)，分別使螢火蟲熒光素酶的穩(wěn)定性顯著提高。并且發(fā)現(xiàn)，在將該2狐突變和/或3921突變中的任意一者或者將兩個突變組合導(dǎo)入到344A熒光素酶中時，顯著改善了 344A熒光素酶的問題即穩(wěn)定性低，此外發(fā)現(xiàn)， 在將這些突變與其它突變進(jìn)一步組合而導(dǎo)入時，也良好地發(fā)揮了穩(wěn)定性提高效果。進(jìn)而獲知，作為提高344A熒光素酶的低穩(wěn)定性的其它突變，將第3 位的氨基酸置換成絲氨酸的突變(以下稱為326S突變)、和將第467位的氨基酸置換成異亮氨酸的突變(以下稱為4671 突變)組合導(dǎo)入也是有效的，從而完成了發(fā)明。即，本發(fā)明涉及以下方案。(1)一種螢火蟲熒光素酶，在螢火蟲熒光素酶中具有相當(dāng)于平家螢熒光素酶的第 287位的氨基酸突變成丙氨酸、或者相當(dāng)于第392位的氨基酸突變成異亮氨酸的氨基酸序列。(2)—種螢火蟲熒光素酶，在螢火蟲熒光素酶中具有相當(dāng)于平家螢熒光素酶的第 287位的氨基酸突變成丙氨酸、相當(dāng)于第392位的氨基酸突變成異亮氨酸的氨基酸序列。(3)根據(jù)上述(1)或(2)所述的螢火蟲熒光素酶，其具有選自相當(dāng)于平家螢熒光素酶的第344位的氨基酸突變成丙氨酸、或者相當(dāng)于第3 位的氨基酸突變成絲氨酸、或者相當(dāng)于第467位的氨基酸突變成異亮氨酸的突變中的1種以上突變。(4)根據(jù)上述(1)或(2)所述的螢火蟲熒光素酶，相當(dāng)于平家螢熒光素酶的第344 位的氨基酸突變成丙氨酸，相當(dāng)于第3 位的氨基酸突變成絲氨酸，且相當(dāng)于第467位的氨基酸突變成異亮氨酸。(5)—種螢火蟲熒光素酶，在平家螢熒光素酶或源氏螢熒光素酶中具有熒光素酶的第344位的氨基酸突變成丙氨酸、第3 位的氨基酸突變成絲氨酸、第467位的氨基酸突變成異亮氨酸的突變。(6)—種螢火蟲熒光素酶基因，其編碼上述(1) (5)所述的螢火蟲熒光素酶。(7)—種重組體DNA，其特征在于，在載體DNA中插入了上述(6)所述的螢火蟲熒光素酶基因。(8) 一種穩(wěn)定性提高了的螢火蟲熒光素酶的制造法，其特征在于，培養(yǎng)含有上述 (6)所述的螢火蟲熒光素酶基因或上述(7)所述的重組體DNA、具有螢火蟲熒光素酶生產(chǎn)能力的微生物，由該培養(yǎng)物采集螢火蟲熒光素酶。


圖1是表示各種螢火蟲熒光素酶的、于47°C熱處理90分鐘后的活性殘存率的圖表。圖2是表示各種螢火蟲熒光素酶的、于4、45、50和55°C熱處理各10分鐘后的活性
殘存率圖表。圖3是表示各種螢火蟲熒光素酶的、于37°C保存11天后的活性殘存率的圖表。圖4是表示各種螢火蟲熒光素酶的、于37°C保存14天后的活性殘存率的圖表。
具體實施例方式以下詳細(xì)說明本發(fā)明。(螢火蟲熒光素酶基因和其重組體DNA)作為本發(fā)明的螢火蟲熒光素酶基因和其重組體DNA，可以使用來源于任意螢火蟲的基因和其重組體DNA。例如，可以使用來源于平家螢、源氏螢、北美產(chǎn)螢火蟲等的螢火蟲熒光素酶?；蛘?，也可以使用以來源于各種螢火蟲的熒光素酶基因為基礎(chǔ)而制作的嵌合基因。進(jìn)而，在本發(fā)明的螢火蟲熒光素酶基因中，還可以含有本發(fā)明的突變以外的突變。 前述突變既可以是為謀求某種特定效果而人為導(dǎo)入的突變，也可以是隨機(jī)或非人為導(dǎo)入的突變。作為為謀求特定效果而導(dǎo)入的突變，還可以包含如為了增強(qiáng)螢火蟲熒光素酶基因的表達(dá)量的序列的添加、改變，為了提高螢火蟲熒光素酶蛋白的純化效率的改變等，以及對螢火蟲熒光素酶賦予實用上優(yōu)選的特性的各種突變。作為這樣的公知的突變例子，可以列舉出如日本特開2000-197484號公報中記載的提高發(fā)光持續(xù)性的突變、如日本專利第 2666561號公報或日本特表2003-512071號公報中記載的改變發(fā)光波長的突變、如日本特開平11-239493號公報中記載的提高表面活性劑耐受性的突變、如國際公開第99/(^697號小冊子、日本特表平10-512750號公報或日本特表2001-518799號公報中記載的提高底物親和性的突變、或如日本專利第3048466號公報、日本特開2000-197487號公報、日本特表平9-510610號公報和日本特表2003-518912號公報中記載的提高穩(wěn)定性的突變等。這些基因和其重組體DNA可以按照公知的方法而制備。例如，平家螢熒光素酶基因和其重組體DNA可以利用日本特公平7-11M34號公報中所述的方法制備，源氏螢熒光素酶基因和其重組體DNA可以利用日本特開平1-51086號公報中所述的方法制備，此外，北美產(chǎn)螢火蟲熒光素酶基因和其重組體DNA可以從Promega公司購入。(本發(fā)明的基因突變和相應(yīng)的氨基酸序列突變)本發(fā)明的螢火蟲熒光素酶基因，其特征在于，在上述任意的螢火蟲熒光素酶基因中導(dǎo)入特定的突變。本發(fā)明的突變基因之一，具體而言，在平家螢或源氏螢的情況下，為編碼熒光素酶的第287位氨基酸(野生型的情況下為纈氨酸)突變成丙氨酸的2狐突變氨基酸序列的螢火蟲熒光素酶基因。此外，本發(fā)明的突變基因之一，具體而言，在平家螢或源氏螢的情況下，為編碼熒光素酶的第392位的氨基酸(野生型的情況下為纈氨酸)突變成異亮氨酸的3921突變氨基酸序列的螢火蟲熒光素酶基因。此外，本發(fā)明的突變基因之一，為編碼如下氨基酸序列的螢火蟲熒光素酶基因在前述2狐突變和/或3921突變的基礎(chǔ)上，具有選自熒光素酶的第344位的氨基酸(野生型的情況下為亮氨酸)突變成丙氨酸的344A突變、第3 位的氨基酸(野生型的情況下為甘氨酸)突變成絲氨酸的326S突變、或第467位的氨基酸(野生型的情況下為苯丙氨酸)突變成異亮氨酸的4671突變中的1種以上突變。 或者，為編碼具有前述;344A突變、突變和4671突變的組合的突變熒光素酶的氨基酸序列的螢火蟲熒光素酶基因。通過在平家螢熒光素酶或源氏螢熒光素酶的氨基酸序列中具有2狐突變和/或 3921突變，螢火蟲熒光素酶的穩(wěn)定性顯著提高。此外，3 ^突變、4671突變也分別提高了螢火蟲熒光素酶的穩(wěn)定性。本發(fā)明的螢火蟲熒光素酶的氨基酸序列優(yōu)選為在螢火蟲熒光素酶的氨基酸序列中，具有至少1處上述位置中的上述置換，更優(yōu)選具有2處以上，進(jìn)一步優(yōu)選具有3處以上置換。通過導(dǎo)入上述多個突變，可以階段性提高螢火蟲熒光素酶的穩(wěn)定性。 具體而言，通過在1狐突變和/或3921突變的基礎(chǔ)上組合選自326S突變、4671突變中的 1種以上突變，從而進(jìn)一步提高螢火蟲熒光素酶的穩(wěn)定性的提高程度。并且，就這些突變而言，在通過導(dǎo)入而與使螢火蟲熒光素酶的穩(wěn)定性降低的其它突變、如344A突變等組合的情況下，可以有效地恢復(fù)降低了的穩(wěn)定性。尤其是在具有344A突變的螢火蟲熒光素酶中組合導(dǎo)入326S突變和4671突變，使螢火蟲熒光素酶的降低了的穩(wěn)定性得以恢復(fù)。S卩，就本發(fā)明的突變而言，與突變導(dǎo)入前相比，提高了螢火蟲熒光素酶的穩(wěn)定性，此外，在與使螢火蟲熒光素酶的穩(wěn)定性顯著降低的其它突變組合的情況下，也發(fā)揮優(yōu)異的穩(wěn)定性恢復(fù)效果。予以說明，本發(fā)明中的穩(wěn)定性是指熱穩(wěn)定性和/或保存穩(wěn)定性。熱穩(wěn)定性可以以例如將螢火蟲熒光素酶暴露于在規(guī)定的溫度下熱處理規(guī)定時間時的殘存活性為指標(biāo)進(jìn)行評價。具體而言，本發(fā)明中的螢火蟲熒光素酶的熱穩(wěn)定性可以如下評價將螢火蟲熒光素酶在高溫條件下如通常40 60°C、優(yōu)選45 55°C的反應(yīng)溫度下熱處理一定時間、通常 10 180分鐘、例如60 180分鐘，通過比較熱處理后的活性殘存率而評價。本發(fā)明中的螢火蟲熒光素酶的活性殘存率以熱處理后的活性相對于在上述高溫條件下作用前的螢火蟲熒光素酶活性之比而算出。本發(fā)明中的熱穩(wěn)定性提高是指如下情況在上述條件下對螢火蟲熒光素酶作用時的活性殘存率，相對于未導(dǎo)入本發(fā)明的突變的酶顯示為1.2倍以上的提尚。本發(fā)明中的螢火蟲熒光素酶的保存穩(wěn)定性可以以將螢火蟲熒光素酶在規(guī)定的溫度下保管規(guī)定的期間時的殘存活性為指標(biāo)進(jìn)行評價。此外，本發(fā)明中的保存穩(wěn)定性提高是指如下情況在上述條件下對螢火蟲熒光素酶作用時的活性殘存率，與未導(dǎo)入本發(fā)明的突變的酶相同或更高。本發(fā)明中的、這樣的熱穩(wěn)定性和/或保存穩(wěn)定性的提高程度，在為了提高螢火蟲熒光素酶的穩(wěn)定性而導(dǎo)入突變的嘗試中是顯著的，其難以簡單地實現(xiàn)，是螢火蟲熒光素酶的實用中有用的改善。(螢火蟲熒光素酶的基因序列和氨基酸序列中的序號)本發(fā)明中的、表示螢火蟲熒光素酶的基因序列和氨基酸序列中的突變的位置的序號是以野生型平家螢熒光素酶或源氏螢熒光素酶中的序號為基準(zhǔn)的。即，在將本發(fā)明用于野生型平家螢熒光素酶以外的熒光素酶時，其基因序列和氨基酸序列中的突變位置為在置換成野生型平家螢熒光素酶或源氏螢熒光素酶中相當(dāng)?shù)奈恢脮r在各種螢火蟲熒光素酶中相應(yīng)的位置。具體的例子為，相當(dāng)于平家螢熒光素酶或源氏螢熒光素酶的第287位、第326位、第392位和第467位的位置的氨基酸的位置，在北美產(chǎn)螢火蟲熒光素酶中為第285 位、第3M位、第390位和第465位。就這些的對應(yīng)關(guān)系而言，例如使用現(xiàn)有的氨基酸同源性解析用軟件如GENETY X -Mac (Software Development公司制)等比較各種熒光素酶的氨基酸序列和平家螢熒光素酶的氨基酸序列，從而能夠容易地獲知。實際上，在平家螢熒光素酶、源氏螢熒光素酶、 北美產(chǎn)螢火蟲熒光素酶中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了氨基酸序列上的共通性、以及基于此的結(jié)構(gòu)上的共通點，在相當(dāng)?shù)母鱾€位置導(dǎo)入同樣的突變而對螢火蟲熒光素酶的性質(zhì)發(fā)揮同樣效果的例子也是已知的。因此，作為為了利用平家螢熒光素酶顯示出的本發(fā)明突變的知識而在源氏螢熒光素酶、或北美產(chǎn)螢火蟲熒光素酶中獲得同樣效果的方案，可容易地進(jìn)行在相當(dāng)?shù)奈恢脤?dǎo)入同樣的突變的嘗試。(突變的導(dǎo)入)上述突變型螢火蟲熒光素酶基因可以通過公知的任意方法改變螢火蟲熒光素酶基因而適當(dāng)獲得。作為改變基因的方法，可以廣泛應(yīng)用位點特異性地導(dǎo)入突變的方法、隨機(jī)導(dǎo)入突變的方法、使作為突變原的藥劑進(jìn)行作用的方法、紫外線照射法、蛋白質(zhì)工程法等。就上述突變處理中使用的作為突變原的藥劑而言，可以列舉出例如羥氨、N-甲基-N’ -亞硝基胍(NTG)、亞硝酸、亞硫酸、胼、甲酸、5-溴尿嘧啶等。就藥劑處理而言，可以根據(jù)使用的藥劑種類等采用適當(dāng)?shù)臈l件，只要能夠在螢火蟲熒光素酶基因中引發(fā)期望的突變，則沒有特別限定。例如，在0. 5 12M的上述藥劑濃度下以20 80°C處理10分鐘以上、具體為處理10 180分鐘，從而能夠引發(fā)期望的突變。紫外線照射可以使用例如現(xiàn)代化學(xué)、pp24 30、1989年6月號記載的方法等公知的方法而進(jìn)行。作為運(yùn)用蛋白質(zhì)工程法的方法，通?？梢允褂靡阎奈稽c專一誘變 (Site-specific Mutagenesis)手法?？梢粤信e例如 Kramer 法(Kramer, W. et al. ,Nucleic Acids Res, vol. 12,pp9441-9456 (1984) ；Kramer, W. et al. , Methods Enzymol,vol.154, pp350-367 (1987) ；Bauer, C. E. et al., Gene, vol.37, pp73_81 (1985))、Eckstein 法 (Taylor, J. W. et al.，Nucleic Acids Res, vol. 13，pp8749_8764 (1985)；Taylor, J. W. et al. , Nucleic Acids Res, vol.13. pp8765_8785 (1985) ；Nakamaye, K.L. et al., Nucleic Acids Res, vol.14, pp9679-9698 (1986))、Kunkel ^(Kunke1, T.A. ， Proc. Natl. Acids Sci.U. S. A.，vol.82，pp488-492 (1985) ;Kunkel，T. A. et al. ,Methods Enzymol, vol. 154, pp367-382 (1987))等。此外，還可以使用通常已知的聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction)手法〔 Technique,1,11 (1989)〕。除上述改變基因的方法外，當(dāng)然也可以通過有機(jī)合成法或酶合成法直接合成期望的改變螢火蟲熒光素酶基因。通過上述方法獲得的期望的螢火蟲熒光素酶基因中的堿基序列的確定和確認(rèn)可以通過例如馬克薩姆·吉爾伯特化學(xué)修飾法〔Maxam-GiIbert，Meth. Enzym.，vol. 65，pp499_560 (1980)〕、使用M13噬菌體的雙脫氧核苷酸鏈終止法(Messing et al.，Gene, vol. 19，pp269_276 (1982))等進(jìn)行。(載體的制備和轉(zhuǎn)化體的制備)將如上述那樣獲得的突變螢火蟲熒光素酶基因，通過常規(guī)方法重組到噬菌體、黏粒(cosmid)、或用于轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞或真核細(xì)胞的質(zhì)粒等載體中，使用該載體對宿主通過常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)。宿主可以使用任意種類，優(yōu)選例如微生物。具體而言，可利用屬于埃希氏菌屬等的微生物。作為屬于埃希氏菌屬的微生物的例子，可以列舉出大腸桿菌K-12、JM109、DH5ci、 HBlOU BL21 等。然后，由獲得的轉(zhuǎn)化體或經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主，篩選具有帶有期望突變的螢火蟲熒光素酶的生產(chǎn)能力的菌株，即可獲得具有突變型螢火蟲熒光素酶生產(chǎn)能力的菌株。為了由這樣獲得的菌株獲得純化的新的重組體DNA，可以使用例如Guerry的方法〔J. Bacteriology, 116,1604 (1973)〕、Clewell 的方法〔J. Bacteriology，110,667 (1972)〕等。為了由獲得的重組體DNA獲得含有突變型螢火蟲熒光素酶基因的DNA，可以使用公知的方法，例如如下方法對該質(zhì)粒DNA用各種限制酶在反應(yīng)溫度30 40°C下作用1 24小時，將反應(yīng)終止液供于瓊脂糖凝膠電泳法，等(參照Molecular Cloning, 150, Cold Spring Harbor Laboratory (1982))。(突變螢火蟲熒光素酶的制造)為了使用如上述那樣獲得的、具有本發(fā)明的突變螢火蟲熒光素酶的生產(chǎn)能力的菌株生產(chǎn)突變型螢火蟲熒光素酶，可以通過各種公知的方法培養(yǎng)具有突變螢火蟲熒光素酶的生產(chǎn)能力的菌株。培養(yǎng)可以用固體培養(yǎng)法，但優(yōu)選用液體培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)。作為培養(yǎng)上述菌株的培養(yǎng)基，可以使用例如在酵母浸膏、胰蛋白胨、胨、肉浸膏、玉米漿或者大豆或小麥麩的浸出液等的1種以上的氮源中添加氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鎂、氯化鐵、硫酸鐵或硫酸錳等無機(jī)鹽類中的1種以上物質(zhì)，再根據(jù)需要適當(dāng)添加糖質(zhì)原料、維生素等。培養(yǎng)基的起始pH調(diào)整至pH7 9是合適的。此外，就培養(yǎng)而言，優(yōu)選的是在30 40°C、優(yōu)選37°C前后通過通氣攪拌培養(yǎng)、震蕩培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)等實施4 M小時、優(yōu)選6 8小時。培養(yǎng)結(jié)束后，可以使用通常公知的酶采集手段由培養(yǎng)物采集穩(wěn)定性提高了的螢火蟲熒光素酶。具體而言，利用常規(guī)方法將菌體供于超聲波破碎處理、磨碎處理等，或使用溶菌酶 (Iysozyme)等溶菌酶提取穩(wěn)定性提高了的螢火蟲熒光素酶，或在甲苯等有機(jī)溶劑存在下震蕩或放置而進(jìn)行自消化而使螢火蟲熒光素酶排出至菌體外。將獲得的提取液或自消化物供于過濾、離心分離等，去除固體成分，根據(jù)需要通過鏈霉素硫酸鹽、魚精蛋白硫酸鹽、硫酸錳等去除核酸，然后在其中添加硫酸銨、醇、丙酮等分級，得到粗酶。對上述粗酶，適當(dāng)選擇例如使用葡聚糖凝膠、超凝膠(Ultrogel)或生物凝膠等的凝膠過濾法；使用離子交換體的吸附洗脫法；使用聚丙烯酰胺凝膠等的電泳法；使用羥基磷灰石的吸附洗脫法；蔗糖密度梯度離心法等沉降法；親和色譜法；使用分子篩膜或中空纖維膜等的分級法等公知技術(shù)，并將其任意組合而實施，從而能夠制成純化度進(jìn)一步提高的酶標(biāo)品。以下列舉實施例更具體地說明本發(fā)明。[實施例1](質(zhì)粒pET16b-BLU_Y 的制備)合成了用于擴(kuò)增生物素化熒光素酶結(jié)構(gòu)基因的全長用引物(序列號1)。以日本專利第3466765號所述的質(zhì)粒pHLf248 (包含本質(zhì)粒的大腸桿菌JMlOl [pHLf248]保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，記作FERM BP-5081。)為模板，使用上述全長用引物和市售的M 13-M4引物(Takara Bio, Inc.制)，通過PCR擴(kuò)增DNA片段。將獲得的DNA片段用NdeI和HindIII消化后，供于瓊脂糖凝膠電泳，由1. 9kb的條帶純化DNA 片段。接著，通過常規(guī)方法將上述DNA片段插入到經(jīng)Ndel、HindIII消化的質(zhì)粒載體 pET16b (Novagen 公司制)，制得質(zhì)粒 pET16b_BLU_Y。進(jìn)而，將制得的質(zhì)粒pET16b-BLU_Y導(dǎo)入到大腸桿菌JM109株，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。從獲得的轉(zhuǎn)化體純化質(zhì)粒后，確認(rèn)DNA序列。由該DNA序列中含有的螢火蟲熒光素酶基因演繹的螢火蟲熒光素酶(BLU-Y)的氨基酸序列與日本專利第3466765號所述的序列相同。[實施例2](含有突變螢火蟲熒光素酶基因的質(zhì)粒的制備)如下所述地制備含有如下基因的質(zhì)粒(pHLf344A)，所述基因編碼在平家螢熒光素酶的氨基酸序列第344位的氨基酸殘基亮氨酸突變成丙氨酸(344A突變)的熒光素酶。首先，合成了按照將第344位的氨基酸殘基亮氨酸變換成丙氨酸進(jìn)行設(shè)計的 PCR引物(pHLf344A F-344A (序列號2)、pHLf344A R-344A (序列號3))。使用這些引物以pET16b-BLU-Y為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(反應(yīng)步驟、條件按照常規(guī)方法)。將擴(kuò)增后的PCR 反應(yīng)液用DpnI消化，通過激酶處理對PCR產(chǎn)物的末端進(jìn)行磷酸化。接著使用Ligation Convenience Kit (Nippon Gene Co. , Ltd.制)，使經(jīng)DpnI和激酶處理后的PCR產(chǎn)物反應(yīng)物自身連接(self-ligation)，獲得 pHLf344A。按照 D. Μ· Morrison 的方法(Methods in Enzymology，68，p. 326-331，1979)，使用該pHLf344A轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM 109株，由獲得的轉(zhuǎn)化體JM109株純化質(zhì)粒，確認(rèn)了 pHLf344A中的編碼突變熒光素酶的DNA序列(序列號4)。 由該DNA序列演繹的氨基酸序列，與實施例1獲得的pET16b-BLU-Y中含有的熒光素酶基因?qū)?yīng)的氨基酸序列的、第344位氨基酸殘基亮氨酸已變換成了丙氨酸。含有編碼將本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的突變?nèi)藶榈亟M合而得的熒光素酶、或者將本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的突變置換成其它氨基酸的熒光素酶的基因的質(zhì)粒均基于上述步驟而制備。[實施例3](穩(wěn)定性提高的突變螢火蟲熒光素酶的取得)以實施例2所述的重組體質(zhì)粒pHLf344A為模板，使用設(shè)計在突變熒光素酶基因區(qū)域的上游、下游的引物(序列號5和6 )進(jìn)行易錯PCR( error-prone PCR)。具體而言，按照終濃度為0. 2μ M使用這些引物，在錳離子濃度為0. ImM、鎂離子濃度為6. 5mM下使用Ex-Taq (Takara Bio, Inc.制)，對pHLf344A基因區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，從而獲得導(dǎo)入了各種突變的螢火蟲熒光素酶基因片段。接著，將這些用Ndel、HindIII進(jìn)行限制酶處理，然后利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，使用REC0-CHIP (Takara Bio, Inc.制)，從電泳后的凝膠回收DNA 片段。將獲得的 DNA 片段，使用 Ligation Convenience KitCNippon Gene Co.，Ltd.制)連接到將pHLf344A進(jìn)行NdeI和HindIII處理而得的pHLf344A載體上。連接結(jié)束后，使用按照上述方法導(dǎo)入了突變的重組體質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli)BL21 (DE3) (Invitrogen Corp.制)，制備突變體文庫。將該轉(zhuǎn)化株接種到LB-amp瓊脂培養(yǎng)基〔1% (w/v)細(xì)菌用胰蛋白胨(bacto tryptone)、0. 5% (w/v)酵母浸膏、10. 5% (w/v)NaCl、氨芐西林(50 μ g/ml)、和1.4% (w/v)瓊脂〕中，37°C下進(jìn)行平板培養(yǎng)。12小時后，將出現(xiàn)的各菌落接種到LB-IPTG-amp瓊脂培養(yǎng)基〔1% (w/v)細(xì)菌用胰蛋白胨(bactotryptone)、0· 5% (w/v)酵母浸膏、10. 5% (w/v) NaCl、ImM 異丙基 β-D-硫代半乳糖苷、50μ g/ml氨芐西林、和1. 4%(w/v)瓊脂〕中，30°C下進(jìn)行平板培養(yǎng)。培養(yǎng)12 18 小時后，從菌體的上方覆蓋硝酸纖維素濾膜(Advantech，Inc.制)，將菌落轉(zhuǎn)移到濾膜上，與該濾膜一起供于55°C、30分鐘的熱處理，接著將熱處理完成后的濾膜浸入發(fā)光試劑〔IOOmM 檸檬酸鈉，ImM 熒光素，IOmM MgSO4, pH5. 0)中，使用 LAS-3000 (FujiFilm Corp.制)，在下述條件下拍攝菌落的發(fā)光(方法化學(xué)發(fā)光；曝光模式連續(xù)曝光(Increment)；曝光時間 10 30秒)。選擇已確認(rèn)熱處理后也發(fā)光的菌株中所含的螢火蟲熒光素酶，將其作為穩(wěn)定性提高的突變體的候補(bǔ)。[實施例4](突變位置的確認(rèn))將實施例3中選擇的菌株在2ml的LB-IPTG-amp培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)18 24小時后，通過離心分離回收菌體，將菌體懸浮在50mM磷酸鉀緩沖液、0. 2% (w/v)BSA (和光純藥工業(yè)公司制)、pH7. 5中，進(jìn)行超聲波破碎獲得粗酶液。將在0. 3MTricine-Na0H, 0. 2%BSA、5%甘油、pH7. 8中添加了 1 10 μ 1上述粗酶液而得到的溶液，供于47°C反應(yīng)溫度下90分鐘的熱處理中。然后，使用活性測定試劑〔50mM Tricine-Na0H，4mMATP，2mM熒光素，IOmM MgS04，pH7.8〕，測定熱處理前后的熒光素酶粗酶的活性。就熒光素酶活性而言，使用照度計(Berthold Co. , Ltd.制，LB96V)，以1秒鐘累計獲得的發(fā)光量進(jìn)行評價，算出熱處理后的發(fā)光量相對于熱處理前的發(fā)光量的比，作為“活性殘存率”。將活性殘存率比母株更大的候選株作為穩(wěn)定性提高的突變體，使用CEQ 2000DNA Sequencing System (Beckman Coulter, Inc.制)，確定穩(wěn)定性提高的突變體中的質(zhì)粒所編碼的螢火蟲熒光素酶基因的序列。其結(jié)果是，確認(rèn)了 4種候選株中的相應(yīng)基因序列分別編碼由第287位的纈氨酸置換成丙氨酸的氨基酸序列(序列號7)、或第3 位的甘氨酸置換成絲氨酸的氨基酸序列(序列號8)、或第392位的纈氨酸置換成異亮氨酸的氨基酸序列(序列號9)、或第467位的苯丙氨酸置換成異亮氨酸的氨基酸序列(序列號10)構(gòu)成的突變型螢火蟲熒光素酶。編碼第觀7 位的纈氨酸置換成丙氨酸的螢火蟲熒光素酶的氨基酸序列的基因序列示于序列號11。進(jìn)而，利用獲得的突變株中的突變點的信息，基于之前實施例所述的方法，制備了具有將多個上述突變組合而成的突變的新的突變株、和將突變置換成其它氨基酸的突變株，取得了各種突變螢火蟲熒光素酶。[實施例5](突變螢火蟲熒光素酶的穩(wěn)定性評價)基于實施例4所述的方法，將獲得的具有各種氨基酸序列的突變螢火蟲熒光素酶供于熱處理，然后進(jìn)行熒光素酶活性測定，評價熱處理后(47°C、90分鐘)的活性殘存率。其結(jié)果示于圖1。1. 287A突變螢火蟲熒光素酶的穩(wěn)定性評價就熱處理后的活性殘存率而言，相對于不含本發(fā)明的突變的熒光素酶(BLU-Y)為28. 1%而言，具有突變的酶(B-M87A)為48. 3%，顯著提高(為1.7倍)。由此可知，287A 突變對提高熒光素酶的熱穩(wěn)定性而言效果很大。此外，基于實施例2 5的方法，對于源氏螢熒光素酶同樣地制備2狐突變體， 對獲得的觀7々突變體的熱穩(wěn)定性進(jìn)行評價。予以說明，LcrL的氨基酸序列如日本專利第 3048466所述，是第217位的蘇氨酸置換成亮氨酸的突變體。其結(jié)果是，相對于不含源氏螢熒光素酶突變的熒光素酶(LcrL)的熱處理后的活性殘存率為10. 1%而言，具有突變的突變熒光素酶(LcrL-M87A)的熱處理后的活性殘存率為14. 7%，提高為1. 5倍。S卩，確認(rèn)了突變不僅提高了平家螢的熱穩(wěn)定性，也提高了源氏螢熒光素酶的熱穩(wěn)定性。2. 3921突變螢火蟲熒光素酶的穩(wěn)定性評價此外，具有3921突變的突變螢火蟲熒光素酶，其熱處理后的活性殘存率提高至 45. 5%，相對于BLU-Y，提高為1. 5倍。這表明3921突變對提高熒光素酶的熱穩(wěn)定性是有效的。此外，基于實施例2 5的方法，對源氏螢熒光素酶也同樣制備了 3921突變體，對獲得的3921突變體的熱穩(wěn)定性進(jìn)行評價。其結(jié)果是，相對于不含源氏螢熒光素酶3921突變的熒光素酶(LcrL)的熱處理后的活性殘存率為10. 7%而言，具有3921突變的突變熒光素酶(LcrL-V392I)的熱處理后的活性殘存率為16. 2%，提高為1. 5倍。S卩，確認(rèn)了 3921突變不僅提高了平家螢的熱穩(wěn)定性，也提高了源氏螢熒光素酶的熱穩(wěn)定性。3.含有2狐突變和3921突變的螢火蟲熒光素酶的穩(wěn)定性評價此外，測定組合了突變和3921突變的突變熒光素酶的活性殘存率，其結(jié)果是 58. 5%，相對于BLU-Y而言，提高為1. 9倍。S卩，確認(rèn)了 與分別單獨具有1狐突變或3921 突變的突變熒光素酶相比，通過將兩個突變組合，熱穩(wěn)定性進(jìn)一步提高。S卩，表明2KJk突變和3921突變的組合對于提高熱穩(wěn)定性更為有效。4.含有其它組合突變的螢火蟲熒光素酶的穩(wěn)定性評價此外，相對于BLU-Y而言，組合了使熒光素酶的熱穩(wěn)定性變差的344A突變的熒光素酶(B-L344A)的活性殘存率降低至16. 2%，對其再組合1狐突變的熒光素酶(B-L344A V287A)，其活性殘存率恢復(fù)至22. 7%，相對于B-L344A，顯示為1. 4倍的提高。將4671突變與344A突變組合而得的熒光素酶(B-L344A F467I)、或?qū)?26S突變與344A突變組合而得的熒光素酶(圖中未記載數(shù)據(jù))，相對于B-L344A提高了穩(wěn)定性，但其程度未超過1. 2倍，與組合了突變的酶的效果相比，提高效果并不充分。但是將這些突變分別與突變組合而得的酶顯示出維持了 2狐突變帶來的熱穩(wěn)定性提高效果或進(jìn)一步提高的效果，例如， B-L344A V287A F467I的活性殘存率恢復(fù)至24. 3%，相對于B_L;M4A，顯示為1. 5倍的提高。予以說明，與F467這一突變位置相應(yīng)的北美螢火蟲熒光素酶的突變體(F465R) 在國際公開第2007/017684號小冊子中已經(jīng)報告過，但并未確認(rèn)通過組合該突變而恢復(fù) L344A突變所致的穩(wěn)定性降低。進(jìn)而，就對;344A導(dǎo)入3種突變的熒光素酶(B-L;M4A V287AG326S F467I，以下稱為 3重突變體)而言，活性殘存率提高至27. 3%，相對于L344A，顯示為1. 7倍的提高。就對前述3重突變體再加入3921突變而成的4重突變體(B-L;M4A V287A G326SF467I V392I)而言，活性殘存率進(jìn)一步提高，與不含344A突變的BLU-Y相比，顯示為1. 6倍的提高(圖中未記載數(shù)據(jù))。此外，就不含1狐突變而是將4671突變和326S突變這2種與344A突變組合而成的熒光素酶(B-L;M4A G326S F467I)而言，活性殘存率提高至21. 5%，相對于B-L344A顯示為1. 3倍的提高。5.將第V287位突變成各種氨基酸的突變體的穩(wěn)定性評價進(jìn)而，制備了編碼如下熒光素酶基因的質(zhì)粒，所述基因為在平家螢熒光素酶344A 突變體中第287位的纈氨酸突變成丙氨酸以外的18種氨基酸的熒光素酶基因。使用PCR 的突變導(dǎo)入基于實施例2所述的344A突變的導(dǎo)入方法而進(jìn)行，使用的引物示于序列號12 至序列號30。PCR中的正向引物(Primer F (序列號12))通用于所有的氨基酸突變體的制備中。PCR中的反向引物(M87C-R (序列號13)、V287D-R (序列號14)、V287E-R (序列號 15)、V287F-R (序列號 16)、V287G-R (序列號 17)、V287H-R(序列號 18)、M87I_R(序列號 19),V287K-R (序列號 20)、M87L-R (序列號 21 )、M87M-R (序列號 22)、M87N-R (序列號 23), V287P-R (序列號 Μ)、M87 Q -R (序列號 25)、M87R-R(序列號 26)、M87S-R(序列號27)、V287T-R (序列號28),V287ff-R (序列號29),V287Y-R (序列號30))根據(jù)氨基酸的種類而分別使用不同的引物。在344A突變的將第287位的纈氨酸突變成丙氨酸以外的18種氨基酸的突變體 (B-L344A V287 X)中，可看到活性和穩(wěn)定性因第V287位的氨基酸的種類而異。第287位置換成 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gin、Arg、Trp、Tyr 各氨基酸的突變體幾乎失去熒光素酶活性。并且，保持了熒光素酶活性的第287位突變體當(dāng)中，置換成Leu、lie, Cys, Met.Ser.Thr的突變體的熱處理后的活性殘存率降低至344A突變體的0. 25 0. 8倍。結(jié)果示于表1。S卩，顯示了充分的熒光素酶活性和熱穩(wěn)定性提高效果的第287位的突變體僅僅是第287位的氨基酸置換成丙氨酸的突變體。表 權(quán)利要求
1.一種螢火蟲熒光素酶，在螢火蟲熒光素酶中具有相當(dāng)于平家螢熒光素酶的第287 位的氨基酸突變成丙氨酸、或者相當(dāng)于第392位的氨基酸突變成異亮氨酸的氨基酸序列。
2.一種螢火蟲熒光素酶，在螢火蟲熒光素酶中具有相當(dāng)于平家螢熒光素酶的第287 位的氨基酸突變成丙氨酸、相當(dāng)于第392位的氨基酸突變成異亮氨酸的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的螢火蟲熒光素酶，其具有選自相當(dāng)于平家螢熒光素酶的第344位的氨基酸突變成丙氨酸、或者相當(dāng)于第3 位的氨基酸突變成絲氨酸、或者相當(dāng)于第467位的氨基酸突變成異亮氨酸的突變中的1種以上突變。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的螢火蟲熒光素酶，其中，相當(dāng)于平家螢熒光素酶的第344 位的氨基酸突變成丙氨酸、相當(dāng)于第3 位的氨基酸突變成絲氨酸，且相當(dāng)于第467位的氨基酸突變成異亮氨酸。
5.一種螢火蟲熒光素酶，在平家螢熒光素酶或源氏螢熒光素酶中具有熒光素酶的第 344位的氨基酸突變成丙氨酸、第3 位的氨基酸突變成絲氨酸、第467位的氨基酸突變成異亮氨酸的突變。
6.一種螢火蟲熒光素酶基因，其編碼權(quán)利要求1 5所述的螢火蟲熒光素酶。
7.一種重組體DNA，其特征在于，在載體DNA中插入了權(quán)利要求6所述的螢火蟲熒光素酶基因。
8.一種穩(wěn)定性提高了的螢火蟲熒光素酶的制造法，其特征在于，培養(yǎng)含有權(quán)利要求6 所述的螢火蟲熒光素酶基因或權(quán)利要求7所述的重組體DNA、具有螢火蟲熒光素酶生產(chǎn)能力的微生物，由該培養(yǎng)物采集螢火蟲熒光素酶。
全文摘要
提供熱穩(wěn)定性和/或保存穩(wěn)定性優(yōu)異的螢火蟲熒光素酶和其制造法。螢火蟲熒光素酶和螢火蟲熒光素酶基因，其特征在于，在螢火蟲熒光素酶的氨基酸序列中具有相當(dāng)于平家螢熒光素酶的第287位的氨基酸置換成丙氨酸、或者相當(dāng)于第392位的氨基酸突變成異亮氨酸的氨基酸序列。通過利用該基因，能夠高效制造穩(wěn)定性提高了的螢火蟲熒光素酶。此外，通過組合第326位的氨基酸置換成絲氨酸的突變、和/或第467位的氨基酸置換成異亮氨酸的突變，能夠獲得穩(wěn)定性進(jìn)一步提高了的螢火蟲熒光素酶。
文檔編號C12N15/09GK102597231SQ20108005101
公開日2012年7月18日 申請日期2010年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日
發(fā)明者吉原繪里子, 小玉侑加子 申請人:龜甲萬株式會社