專利名稱：冷凍方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及冷凍方法。更具體地講，涉及在存在磁場(chǎng)的情況下，以非破壞狀態(tài)對(duì)食品、臟器等進(jìn)行冷凍的方法。
背景技術(shù)：
作為能夠抑制對(duì)食品等進(jìn)行冷凍保存時(shí)的水分分離和組織破壞，從而在不損害食品的鮮度和味道的情況下進(jìn)行冷凍的方 法，提出過(guò)利用磁共振的方法(日本特開2000-325062號(hào)公報(bào))。該方法包括如下步驟對(duì)配置于靜磁場(chǎng)內(nèi)的食品等被冷凍物連續(xù)地或者間歇地照射規(guī)定頻率的電磁波，使構(gòu)成被冷凍物中含有的水分子的氫原子核產(chǎn)生磁共振，使水分的結(jié)冰溫度下降，從而以通常情況以下的結(jié)冰溫度進(jìn)行急速冷凍。由于該方法能夠?qū)崿F(xiàn)不產(chǎn)生細(xì)胞破壞的冷凍，所以作為能夠融解并重現(xiàn)未損害冷凍前的食品的味覺和味道的食品的方法而得到關(guān)注(以下，在本說(shuō)明書中有時(shí)將該冷凍方法稱為“磁共振冷凍方法”)。關(guān)于能夠用于該磁共振冷凍方法的裝置等，例如在國(guó)際公開WO 01/24647、日本特開2003-139460號(hào)公報(bào)或者日本特開2004-81133號(hào)公報(bào)等中有所記載。另外，已掲示了實(shí)現(xiàn)如下方法的可能性通過(guò)在食蟹猿的卵巢冷凍中使用磁共振冷凍方法，能夠在不破壞細(xì)胞的狀態(tài)下長(zhǎng)期地對(duì)卵巢進(jìn)行冷凍保存(山海，第25回日本受精著床學(xué)會(huì)總會(huì)，2007年8月31 日)。磁共振冷凍方法是這樣的方法通過(guò)在磁場(chǎng)內(nèi)冷卻對(duì)象物而以良好的再現(xiàn)性創(chuàng)造出過(guò)冷卻狀態(tài)，并以極短的時(shí)間完成此后的從開始冷凝到完全冷凝為止的過(guò)程，由此來(lái)抑制冷凍過(guò)程中的對(duì)象物中的細(xì)胞破壞。該方法包括如下步驟向與一般為IOOHz以下的交流電源(典型為50Hz或者60Hz的商用交流電源)連接的線圈流入交流電，在線圈中央部形成與交流頻率對(duì)應(yīng)的頻率的變化磁場(chǎng)，在該磁場(chǎng)內(nèi)進(jìn)行對(duì)象物的冷卻。然而以往，并沒有充分理解由交流電形成的變化磁場(chǎng)與過(guò)冷卻狀態(tài)之間的關(guān)系，尤其是完全沒有理解磁場(chǎng)頻率與過(guò)冷卻狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I日本特開2000-325062號(hào)公報(bào)特許文獻(xiàn)2國(guó)際公開WO01/2464專利文獻(xiàn)3日本特開2003-139460號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4日本特開2004-81133號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I第25回日本受精著床學(xué)會(huì)總會(huì)，OrganonSponsored Specialsymposium, uryopreservation and Transplantation of Ovarian Tissue, A Novel Methodfor Cryopreservation of Ovarian Tissue in Cynomolgus Monkeys, 2007 年 8 月 31日，http://jsfi2007. umin. jp/program. html

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題本發(fā)明的課題是提供ー種在存在磁場(chǎng)的情況下以非破壞狀態(tài)對(duì)食品、臟器等對(duì)象物進(jìn)行冷凍的方法。更具體地講，本發(fā)明的課題是提供一種與現(xiàn)有的磁共振冷凍方法相比，對(duì)象物的破壞(例如細(xì)胞破壞等)更少的冷凍方法。用于解決課題的手段本發(fā)明人為了解決上述課題而進(jìn)行了深刻研究的結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)了如下情況在磁共振冷凍方法中，通過(guò)使磁場(chǎng)頻率比以往的頻率(100Hz以下)高，能夠改善冷凝開始前的過(guò)冷度，并且，通過(guò)使磁場(chǎng)頻率成為2000Hz左右，能夠達(dá)到極高的過(guò)冷度，能夠大幅縮短從冷凝開始到結(jié)束為止的時(shí)間，以非破壞狀態(tài)對(duì)對(duì)象物進(jìn)行冷凍。本發(fā)明正是基于上述認(rèn)識(shí)而完成的。
S卩，本發(fā)明提供了ー種磁共振冷凍方法，該方法包括在磁場(chǎng)內(nèi)冷卻對(duì)象物的步驟，其中，磁場(chǎng)頻率為200Hz以上。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方式，提供如下各種方式的上述磁共振冷凍方法，所述各種方式有磁場(chǎng)頻率為IOOOHz 10000Hz ;磁場(chǎng)強(qiáng)度為O. OlmT O. 4mT，優(yōu)選為O. 2mT ;在_2°C以下且-40°C以上的范圍的溫度下進(jìn)行冷凍按照每分鐘溫度下降O. 1°C I. (TC的方式進(jìn)行上述冷凍。根據(jù)更優(yōu)選的方式，提供如下各種方式的上述磁共振冷凍方法，所述各種方式有對(duì)象物為食品；對(duì)象物為生物個(gè)體、或者從活體分離出的臟器或組織；對(duì)象物為細(xì)胞；對(duì)象物為核酸或者蛋白質(zhì)。另外，根據(jù)其他觀點(diǎn)，提供ー種使用對(duì)從手術(shù)中的患者分離/采集的組織進(jìn)行冷凍而調(diào)制出的標(biāo)本在手術(shù)中進(jìn)行病理診斷的方法，其中，該方法包含利用上述磁共振冷凍方法進(jìn)行冷凍的步驟。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明所提供的磁共振冷凍方法，與現(xiàn)有的磁共振冷凍方法相比，能夠達(dá)到更高的過(guò)冷度，能夠大幅縮短從對(duì)象物的冷凝開始到結(jié)束為止的時(shí)間。其結(jié)果，基于本發(fā)明的磁共振冷凍方法，能夠在實(shí)質(zhì)上未發(fā)生破壞的狀態(tài)下對(duì)食品、組織等對(duì)象物進(jìn)行冷凍。


圖I是作為對(duì)照而示出了以磁場(chǎng)頻率50Hz進(jìn)行3次冷凍試驗(yàn)后的溫度變化的圖。圖2是示出改變磁場(chǎng)頻率而求取過(guò)冷度的平均值以及方差所得的結(jié)果的圖。圖3是示出在顯微鏡下觀察非冷凍組織(non-frozen)、和利用急速冷凍法(traditional freezing)、CAS (磁場(chǎng)頻率IOOHz以下)、以及本發(fā)明的方法(2kHz過(guò)冷卻冷凍)對(duì)全身進(jìn)行冷凍后的小白鼠的腦組織切片所得的結(jié)果的圖。圖4是示出在顯微鏡下觀察非冷凍組織(non-frozen)、和利用急速冷凍法(traditional freezing)、CAS (磁場(chǎng)頻率100Hz以下)、以及本發(fā)明的方法(2kHz過(guò)冷卻冷凍)對(duì)全身進(jìn)行冷凍后的小白鼠的小腸組織切片所得的結(jié)果的圖。圖5是示出在顯微鏡下觀察非冷凍組織(non-frozen)、和利用急速冷凍法(traditional freezing)、CAS (磁場(chǎng)頻率100Hz以下)、以及本發(fā)明的方法(2kHz過(guò)冷卻冷凍)對(duì)全身進(jìn)行冷凍后的小白鼠的肺泡組織切片所得的結(jié)果的圖。圖6是示出以磁場(chǎng)頻率2kHz反復(fù)執(zhí)行6次ALP溶液的冷凍/融解后的ALP活性的圖。示出了使用不銹鋼管時(shí)的結(jié)果。圖7是示出以磁場(chǎng)頻率2kHz反復(fù)執(zhí)行6次ALP溶液的冷凍/融解后的ALP活性的圖。示出了不使用不銹鋼管時(shí)的結(jié)果。圖8示出以磁場(chǎng)頻率2kHz反復(fù)執(zhí)行6次GFPP溶液的冷凍/融解后的GFP的熒光強(qiáng)度的圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的磁共振冷凍方法的特征在于，在磁場(chǎng)內(nèi)冷卻對(duì)象物時(shí)，磁場(chǎng)頻率為200Hz以上。關(guān)于包含了在磁場(chǎng)內(nèi)冷卻對(duì)象物的步驟的磁共振冷凍方法的基本概念,例如已經(jīng)記 載于日本特開2000-325062號(hào)公報(bào)中，而關(guān)于應(yīng)用于該方法的裝置等，已經(jīng)記載于國(guó)際公開TO 01/24647、日本特開2003-139460號(hào)公報(bào)以及日本特開2004-81133號(hào)公報(bào)等中，所以本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)參照這些刊物能夠正確地理解磁共振冷凍方法的概念。通過(guò)引證的方式將這些刊物所公開的全部?jī)?nèi)容包含于本說(shuō)明書公開的內(nèi)容中。在進(jìn)行磁共振冷凍方法時(shí)，需要在形成磁場(chǎng)的線圈中流過(guò)交流電流，但是磁場(chǎng)的頻率與交流電流的頻率一致，所以在本發(fā)明的方法中，為了調(diào)節(jié)磁場(chǎng)的頻率，只要調(diào)節(jié)流入線圈的交流電流的頻率即可。例如，可通過(guò)能夠容易地得到的函數(shù)發(fā)生器產(chǎn)生期望頻率的交流電流，在線圈內(nèi)形成與該頻率對(duì)應(yīng)的頻率的磁場(chǎng)。一般而言，只要磁場(chǎng)的頻率為200Hz以上即可，沒有特別限定，不過(guò)，例如，優(yōu)選的是選擇400Hz以上的頻率，更優(yōu)選的是選擇600Hz以上的頻率，進(jìn)ー步優(yōu)選的是選擇800Hz以上的頻率，特別優(yōu)選的是選擇1000Hz以上的頻率。頻率的上限沒有特別限定，不過(guò)，例如為200000Hz以下，優(yōu)選的是100000Hz以下，更優(yōu)選的是10000Hz以下，特別優(yōu)選的是5000Hz以下。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方式，磁場(chǎng)的頻率為1000Hz 10000Hz的范圍，特別優(yōu)選的是2000Hz左右的頻率。磁共振冷凍方法中的磁場(chǎng)強(qiáng)度沒有特別限定，可以根據(jù)對(duì)象物的種類、大小等適宜地選擇，不過(guò)，例如在冷凍卵巢等小型臟器或者細(xì)胞的情況下，例如可以設(shè)定為
0.OlmT 0. 4mT,優(yōu)選設(shè)定為0. 2mT左右。進(jìn)行冷凍操作的溫度沒有特別限定，例如可以在_2°C以下且-40°C以上的范圍內(nèi)進(jìn)行，優(yōu)選的是在_20°C以下且-33°C以上的范圍或者-20°C以下且-40°C以上的溫度下進(jìn)行。在冷凍時(shí)，例如可以使溫度以每分鐘0. 1°C
1.(TC的比例下降，優(yōu)選的是，使溫度以每分鐘大約0.5°C的比例下降。優(yōu)選的是，將開始時(shí)的線圈內(nèi)冷卻槽溫度設(shè)為_2°C左右，并以-0. 5°C /分鐘的比例使溫度下降，例如使最終的線圈內(nèi)溫度成為-33°C。作為用于磁共振冷凍方法的裝置，例如ABI公司(株式會(huì)社ァビー)已提出了各種裝置(http://www. abi-net. co. jp/, CAS:Cell Alive System),而在進(jìn)行本發(fā)明的磁場(chǎng)共振冷凍法時(shí)，只要在這些冷凍裝置中添加調(diào)節(jié)磁場(chǎng)頻率的裝置即可。例如優(yōu)選的是，添加如上述那樣借助函數(shù)發(fā)生器向線圈流入交流電流的裝置。這些裝置中的任何ー個(gè)都可以作為執(zhí)行如下功能的裝置來(lái)提供在冷凍倉(cāng)內(nèi)，通過(guò)50Hz或者60Hz的商用交流電流形成磁場(chǎng)，使對(duì)象物中的水分子振動(dòng)，在-10 °C左右的溫度下創(chuàng)造出不發(fā)生冷凝的過(guò)冷卻狀態(tài)，并在-20°C以下使全體細(xì)胞ー下子冷凝起來(lái)。通過(guò)將磁場(chǎng)的頻率提高到上述頻率，能夠以更低的溫度實(shí)現(xiàn)過(guò)冷卻狀態(tài)，使得對(duì)象物以極短的時(shí)間從過(guò)冷卻狀態(tài)達(dá)到完全冷凝狀態(tài)。另外，可以在冷卻槽中填充こ醇或者水/こニ醇的混合物等作為防凍液。本發(fā)明的磁共振冷凍方法所能夠冷凍的對(duì)象物只要含有水分即可，沒有特別的限定，例如可以列舉出蔬菜類、谷類、肉類或者加工食品等食品類；包含人在內(nèi)的哺乳類動(dòng)物、昆蟲或者線蟲等已經(jīng)死亡的生物個(gè)體；卵巣、精巣或者肝臟等從活體分離出的臟器；肌肉、脂肪或者皮膚等從活體分離出的組織；血液、淋巴液或者精液等從活體分離出的體液；培育細(xì)胞、卵細(xì)胞、精細(xì)胞或者受精卵等細(xì)胞或細(xì)胞小器官；DNA或RNA等核酸類；骨膠原、各種受體或者各種酶等蛋白質(zhì)類；為了生成病理診斷用標(biāo)本而從活體分離出的組織切片；或者生理鹽水、緩沖液/冷凍保護(hù)劑等溶液等，但不限于此。由于本發(fā)明的磁共振冷凍方法在冷凍時(shí)不會(huì)發(fā)生組織或細(xì)胞的破壞，因此，除了例如食品類的冷凍以外，還適合用于進(jìn)行卵巣、精巢等臟器或者組織的冷凍的情況。另外，可使用本發(fā)明的磁共振冷凍方法，對(duì)從手術(shù)中的患者分離/采集的組織進(jìn)行冷凍，調(diào)制病理標(biāo)本，還可以使用該病理標(biāo)本在手術(shù)中進(jìn)行病理診斷。例如，可以在患者 的手術(shù)中，利用本發(fā)明的磁共振冷凍方法對(duì)從患者分離/采集的組織進(jìn)行冷凍。手術(shù)的種類沒有特別限定，可以是侵入性手術(shù)或者非侵入性手術(shù)中的任意一者，還可以是利用了內(nèi)窺鏡的手木。作為組織，除了例如腫瘤組織等外觀上能夠識(shí)別的病變組織以外，還可以將任意組織作為對(duì)象，例如外觀上無(wú)法與正常組織區(qū)分但疑似已被惡性腫瘤所侵染的淋巴組織等。“組織”這ー用語(yǔ)除了包含臟器的全部或者一部分以外，還包含體液等，需要按照最廣義的方式來(lái)解釋，在任何含義下都不應(yīng)限定地進(jìn)行解釋。例如，對(duì)于摘除惡性腫瘤的手術(shù)而言，可以利用磁共振冷凍法對(duì)摘除的惡性腫瘤組織的周邊部組織進(jìn)行冷凍，確認(rèn)在周邊部位不存在惡性腫瘤細(xì)胞的情況。對(duì)從患者分離/采集的組織進(jìn)行冷凍之前的處理沒有特別限定，例如可以進(jìn)行如下處理使用冰涼的生理鹽水等對(duì)組織進(jìn)行清洗，將組織擱到放有包埋劑(例如OCT化合物(フナコシ)等)的包埋盤中，利用莎倫膜(Saran Wrap)等將該組織和包埋盤包好后，放入尼龍袋中，進(jìn)行排氣而密閉起來(lái)。不過(guò)，可以對(duì)該エ序進(jìn)行適當(dāng)?shù)母淖兓蛘咝揎?，也可以根?jù)情況而適當(dāng)?shù)厥÷?。關(guān)于從冷凍后的組織調(diào)制出切片來(lái)制作病理診斷用標(biāo)本的方法，沒有特別限定，可以采用現(xiàn)有的手術(shù)中迅速病理診斷法等中使用的通常方法。一般而言，可以從冷凍后的組織調(diào)制出幾微米(優(yōu)選為5 7μπι左右)的厚度的切片，并將切片貼在載玻片上進(jìn)行風(fēng)干，按照通常的方法進(jìn)行基于蘇木精/曙紅的染色。通過(guò)在顯微鏡下對(duì)這樣得到的標(biāo)本進(jìn)行觀察，確認(rèn)細(xì)胞的形態(tài)等，能夠進(jìn)行病理診斷。另外，從冷凍后的組織調(diào)制出幾微米(優(yōu)選為5 7μπι左右)的厚度的切片，并將切片貼在載玻片上進(jìn)行風(fēng)干，之后，根據(jù)需要利用通用的固定液(例如こ醇、丙酮、福爾馬林、甲醇、或者其混合物)對(duì)組織進(jìn)行固定，對(duì)特定的膜蛋白質(zhì)作用特殊的抗體(一次抗體)，并且進(jìn)一歩作用二次抗體，進(jìn)行組織免疫化學(xué)染色，由此，能夠確認(rèn)標(biāo)本中的組織的膜蛋白質(zhì)的存在或者局部存在。在上述方法中，也可以應(yīng)用只使用一次抗體而不使用二次抗體的染色法。更具體地講，例如，可經(jīng)過(guò)冷凍切片制作一固定15秒一PBS清洗10秒(3次)一與HRP標(biāo)識(shí)聚合物結(jié)合一次抗體的反應(yīng)(3分鐘)一PBS清洗10秒(5次)一DAB染色2分鐘—水洗5秒一5%甲基綠核染色一水洗+脫水+透徹+密封合計(jì)20秒的エ序，進(jìn)行染色，但不限于該エ序。由此，能夠證明在特定疾病的病變組織中存在特異地發(fā)現(xiàn)的膜蛋白質(zhì)，能夠確定病理診斷。作為特定的膜蛋白質(zhì)，例如可以列舉出作為癌標(biāo)記的EMA (上皮性腫瘤標(biāo)記)等，但不限于此。實(shí)施例以下，通過(guò)實(shí)施例進(jìn)ー步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說(shuō)明，但是，本發(fā)明的方法不限于下述的實(shí)施例。例I在內(nèi)徑40mm、深40mm的招制冷卻槽的外側(cè)配置內(nèi)徑80mm、深80mm的線圈(阻數(shù)為6)，將線圈以及冷卻槽裝在冷卻裝置(斯特林發(fā)動(dòng)機(jī)，Twinbird公司，SC-UD08)上。將用于產(chǎn)生交流電流的函數(shù)發(fā)生器連接至線圈。使用該裝置對(duì)Iml的生理鹽水(凝固點(diǎn)-0. 650C )進(jìn)行冷卻而實(shí)施了冷凍實(shí)驗(yàn)。設(shè)磁場(chǎng)強(qiáng)度為O. 12±0. 02mT、冷卻速度為O. 8K/min,并且設(shè)交流電流的頻率為OHz (無(wú)磁場(chǎng))、50Hz、200Hz、2000Hz、20000Hz或者200000Hz，對(duì)不同的磁場(chǎng)頻率分別進(jìn)行了 12次實(shí)驗(yàn)。圖I示出了在磁場(chǎng)頻率為50Hz的情況下進(jìn)行3次試驗(yàn)后的溫度變化。對(duì)于各次試驗(yàn)，把“過(guò)冷度”設(shè)為生理鹽水的凝固點(diǎn)與過(guò)冷卻即將消失之前的溫度之差的絕對(duì)值而進(jìn)行求取，求出平均值以及方差，針對(duì)OHz (無(wú)磁場(chǎng))的情況，使用Welch95%單側(cè)檢測(cè)，檢測(cè)總體平均值的有意差。結(jié)果表示在圖2中。在磁場(chǎng)頻率為200Hz、2000Hz、20000Hz以及200000Hz中的任何ー個(gè)頻率時(shí)，都確認(rèn)到促進(jìn)了過(guò)冷卻的情況，但是，在50Hz的情況下，與OHz (無(wú)磁場(chǎng))的情況相比，未確認(rèn)到有意差。例2使2只Lewis雌性小白鼠(285g，280g)絕食24小時(shí)后，在こ醚麻醉下使它們安樂死，緊接著不摘除臟器而直接用于冷凍實(shí)驗(yàn)。在冷凍裝置的冷卻槽中充滿60%的こニ醇，盡可能地排除空氣，將封入到尼龍袋中的小白鼠放入帶有墜子的測(cè)量?jī)x器中，沉入冷卻槽。把磁場(chǎng)強(qiáng)度設(shè)為O. ImT O. 2mT,在2°C下冷卻I小時(shí)后，以-O. 5°C /分鐘的速度進(jìn)行冷卻，一直冷卻到-30°C而進(jìn)行了冷凍。從冷卻開始到冷凍結(jié)束用了 2小時(shí)45分鐘。磁場(chǎng)頻率為2000Hz ο從冷凍組織按照5 7 μ m的厚度切取組織切片，將切片貼在載玻片上風(fēng)干30分鐘。組織切片的染色是利用蘇木精/曙紅染色，并通過(guò)以下方法進(jìn)行的。將載玻片浸潰到95%的こ醇中2分鐘，用流動(dòng)水進(jìn)行清洗；浸潰到蘇木精液中I分鐘，用流動(dòng)水進(jìn)行清洗；浸潰到曙紅Y液中30秒，用流動(dòng)水進(jìn)行清洗；將載玻片按照70%、80%、90%、100%こ醇的順序進(jìn)行脫水后，浸潰到ニ甲苯中，用屈大麻酚進(jìn)行密封。作為對(duì)照，從在IOOHz以下的磁場(chǎng)頻率下進(jìn)行冷凍后的組織、以及用液體氮進(jìn)行急速冷凍后的控制試料調(diào)制出切片，同樣地進(jìn)行了染色。用光學(xué)顯微鏡(X 100或者X400)對(duì)得到的標(biāo)本進(jìn)行了觀察。 關(guān)于腦(圖3)，雖然腦組織自身的構(gòu)造被破壞，但是，在利用本發(fā)明的方法以磁場(chǎng)頻率2000Hz進(jìn)行冷凍后的組織中，確認(rèn)到在形態(tài)上保存了 10倍左右的腦神經(jīng)細(xì)胞。關(guān)于小腸(圖4)，在急速冷凍法以及IOOHz以下的磁場(chǎng)頻率的情況下，確認(rèn)到粘膜脫落以及基底膜的組織間空隙，但是在基于本發(fā)明的方法的冷凍中，基本未確認(rèn)到脫落以及空隙。關(guān)于肺泡(圖5)，在急速冷凍法以及IOOHz以下的磁場(chǎng)頻率的情況下，肺泡構(gòu)造被破壞，但是在基于本發(fā)明的方法的冷凍中，肺泡構(gòu)造被保存下來(lái)，并且毛細(xì)血管內(nèi)的紅血球也被保存下來(lái)。例3使用堿性磷酸酶(ALP)以及綠色熒光蛋白(GFP)，反復(fù)進(jìn)行基于本發(fā)明的方法的冷凍和融解，確認(rèn)改性的程度。將100μ I的樣本放入聚こ烯制的樣本管中，存儲(chǔ)到填充有鋁球(直徑O. 5mm)的不銹鋼管(1X1X4CH1)中，在磁場(chǎng)頻率為30Hz或者2000Hz、磁場(chǎng)強(qiáng)度為O. 8mT的條件下，將冷凍條件以45分鐘從30°C到達(dá)_40°C、融解條件冷凍結(jié)束后以20分鐘到達(dá)30°C設(shè)為I個(gè)周期，反復(fù)執(zhí)行6次冷凍/融解。使用了 ALP的活性測(cè)定是通過(guò)以下方法進(jìn)行的。當(dāng)使樣本作用于包含對(duì)硝基磷酸苯酯(p-nitrophenyl phosphate)的炭酸鹽緩沖液(ρΗ9· 8)時(shí)，由于檢測(cè)體中的堿性磷酸酶的作用，對(duì)硝基磷酸苯酯分解為對(duì)硝基苯酹(p-nitrophenol)和磷酸,生成的對(duì)硝基苯酹在堿性側(cè)呈現(xiàn)為黃色。用405nm的吸光度對(duì)該呈現(xiàn)的顏色進(jìn)行測(cè)定，由此求出了檢測(cè)體中 的堿性磷酸酶活性值。使用蒸餾水將ALPdOunits/μ I)稀釋150倍(O. 67units/μ I)，在上述條件下反復(fù)進(jìn)行冷凍/融解，用蒸餾水將第2次、第4次以及第6次融解后的樣本稀釋1000倍(100%殘留時(shí)的活性0. 67munitS/y 1)，然后進(jìn)行了活性測(cè)定。同樣地在不使用不銹鋼管而將樣本管沉在鋁球上的狀態(tài)下進(jìn)行了試驗(yàn)。結(jié)果如圖6(存在不銹鋼管)以及圖7(不存在不銹鋼管)所示。在以磁場(chǎng)頻率2kHz下反復(fù)進(jìn)行了冷凍/融解的情況下，特別是未使用不銹鋼管的情況下，在第6次的冷凍/融解后，ALP活性仍有相當(dāng)程度的殘留。通過(guò)在磁場(chǎng)內(nèi)進(jìn)行冷凍/融解，認(rèn)為能夠抑制冷凍過(guò)程中的蛋白質(zhì)的高次構(gòu)造的改性，保持酶的活性。用蒸餾水將GFP (I μ g/ml)稀釋25倍(40ng/ml)，按上述條件反復(fù)進(jìn)行6次冷凍/融解，用蒸餾水將第2次、第4次以及第6次融解后的樣本稀釋4倍(100%殘留時(shí)的含有量10ng/ml)，照射485nm的激勵(lì)光，檢測(cè)出535nm的熒光。結(jié)果表示在圖8中。以磁場(chǎng)頻率2kHz反復(fù)進(jìn)行了冷凍/融解的情況下，在第6次的融解后仍然在GFP中確認(rèn)到很高的熒光強(qiáng)度。產(chǎn)業(yè)上的可利用性根據(jù)本發(fā)明所提供的磁共振冷凍方法，能夠大幅縮短從對(duì)象物的冷凍開始到結(jié)束為止的時(shí)間，能夠在實(shí)質(zhì)上未發(fā)生破壞的狀態(tài)下對(duì)食品、組織等對(duì)象物進(jìn)行冷凍。
權(quán)利要求
1.ー種磁共振冷凍方法,該方法包括在磁場(chǎng)內(nèi)冷卻對(duì)象物的步驟,其中，磁場(chǎng)頻率為200HZ以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，磁場(chǎng)頻率為IOOOHz 10000Hz。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，磁場(chǎng)強(qiáng)度為O. OlmT O. 4mT。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，在-2 °C以下且_40°C以上的范圍的溫度下，進(jìn)行冷凍。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，按照每分鐘溫度下降0.1°C I. (TC的方式進(jìn)行所述冷凍。
全文摘要
一種在存在磁場(chǎng)的情況下以非破壞狀態(tài)對(duì)食品、臟器等對(duì)象物進(jìn)行冷凍的方法，其中，磁場(chǎng)的頻率為200Hz以上。
文檔編號(hào)A23L3/36GK102686118SQ20108005054
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2010年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日
發(fā)明者三原誠(chéng), 中川毅史, 土肥健純, 山下纮正, 新野豊太郎, 正宗賢, 野口修平 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人東京大學(xué)