專利名稱：：具有木聚糖酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及用于產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。相關(guān)領(lǐng)域描述纖維素是單糖葡萄糖通過P-I,4-鍵連接的聚合物。許多微生物產(chǎn)生水解P-連接的葡聚糖的酶。這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和3-葡糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶在隨機(jī)位置消化纖維素聚合物，將其打開(openingit)以受到纖維二糖水解酶攻擊(attack)。纖維二糖水解酶順序地從纖維素聚合物的末端釋放纖維二糖的分子。纖維二糖是水溶性的￠-1,4-連接的葡萄糖二聚體。￠-葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。木素纖維素，世界最大的可再生生物質(zhì)資源，主要由木質(zhì)素、纖維素和半纖維素組成，其中后者的最大部分為木聚糖。木聚糖酶(例如內(nèi)切-1，4-0-木聚糖酶，EC3.2.1.8)水解木聚糖中的內(nèi)部￠-1,4-木糖苷連接以產(chǎn)生較小分子量的木聚糖和木糖寡聚物。木聚糖為由1，4-P-葡糖苷連接的D-木糖吡喃糖形成的多糖。將含木素纖維素原料(lignocellulosicfeedstock)轉(zhuǎn)化為乙醇具有以下優(yōu)勢(shì)大量原料現(xiàn)成可用，避免燃燒或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清潔性。木材、農(nóng)業(yè)殘余物、草本作物和城市固體廢物被認(rèn)為是用于乙醇產(chǎn)生的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。一旦將纖維素和半纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖和木糖，葡萄糖和木糖將容易地由酵母發(fā)酵成乙醇。在本領(lǐng)域中，有通過補(bǔ)充其他酶以增加效力而改善纖維素分解酶組合物，和提供劃算的供降解木素纖維素的酶溶液的需要。本發(fā)明提供了具有木聚糖酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸。發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性的分離的多肽，所述多肽選自下組(a)多肽，與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少65%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中等嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列或其基因組DNA序列具有至少65%序列同一性；(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有木聚糖酶活性的片段。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、重組表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞；和產(chǎn)生所述多肽的方法。本發(fā)明還涉及用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料或含木聚糖材料的方法，包括在本發(fā)明的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下用酶組合物處理所述纖維素材料或含木聚糖材料。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述方法進(jìn)一步包括回收降解的或轉(zhuǎn)化的纖維素材料或含木聚糖材料。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括(a)在本發(fā)明的具有木聚糖酶活性的多肽用酶組合物糖化纖維素材料或含木聚糖材料；(b)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵糖化的纖維素材料或含木聚糖材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(C)從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及發(fā)酵纖維素材料或含木聚糖材料的方法，包括用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵所述纖維素材料或含木聚糖材料，其中所述纖維素材料是在本發(fā)明的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下用酶組合物糖化的。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述纖維素材料或含木聚糖材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。在一個(gè)方面，所述方法進(jìn)一步包括從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及編碼信號(hào)肽的多核苷酸，所述信號(hào)肽包含SEQIDNO:2的氨基酸I至19，或由SEQIDN0:2的氨基酸I至19組成，其可操作地連接于編碼蛋白的基因；涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞；并涉及產(chǎn)生蛋白的方法。附圖簡(jiǎn)述圖I顯不揭抱長(zhǎng)毛盤菌(Trichophaeasaccata)CBS804.70木聚糖酶基因的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:I和2)。圖2顯示在50°C、55°C和60°C在經(jīng)磨制、洗滌的PCS的水解中對(duì)將褐孢長(zhǎng)毛盤菌GHlO木聚糖酶以10%添加(0.35mg蛋白每g纖維素)至高溫酶組合物(3.5mg蛋白每g纖維素)的衡量。圖3顯示在50°C、55°C和60°C在經(jīng)磨制、洗滌的PCS的水解中就與高溫酶組合物的協(xié)同作用衡量褐孢長(zhǎng)毛盤菌GHlO木聚糖酶。將褐孢長(zhǎng)毛盤菌GHlO木聚糖酶以不同水平(I.25%，2.5%，5%，10%,和20%)添加至高溫酶組合物的恒定加載(3mg蛋白每g纖維素)。圖4A和4B顯示在經(jīng)洗滌(A)和未經(jīng)洗滌(B)的PCS的水解中，含有褐孢長(zhǎng)毛盤菌GHlO木聚糖酶的改善的高溫酶組合物(60°C)與基于里氏木霉的纖維素酶XCL-533(50°C)的比較。定義半纖維素分解酶或半纖維素酶術(shù)語“半纖維素分解酶”或“半纖維素酶”意指一種或多種(幾種)水解半纖維素材料的酶。參見，例如Shallom,D.和Shoham,Y.Microbialhemicellulases.CurrentOpinionInMicrobiology,2003，6(3):219-228)。半纖維素酶是植物生物質(zhì)降解中的關(guān)鍵成分。半纖維素酶的實(shí)例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。這些酶的底物，半纖維素，是支化和直鏈多糖的混雜集團(tuán)，這些多糖通過氫鍵鍵合于植物細(xì)胞壁中的纖維素微纖維，將其交聯(lián)為魯棒(robust)的網(wǎng)絡(luò)。半纖維素亦共價(jià)地附接于木質(zhì)素，與纖維素一同形成高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。半纖維素的可變的結(jié)構(gòu)和組織形式需要許多酶的協(xié)同作用使其完全降解。半纖維素酶的催化模塊為水解糖苷鍵的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸側(cè)基酯連接的糖酯酶(CE)。這些催化模塊，基于其一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性，可指定為以數(shù)字標(biāo)記的GH和CE家族。一些家族，具有總體上類似的折疊，可進(jìn)一步歸類為宗族(clan)，以字母標(biāo)記(例如，GH-A)。最具信息性和最新的這些和其他糖活性酶的分類可在Carbohydrate-ActiveEnzymes(CAZy)數(shù)據(jù)庫獲得。半纖維素分解酶活性可根據(jù)Ghose和Bisaria,1987,Pure&Appl.Chem.59:1739-1752測(cè)量。木聚糖降解活性或木聚糖分解活性術(shù)語“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物學(xué)活性。兩種測(cè)定木聚糖分解活性的基礎(chǔ)方法包括(I)測(cè)定總木聚糖分解活性，和(2)測(cè)定單獨(dú)的木聚糖分解活性(例如，內(nèi)切木聚糖酶、￠-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、a-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和a-葡糖醒酸酯酶(a-glucuronylesterase))。最近在木聚糖分解酶測(cè)定法的進(jìn)展總結(jié)于幾個(gè)公開文獻(xiàn)中，包括Biely和Puchard,Recentprogressintheassaysofxylanolyticenzymes,2006,JournaloftheScienceofFoodandAgriculture86(11):1636-1647；Spanikova和Biely,2006，Glucuronoylesterase-NovelcarbohydrateesteraseproducedbySchizophyllumcommune,FEBSLetters580(19):4597-4601;Herrmann,Vrsanska,Jurickova,Hirsch,Biely和Kubicek,1997,Thebeta-D-xylosidaseofTrichodermareeseiisamultifunctionalbeta—D—xylanxylohydrolase,BiochemicalJournal321:375-381?？偰揪厶墙到饣钚钥赏ㄟ^確定從多種類型的木聚糖形成的還原糖來測(cè)量，所述木聚糖包括例如燕麥小麥(oatspelt)、山毛櫸木(beechwood)和落葉松木(Iarchwood)木聚糖，或者可通過光度法確定從多種共價(jià)染色的木聚糖釋放出的染色的木聚糖片段來測(cè)量。最常見的總木聚糖分解活性測(cè)定法基于從多聚的4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖產(chǎn)生還原糖，如Bailey,Biely,Poutanen,1992,Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity,JournalofBiotechnology23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性亦可用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作為底物在37°C在0.01%TritonX-100和200mM磷酸鈉緩沖液PH6中確定。一單位的木聚糖酶活性定義為在200mM磷酸鈉pH6緩沖液中在37°C，pH6從作為底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分鐘產(chǎn)生I.0微摩爾的天青精(azurine)。就本發(fā)明而言，木聚糖降解活性是通過測(cè)量由木聚糖降解酶在下述典型條件下造成的樺木木聚糖(SigmaChemicalCo.，Inc.，St.Louis,MO,USA)水解的增加來確定的1ml反應(yīng),5mg/ml底物(總固形物)，5mg木聚糖分解蛋白/g底物,50mM乙酸鈉，pH5,50°C,24小時(shí)，如Lever,1972，Anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述使用對(duì)輕基苯甲酸酸餅(PHBAH)測(cè)定法進(jìn)行糖分析。木聚糖酶術(shù)語“木聚糖酶”意指催化木聚糖中1，4-0-D-木糖苷鍵的內(nèi)水解的1,4-P-D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)。就本發(fā)明而言，木聚糖酶活性是使用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖(小麥；(MegazymeInternationalIreland,Ltd.,Bray,Co.Wicklow,Ireland))作為底物在37°C含有0.01%TR丨TONX-100的200mM磷酸鈉pH6中進(jìn)行確定的。一單位的木聚糖酶活性定義為在37°C，pH6從含有0.01%TRITONX-100的0.2M磷酸鈉pH6緩沖液中的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分鐘產(chǎn)生I.0微摩爾的天青精。本發(fā)明的多肽具有SEQIDNO:2的成熟多肽的纖維二糖水解酶活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少100%。纖維素分解酶或纖維素酶術(shù)語“纖維素分解酶”或“纖維素酶”意指一種或多種(幾種)水解纖維素材料的酶。此類酶包括內(nèi)切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶，￠-葡糖苷酶，或其組合。測(cè)量纖維素分解活性的兩種基本方法包括(1)測(cè)量總纖維素分解活性，和(2)測(cè)量單獨(dú)的纖維素分解活性(內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和￠-葡糖苷酶)，如Zhang等，Outlookforcellulaseimprovement:Screeningandselectionstrategies,2006,BiotechnologyAdvances24:452-481所綜述的。總纖維素分解活性通常是使用不溶性底物來測(cè)定的，所述底物包括WhatmanNo.I濾紙、微晶纖維素、細(xì)菌纖維素、藻類纖維素、棉花、經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素等。最常見的總纖維素分解活性測(cè)定法是使用WhatmanNo.I濾紙作為底物的濾紙測(cè)定法。該測(cè)定法是由InternationalUnionofPureandAppliedChemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurementofcellulaseactivities,PureAppI.Chem.59:257-68)確立的。就本發(fā)明而言，纖維素分解酶活性通過測(cè)量在下述條件下由纖維素分解酶進(jìn)行的纖維素材料水解與未添加纖維素分解酶蛋白的對(duì)照水解相比較的增加來確定l-20mg的纖維素分解酶蛋白/g的PCS中纖維素在50°C進(jìn)行3-7日。通常條件為1ml反應(yīng)液，經(jīng)洗滌或未洗滌的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸鈉pH5，ImMMnSO4,50°C，72小時(shí)，通過AMINEXHPX-87H柱(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)進(jìn)行糖分析。內(nèi)切葡聚糖酶術(shù)語“內(nèi)切葡聚糖酶”意指內(nèi)切-1，4-(1,3;1，4)-@-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-3-D-glucan4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.I.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉(Iichenin)中的1，4-P-D-糖苷鍵、混合的￠-1,3葡聚糖如谷類P-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纖維素組分的其它植物材料中的P-1，4鍵的內(nèi)水解(endohydrolysis)。內(nèi)切葡聚糖酶活性可通過測(cè)量底物粘度的減少或由還原糖測(cè)定法(Zhang等，2006,BiotechnologyAdvances24:452-481)確定的還原端增加來確定。就本發(fā)明而言，根據(jù)Ghose,1987,PureandAppI.Chem.59:257-268的方法，在pH5，40°C，使用羧甲基纖維素(CMC)作為底物來確定內(nèi)切葡聚糖酶活性。纖維二糖水解酶術(shù)語“纖維二糖水解酶”意指1，4-P-D-葡聚糖纖維二糖水解酶(I,4-beta-D-glucancellobiohydrolase)(E.C.No.3.2.I.91)，其催化纖維素、纖維素寡糖，或任何包含￠-1,4-連接的葡萄糖的聚合物中的1，4-P-D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖(Teeri,1997，Crystallinecellulosedegradation:Newinsightintothefunctionofcellobiohydrolases,TrendsinBiotechnology15:160-167;Teeri等，1998，Trichodermareeseicellobiohydrolases:whysoefficientoncrystallinecellulose，Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。就本發(fā)明而言，根據(jù)Lever等，1972，Anal.Biochem.47:273-279;vanTilbeurgh等，1982，F(xiàn)EBSLetters149:152-156;vanTilbeurgh和Claeyssens，1985，F(xiàn)EBSLetters187:283-288;和Tomme等，1988，Eur.J.Biochem.170:575-581描述的方法在pH5，40°C來測(cè)定纖維二糖水解酶活性。在本發(fā)明中，Lever等的方法可用于評(píng)價(jià)玉米秸桿中纖維素的水解，而vanTilbeurgh等和Tomme等的方法可用于確定對(duì)突光性二糖衍生物4-甲基傘形基-D-乳糖苷的纖維二糖水解酶活性。P-葡糖苷酶術(shù)語“3-葡糖苷酶”意指P-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.No.3.2.I.21)，其催化末端非還原3-D-葡萄糖殘基的水解，并釋放P-D-葡萄糖。就本發(fā)明而言,根據(jù)Venturi等，2002，Extracellularbeta—D—glucosidasefromChaetomiumthermophilumvar.coprophilum:production,purificationandsomebiochemicalproperties,J.BasicMicrobiol.42:55-66描述的基本方法確定￠-葡糖苷酶活性。一個(gè)單位的￠-葡糖苷酶定義為在25°C，pH4.8，在含有0.01%TWEEN20的50mM檸檬酸鈉中從作為底物的ImM對(duì)硝基苯基-P-D-葡糖吡喃糖苷每分鐘產(chǎn)生I.0微摩爾對(duì)硝基苯酚陰離子。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽術(shù)語“具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽”意指催化具有纖維素分解活性的酶對(duì)纖維素材料水解的增強(qiáng)的GH61多肽。就本發(fā)明而言，通過測(cè)量由纖維素分解酶在下述條件下水解纖維素材料所導(dǎo)致的還原糖增加或纖維二糖與葡萄糖的總量增加來確定纖維素分解增強(qiáng)活性l_50mg總蛋白/gPCS中纖維素，其中總蛋白包含50-99.5%w/w的纖維素分解酶蛋白，及0.5-50%w/w的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽的蛋白質(zhì)，在50°C歷時(shí)1-7天，與用等量的總蛋白加載量而無纖維素分解增強(qiáng)活性(l-50mg纖維素分解蛋白/gPCS中纖維素)所進(jìn)行的對(duì)照水解相比。在一個(gè)優(yōu)選的方面，使用在總蛋白重量的2-3%的米曲霉￠-葡糖苷酶(根據(jù)WO02/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生)或者總蛋白質(zhì)量的2-3%的煙曲霉￠-葡糖苷酶(如WO2002/095014所述在米曲霉中重組產(chǎn)生)的纖維素酶蛋白加載量存在下的CELLUCLASTI.5L(NovozymesA/S,Bagsveerd,Denmark)的混合物作為纖維素分解活性的來源。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽通過降低達(dá)到相同水解程度所需的纖維素分解酶的量而增強(qiáng)由具有纖維素分解活性的酶催化的纖維素材料的水解，優(yōu)選降低至少1.01倍，更優(yōu)選至少I.05倍，更優(yōu)選至少I.10倍，更優(yōu)選至少I.25倍，更優(yōu)選至少I.5倍，更優(yōu)選至少2倍，更優(yōu)選至少3倍，更優(yōu)選至少4倍，更優(yōu)選至少5倍，甚至更優(yōu)選至少10倍，并且最優(yōu)選至少20倍。家族10糖苷水解酶術(shù)語“家族10糖苷水解酶”或“家族GH10”或“GH10”在本文中定義為根據(jù)HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities，Biochem.J.280:309-316,及HenrissatB.，和BairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696屬于糖苷水解酶家族10的多妝。家族61糖苷水解酶術(shù)語“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根據(jù)HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities，Biochem.J.280:309-316,及HenrissatB.,^BBairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696屬于糖苷水解酶家族61的多肽。^-木糖苷酶術(shù)語“^-木糖苷酶”意指P-D木糖苷木糖水解酶(P-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.I.37)，其催化短3(I—4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以從非還原端去除連續(xù)的D-木糖殘基。就本發(fā)明而言，一個(gè)單位的￠-木糖苷酶定義為在40°C，pH5從ImM對(duì)硝基苯基-P-D-木糖苷作為底物在含有0.01%TWEEN20的IOOmM檸檬酸鈉中每分鐘產(chǎn)生I.0iimol對(duì)硝基苯酚陰離子。乙酰木聚糖酯酶術(shù)語“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC3.I.I.72)，其催化乙酰基從聚合木聚糖、乙?；咎?、乙?；咸烟?、乙酸a-萘酯(alpha-napthylacetate)和乙酸對(duì)硝基苯酯(p-nitrophenylacetate)的水解。就本發(fā)明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用0.5mM乙酸對(duì)硝基苯酯作為底物，在含有0.01%TWEEN20的50mM乙酸鈉pH5.0中確定的。一個(gè)單位的乙酰木聚糖酯酶定義為能夠在pH5，25°C每分鐘釋放I微摩爾對(duì)硝基苯酹陰離子(p-nitrophenolateanion)的酶量。阿魏酸酯酶術(shù)語“阿魏酸酯酶(feruloylesterase)”意指4_輕基_3_甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC3.I.I.73)，其催化4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基團(tuán)從酯化的糖(其在“天然”底物中通常為阿拉伯糖)的水解，以產(chǎn)生阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也稱作阿魏酸酯酶(ferulicacidesterase)、FAE_III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。就本發(fā)明而言，阿魏酸酯酶是使用50mM乙酸鈉pH5.0中的0.5mM阿魏酸對(duì)硝基苯酯作為底物確定的。一個(gè)單位的阿魏酸酯酶活性等于能夠在pH5，25°C每分鐘釋放出IymoI對(duì)硝基苯酚陰離子的酶量。a-葡糖醛酸糖苷酶術(shù)語“a-葡糖醛酸糖苷酶”意指a-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronateglucuronohydrolaseactivity)(EC3.2.I.139),其催化a-D-葡糖醛酸糖苷水解為D-葡糖醛酸和醇。就本發(fā)明而言，a-葡糖醛酸糖苷酶活性是根據(jù)deVries,1998，J.Bacteriol.180:243-249確定的。一個(gè)單位的a-葡糖醛酸糖苷酶等于能夠在pH5，40°C每分鐘釋放出Iumol葡糖醛酸或4_0_甲基葡糖醛酸的酶量。a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶術(shù)語“a_L_阿拉伯呋喃糖苷酶活性”意指a_L_阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.I.55)，其催化對(duì)a-L-阿拉伯糖苷中的末端非還原性a-L-阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解。該酶對(duì)a-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)_和/或(1，5)-鍵的a-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也稱為阿拉伯糖苷酶、a-阿拉伯糖苷酶、a-L-阿拉伯糖苷酶、a-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或a-L-阿拉伯聚糖酶。就本發(fā)明而言，a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用總體積200V-I中的每ml的IOOmM乙酸鈉pH5中5mg的中等粘度小麥阿拉伯木聚糖(MegazymeInternationalIreland,Ltd.,Bray,Co.Wicklow,Ireland)在4CTC進(jìn)行30分鐘，接著通過AMINEXHPX-87H柱層析(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)的阿拉伯糖分析來確定的。纖維素材料纖維素材料可以是包含纖維素的任何材料。生物質(zhì)的初生細(xì)胞壁(primarycellwall)中的主要多糖是纖維素,其次最豐富的是半纖維素,而第三是果膠。次生細(xì)胞壁(secondarycellwall)在細(xì)胞停止生長(zhǎng)后產(chǎn)生,其同樣含有多糖并通過共價(jià)交聯(lián)至半纖維素的聚合木質(zhì)素而加強(qiáng)。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，并且因此是直鏈^-(1-4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)。盡管通常是多形的，存在于植物組織中的纖維素主要是平行葡聚糖鏈的不溶晶體基質(zhì)。半纖維素通常與纖維素以及其它半纖維素以氫鍵相連，其幫助穩(wěn)定細(xì)胞壁基質(zhì)。纖維素通常見于例如植物的莖、葉、殼、皮和穗軸，或樹的葉、枝和木材。纖維素材料可以是，但不限于，草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙和紙漿與造紙廠殘余物(參見，例如，Wiselogel等，1995，于HandbookonBioethanol(CharlesE.Wyman編),pp.105-118,Taylor&Francis,WashingtonD.C.;Wyman,1994,BioresourceTechnology50:3-16;Lynd,1990,AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25:695-719;Mosier等,,1999,RecentProgressinBioconversionofLignoceIlulosics,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,T.Scheper主編，Volume65,pp.23-40，Springer-Verlag,NewYork)。在本文中應(yīng)理解的是，纖維素可以是任何形式的木素纖維素，在混合基質(zhì)中包含木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的植物細(xì)胞壁材料。在一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素材料是木素纖維素。在一個(gè)方面，纖維素材料是草本材料。在另一個(gè)方面，纖維素材料是農(nóng)業(yè)殘余物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是林業(yè)殘余物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是城市固體廢物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是廢紙。在另一個(gè)方面，纖維素材料是紙漿和造紙廠殘余物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是玉米秸桿。在另一個(gè)方面，纖維素材料是玉米纖維。在另一個(gè)方面，纖維素材料是玉米穗軸。在另一個(gè)方面，纖維素材料是橙皮。在另一個(gè)方面，纖維素材料是稻桿。在另一個(gè)方面，纖維素材料是麥桿。在另一個(gè)方面，纖維素材料是柳枝稷(switchgrass)。在另一個(gè)方面，纖維素材料是芒草屬。在另一個(gè)方面，纖維素材料是甘蔗渣。在另一個(gè)方面，纖維素材料是微晶纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是細(xì)菌纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是藻類纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是棉線頭(cottonlinter)。在另一個(gè)方面，纖維素材料是無定形的磷酸處理的纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是濾紙。纖維素材料可以直接使用或進(jìn)行預(yù)處理，使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，如本文所述。在一個(gè)優(yōu)選的方面，預(yù)處理纖維素材料。預(yù)處理的玉米秸桿術(shù)語“PCS”或“預(yù)處理的玉米秸桿”意指通過用熱和稀硫酸處理的源自玉米秸桿的纖維素材料。含木聚糖材料術(shù)語“含木聚糖材料”在本文中定義為任何包含含有3-(1-4)連接木糖殘基骨架的植物細(xì)胞壁多肽的材料。陸生植物的木聚糖是具有￠-(1-4)-D-吡喃木糖骨架、具有短糖鏈分支的雜聚物。其包含D-葡糖醛酸或其4-0-甲基醚、L-阿拉伯糖和/或多種寡糖，包括D-木糖、L-阿拉伯糖，D-或L-半乳糖和D-葡萄糖。木聚糖類型的多糖可分為同木聚糖(homoxylan)和雜木聚糖(heteroxylan),其包括葡糖醒酸木聚糖，(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖，(葡糖醛酸)阿拉伯木聚糖，阿拉伯木聚糖和復(fù)合雜木聚糖(complexheteroxylan)參見例如Ebringerova等，2005，Adv.Polym.Sci.186:1-67。在本發(fā)明的方法中，可使用任何含木聚糖材料。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述含木聚糖材料是木素纖維素。分離的或純化的術(shù)語“分離的”或“純化的”意指從與其天然聯(lián)系的至少一種組分移去的多肽或多核苷酸。舉例而言，多肽如通過SDS-PAGE測(cè)定的，可為至少1%純，例如至少5%純，至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純，至少80%純，至少90%純，或至少95%純，而多核苷酸如通過瓊脂糖電泳測(cè)定的，可為至少1%純，例如至少5%純，至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純，至少80%純，至少90%純，或至少95%純。成熟多肽術(shù)語“成熟多肽”意指以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在的多肽，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一個(gè)方面，根據(jù)預(yù)測(cè)SEQIDNO:2的氨基酸I至19是信號(hào)肽的SignalP軟件(Nielsen等,1997,ProteinEngineering10:1_6),成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸20至398。本領(lǐng)域中已知宿主細(xì)胞可產(chǎn)生由相同多核苷酸表達(dá)的兩種或更多種不同成熟多肽的混合物(即，具有不同的C端和/或N端氨基酸)。成熟多肽編碼序列術(shù)語“成熟多肽編碼序列”意指編碼具有木聚糖酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一個(gè)方面，根據(jù)預(yù)測(cè)SEQIDNO:I的核苷酸I至57編碼信號(hào)肽的SignalP軟件(Nielsen等，1997，見上)，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:I的核苷酸58至1194。在另一個(gè)方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:I的核苷酸58至1194的基因組DNA序列。序列同一性參數(shù)“序列同一性”描述兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsGenet.16:276-277),優(yōu)選3.0.0版或更高版本的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，J.Mol.Biol.48:443-453)來測(cè)定。使用的可選參數(shù)為缺口罰分(gappenalty)10,缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為“最高同一性(longestidentity)”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為同一性百分比，并計(jì)算如下(同樣的殘基X100)/(比對(duì)長(zhǎng)度一比對(duì)中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個(gè)核苷酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,見上文)，優(yōu)選3.0.0版或更高版本的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，見上文)來測(cè)定。使用的可選參數(shù)為缺口罰分10，缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為“最高同一性”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為同一性百分比，并計(jì)算如下(同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對(duì)長(zhǎng)度一比對(duì)中缺口的總數(shù))片段術(shù)語“片段”意指從成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的多肽；其中所述片段具有木聚糖酶活性。在一個(gè)方面，片段含有至少320個(gè)氨基酸殘基，例如至少340個(gè)氨基酸殘基，或至少360個(gè)氨基酸殘基。亞序列術(shù)語“亞序列(subsequence)”意指從成熟多肽編碼序列的5’和/或3’端缺失一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))核苷酸的多核苷酸；其中所述亞序列編碼具有木聚糖酶活性的片段。在一個(gè)方面，亞序列含有至少960個(gè)核苷酸,例如至少1020個(gè)核苷酸或至少1080個(gè)核苷酸。等位變體(allelicvariant):術(shù)語“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或更多種(幾種)可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。編碼序列術(shù)語“編碼序列”意指直接指定多肽氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或其他起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的多核苷酸。cDNA:術(shù)語“cDNA”意指能夠通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核細(xì)胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級(jí)的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列的包括剪接的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。核酸構(gòu)建體術(shù)語“核酸構(gòu)建體”意指分離自天然存在的基因，或受修飾以本來不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式含有核酸的區(qū)段的的單鏈或雙鏈的核酸分子。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時(shí)，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達(dá)盒”同義。調(diào)控序列(controlsequence):術(shù)語“調(diào)控序列”意指包括對(duì)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達(dá)是必需的或有利的所有成分。各個(gè)調(diào)控序列對(duì)于編碼所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各個(gè)調(diào)控序列對(duì)于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號(hào)。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點(diǎn)的接頭一起提供，所述特異性限制位點(diǎn)促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的多核苷酸編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接術(shù)語“可操作地連接”意指這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對(duì)于多核苷酸的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。表達(dá)術(shù)語“表達(dá)”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達(dá)載體術(shù)語“表達(dá)載體”意指線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達(dá)的額外核苷酸可操作地連接。宿主細(xì)胞“宿主細(xì)胞”意指任何細(xì)胞類型，所述細(xì)胞類型對(duì)于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)。術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋親本細(xì)胞的任何后代，所述后代由于在復(fù)制中發(fā)生的突變而不同于親本細(xì)胞。變體術(shù)語“變體”抑制具有木聚糖酶活性的多肽，其包含改變，即在一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))位置的取代、插入和/或缺失一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸殘基。取代意指用另一個(gè)氨基酸取代占據(jù)位置的氨基酸；缺失意指去除占據(jù)位置的氨基酸；而插入意指鄰接于占據(jù)位置的氨基酸添加一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸，例如1-5個(gè)氨基酸。發(fā)明詳述具有木聚糖酶活性的多肽本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性的分離的多肽，所述多肽選自下組(a)多肽，與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少65%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中等嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少65%序列同一性；(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有木聚糖酶活性的片段。本發(fā)明涉及分離的多肽，所述分離的多肽具有與SEQIDN0:2的成熟多肽至少65%,例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性，所述多肽具有木聚糖酶活性。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽與SEQIDNO:2的成熟多肽相差不超過十個(gè)氨基酸，例如相差五個(gè)氨基酸，相差四個(gè)氨基酸，相差三個(gè)氨基酸，相差兩個(gè)氨基酸，和相差一個(gè)氨基酸。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體；或由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體組成；或?yàn)槠渚哂心揪厶敲富钚缘钠?。在另一個(gè)方面，所述多肽包含SEQIDNO:2的成熟多肽，或由SEQIDN0:2的成熟多肽組成。在另一個(gè)優(yōu)選方面，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸20至398，或由SEQIDNO:2的氨基酸20至398組成。本發(fā)明還涉及具有木聚糖酶活性的分離的多肽，所述分離的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常低嚴(yán)格條件，低嚴(yán)格條件，中等嚴(yán)格條件，中-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件或非常高嚴(yán)格條件下，與以下雜交(i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)0SEQIDNO:I的多核苷酸或其亞序列，以及SEQIDNO:2的氨基酸序列或其片段，可用于設(shè)計(jì)核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬和種的菌株鑒定和克隆編碼具有木聚糖酶活性的多肽的DNA。具體而言，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組DNA或cDNA雜交，以鑒定和從其中分離相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長(zhǎng)度上應(yīng)為至少14,例如至少25,至少35,或至少70個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，所述核酸探針是至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，例如，至少200個(gè)核苷酸，至少300個(gè)核苷酸，至少400個(gè)核苷酸，至少500個(gè)，至少600個(gè)核苷酸，至少700個(gè)核苷酸，至少800個(gè)核苷酸，或至少900個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標(biāo)記以探測(cè)相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標(biāo)記)。這些探針涵蓋于本發(fā)明中。可從由這些其它生物體制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有木聚糖酶活性的多肽?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術(shù)分離來自這些其它生物體的基因組或其它DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDN0:1或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料優(yōu)選用在Sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示多核苷酸在非常低至非常高的嚴(yán)格條件下與標(biāo)記的核酸探針雜交，所述核酸探針對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:I；SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列；SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列；其全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；或它們的亞序列?？墒褂美鏧射線片(X-rayfilm)檢測(cè)在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個(gè)方面，核酸探針是SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列或其基因組DNA序列。在另一個(gè)方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2的多肽或其成熟多肽的多核苷酸，或其片段的多核苷酸。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:I或其基因組DNA序列。在另一個(gè)方面，核酸探針是包含在大腸桿菌(E.Coli)NRRLB-50309中的質(zhì)粒pTF12Xyll70中含有的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列編碼具有木聚糖酶活性的多肽。在另一個(gè)方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50309中的質(zhì)粒pTF12Xyll70中含有的成熟多肽編碼區(qū)。對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，將非常低至非常高的嚴(yán)格條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對(duì)于非常低和低嚴(yán)格性為25%的甲酰胺、對(duì)于中和中-高嚴(yán)格性為35%的甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán)格性為50%的甲酰胺,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法進(jìn)行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時(shí)。使用2XSSC、0.2%SDS至少在45°C(非常低嚴(yán)格性)，至少在50°C(低嚴(yán)格性)，至少在55°C(中嚴(yán)格性)，至少在60°C(中-高嚴(yán)格性)，至少在65°C(高嚴(yán)格性)，至少在70V(非常高嚴(yán)格性)將載體材料最終洗滌三次,每次15分鐘。對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，將嚴(yán)格條件定義為在比根據(jù)Bolton和McCarthy計(jì)算法(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:1390)得出的Tm低大約5°C至大約10°C，在0.9MNaCl,0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA，0.5%NP_40，IXDenhardt溶液，ImM焦憐酸鈉(sodiumpyrophosphate),ImM憐酸二氫鈉(sodiummonobasicphosphate),0.ImMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟進(jìn)行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時(shí)。將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中最終洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計(jì)算的Tm低5°C至I(TC的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。本發(fā)明還涉及由多核苷酸編碼的具有木聚糖酶活性的分離的多肽，所述多核苷酸與SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列或其基因組DNA序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%,至少97%，至少98%，至少99%或100%的序列同一性。本發(fā)明還涉及SEQIDN0:2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。優(yōu)選地，氨基酸改變對(duì)性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature),即保守的氨基酸取代或插入,其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為I至大約30個(gè)氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進(jìn)純化的小延伸，如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)。保守取代的實(shí)例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.Neuratt^PR.L.Hill,1979,于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly?？晒┻x擇的是，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)使多肽的物理化學(xué)性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改進(jìn)多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適pH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法,例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells,1989，Science244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個(gè)殘基，并且測(cè)試所得突變分子的木聚糖酶活性以鑒定對(duì)于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而測(cè)定，如通過以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，連同推導(dǎo)的接觸位點(diǎn)氨基酸的突變來測(cè)定。參見例如deVos等，1992，Science255:306-312;Smith等，1992,J.Mol.Biol.224:899-904;Wlodaver等，1992,FEBSLett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能夠從與多肽的同一丨丨生分析來推斷，所述多肽與親本多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；W095/17413;或冊(cè)95/22625公開的那些方法來進(jìn)行并測(cè)試單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。能夠使用的其它方法包括易錯(cuò)PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991,Biochemistry30:10832-10837;美國(guó)專利No.5，223，409；WO92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46:145；Ner等，1988，DNA7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動(dòng)化的篩選方法組合以檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。能夠從宿主細(xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法快速測(cè)序。這些方法允許快速測(cè)定多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性。SEQIDN0:2的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)不多于10，例如1，2,3，4，5，6，7，8或9。所述多肽可為雜合多肽，其中一種多肽的一部分融合于另一種多肽的一部分的N端或C端。所述多肽可為融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一種多肽融合于本發(fā)明多肽的N端或C端。通過將編碼另一個(gè)多肽的多核苷酸融合于本發(fā)明的多核苷酸來產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們?cè)陂喿x框中，并且使融合多肽的表達(dá)在相同啟動(dòng)子和終止子的控制下。融合蛋白亦可使用內(nèi)蛋白(intein)技術(shù)構(gòu)建,其中融合物在翻譯后產(chǎn)生(Cooper等，1993，EMBOJ.12:2575-2583;Dawson等，1994，Science266:776-779)。融合多肽還可以包含在兩個(gè)多肽之間的切割位點(diǎn)。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位點(diǎn)，釋放所述兩個(gè)多肽。切割位點(diǎn)的實(shí)例包括，但不限于，公開于Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76;Svetina等，2000，J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等，1995，Biotechnology13:498-503;和Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381；Eaton等，1986，Biochem.25:505-512);Collins_Racie等，1995，Biotechnology13:982-987;Carter等，1989，Proteins:Structure，F(xiàn)unction，andGenetics6:240-248；以及Stevens，2003，DrugDiscoveryWorld4:35-48中的位點(diǎn)。具有木聚糖酶活性的多肽的來源本發(fā)明的具有木聚糖酶活性的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語“獲得自”，意思是多核苷酸編碼的多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的多核苷酸的菌株產(chǎn)生。在一個(gè)方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。所述多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可以是具有木聚糖酶活性的革蘭氏陽性細(xì)菌多肽例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、腸球菌屬(Enterococcus)、地芽抱桿菌屬(Geobacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、海洋芽抱桿菌屬(Oceanobacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)多肽；或革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如彎曲桿菌屬(Campylobacter)、大腸桿菌(E.coli)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、螺桿菌屬(Helicobacter)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)或脲原體屬(Ureaplasma)屬多妝。在一個(gè)方面，所述多肽是嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽抱桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽抱桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽抱桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽抱桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽抱桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽抱桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽抱桿菌(Bacillusthuringiensis)多月太。在另一個(gè)方面，所述多肽是似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞種(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多月太。在另一個(gè)方面，所述多肽是不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍(lán)鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(StreptomycesIividans)多月太。所述多肽也可以是真菌多肽。例如，所述多肽可為酵母多肽如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓄霉屬(Yarrowia)多肽；或絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria^擬錯(cuò)菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、Claviceps^Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium、德抱屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、把齒菌屬(Irpex)、蘑燕屬(Lentinula)、Leptospaeria、梨抱菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孑L菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假黑盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha^根毛霉屬(Rhizomucor)、裂糟菌屬(Schizophyllum)、柱頂抱屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長(zhǎng)毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳燕屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽。在另一個(gè)方面，所述多肽是卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是解纖維枝頂孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、Chrysosporiuminops、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、Chrysosporiummerdarium^lS^Jfe^^(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiumzonatum、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(FusariumcuImorum)、禾本科德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)、白把齒菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糖脈抱菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、無色梭抱殼(Thielaviaachromatica)、Thielaviaalbomyces>Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼(Thielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimeti、小抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱殼(Thielaviaovispora)>Thielaviaperuviana、毛梭抱殼(Thielaviasetosa)、瘤抱梭抱殼(Thielaviaspededonium)、Thielaviasubthermophila、土生梭抱霉(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長(zhǎng)枝木霉(TrichodermaIongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)多肽。在另一個(gè)方面，所述多肽是具有木聚糖酶活性的褐孢長(zhǎng)毛盤菌多肽。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述多肽是具有木聚糖酶活性的褐孢長(zhǎng)毛盤菌CBS804.70多肽，例如包含SEQIDNO:2的成熟多肽的多肽。可理解的是對(duì)于前述的種，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates),和其它分類學(xué)的等同物(equivalent),例如無性型(anamorph),而無論它們已知的種名。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將容易地識(shí)別適合的等同物的同一性。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對(duì)于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSMZ)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)?？梢允褂蒙鲜龅奶结槒钠渌鼇碓矗◤淖匀唤?例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得所述多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選另一種微生物的基因組DNA或cDNA文庫或混合的DNA樣品來獲得編碼所述多肽的多核苷酸。一旦用所述探針檢測(cè)到編碼多肽的多核苷酸，就能夠使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)分離或克隆所述多核苷酸(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。多核苷酸本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^例如使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或表達(dá)文庫的抗體篩選來檢測(cè)具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段，從而實(shí)現(xiàn)從這種基因組DNA克隆多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸擴(kuò)增方法,如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于多核苷酸的擴(kuò)增(NASBA)?？梢詮腡richophaea菌株，或相關(guān)生物體克隆多核苷酸，并且因此可為例如所述多核苷酸的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發(fā)明還涉及包含下述多核苷酸或由下述多核苷酸組成的分離的多核苷酸，所述多核苷酸與SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列或基因組DNA序列具有至少65%，例如至少70%,至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%的序列同一性程度，其編碼具有木聚糖酶活性的多肽。修飾編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸對(duì)于合成與所述多肽基本上相似的多肽可為必需的。術(shù)語與所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適PH等方面不同的變體?？梢栽谧鳛镾EQIDNO:I的多肽編碼序列或其基因組DNA序列存在的多核苷酸，例如其亞序列的基礎(chǔ)上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構(gòu)建變體所述取代不導(dǎo)致多肽氨基酸序列的改變，但是符合意欲產(chǎn)生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產(chǎn)生不同的氨基酸序列。關(guān)于核苷酸取代的概述，參見，例如，F(xiàn)ord等，1991，ProteinExpressionandPurification2:95_107。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在非常低嚴(yán)格條件，低嚴(yán)格條件，中等嚴(yán)格條件，中-高嚴(yán)格條件，高嚴(yán)格條件或非常高嚴(yán)格條件下，與以下序列雜交(i)SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列，(ii)或SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，見上文)，如本文所定義的。在一個(gè)方面，所述多核苷酸包含SEQIDN0:1,SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列，或大腸桿菌NRRLB-50309中所含的質(zhì)粒pTF12Xyll70中包含的序列，或編碼SEQIDNO:2具有木聚糖酶活性的片段的SEQIDNO:I亞序列，如SEQIDNO:I核苷酸58至1194的多核苷酸，或者由SEQIDNO:1，SEQIDNOil的成熟多肽編碼序列，或大腸桿菌NRRLB-50309中所含的質(zhì)粒pTF12Xyll70中包含的序列，或編碼SEQIDNO:2具有木聚糖酶活性的片段的SEQIDNO:I亞序列，如SEQIDNO:I核苷酸58至1194的多核苷酸組成。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸與一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細(xì)胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)?？梢杂迷S多方式操作所述多核苷酸以提供多肽的表達(dá)。依賴于表達(dá)載體，在將多核苷酸插入載體之前對(duì)其進(jìn)行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。調(diào)控序列可為啟動(dòng)子序列，其是由用于表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞所識(shí)別的多核苷酸。啟動(dòng)子序列含有介導(dǎo)多肽的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是在所選的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于在細(xì)菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下述獲得的啟動(dòng)子解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、大腸桿菌Iac操縱子、天藍(lán)鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)和原核￠-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731)，以及tac啟動(dòng)子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25)o另夕卜的啟動(dòng)子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria〃于Gilbert等，1980，ScientificAmerican,242:74-94中；和在Sambrook等，1989，見上文中描述。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下列酶的基因獲得的啟動(dòng)子構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(W000/56900)、鑲片鐮孢Quinn(W000/56900)、曼赫根毛霉脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉3-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉P-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動(dòng)子(一種修飾的啟動(dòng)子，其來自在曲霉屬中編碼中性a-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由在曲霉屬中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代；非限制性實(shí)例包括修飾的啟動(dòng)子，其來自在黑曲霉中編碼中性a-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由在構(gòu)巢曲霉和米曲霉中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子。在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞其它有用的啟動(dòng)子由Romanos等，1992，Yeast8:423-488描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄。所述終止子序列與編碼所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地連接。可以將在所選宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉a-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見上文描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，當(dāng)被轉(zhuǎn)錄時(shí)其為對(duì)于宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的多核苷酸的5’-末端?？墒褂迷谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母a因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與多核苷酸的3’末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時(shí)，宿主細(xì)胞將其識(shí)別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號(hào)?？墒褂迷谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉a-葡糖苷酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.15:5983-5990描述。調(diào)控序列還可以是信號(hào)肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的N端相連的信號(hào)肽，并且指導(dǎo)所述多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。多核苷酸的編碼序列5’端可固有地包含信號(hào)肽編碼序列，其與編碼所述多肽的編碼區(qū)片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?？晒┻x擇的是，編碼序列5’端可含有對(duì)于所述編碼序列異源的信號(hào)肽編碼序列。異源信號(hào)肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號(hào)肽編碼序列時(shí)可為必需的。或者，外源信號(hào)肽編碼序列可以簡(jiǎn)單地取代天然信號(hào)肽編碼序列以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，可使用指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號(hào)肽編碼序列。對(duì)于細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌￠-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號(hào)肽由Simonen和Palva,1993,MicrobiologicalReviews57:109-137描述。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的信號(hào)肽從釀酒酵母a因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號(hào)肽編碼序列由Romanos等，1992，見上文描述。調(diào)控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽N端的前肽。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的，并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化為活性多肽。可以從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和釀酒酵母a因子的基因獲得前肽編碼序列。當(dāng)信號(hào)肽和前肽序列二者均出現(xiàn)在多肽的N端時(shí)，將前肽序列置于緊接著(nextto)多肽N端，并且將信號(hào)肽序列置于緊接著前肽序列的N端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)來調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是引起基因表達(dá)響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶、啟動(dòng)子TAKAa-淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子。調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的多核苷酸將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。多種核苷酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))方便的限制位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的多核苷酸?？晒┻x擇的是，可以通過在適當(dāng)?shù)挠糜诒磉_(dá)的載體中插入包含所述序列的多核苷酸或核酸構(gòu)建體來表達(dá)所述多核苷酸。在制備表達(dá)載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生多核苷酸的表達(dá)。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)?；蛘撸d體可以是一種當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外,可以使用單獨(dú)的載體或質(zhì)?；騼蓚€(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細(xì)胞基因組的完整DNA(totalDNA),或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。所述載體優(yōu)選地含有一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))選擇性標(biāo)記，其允許簡(jiǎn)單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對(duì)重金屬的抗性、對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標(biāo)記，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素或四環(huán)素抗性。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞合適的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPI和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷_5’_憐酸脫羧酶)(orotidine_5’-phosphatedecarboxylase)>sC(硫酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。所述載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細(xì)胞基因組或載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組的自主復(fù)制。為了整合入宿主細(xì)胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以含有額外的多核苷酸，用于指導(dǎo)通過同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10，000堿基對(duì)，400至10，000堿基對(duì)，和800至10，000堿基對(duì)，其與相應(yīng)的目標(biāo)序列具有高度序列同一性以增強(qiáng)同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源。此夕卜，整合元件可以是非編碼或編碼的多核苷酸。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含復(fù)制起點(diǎn)，其使載體能夠在所述的宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(replicator),其在細(xì)胞中發(fā)揮功能。術(shù)語“復(fù)制起點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制子”意指能夠使質(zhì)?；蜉d體體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和PAM^I的復(fù)制起點(diǎn)。用于酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)，ARS1,ARS4,ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsRes.15:9163-9175;W000/24883)。分離AMAl基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)粒或載體能夠根據(jù)公開于WO00/24883中的方法完成?？梢詫⒍嘤谝粋€(gè)拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細(xì)胞以增加多肽的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得將至少一個(gè)額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組，或?qū)⒖蓴U(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因包括于多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來選擇含有選擇性標(biāo)記基因的擴(kuò)增拷貝，且由此含有多核苷酸的額外拷貝的細(xì)胞。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的多核苷酸可操作地連接于一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))指導(dǎo)本發(fā)明多肽的產(chǎn)生的調(diào)控序列。將包含多核苷酸的構(gòu)建體或載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使構(gòu)建體或載體如前所述作為染色體整體或者作為自復(fù)制的染色體外載體維持。術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括親本細(xì)胞的任何后代，其由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變而不同于親本細(xì)胞。宿主細(xì)胞的選擇將在很大程度上依賴于編碼多肽的基因及其來源。宿主細(xì)胞可以是在本發(fā)明的多肽的重組產(chǎn)生中有用的任何細(xì)胞，例如，原核或真核細(xì)胞。原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽性細(xì)菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、地芽孢桿菌屬、乳酸菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬和鏈霉菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于，彎曲桿菌屬、大腸桿菌、黃桿菌屬、梭桿菌屬、螺桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬和脲原體屬。細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌屬細(xì)胞，包括但不限于嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞，包括但不限于，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞，包括但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細(xì)胞?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，使用感受態(tài)細(xì)胞(參見，例如，Young和Spizizen,1961，J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221),電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(參見，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通過如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Hanahan,1983，J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見，例如，Dower等,1988,NucleicAcidsRes.16:6127-6145)。可通過如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004,FoliaMicrobiol.(Praha)49:399-405)，接合(參見,例如,Mazodier等，1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細(xì)胞例如電穿孔(參見，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通過如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細(xì)胞例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，電穿孑L(參見，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(參見，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而,可以使用本領(lǐng)域已知的將DNA引入宿主細(xì)胞的任何方法。宿主細(xì)胞還可以是真核生物，如哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物或真菌細(xì)胞。宿主細(xì)胞可為真菌細(xì)胞?！罢婢庇迷诒疚陌ㄒ韵麻T子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisbyjsDictionaryofTheFungi,第8版，1995，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等,1995,見上文)。真菌宿主細(xì)胞可為酵母細(xì)胞?！敖湍浮庇迷诒疚陌óa(chǎn)子囊酵母(ascospOTogenousyeast)(內(nèi)抱霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母(basidiosporogenousyeast)和屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽孢綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9，1980)中所述。酵母宿主細(xì)胞可為假絲酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細(xì)胞，如卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母、卵形酵母、乳酸克魯維酵母(KluyveromycesIactis)或解脂西洋蓍霉(YarrowiaIipolytica)細(xì)胞。真菌宿主細(xì)胞可為絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995，見上文,所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)通過單細(xì)胞菌體的出芽生殖(budding)進(jìn)行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。絲狀真菌宿主細(xì)胞可為枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬臘菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂裙菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細(xì)胞。絲狀真菌宿主細(xì)胞可為泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)、干擬臘菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬臘菌(Ceriporiopsissubvermispora)、Chrysosporiuminops、嗜角質(zhì)金抱子菌、Chrysosporiumlucknowense、Chrysosporiummerdarium、租金抱子菌、Chrysosporiumqueenslandicum、熱帶金抱子菌、Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、福射射脈菌(Phlebiaradiata)、刺療側(cè)耳(Pleurotuseryngii)、土生梭抱霉、長(zhǎng)絨毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細(xì)胞。可以將真菌細(xì)胞通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁重建的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的合適方法在EP238023，Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474和Christensen等,1988,Bio/Technology6:1419-1422中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I(xiàn)描述的方法轉(zhuǎn)化酵母Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volumel94,pp182—187，AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等,1983,J.Bacteriol.153:163；和Hinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920。產(chǎn)生方法本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是Trichophaea屬的細(xì)胞。在一個(gè)更優(yōu)選的方面,所述細(xì)胞為褐孢長(zhǎng)毛盤菌。在一個(gè)最優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是褐孢長(zhǎng)毛盤菌CBS804.70。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，和實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開的組成制備(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌，則其能夠從細(xì)胞裂解物(lysate)回收?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對(duì)于所述多肽是特異性的方法來檢測(cè)多肽。這些檢測(cè)方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(yàn)(enzymeassay)可用于測(cè)定多肽的活性。多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規(guī)方法從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson和LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。在一個(gè)可選的方面，不回收多肽，而將表達(dá)多肽的本發(fā)明宿主細(xì)胞作為多肽的來源。植物本發(fā)明還涉及分離的植物，例如，轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸，從而以可回收的量表達(dá)和產(chǎn)生所述多肽。多肽可從植物或植物部分回收?；蛘撸瑯涌梢詫⒑兴龆嚯牡闹参锘蛑参锊糠钟糜诟倪M(jìn)食品或飼料的質(zhì)量，例如，改進(jìn)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、適口性(palatability)和流變性質(zhì)(rheologicalproperties),或用于破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實(shí)例是草(grasses),如草地早熟禾(meadowgrass)(藍(lán)草(bluegrass)，早熟禾屬(Poa));飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium);寒地型牧草(temperategrass),如Agrostis(翦股穎屬)；和谷類,例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實(shí)例是煙草(tobacco),豆類(legumes),如羽扇豆(lupins),馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet),豌豆,豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(familyBrassicaceae)),如花椰菜(cauliflower),油菜桿(rapeseed)和緊密相關(guān)的模型生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。植物部分的實(shí)例是莖(stem)、愈傷組織(callus)、葉(leaf)、根(root)、果實(shí)(fruit)、種子(seed)和塊莖(tuber),以及包含這些部分的獨(dú)立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyme)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。具體的植物細(xì)胞區(qū)室(compartments),如葉綠體(chloroplast)、質(zhì)外體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過氧化物酶體(peroxisome)和細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)也被認(rèn)為是植物部分。此外，任何植物細(xì)胞，無論什么組織來源，都被認(rèn)為是植物部分。同樣地，植物部分，如分離以促進(jìn)本發(fā)明的應(yīng)用的具體組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)。同樣包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的還有這些植物、植物部分和植物細(xì)胞的后代。表達(dá)多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞可以依照本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建。簡(jiǎn)而言之，通過如下方法構(gòu)建所述植物或植物細(xì)胞將編碼多肽的一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))表達(dá)構(gòu)建體并入植物宿主基因組或葉綠體基因組，并且將所得的修飾植物或植物細(xì)胞繁殖為轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。表達(dá)構(gòu)建體便利地是包含編碼多肽的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達(dá)該多核苷酸所需的適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列可操作地連接。此外，表達(dá)構(gòu)建體可以包含對(duì)于鑒定宿主細(xì)胞有用的選擇性標(biāo)記，在所述宿主細(xì)胞中整合了表達(dá)構(gòu)建體和將該構(gòu)建體引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依賴于使用的DNA引入方法)。調(diào)節(jié)序列的選擇，例如啟動(dòng)子和終止子序列和任選地信號(hào)或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的選擇，舉例來說，基于期望何時(shí)、何處以及如何表達(dá)多肽而確定。例如，編碼多肽的基因的表達(dá)可以是組成型的或誘導(dǎo)型的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以靶向特定的組織或植物部分例如種子或葉。調(diào)節(jié)序列由例如Tague等，1988，PlantPhysiology86:506所述。對(duì)于組成性表達(dá)，可以使用35S_CaMV、玉米泛素I和稻肌動(dòng)蛋白I啟動(dòng)子(Franck等，1980，Cell21:285-294，Christensen等，1992，PlantMo.Biol.18:675-689；Zhang等，1991，PlantCell3:1155-1165)。器官特異性啟動(dòng)子可以是例如來自貯藏庫組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊莖和果實(shí)的啟動(dòng)子(Edwards和Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或來自代謝庫組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動(dòng)子(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863-878),種子特異性啟動(dòng)子諸如來自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動(dòng)子(Wu等，1998，PlantCellPhysiol.39:885-889),來自豆球蛋白(Iegumin)B4和蠶豆(Viciafaba)的未知的種子蛋白基因的蠶豆啟動(dòng)子(Conrad等，1998，J.ofPlantPhysiol.152:708-711)、來自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動(dòng)子(Chen等，1998，PlantCellPhysiol.39:935-941),來自歐洲油菜(Brassicanapus)的忙藏蛋白napA啟動(dòng)子，或本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的任何其他種子特異性的啟動(dòng)子，例如，在WO91/14772中所描述的。此外，啟動(dòng)子可為葉特異性的啟動(dòng)子，如來自稻或番爺?shù)膔bcs啟動(dòng)子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiology102:991-1000),小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動(dòng)子(Mitra和Higgins,1994，PlantMol.Biol.26:85-93)，或來自稻的aldP基因啟動(dòng)子(Kagaya等，1995,Mol.Gen.genet.248:668-674)，或傷口誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如馬鈴薯pin2啟動(dòng)子(Xu等，1993，PlantMol.Biol.22:573-588)。同樣地，所述啟動(dòng)子可通過非生物的處理誘導(dǎo)，所述非生物的處理諸如溫度、干旱或鹽度變化，或通過外源施加的激活所述啟動(dòng)子的物質(zhì)誘導(dǎo)，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脫落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellicacid),和重金屬。啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件也可以用于實(shí)現(xiàn)多肽在植物中的較高表達(dá)。例如，啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件可以是內(nèi)含子，其置于啟動(dòng)子和編碼多肽的多核苷酸之間。例如Xu等，1993，見上，公開了使用稻肌動(dòng)蛋白I基因的第一內(nèi)含子以增強(qiáng)表達(dá)。選擇性標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其它部分可以選自本領(lǐng)域內(nèi)可用的那些。將核酸構(gòu)建體根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)并入植物基因組，所述常規(guī)技術(shù)包括土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化和電穿孔(Gasser等，1990，Science244:1293；Potrykus,1990,Bio/Technology8:535；Shimamoto等,1989,Nature338:274)。目前，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(genetransfer),是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(為了參考，見Hooykas和Schilperoort,1992，PlantMol.Biol.19:15-38)，而且它也可以用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，雖然對(duì)于這些植物其他的轉(zhuǎn)化方法是常用的。目前，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的優(yōu)選的方法，是用粒子(用轉(zhuǎn)化DNA涂覆的微觀的金或鶴粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發(fā)育中的胚(developingembryos)(Christou,1992,PlantJ.2:275-281；Shimamoto,1994,CurrentOpin.Biotech.5:158-162；VasiI等,1992,Bio/Technology10:667-674)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的可供選擇的方法是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,如由Omirulleh等，1993，PlantMol.Biol.21:415-428所描述的。其他用于依照本公開使用的轉(zhuǎn)化方法包括那些描述于美國(guó)專利6，395，966和7，151，204的那些(兩者均通過全文提述并入本文)。轉(zhuǎn)化之后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法選擇具有并入的表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并且再生成為完整植物。通常設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化方法用于通過如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性消除選擇基因例如，使用帶有兩個(gè)獨(dú)立的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或通過特異性重組酶位點(diǎn)特異性地切除選擇基因。除了直接用根據(jù)本發(fā)明制備的構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化具體植物基因型之外，還可通過將植物與缺乏該構(gòu)建體的第二植物雜交來制備轉(zhuǎn)基因植物。舉例而言，可將編碼的多肽的構(gòu)建體通過雜交而引入特定植物品種，而根本無需直接轉(zhuǎn)化該給定品種的植物。因此，本發(fā)明不僅涵蓋從依照本發(fā)明經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞直接再生的植物，還包括此類植物的后代(progeny)。如用于本文，后代可指依照本發(fā)明制備的親本植物任何世代的后裔(offspring)。此種后代可包含依據(jù)本發(fā)明制備的DNA構(gòu)建體，或依據(jù)本發(fā)明制備的DNA構(gòu)建體的一部分。雜交導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因通過將起始種系與供體植物種系交叉授粉而引入植物種系。此類步驟的非限制性實(shí)例進(jìn)一步闡述于美國(guó)專利7，151，204號(hào)。植物可通過回交轉(zhuǎn)化方法生成。舉例而言，植物包括稱作回交轉(zhuǎn)化的基因型、種系、近交體(inbred)或雜交體(hybrid)的植物?？墒褂眠z傳標(biāo)記以協(xié)助本發(fā)明的一種或多種轉(zhuǎn)基因從一個(gè)遺傳背景基因滲入(introgression)至另一個(gè)。標(biāo)記協(xié)助的選擇提供了相對(duì)于常規(guī)育種的優(yōu)勢(shì)，在于其可用于避免由表型變異導(dǎo)致的錯(cuò)誤。進(jìn)一步，遺傳標(biāo)記可在特定雜交的個(gè)體后代中提供有關(guān)良種種質(zhì)相對(duì)程度的數(shù)據(jù)。舉例而言，當(dāng)本不(otherwise)具有非農(nóng)藝學(xué)所需的遺傳背景但具有所需性狀的植物與良種親本雜交時(shí)，可使用遺傳標(biāo)記來選擇不僅具有目標(biāo)性狀，還具有相對(duì)較大比例所需種質(zhì)的后代。以此方式，使一種或多種性狀基因滲入特定遺傳背景所需的世代數(shù)得到最小化。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)包含編碼所述多肽的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。去除或減少木聚糖酶活性本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生親本細(xì)胞突變體的方法，其包括破壞或缺失編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸或其部分，所述方法導(dǎo)致在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，與親本細(xì)胞相比突變的細(xì)胞產(chǎn)生較少的所述多肽?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的方法(例如，插入、破壞、替代或缺失)通過減少或消除多核苷酸的表達(dá)來構(gòu)建突變細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多核苷酸是失活的。待修飾或失活的多核苷酸可以是，例如，編碼區(qū)或其對(duì)活性關(guān)鍵的部分，或表達(dá)編碼區(qū)所需的調(diào)節(jié)元件。這種調(diào)節(jié)或調(diào)控序列的實(shí)例可以是啟動(dòng)子序列或其功能部分，即，足以影響多核苷酸表達(dá)的部分。用于可能的修飾的其它調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號(hào)肽序列、轉(zhuǎn)錄終止子和轉(zhuǎn)錄激活子。可以通過向親本細(xì)胞施以誘變，并且選擇其中已將多核苷酸的表達(dá)減少或消除的突變細(xì)胞來進(jìn)行多核苷酸的修飾或失活。誘變可能是特異性的或隨機(jī)的，可以通過例如使用合適的物理或化學(xué)誘變劑進(jìn)行，通過使用合適的寡核苷酸進(jìn)行，或通過將所述DNA序列進(jìn)行PCR產(chǎn)生的誘變。此外，可以通過使用這些誘變劑的任何組合來進(jìn)行誘變。適合于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的實(shí)例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、0_甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethylmethanesulphonate)(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。當(dāng)使用這些試劑時(shí)，通常通過如下方法來進(jìn)行所述誘變?cè)诤线m條件下存在優(yōu)選的誘變劑時(shí)溫育待誘變的親本細(xì)胞，并篩選和/或選擇顯示基因表達(dá)減少的或無基因表達(dá)的突變體細(xì)胞。通過導(dǎo)入、取代或去除基因中的一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))核苷酸或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)控元件可以實(shí)現(xiàn)所述多核苷酸的修飾或失活。例如，可以插入或去除核苷酸從而導(dǎo)致引入終止密碼子，去除起始密碼子，或改變開放閱讀框。按照本領(lǐng)域已知的方法通過定位誘變或PCR產(chǎn)生的誘變可以實(shí)現(xiàn)這種修飾或失活。盡管在理論上所述修飾可以在體內(nèi)進(jìn)行，即，直接在表達(dá)待修飾的多核苷酸的細(xì)胞上進(jìn)行，但優(yōu)選如下面所示例的那樣在體外進(jìn)行所述修飾。消除或減少多核苷酸表達(dá)的便利方式的例子是基于基因取代，基因缺失，或基因破壞的技術(shù)。例如，在基因破壞方法中，將相應(yīng)于內(nèi)源多核苷酸的核酸序列在體外進(jìn)行誘變以產(chǎn)生缺陷性的核酸序列，然后將其轉(zhuǎn)化入親本細(xì)胞中以產(chǎn)生缺陷基因。通過同源重組，所述缺陷性核酸序列替代了內(nèi)源多核苷酸。理想的是所述缺陷性多核苷酸還編碼標(biāo)記，其可用于選擇其中多核苷酸被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化子。在特別優(yōu)選的方面，用可選擇的標(biāo)記(如本文所述的那些)來破壞所述多核苷酸。本發(fā)明還涉及在細(xì)胞中抑制具有木聚糖酶活性的多肽的表達(dá)的方法，包括對(duì)細(xì)胞施用或在細(xì)胞中表達(dá)雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本發(fā)明的多核苷酸的亞序列。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述dsRNA長(zhǎng)度為約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個(gè)雙鏈體核苷酸。所述dsRNA優(yōu)選為小干擾RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述dsRNA是供抑制轉(zhuǎn)錄的小干擾RNA。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述dsRNA是供抑制翻譯的微RNA(miRNA)。本發(fā)明還涉及這樣的雙鏈RNA(dsRNA)分子，其包含SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列的一部分，以供在細(xì)胞中抑制所述多肽的表達(dá)。盡管本發(fā)明并不限于任何具體的作用機(jī)制，但dsRNA可進(jìn)入細(xì)胞并導(dǎo)致類似或相同序列的單鏈RNA(ssRNA)包括內(nèi)源mRNA的降解。當(dāng)細(xì)胞暴露于dsRNA時(shí)，來自同源基因的mRNA通過稱作RNA干擾(RNAi)的過程被選擇性降解。本發(fā)明的dsRNA可用于基因沉默。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的dsRNAi選擇性降解RNA的方法。該過程可在體外、離體或體內(nèi)實(shí)施。在一個(gè)方面，所述dsRNA分子可用于在細(xì)胞、器官或動(dòng)物中生成功能缺失(loss-of-function)的突變。用于制備和使用dsRNA分子以選擇性降解RNA的方法在本領(lǐng)域是公知的；參見，例如美國(guó)專利Nos.6，489，127,6,506，559,6,511，824和6，515，109號(hào)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及親本細(xì)胞的突變體細(xì)胞，其包含編碼多肽的多核苷酸或其調(diào)控序列的破壞或缺失，或沉默的編碼該多肽的基因，這導(dǎo)致與親本細(xì)胞相比突變體細(xì)胞產(chǎn)生更少的多肽或不產(chǎn)生多肽。多肽缺陷型突變細(xì)胞作為表達(dá)天然和異源多肽的宿主細(xì)胞特別有用。所以，本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)天然或異源多肽的方法，其包括(a)在有助于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)突變細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。術(shù)語“異源多肽”意指對(duì)宿主細(xì)胞不是天然的多肽，例如天然蛋白質(zhì)的變體。宿主細(xì)胞可包含多于一個(gè)拷貝的編碼天然或異源多肽的多核苷酸。用于培養(yǎng)和純化感興趣的產(chǎn)物的方法可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。本發(fā)明用于產(chǎn)生基本上無木聚糖酶的產(chǎn)物的方法在真核多肽，特別是真菌蛋白質(zhì)例如酶的產(chǎn)生中是特別令人有興趣的。木聚糖酶-缺陷細(xì)胞也可以用于表達(dá)在制藥上感興趣的異源蛋白質(zhì)如激素、生長(zhǎng)因子、受體等。術(shù)語“真核多肽”不僅包括天然多肽，也包括多肽例如酶，其通過氨基酸取代、缺失或添加或其它這樣的修飾而被修飾以增強(qiáng)活性、熱穩(wěn)定性、PH耐受性等。在一個(gè)另外的方面，本發(fā)明涉及基本上無木聚糖酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生。組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物。優(yōu)選地，所述組合物富含這種多肽。術(shù)語“富含”表示所述組合物的纖維二糖水解酶活性，例如，以至少I.I的富集因數(shù)(enrichmentfactor)增力口。所述組合物可以包含本發(fā)明的多肽作為主要酶成分，例如，單成分組合物?；蛘?，所述組合物可以包含多種酶活性，如一種或多種(幾種)選自下組的酶纖維素酶，半纖維素酶，棒曲霉素，酯酶，漆酶，木質(zhì)素分解酶，果膠酶，過氧化物酶，蛋白酶和膨脹素。可以依照本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法制備多肽組合物，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域內(nèi)已知方法使包含于組合物的多肽穩(wěn)定化。在下文中給出了本發(fā)明的多肽組合物的優(yōu)選用途。本發(fā)明的多肽組合物的劑量和使用所述組合物的其他條件可基于本領(lǐng)域已知方法確定。用途本發(fā)明還涉及使用具有木聚糖酶活性的多肽或其組合物的方法。本發(fā)明的多肽可用于降解或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞壁或任何含木聚糖材料，例如木素纖維素，其來源于植物細(xì)胞壁(參見，例如W02002/18561)。多種用途的實(shí)例如下所述。本發(fā)明的多肽的劑量和使用所述多肽的其他條件可基于本領(lǐng)域已知方法來確定。通過完全或部分去除側(cè)鏈(sidebranch)促進(jìn)了含木聚糖材料的酶法降解。本發(fā)明的多肽優(yōu)選與其他木聚糖降解酶如木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶及其組合在其中待降解含木聚糖材料的工藝中一同使用。舉例而言，可通過乙酰木聚糖酯酶去除乙?；鶊F(tuán)；通過α-阿拉伯糖苷酶去除阿拉伯糖基團(tuán)；通過阿魏酸酯酶去除阿魏?；鶊F(tuán)和通過α-葡糖醛酸糖苷酶去除葡糖醛酸基團(tuán)。由木聚糖酶，或由木聚糖酶和側(cè)鏈水解酶的組合釋放的寡聚物可由木糖苷酶進(jìn)一步降解為游離的木糖。本發(fā)明還涉及降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料或含木聚糖材料的方法，其包括在存在本發(fā)明的具有木聚糖酶活性的多肽的情況下，用酶組合物處理纖維素材料或含木聚糖材料。在一個(gè)優(yōu)選方面，所述方法還包括回收已降解或轉(zhuǎn)化的纖維素材料或含木聚糖材料。本發(fā)明還涉及供產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括(a)在存在本發(fā)明的具有木聚糖酶活性的多肽的條件下，用酶組合物糖化纖維素材料或含木聚糖材料；(b)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料或含木聚糖材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(C)從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及發(fā)酵纖維素材料或含木聚糖材料的方法，其包括用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料或含木聚糖材料，其中所述纖維素材料或含木聚糖材料是在存在具有木聚糖酶活性的多肽的條件下用酶組合物糖化的。在一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素材料或含木聚糖材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，方法進(jìn)一步包括從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明的方法可以用于將纖維素材料或含木聚糖材料糖化成可發(fā)酵糖，并且將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成很多有用的物質(zhì)，例如燃料、飲用乙醇和/或發(fā)酵產(chǎn)物(例如酸、醇、酮、氣體等)。從纖維素材料或含木聚糖材料產(chǎn)生期望的發(fā)酵產(chǎn)物通常涉及預(yù)處理、酶水解(糖化)和發(fā)酵。根據(jù)本發(fā)明的纖維素材料或含木聚糖材料的處理可以使用本領(lǐng)域的常規(guī)過程完成。此外，本發(fā)明的方法能使用經(jīng)配置以依照發(fā)明操作的任何常規(guī)生物質(zhì)處理設(shè)備進(jìn)行。水解(糖化)和發(fā)酵，分別或同時(shí)，包括但不限于，分離的水解和發(fā)酵(SHF)、同步糖化和發(fā)酵(SSF)、同步糖化和共發(fā)酵(SSCF)、混合的水解和發(fā)酵(HHF)、分離的水解和共發(fā)酵(SHCF)、混合的水解和共發(fā)酵(HHCF)，和直接微生物轉(zhuǎn)化(DMC)。SHF使用分離的處理步驟以首先將纖維素材料或含木聚糖材料酶水解為可發(fā)酵糖，例如，葡萄糖，纖維二糖、纖維三糖和戊糖(例如木糖)，然后將可發(fā)酵糖發(fā)酵成為乙醇。在SSF中，纖維素材料或含木聚糖材料的酶水解和糖變?yōu)橐掖嫉陌l(fā)酵在一個(gè)步驟中組合(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization,Wyman,C.E編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF包括多種糖的共發(fā)酵(Sheehan，J.，和Himmel，Μ.，1999，Enzymes,energyandtheenvironment:AstrategicperspectiveontheU.S.DepartmentofEnergy^sresearchanddevelopmentactivitiesforbioethanol，Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF在同步糖化和水解步驟之外，還涉及單獨(dú)的水解步驟，所述步驟可以在同一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行。HHF過程中的步驟可以在不同的溫度，即，高溫酶法糖化，然后在發(fā)酵菌株能夠耐受的較低溫度進(jìn)行SSF。DMC在一個(gè)或多個(gè)步驟中組合了所有三個(gè)過程(酶產(chǎn)生、水解和發(fā)酵)，其中使用相同的生物體產(chǎn)生用于將纖維素或含木聚糖材料轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖并將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物的酶(Lynd,L.R.,WeimerjP.J.,vanZyljW.H.,和Pretorius，I.S.，2002，MicrobialcelluloseutiIization:Fundamentalsandbiotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506-577)。在本文可以理解的是，任何本領(lǐng)域中已知的方法，包括預(yù)處理、酶水解(糖化)、發(fā)酵，或它們的組合，可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。常規(guī)設(shè)備包括補(bǔ)料批式攪拌反應(yīng)器、批式攪拌反應(yīng)器、具有超濾的連續(xù)流攪拌反應(yīng)器和/或連續(xù)活塞流柱式反應(yīng)器(FernandadeCastilhosCorazzajFlavioFariadeMoraes，GisellaMariaZanin和IvoNeitzel，2003，Optimalcontrolinfed—batchreactorforthecellobiosehydrolysis,ActaScientiarum.TechnoIogy25:33-38;Gusakov,A.V.，和Sinitsyn，A.P.，1985，Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose:I.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess，Enz.Microb.Technol.7:346-352)、研磨反應(yīng)器(Ryu，S.Κ·，和Lee,J.M.，1983，Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65)，或者具有由電磁場(chǎng)引起的強(qiáng)烈攪拌的反應(yīng)器(Gusakov,A.V.，Sinitsyn,A.P.，DavydkinjI.Y.，DavydkinjV.Y.，Protasj0.V.，1996，Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反應(yīng)器類型包括流化床、升流層(upflowblanket)、固定化和用于水解和/或發(fā)酵的擠出機(jī)型的反應(yīng)器。預(yù)處理。在本發(fā)明的方法的實(shí)施中，可以使用本領(lǐng)域已知的任何預(yù)處理過程破壞植物細(xì)胞壁的纖維素材料和/或含木聚糖材料組分(Chandra等，2007，Substratepretreatment:ThekeytoeffectiveenzymatichydrolysisoflignocellulosicsAdv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:67-93;Galbe和Zacchi,2007，Pretreatmentoflignocellulosicmaterialsforefficientbioethanolproduction,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:41-65;Hendriks和Zeeman,2009，Pretreatmentstoenhancethedigestibilityoflignocellulosicbiomass，BioresourceTechnol.100:10-18;Mosier等，2005，F(xiàn)eaturesofpromisingtechnologiesforpretreatmentoflignocellulosicbiomass,BioresourceTechnol.96:673-686;Taherzadeh和Karimi，2008，Pretreatmentoflignocellulosicwastestoimproveethanolandbiogasproduction:Areview,Int.J.ofMol.Sci.9:1621-1651;Yang和Wyman，2008，Pretreatment:thekeytounlockinglow-costcellulosicethanol,BiofuelsBioproductsandBiorefining-Biofpr.2:26-40)。纖維素材料或含木聚糖材料也可以在預(yù)處理之前使用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行粒度減小、預(yù)浸泡、潤(rùn)濕、洗滌或調(diào)節(jié)。常規(guī)的預(yù)處理包括但不限于，蒸汽預(yù)處理(伴隨或不伴隨爆炸)、稀酸預(yù)處理、熱水預(yù)處理、堿性預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕氧化、濕爆炸、氨纖維爆炸、有機(jī)溶劑預(yù)處理和生物預(yù)處理。其它預(yù)處理包括氨滲濾、超聲、電穿孔、微波、超臨界CO2、超臨界!120、臭氧和Y輻射預(yù)處理?？梢栽谒夂?或發(fā)酵之前預(yù)處理纖維素材料或含木聚糖材料。預(yù)處理優(yōu)選在水解前進(jìn)行。或者，預(yù)處理可以與酶水解同時(shí)進(jìn)行以釋放可發(fā)酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纖維二糖。在大多數(shù)情況下，預(yù)處理步驟本身使一些生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖(甚至在不存在酶的情況下)。蒸汽預(yù)處理。在蒸汽預(yù)處理中，加熱纖維素材料或含木聚糖材料以破壞植物細(xì)胞壁成分，包括木質(zhì)素、半纖維素和纖維素，使酶可接觸纖維素和其它級(jí)分，例如，半纖維素。將纖維素材料或含木聚糖材料傳入或經(jīng)過反應(yīng)容器，其中注入蒸汽以增加溫度至需要的溫度和壓力，并且在其中保持期望的反應(yīng)時(shí)間。蒸汽預(yù)處理優(yōu)選在140-230°C，更優(yōu)選160-200V，并且最優(yōu)選170-190V進(jìn)行，其中最優(yōu)的溫度范圍依賴于任何化學(xué)催化劑的添力口。蒸汽預(yù)處理的停留時(shí)間優(yōu)選1-15分鐘，更優(yōu)選3-12分鐘，并且最優(yōu)選4-10分鐘，其中最優(yōu)的停留時(shí)間依賴于溫度范圍和任何化學(xué)催化劑的添加。蒸汽預(yù)處理允許相對(duì)較高的固體加載量，使纖維素材料或含木聚糖材料在預(yù)處理過程中通常僅僅變得潮濕。蒸汽預(yù)處理經(jīng)常與預(yù)處理后的物質(zhì)的爆炸放料(explosivedischarge)組合,這稱為蒸汽爆炸，即，快速閃變至大氣壓和物質(zhì)的瑞流，以通過破碎增加可接觸的表面積(Duff和Murray,1996,BioresourceTechnology855:1-33;Galbe和Zacchi,2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628;美國(guó)專利申請(qǐng)No.20020164730)。在蒸汽預(yù)處理過程中，切割半纖維素乙酰基團(tuán)，并且得到的酸自催化半纖維素部分水解成為單糖和寡糖。去除木質(zhì)素至有限的程度。經(jīng)常在蒸汽預(yù)處理之前加入催化劑如H2SO4或SO2(通常0.3至3%w/w)，其可減少時(shí)間，降低溫度，增加回收率，并改進(jìn)酶水解(Ballesteros等,2006,Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508;Varga等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:509-523;Sassner等·,2006,EnzymeMicrob.Technol.39:756-762)?；瘜W(xué)預(yù)處理術(shù)語“化學(xué)處理“指能促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素分離和/或釋放的任何化學(xué)處理。合適的化學(xué)預(yù)處理步驟的實(shí)例包括例如稀酸預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕氧化、氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)、氨滲濾(APR)和有機(jī)溶劑預(yù)處理。在稀酸預(yù)處理中，將纖維素材料或含木聚糖材料與稀酸(通常是H2SO4)和水混合以形成漿料，由蒸汽加熱至期望的溫度，并在一段停留時(shí)間后閃變至大氣壓?？梢杂煤芏喾磻?yīng)器設(shè)計(jì)進(jìn)行稀酸預(yù)處理，例如，活塞流反應(yīng)器、逆流反應(yīng)器或連續(xù)逆流收縮床反應(yīng)器(Duff和Murray,1996,supra;Schell等,2004,BioresourceTechnol.91:179-188;Lee等,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。還可以使用堿性條件下的幾種預(yù)處理方法。這些堿預(yù)處理包括，但不限于，石灰預(yù)處理、濕氧化、氨滲濾(APR)和氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)。用碳酸鈣、氫氧化鈉或氨，在85-150V的低溫進(jìn)行石灰預(yù)處理，停留時(shí)間從I小時(shí)到幾天(Wyman等，2005，BioresourceTechnol.96:1959-1966;Mosier等，2005，BioresourceTechnol.96:673-686)。WO2006/110891,WO2006/110899,WO2006/110900和WO2006/110901公開了使用氨的預(yù)處理方法。濕法氧化是熱預(yù)處理，通常在180-20(TC進(jìn)行5-15分鐘，加入氧化劑如過氧化氧或過壓氧(Schmidt和Thomsen,1998，BioresourceTechnol.64:139-151;Palonen等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17;Varga等，2004，Biotechnol.Bioeng.88:567-574;Martin等,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。預(yù)處理以優(yōu)選1-40%干物質(zhì)，更優(yōu)選2-30%干物質(zhì)，并且最優(yōu)性5-20%干物質(zhì)進(jìn)行，并且由于加入堿如碳酸鈉，初始PH經(jīng)常會(huì)增加。濕法氧化預(yù)處理方法的修改方法，稱為濕爆炸(濕氧化和蒸汽爆炸的組合)，能夠處理高達(dá)30%的干物質(zhì)。在濕爆炸中，在預(yù)處理過程中，在一定的停留時(shí)間后引入氧化劑。然后通過閃變至大氣壓而結(jié)束預(yù)處理(W02006/032282)。氨纖維爆炸(AFEX)涉及在溫和溫度如90-100°C和高壓如17_20bar，用液體或氣體氨將纖維素材料或含木聚糖材料處理5-10分鐘，其中干物質(zhì)含量可以高達(dá)60%(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35;Chundawat等,2007,Biotechnol.Bioeng.96:219-231;Alizadeh等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol121:1133-1141;Teymouri等，2005,BioresourceTechnol.96:2014-2018)。AFEX預(yù)處理導(dǎo)致纖維素解聚，和半纖維素的部分水解。木質(zhì)素-糖復(fù)合物得到切割。有機(jī)溶劑預(yù)處理通過用含水乙醇(40-60%乙醇)在160-200°C提取30-60分鐘而將纖維素材料或含木聚糖材料去木質(zhì)素化(Pan等，2005，Biotechnol.Bioeng.90:473-481;Pan等，2006，Biotechnol.Bioeng.94:851-861;Kurabi等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121:219-230)。經(jīng)常加入硫酸作為催化劑。在有機(jī)溶劑預(yù)處理中，去除大部分半纖維素。合適的預(yù)處理方法的其他實(shí)例如Schell等，2003，Appl.BiochemandBiotechn.Vol.105-108:69-85,和Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673-686，和美國(guó)專利公開申請(qǐng)2002/0164730所述。在一個(gè)方面，化學(xué)預(yù)處理優(yōu)選作為酸處理，并且更優(yōu)選作為連續(xù)稀酸和/或弱酸(mildacid)處理進(jìn)行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、檸檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氫或其混合物。弱酸處理在優(yōu)選1-5，更優(yōu)選1-4，并且最優(yōu)選1-3的pH范圍內(nèi)進(jìn)行。在一個(gè)方面，酸濃度在優(yōu)選0.01至20wt%酸，更優(yōu)選0.05至10wt%酸，甚至更優(yōu)選0.I至5wt%酸，并且最優(yōu)選0.2至2.0wt%酸的范圍內(nèi)。酸與纖維素材料或含木聚糖材料接觸，并在優(yōu)選160-220°C，和更優(yōu)選165-195°C范圍內(nèi)的溫度保持?jǐn)?shù)秒到數(shù)分鐘，例如I秒-60分鐘的時(shí)間。在另一個(gè)方面，預(yù)處理作為氨纖維爆炸步驟(AFEX預(yù)處理步驟)進(jìn)行。在另一個(gè)方面，預(yù)處理發(fā)生在含水漿料中。在優(yōu)選的方面，在預(yù)處理過程中纖維素材料或含木聚糖材料以優(yōu)選10-80wt%，更優(yōu)選20-70wt%，并且最優(yōu)選30-60wt%，如約50wt%的量存在。預(yù)處理的纖維素材料或含木聚糖材料可以不洗滌或者使用本領(lǐng)域任何已知的方法洗漆，例如，用水洗漆。機(jī)械預(yù)處理術(shù)語“機(jī)械預(yù)處理”指各種類型的磨制(grinding)或粉碎(milling)(例如，干磨、濕磨或振動(dòng)球磨)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，機(jī)械預(yù)處理在使用如上所定義的高溫和高壓的分批過程、蒸汽槍水解器系統(tǒng)，例如來自SundsDefibratorAB,Sweden的SundsHydrolyzer中進(jìn)行。物理預(yù)處理術(shù)語“物理預(yù)處理”指促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從纖維素材料或含木聚糖材料分離和/或釋放的任何預(yù)處理。例如，物理預(yù)處理可涉及輻射(例如，微波福射)、汽蒸/蒸汽爆炸、水熱解(hydrothermolysis)和它們的組合。物理預(yù)處理可以涉及高壓和/或高溫(蒸汽爆炸)。在一個(gè)方面，高壓指優(yōu)選約300至約600psi，更優(yōu)選約350至約550psi，并且最優(yōu)選約400至約500psi，如約450psi的壓力。在另一個(gè)方面，高溫指約100至300°C，優(yōu)選約140至235°C的溫度。組合的物理和化學(xué)預(yù)處理可以對(duì)纖維素材料或含木聚糖材料進(jìn)行物理和化學(xué)預(yù)處理。例如，預(yù)處理步驟可以涉及稀酸或弱酸處理和高的溫度和/或壓力處理。根據(jù)需要，可以順序或同時(shí)進(jìn)行物理和化學(xué)預(yù)處理。還可以包括機(jī)械預(yù)處理。因此，在一個(gè)優(yōu)選的方面，對(duì)纖維素材料或含木聚糖材料進(jìn)行機(jī)械、化學(xué)或物理預(yù)處理，或者它們的任何組合，以促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放。生物預(yù)處理術(shù)語“生物預(yù)處理”指可以促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從纖維素材料或含木聚糖材料分離和/或釋放的任何生物預(yù)處理。生物預(yù)處理技術(shù)可以包括應(yīng)用溶解木質(zhì)素的微生物(參見，例如，Hsu,T.-A.，1996，Pretreatmentofbiomass,于HandbookonBioethanolProductionandUtilization,Wyman,C.E編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212;Ghosh和Singh,1993，Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333;McMillan,J.D.,1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,于EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction,Himmel,M.E.,Baker,J.0.,和Overend,R.P.，編,ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,第15章;Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999，Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.,編,Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241;01sson和Hahn-HagerdaI,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331;和Vallander和Eriksson,1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。趣化。在水解(也稱作糖化)步驟中，將例如經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料或含木聚糖材料水解以將纖維素和半纖維素分解成可發(fā)酵糖，如葡萄糖、纖維二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解由酶組合物以酶法在本發(fā)明具有木聚糖酶活性的多肽的存在下進(jìn)行。組合物的酶還可以順序加入。酶水解優(yōu)選在易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的條件下，在合適的含水環(huán)境中進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的方面，水解在適于酶的活性，即對(duì)于酶最優(yōu)的條件下進(jìn)行。水解可以以補(bǔ)料分批或連續(xù)的工藝進(jìn)行，其中將經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料(底物)逐漸補(bǔ)入，例如，含酶的水解溶液中。糖化通常在攪拌釜反應(yīng)器或發(fā)酵罐中，在受控的pH、溫度和混合條件下進(jìn)行。合適的處理時(shí)間、溫度和pH條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。例如，糖化可以持續(xù)長(zhǎng)達(dá)200小時(shí)，但是通常優(yōu)選進(jìn)行約12至約96小時(shí)，更優(yōu)選約16至約72小時(shí)，并且最優(yōu)選約24至約48小時(shí)。溫度優(yōu)選約25°C至約70°C，更優(yōu)選約30°C至約65°C，并且最優(yōu)選約40°C至約60°C，特別是約50°C。pH優(yōu)選約3至約8，更優(yōu)選約3.5至約7，并且最優(yōu)選約4至約6,特別是約pH5。干燥固體含量?jī)?yōu)選約5至約50wt%,更優(yōu)選約10至約40wt%,并且最優(yōu)選約20至約30wt%。具有木聚糖酶活性的多肽和酶的最適量取決于幾個(gè)因素，其包括但不限于，組分酶的混合物、纖維素材料或含木聚糖材料、纖維素材料或含木聚糖材料的濃度、纖維素材料或含木聚糖材料的預(yù)處理、溫度、時(shí)間、PH和包括發(fā)酵生物體(例如，同步糖化和發(fā)酵的酵母)。在一個(gè)方面，纖維素分解酶和/或木聚糖降解酶對(duì)于纖維素材料或含木聚糖材料的有效量是約O.5至約50mg，優(yōu)選約O.5至約40mg，更優(yōu)選約O.5至約25mg，更優(yōu)選約O.75至約20mg,更優(yōu)選約O.75至約15mg,甚至更優(yōu)選約O.5至約IOmg,并且最優(yōu)選約2.5至約IOmg每g纖維素材料或含木聚糖材料。在另一個(gè)方面，具有木聚糖酶活性的多肽對(duì)于纖維素材料或含木聚糖材料的有效量是約O.01至約50.Omg,優(yōu)選約O.01至約40mg,更優(yōu)選約O.01至約30mg,更優(yōu)選約O.01至約20mg,更優(yōu)選約O.01至約IOmg,更優(yōu)選約O.01至約5mg,更優(yōu)選約O.025至約I.5mg,更優(yōu)選約O.05至約I.25mg,更優(yōu)選約O.075至約I.25mg,更優(yōu)選約O.I至約I.25mg,甚至更優(yōu)選約O.15至約I.25mg,并且最優(yōu)選約O.25至約I.Omg每g纖維素材料或含木聚糖材料。在另一個(gè)方面，具有木聚糖酶活性的多肽對(duì)于纖維素分解酶和/或木聚糖降解酶的有效量是約O.005至約I.Og,優(yōu)選約O.01至約I.Og,更優(yōu)選約O.15至約O.75g，更優(yōu)選約O.15至約O.5g,更優(yōu)選約O.I至約O.5g,甚至更優(yōu)選約O.I至約O.5g,并且最優(yōu)選約O.05至約O.2g每g纖維素分解酶。在一個(gè)方面，酶組合物包含或進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的酶纖維素酶、具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽，半纖維素酶，棒曲霉素(expansin)，酯酶，漆酶，木質(zhì)素分解酶(ligninolyticenzyme),果膠酶,過氧化物酶,蛋白酶和膨脹素。在另一個(gè)方面，所述纖維素酶優(yōu)選為一種或多種(幾種)選自下組的酶內(nèi)切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶和葡糖苷酶。在另一個(gè)方面，所述半纖維素酶優(yōu)選為一種或多種(幾種)選自下組的酶乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含或進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)半纖維素分解酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶和一種或多種(幾種)半纖維素分解酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的酶纖維素分解酶和半纖維素分解酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含纖維二糖水解酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含葡糖苷酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，酶組合物包含纖維二糖水解酶和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，酶組合物包含β-葡糖苷酶和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶，和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶，β-葡糖苷酶，和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，酶組合物包含纖維二糖水解酶，β-葡糖苷酶，和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶，和β-葡糖苷酶，和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，酶組合物包含乙酰甘露聚糖酯酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含乙酰木聚糖酯酶。在另一個(gè)方面酶組合物包含阿拉伯聚糖酶(例如a-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一個(gè)方面，酶組合物包含阿拉伯呋喃糖苷酶(例如a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一個(gè)方面，酶組合物包含香豆酸酯酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含阿魏酸酯酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含半乳糖苷酶(例如，α-半乳糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)。在另一個(gè)方面，酶組合物包含葡糖醛酸糖苷酶(例如，a-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一個(gè)方面，酶組合物包含葡糖醛酸酯酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含甘露聚糖酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含甘露糖苷酶(例如甘露糖苷酶)。在另一個(gè)方面，酶組合物包含木聚糖酶。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述木聚糖酶為家族10木聚糖酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含木糖苷酶(例如木糖苷酶)。在另一個(gè)方面，酶組合物包含棒曲霉素。在另一個(gè)方面，酶組合物包含酯酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含漆酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含木質(zhì)素分解酶。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述木質(zhì)素分解酶是錳過氧化物酶。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述木質(zhì)素分解酶是木質(zhì)素過氧化物酶。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述木質(zhì)素分解酶是H2O2產(chǎn)生酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含果膠酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含過氧化物酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含蛋白酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含膨脹素。在本發(fā)明的方法中，酶可在發(fā)酵之前或過程中添加，例如在糖化過程中或在發(fā)酵微生物繁殖過程中或之后添加。所述酶組合物的一種或多種(幾種)組分可為野生型蛋白、重組蛋白或野生型蛋白和重組蛋白的組合。舉例而言，一種或多種(幾種)組分可為細(xì)胞的天然蛋白，其用作宿主細(xì)胞以重組表達(dá)一種或多種(幾種)酶組合物的其他組分。酶組合物的一種或多種(幾種)組分可作為單組分產(chǎn)生，然后將其組合以形成酶組合物。所述酶組合物可為多組分和單組分蛋白制備物的組合。用于本發(fā)明方法中的酶可為任何適用的形式，如例如去除或未去除細(xì)胞的粗發(fā)酵液，含或不含細(xì)胞碎片的細(xì)胞裂解物，半純化或純化的酶制備物，或宿主細(xì)胞，作為酶的來源。所述酶組合物可為干粉或顆粒，無粉塵的顆粒，液體，穩(wěn)定化液體或穩(wěn)定化受保護(hù)的酶。液體酶制備物可根據(jù)確立的工藝，例如通過添加穩(wěn)定劑如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有機(jī)酸來穩(wěn)定化。酶可源自或獲得自任何合適的來源，包括細(xì)菌、真菌、酵母、植物或哺乳動(dòng)物來源。術(shù)語“獲得”在本文中意指該酶可從天然產(chǎn)生該酶作為天然酶的生物分離。術(shù)語“獲得”在本文中還意指該酶可在宿主生物中使用本文中所述的方法重組產(chǎn)生,其中經(jīng)重組產(chǎn)生的酶對(duì)于宿主生物是天然的或異源的，或具有修飾的氨基酸序列，例如，具有一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重組產(chǎn)生的酶，其為天然氨基酸序列的片段和/或突變體或通過本領(lǐng)域已知的氨基酸改組方法產(chǎn)生的酶。天然酶的含義中涵蓋的是天然變體，而外來酶的含義中涵蓋的是重組(如通過定位誘變或改組)獲得的變體。具有酶活性的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可以是具有酶活性的革蘭氏陽性細(xì)菌多肽如芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬或海洋芽孢桿菌屬多肽；或具有酶活性的革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬或脲原體屬多肽在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酶活性的嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酶活性的似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌或馬鏈球菌獸瘟亞種多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酶活性的不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌或淺青紫鏈霉菌多肽。具有酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選具有酶活性的酵母多肽如假絲酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬多肽；或更優(yōu)選具有酶活性的絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬、傘菌屬、鏈格孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、Botryospaeria、擬臘菌屬、Chaetomidium、金抱子菌屬、Claviceps、Cochliobolus、鬼傘屬、Coptotermes、棒囊殼屬、隱叢赤殼菌屬、隱球菌屬、色二孢屬、黑耳屬、Filibasidium、鐮孢屬、赤霉屬、全鞭毛蟲屬、腐質(zhì)霉屬、IE齒菌屬、蘑燕屬、Leptospaeria、梨孢菌屬、Melanocarpus、多孔菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、瘤胃壺菌屬、Poitrasia、假黑盤菌屬、Pseudotrichonympha、根毛霉屬、裂裙菌屬、柱頂孢屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、木霉屬、長(zhǎng)毛盤菌屬、輪枝孢屬、包腳菇屬或炭角菌屬多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酶活性的卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酶活性的解纖維枝頂孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角質(zhì)金孢子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、租金抱子菌、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、桿抱狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、灰腐質(zhì)霉、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、白耙齒菌、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、繩狀青霉、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、Thielaviaachromatica、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼、Thielaviafimeti、小抱梭抱殼、卵抱梭抱殼、Thielaviaperuviana、瘤抱梭抱殼、毛梭抱殼、Thielaviasubthermophila、土生梭抱霉、哈次木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉、綠色木霉或揭抱長(zhǎng)毛盤囷多妝。還可以使用具有酶活性的多肽經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。所述纖維素分解酶組合物的一種或多種(幾種)組分可以是重組組分，亦即，通過克隆編碼所述單獨(dú)組分的DNA序列并隨后用該DNA序列轉(zhuǎn)化細(xì)胞并在宿主中表達(dá)(參見，例如，W091/17243和W091/17244)產(chǎn)生。所述宿主優(yōu)選是異源宿主(酶對(duì)宿主是異源的)，但該宿主在一定條件下也可以是同源宿主(酶對(duì)宿主是天然的)。單組分纖維素分解酶還可以通過從發(fā)酵液中提純這樣的蛋白質(zhì)來制備。在一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包括商業(yè)性纖維素分解酶制備物。適用于本發(fā)明的商業(yè)的纖維素分解酶制備物的實(shí)例包括，例如，CELLICCTec(NovozymesA/S)、CELLICCTec2(NovozymesA/S)、CELLUCLAST(NovozymesA/S)、NOVOZYM188(NovozymesA/S)、CELLUZYME(NovozymesA/S)、CEREFLO(NovozymesA/S)和ULTRAFLO(NovozymesA/S),ACCELERASE(GenencorInt.)、LAMINEX(GenencorInt.)、SPEZYMEtmCP(GenencorInt.),ROHAMENT7069ff(RRohmGmbH),FlBREZYMELDI(DyadicInternational,Inc.)>FIRRF,ZYMR(R)LBR(DyadicInternational,Inc.)或VISCOSTAR150L(DyadicInternational,Inc.)。所述纖維素酶以固體的約O.001到約5.Owt.%，更優(yōu)選固體的O.025到約4.Owt.%，且最優(yōu)選固體的約O.005到約2.Owt.%的有效量添加?？梢杂糜诒景l(fā)明的方法的細(xì)菌內(nèi)切葡聚糖酶的實(shí)例包括但不僅限于，解纖維熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)內(nèi)切葡聚糖酶(W091/05039；W093/15186;美國(guó)專利5，275，944；W096/02551;美國(guó)專利5，536，655，W000/70031,WO05/093050)；Thermobifidafusca內(nèi)切葡聚糖酶III(W005/093050)jPThermobifidafusca內(nèi)切葡聚糖酶V(W005/093050)?？梢杂糜诒景l(fā)明的真菌內(nèi)切葡聚糖酶的實(shí)例包括但不僅限于，里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(Penttila等，1986，Gene45:253-263;里氏木霉Cel7B內(nèi)切葡聚糖酶I；GENBANK登錄號(hào)M15665);里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(Saloheimo等，1988，Gene63:11-22;里氏木霉Cel5A內(nèi)切葡聚糖酶II;GENBANK登錄號(hào)M19373);里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(Okada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64:555-563;GENBANK登錄號(hào)AB003694);里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(Saloheimo等，1994,MolecularMicrobiology13:219-228;GENBANK登錄號(hào)Z33381);棘抱曲霉內(nèi)切葡聚糖酶(Ooi等，1990，NucleicAcidsResearchl8:5884)；川地曲霉(Aspergilluskawachii)內(nèi)切葡聚糖酶(Sakamoto等，1995，CurrentGenetics27:435-439);胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovara)內(nèi)切葡聚糖酶(Saarilahti^,1990,Gene90:9-14);尖鐮孢內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號(hào)L29381);灰腐質(zhì)霉thermoidea變種內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號(hào)AB003107)；Melanocarpusalbomyces內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號(hào)MAL515703);粗糙脈孢菌內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號(hào)XM_324477);特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V;嗜熱毀絲霉CBS117.65內(nèi)切葡聚糖酶；擔(dān)子菌綱(basidiomycete)CBS495.95內(nèi)切葡聚糖酶；擔(dān)子菌綱CBS494.95內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6B內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6C內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7C內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7E內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7F內(nèi)切葡聚糖酶；CladorrhinumfoecundissimumATCC62373CEL7A內(nèi)切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株VTT-D-80133內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號(hào)Ml5665)。可用于本發(fā)明的纖維二糖水解酶的實(shí)例包括但不僅限于，里氏木霉纖維二糖水解酶I;里氏木霉纖維二糖水解酶II;特異腐質(zhì)霉纖維二糖水解酶I)、嗜熱毀絲霉纖維二糖水解酶II、土生梭孢霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)、嗜熱毛殼菌(Chaetomiumthermophilum)纖維二糖水解酶I以及嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶II，煙曲霉纖維二糖水解酶I和煙曲霉纖維二糖水解酶II?？捎糜诒景l(fā)明的葡糖苷酶的實(shí)例包括但不僅限于米曲霉葡糖苷酶；煙曲霉β-葡糖苷酶；巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)IBT20888β-葡糖苷酶；黑曲霉β-葡糖苷酶；以及棘孢曲霉葡糖苷酶。米曲霉葡糖苷酶可根據(jù)W02002/095014獲取。煙曲霉葡糖苷酶可根據(jù)WO2005/047499獲取。巴西青霉葡糖苷酶可根據(jù)WO2007/019442獲取。黑曲霉β_葡糖苷酶可根據(jù)Dan等，2000，J.Biol.Chem.275:4973-4980獲取。棘孢曲霉葡糖苷酶可根據(jù)Kawaguchi等，1996，Gene173:287-288獲取。所述葡糖苷酶可以是融合蛋白。在一個(gè)方面，所述葡糖苷酶是根據(jù)WO2008/057637獲得的米曲霉β-葡糖苷酶變體BG融合蛋白或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白。其它可用的內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡糖苷酶使用根據(jù)HenrissatB.,1991，Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316和HenrissatB.和BairochΑ·，1996，Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696的分類公開于許多糖基水解酶家族中。其它可用于本發(fā)明的纖維素分解酶描述于EP495，257、EP531，315、EP531,372、WO89/09259、WO94/07998、TO95/24471、TO96/11262、W096/29397、TO96/034108、WO97/14804、WO98/08940、WO98/012307、W098/13465、WO98/015619、WO98/015633、WO98/02841I、WO99/06574、WO99/10481、WO99/025846、WO99/025847、WO99/031255、W02000/009707,WO2002/050245,WO2002/0076792,WO2002/101078,W02003/027306,WO2003/052054,WO2003/052055,WO2003/052056,W02003/052057,WO2003/052118、WO2004/016760、WO2004/043980、W02004/048592,WO2005/001065,WO2005/028636、WO2005/093050,W02005/093073,WO2006/074005,WO2006/117432,WO2007/071818、W02007/071820、WO2008/008070、WO2008/008793、美國(guó)專利No.4，435，307、美國(guó)專利No.5，457，046、美國(guó)專利No.5，648，263、美國(guó)專利No.5，686，593、美國(guó)專利No.5，691，178、美國(guó)專利No.5，763，254以及美國(guó)專利No.5，776，757。在本發(fā)明的方法中，可使用任何具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在一個(gè)方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含下述基序[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[Fff]-[TF]-K-[AIV],其中X為任意氨基酸，X(4，5)為在4或5個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸，而X(4)是在4個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸。包含上述所示的基序的多肽可進(jìn)一步包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]，[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，或H-X(I,2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]和[EQ]-X_Y_X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV],其中X為任意氨基酸，X(l,2)為在I個(gè)位置或2個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸，X(3)為3個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸，而X(2)為2個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸。在上述基序中，采用公認(rèn)的IUPAC單字母氨基酸縮寫。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽進(jìn)一步包含H-X(l,2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽包含[EQ]-X-YX(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽進(jìn)一步包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[ALMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在第二個(gè)方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含下述基序[ILMV]-P-X(4，5)—G—x—Y—[ILMV]—x—R—x—[EQ]-χ(3)~Α~[HNQ]，其中χ為任意氨基酸，χ(4，5)為在4或5個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸，而χ(3)為3個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸。在上述基序中，采用公認(rèn)的IUPAC單字母氨基酸縮寫?？捎糜诒景l(fā)明的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的實(shí)例但不限于來自土生梭孢霉的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽(W02005/074647);來自桔橙熱子囊菌的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽(W02005/074656);來自里氏木霉的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽(W02007/089290);和來自嗜熱毀絲霉的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽(W02009/085935,WO2009/085859,WO2009/085864和WO2009/085868)。WO2008/151043公開了通過將可溶性活化二價(jià)金屬陽離子添加至包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的組合物來增加具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的活性的方法。在一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)半纖維素分解酶包括商業(yè)性半纖維素分解酶制備物。適用于本發(fā)明的商業(yè)性半纖維素分解酶制備物的實(shí)例包括，例如SHEARZYME(NovozymesA/S)ΛCELLICHTec(NovozymesA/S)ΛCELLICHTec2(NovozymesA/S)、VISCOZYME(NovozymesA/S)、ULTRAFLO(NovozymesA/S)、PULPZYMEHC(NovozymesA/S)、MULTIFECTXylanase(GenencorInt.),ECOPULPTX-200A(ABEnzymes)、HSP6000Xylanase(DSM)、DEP0L333P(BiocatalystsLimit，Wales，UK)、DEP0L740L(BiocatalystsLimit，Wales，UK)和DEP0L762P(BiocatalystsLimit,Wales,UK)0可用于本發(fā)明方法的木聚糖酶的實(shí)例包括但不限于棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)木聚糖酶(GeneSeqP:AAR63790;WO94/21785)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)木聚糖酶(W02006/078256)和土生梭抱霉(Thielaviaterrestris)NRRL8126木聚糖酶(W02009/079210)。可用于本發(fā)明方法的β-木糖苷酶的實(shí)例包括但不限于里氏木霉(Trichodermareesei)β-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登錄號(hào)Q92458)、埃默森踩節(jié)菌(Talaromycesemersonii)(SwissProt登錄號(hào)Q8X212)和粗糖脈抱菌(Neurosporacrassa)(SwissProt登錄號(hào)Q7S0W4)?？捎糜诒景l(fā)明方法的乙酰木聚糖酯酶的實(shí)例包括但不限于紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)乙酰木聚糖酯酶(WO2005/001036)、粗糙脈孢菌乙酰木聚糖酯酶(UniProt登錄號(hào)q7s259)、土生梭孢霉NRRL8126乙酰木聚糖酯酶(W02009/042846)、球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登錄號(hào)Q2GWX4)、細(xì)麗毛殼菌(Chaetomiumgracile)乙酰木聚糖酯酶(GeneSeqP登錄號(hào)AAB82124)、穎枯殼針孢(Phaeosphaerianodorum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登錄號(hào)Q0UHJ1)和特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)DSM1800乙酰木聚糖酯酶(W02009/073709)。可用于本發(fā)明方法的阿魏酸酯酶的實(shí)例包括但不限于特異腐質(zhì)霉DSM1800阿魏酸酯酶(W02009/076122)、粗糙脈孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登錄號(hào)Q9HGR3)和費(fèi)希新薩托菌(Neosartoryafischer)阿魏酸酯酶(UniProt登錄號(hào)A1D9T4)?？捎糜诒景l(fā)明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的實(shí)例包括但不限于特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)DSM1800阿拉伯呋喃糖苷酶(W02009/073383)和黑曲霉(Aspergillusniger)阿拉伯呋喃糖苷酶(GeneSeqP登錄號(hào)AAR94170)?？捎糜诒景l(fā)明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的實(shí)例包括但不限于棒曲霉(Aspergillusclavatus)α-葡糖醒酸糖苷酶(UniProt登錄號(hào)alccl2)、里氏木霉α-葡糖醒酸糖苷酶(Uniprot登錄號(hào)Q99024)、埃默森踝節(jié)菌α-葡糖醒酸糖苷酶(UniProt登錄號(hào)Q8X211)、黑曲霉α-葡糖醒酸糖苷酶(Uniprot登錄號(hào)Q96WX9)、土曲霉(Aspergillusterreus)α-葡糖醒酸糖苷酶(SwissProt登錄號(hào)Q0CJP9)和煙曲霉α-葡糖醒酸糖苷酶(SwissProt登錄號(hào)Q4WW45)。用于本發(fā)明方法的酶和蛋白可通過在含有合適碳源和氮源和無機(jī)鹽，使用本領(lǐng)域已知方法(參見，例如Bennett,J.W.和LaSure,L.(編)，MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress,CA，1991)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上發(fā)酵上述指出的微生物菌株來產(chǎn)生。合適的培養(yǎng)基可從供應(yīng)商獲得，或可根據(jù)已公開組合物制備(例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)。適于生長(zhǎng)和酶產(chǎn)生的溫度范圍和其他條件在本領(lǐng)域是已知的(參見，例如Bailey,J.E.和Ollis,D.F.，BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-HillBookCompany,NY,1986)。所述發(fā)酵可以是任何其結(jié)果為酶表達(dá)或分離的培養(yǎng)細(xì)胞的方法。因此，發(fā)酵可以理解為包括在合適的培養(yǎng)基中并在允許所述酶得以表達(dá)或分離的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，或在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小-或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)。通過上述方法產(chǎn)生的所得的酶可從發(fā)酵培養(yǎng)基回收并通過常規(guī)方法純化。發(fā)醛?？赏ㄟ^一種或多種(幾種)能將糖直接或間接發(fā)酵成所需發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵微生物發(fā)酵自經(jīng)水解的纖維素材料獲得的可發(fā)酵糖?！鞍l(fā)酵”或“發(fā)酵方法”指任何發(fā)酵方法或包含發(fā)酵步驟的任何方法。發(fā)酵方法還包括用于消費(fèi)品醇工業(yè)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品業(yè)(例如，發(fā)酵乳產(chǎn)品)、皮革業(yè)和煙草業(yè)的發(fā)酵方法。發(fā)酵條件依賴于期望的發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵生物體，并且能由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。在發(fā)酵步驟中，作為預(yù)處理和酶水解步驟的結(jié)果從纖維素材料釋放的糖，通過發(fā)酵生物體(如酵母)發(fā)酵成為產(chǎn)物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和發(fā)酵可以是單獨(dú)或同時(shí)的。在本發(fā)明的發(fā)酵步驟中可以使用任何合適的經(jīng)水解的纖維素材料。通常根據(jù)所需發(fā)酵產(chǎn)品(即，要從發(fā)酵獲得的物質(zhì))和使用的方法來選擇所述材料，如本領(lǐng)域中所公知的。術(shù)語“發(fā)酵培養(yǎng)基”在本文中可理解為指加入發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基，如，由糖化過程產(chǎn)生的培養(yǎng)基，以及同步的糖化和發(fā)酵方法(SSF)中使用的培養(yǎng)基?！鞍l(fā)酵微生物”指適用于理想的發(fā)酵方法產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的任何微生物，包括細(xì)菌和真菌生物體。發(fā)酵生物體可以是(6和/或(5發(fā)酵生物體，或它們的組合。Cf^PC5發(fā)酵生物體均在本領(lǐng)域公知。合適的發(fā)酵微生物能將糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖)直接或間接地發(fā)酵(即，轉(zhuǎn)化)成所需的發(fā)酵產(chǎn)品。可產(chǎn)生乙醇的細(xì)菌和真菌發(fā)酵生物體的實(shí)例如Lin等，2006,Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。能發(fā)酵C6糖的發(fā)酵微生物的實(shí)例包括細(xì)菌和真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬菌種，優(yōu)選釀酒酵母。能發(fā)酵C5糖的發(fā)酵生物體的實(shí)例包括細(xì)菌和真菌生物體，如一些酵母。優(yōu)選的C5發(fā)酵酵母包括畢赤酵母屬，優(yōu)選樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)的菌株,如樹干畢赤酵母CBS5773;假絲酵母屬，優(yōu)選博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)、蕓薹假絲酵母(Candidabrassicae)、休哈塔假絲酵母(Candidasheatae)、迪丹斯假絲酵母(Candidadiddensii)、假熱帶假絲酵母(Candidapseudotropicalis)或產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)的菌株。其它發(fā)酵生物體包括發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas),如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis);漢遜酵母屬，如異常漢遜酵母(Hansenulaanomala);克魯維酵母屬，如脆壁克魯維酵母；裂殖酵母屬，如粟酒裂殖酵母(S.pombe);和大腸桿菌，特別是已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾而改進(jìn)乙醇產(chǎn)量的大腸桿菌；梭菌屬(Clostridium)，如丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum),熱纖維梭菌(Chlostridiumthermocellum)，和Chlostridiumphytofermentans;地芽抱桿菌屬菌種(Geobacillussp.);熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter),如角軍糖熱厭氧桿菌(ThermoanaerobactersaccharoIyticum);和芽孢桿菌屬，如凝結(jié)芽孢桿菌。在一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是酵母屬菌種。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是釀酒酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomycesdistaticus)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面,酵母是克魯維酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面,酵母是脆壁克魯維酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是假絲酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是博伊丁假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是蕓薹假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是迪丹斯假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是假熱帶假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是產(chǎn)朊假絲酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是棒孢酵母屬(Clavispora)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(ClavisporaIusitaniae)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面,酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavisporaopuntiae)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是管囊酵母屬(Pachysolen)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是嗜鞋管囊酵母(Pachysolentannophilus)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是畢赤酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是樹干畢赤酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是酒香酵母屬(Bretannomyces)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面,酵母是克勞森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization,Wyman,C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。能有效地將己糖和戊糖發(fā)酵成乙醇的細(xì)菌包括，例如，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，丙酮丁醇梭菌，熱纖維梭菌，Chlostridiumphytofermentans，地芽孢桿菌屬菌種，解糖熱厭氧桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌(Philippidis,1996，見上文)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌是發(fā)酵單胞菌屬。在更優(yōu)選的方面，細(xì)菌是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌是梭菌屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌是熱纖維梭菌。商業(yè)上可得到的適合乙醇產(chǎn)生的酵母包括，例如ETHANOLRED酵母(RedStar/Lesaffre，USA)、FALITM(Fleischmann’sYeast,BurnsPhilpFoodInc.,USA)ΛSUPERSTART和THERMOSACC新鮮酵母(EthanolTechnology,WIjUSA)、BIOFERMAFT和XR(NABC_NorthAmericanBioproductsCorporation，GA，USA)、GERTSTRAND(GertStrandABjSweden)和FERMIOL(DSMSpecialties)0在一個(gè)優(yōu)選的方面，發(fā)酵微生物已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾，提供發(fā)酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。通過將異源基因克隆入多種發(fā)酵微生物已經(jīng)構(gòu)建了能將己糖和戊糖轉(zhuǎn)化成乙醇(共發(fā)酵)的生物體(Chen和Ho，1993，CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147;Ho等，1998，GeneticallyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingglucoseandxylose,Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859;Kotter和Ciriacy，1993，XylosefermentationbySaccharomycescerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783;Walfridsson等，1995,Xylose-metabolizingSaccharomycescerevisiaestrainsoverexpressingtheTKLlandTALIgenesencodingthepentosephosphatepathwayenzymestransketolaseandtransaldolase,Appl.Environ.Microbiol.61:4184—4190;Kuyper等，2004，MinimalmetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation:aproofofprinciple,FEMSYeastResearch4:655-664;Beall等，1991，ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli,Biotech.Bioeng.38:296-303;Ingram等，1998，Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction,Biotechnol.Bioeng.58:204-214;Zhang等，1995，MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis,Science267:240-243;Deanda等，1996，Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilisstrainbymetabolicpathwayengineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470;WO2003/062430，xyloseisomerase)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是釀酒酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是大腸桿菌。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)□在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述經(jīng)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是克魯維酵母菌種。本領(lǐng)域中公知的是，上述生物體還能用于產(chǎn)生其它物質(zhì)，如本文所述。通常向降解的木素纖維素或水解物加入發(fā)酵微生物，并進(jìn)行約8至約96小時(shí)，如約24至約60小時(shí)發(fā)酵。溫度通常為約26°C至約60°C，特別是約32°C或50°C，并且在約pH3至約pH8，如約pH4-5,6或7。在一個(gè)優(yōu)選的方面，對(duì)降解的纖維素材料施用酵母和/或另一種微生物，并進(jìn)行約12至約96小時(shí)，如通常為24-60小時(shí)發(fā)酵。在一個(gè)優(yōu)選的方面，溫度優(yōu)選為約20°C至約60°C，更優(yōu)選約25°C至約50°C，并且最優(yōu)選約32°C至約50°C，特別是約32°C或50°C，并且pH通常為約pH3至約pH7，優(yōu)選約pH4_7。然而，一些發(fā)酵生物體例如細(xì)菌，具有更高的最適發(fā)酵溫度。酵母或另一種微生物優(yōu)選以約IO5-IO12,優(yōu)選約IO7-IOltl,特別是約2xl08活細(xì)胞計(jì)數(shù)每ml發(fā)酵液的量施用。關(guān)于使用酵母進(jìn)行發(fā)酵的進(jìn)一步指導(dǎo)可以在例如“TheAlcoholTextbook，，(K.Jacques,T.P.Lyons和D.R.Kelsall編,NottinghamUniversityPress,UnitedKingdom1999)中找到，其通過提述并入本文。對(duì)于乙醇生產(chǎn)，在發(fā)酵后蒸餾發(fā)酵的漿料以提取乙醇。根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的乙醇可以用作，例如燃料乙醇；飲料乙醇，即，中性飲料酒，或工業(yè)乙醇。發(fā)酵刺激劑可以與本文所述的任何方法組合使用，以進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵工藝，而且特定地，改進(jìn)發(fā)酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率?！鞍l(fā)酵刺激劑”指用于發(fā)酵微生物(特別是酵母)生長(zhǎng)的刺激劑。優(yōu)選的用于生長(zhǎng)的發(fā)酵刺激劑包括維生素和礦物質(zhì)。維生素的實(shí)例包括多種維生素、生物素、泛酸(鹽)、煙酸、內(nèi)消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、卩比唆醇(pyridoxine)、對(duì)氨基苯甲酸、葉酸、核黃素和維生素A、B、C、D^PE。參見，例如，Alfenore等，ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed—batchprocess,Springer-Verlag(2002),其通過提述并入本文。礦物質(zhì)的實(shí)例包括能夠提供營(yíng)養(yǎng)物的礦物質(zhì)和礦物質(zhì)鹽，所述營(yíng)養(yǎng)物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)酵產(chǎn)物可以是源自發(fā)酵的任何物質(zhì)。發(fā)酵產(chǎn)物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3_丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有機(jī)酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；和氣體(例如，甲烷、氫氣(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。發(fā)酵產(chǎn)物還可以是作為高價(jià)值產(chǎn)品的蛋白質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，發(fā)酵產(chǎn)物是醇?？衫斫獾氖牵g(shù)語“醇”包括包含一個(gè)或多個(gè)羥基基團(tuán)的物質(zhì)。在更優(yōu)選的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是丁醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是乙醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是甘油。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是甲醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是1，3-丙二醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是山梨醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是木糖醇。參見，例如，Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.編,Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241;Silveira,M.Μ.,和Jonas，R.，2002，Thebiotechnologicalproductionofsorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408;Nigam，P.，和Singh，D.，1995，Processesforfermentativeproductionofxylitol-asugarsubstitute,ProcessBiochemistry30(2):117-124;Ezeji，T.C.，QureshijN.和BlaschekjH.P.，2003，Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBAlOlandinsiturecoverybygasstripping,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology19(6):595-603。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是有機(jī)酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是乙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是醋酮酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是己二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是抗壞血酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是朽1檬酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是甲酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是反丁烯二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖醛酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是戊二酸。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是3-羥基丙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是衣康酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是乳酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是蘋果酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是丙二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是草酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是丙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是琥珀酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是木糖酸。參見，例如，Chen,R.,和Lee,Y.Y.，1997，Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435—448。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是酮?？衫斫獾氖切g(shù)語“酮”涵蓋含有一個(gè)或多個(gè)酮基的物質(zhì)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酮是丙酮。參見，例如，Qureshi和Blaschek,2003,見上文。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是氨基酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是天冬氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是賴氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是絲氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是蘇氨酸。參見，例如，Richard,A.，和Margaritis,A.，2004，Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,BiotechnologyandBioengineering87(4):501-515。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是氣體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是甲烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是H2。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是C02。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是CO。參見，例如，Kataoka,N.，A.Miya,和K.Kiriyama,1997,Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria,WaterScienceandTechnology36(6-7):41-47;和GunaseelanV.N.于BiomassandBioenergy,Vol.13(1-2),pp.83-114,1997,Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。通收可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法，任選地從發(fā)酵培養(yǎng)基回收發(fā)酵產(chǎn)物，所述方法包括，但不限于，層析、電泳方法、差示溶解度、蒸餾或提取。例如，通過常規(guī)蒸餾方法從發(fā)酵的纖維素材料分離并純化醇?？梢垣@得純度高達(dá)約96vol%的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、飲用乙醇，即，中性飲料酒,或工業(yè)乙醇。其他用途本發(fā)明的多肽還可與其他木聚糖分解酶的有限活性一同使用以降解木聚糖以供產(chǎn)生寡糖。所述寡糖可用作填充劑(bulkingagent),如從谷物細(xì)胞壁材料釋放的阿拉伯木聚糖寡糖，或來自谷物的或多或少(moreorless)經(jīng)純化的阿拉伯木聚糖。本發(fā)明的多肽還可用于與其他木聚糖分解酶組合以將木聚糖降解為木糖和其他單糖(美國(guó)專利5，658，765號(hào))。釋放出的木糖可轉(zhuǎn)化為其他化合物。本發(fā)明的多肽可與其他酶如葡聚糖酶一同使用以促進(jìn)從富油植物材料提取油，如從玉米胚提取玉米油。本發(fā)明的多肽還可用于烘烤以改善生面團(tuán)的成熟(development)、彈性和/或穩(wěn)定性，和/或烘烤產(chǎn)品的體積、瓤結(jié)構(gòu)(crumbstructure)和/或防腐性(anti-stalingproperty)(參見美國(guó)專利5，693，518號(hào))。所述多肽還可用于制備從任何類型的面粉或粉(例如基于小麥、黑麥、大麥、燕麥或玉米的)制備的生面團(tuán)或烘烤產(chǎn)品。用本發(fā)明的多肽產(chǎn)生的烘烤產(chǎn)品包括面包、小白面包(roll)、法國(guó)棍狀面包(baquette)等。就烘烤目的，本發(fā)明的多肽可用作僅有的或主要的酶活性，或可與其他酶如木聚糖酶、脂肪酶、淀粉酶、氧化酶(例如葡糖氧化酶、過氧化物酶)、漆酶和/或蛋白酶組合使用。本發(fā)明的多肽亦可用于修飾動(dòng)物飼料并可在體外(通過修飾飼料的組分)或在體內(nèi)施加其作用以改善飼料的可消化性并增加其利用效率(美國(guó)專利6，245，546號(hào))?？蓪⑺龆嚯奶砑又涟吡堪⒗揪厶呛推咸侨┧崮揪厶堑娘暳辖M合物中，例如包含谷物如大麥、小麥、黑麥、燕麥或玉米的飼料。當(dāng)添加至飼料時(shí)，多肽會(huì)改善植物細(xì)胞壁材料的體內(nèi)降解，這部分是由于腸粘度(intestinalviscosity)的減少(Bedford等,1993,Proceedingsofthe1stSymposiumonEnzymesinAnimalNutrition,pp.73-77),由此實(shí)現(xiàn)動(dòng)物對(duì)植物營(yíng)養(yǎng)利用的改善。由此,改善了動(dòng)物的生長(zhǎng)速率和/或飼料轉(zhuǎn)化率(即攝入的飼料的重量相對(duì)于體重增加的比例)。本發(fā)明的多肽還可用于造紙和紙漿工業(yè)，用于漂白工藝以增強(qiáng)經(jīng)漂白的紙漿的亮度由此減少在漂白階段使用的氯的量，和用于在回收紙工藝中增加紙漿的自由度(freeness)(Eriksson,1990，WoodScienceandTechnology24:79-101;Paice等，1988，Biotechnol.andBioeng.32:235-239，和Pommier等，1989，TappiJournal187-191)，但不限于此。對(duì)木素纖維素紙漿的處理可例如如美國(guó)專利5，658，765號(hào)、WO93/08275,WO91/02839和WO92/03608中所述進(jìn)行。本發(fā)明的多肽還可用于啤酒釀造，特別是用于改善包含例如大麥和/或高粱麥芽的麥芽汁的可濾過性(filterability)(W02002/24926)。所述多肽可以以相同方式用作常規(guī)用于釀造的戊聚糖酶，例如，如Vietor等，1993，J.Inst.Brew.99:243-248和EP227159所述。此外，所述多肽可用于處理釀酒干酒糟(brewersspentgrain),即包含大麥或發(fā)芽大麥或其他谷物的啤酒麥芽汁產(chǎn)生的殘余物，從而改善所述殘余物的利用，例如，用于動(dòng)物飼料。本發(fā)明的多肽還可用于分離植物細(xì)胞材料的組分，特別是谷物組分如小麥組分。最令人感興趣的是將小麥分離為麩質(zhì)(gluten)和淀粉，即有很大商業(yè)利益的組分。該分離工藝可通過本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行，如作為水力旋流器或傾析器工藝進(jìn)行的所謂掛糊(batter)工藝(或濕法磨制工藝)。在該掛糊工藝中，起始材料是待進(jìn)行分離的植物材料如小麥的稀而可泵送的分散物。在小麥分離工藝中，通常從小麥粉和水制備所述分散物。本發(fā)明的多肽還可用于制備水果或蔬菜汁以增加產(chǎn)率(參見，例如美國(guó)專利號(hào)6，228，630)。本發(fā)明的多肽還可用作紡織品的酶法煮煉(scouring)系統(tǒng)(參見，例如美國(guó)專利號(hào)6，258，590)的組分。本發(fā)明的多肽還可與其他酶功能性(functionality)組合用于洗衣去污劑應(yīng)用(參見，例如美國(guó)專利號(hào)5，696，068)。信號(hào)肽本發(fā)明還涉及編碼信號(hào)肽的分離的多核苷酸，所述信號(hào)肽包含SEQIDN0:2的氨基酸I至19，或由SEQIDNO:2的氨基酸I至19組成。所述多核苷酸還可包含編碼蛋白質(zhì)的基因，其可操作地連接于所述信號(hào)肽。所述蛋白質(zhì)優(yōu)選對(duì)于所述信號(hào)肽是外源的。在一個(gè)方面，對(duì)于所述信號(hào)肽的多核苷酸為SEQIDNO:I的核苷酸I至57。本發(fā)明還涉及包含此種多核苷酸的核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，包括(a)培養(yǎng)包含此種多核苷酸的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)對(duì)于宿主細(xì)胞可以是天然的或異源的。術(shù)語“蛋白質(zhì)”在本文的意思不是指特定長(zhǎng)度的編碼產(chǎn)物，并且因此包含肽、寡肽和多肽。術(shù)語“蛋白質(zhì)”還包含組合以形成編碼產(chǎn)物的兩種以上多肽。所述蛋白質(zhì)還包括雜合多肽和融合多肽。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分，或報(bào)道蛋白(reporter)。例如,所述蛋白質(zhì)可為氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、異構(gòu)酶或連接酶，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酹氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶?；蚩梢詮娜魏卧恕⒄婧嘶蚱渌鼇碓传@得。通過以下實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述，但不應(yīng)將其理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例材料作為緩沖液和底物使用的化學(xué)品是至少試劑等級(jí)的商業(yè)產(chǎn)品。菌株將褐孢長(zhǎng)毛盤菌菌株CBS804.70用作編碼家族GHlO木聚糖酶的基因的來源。使用釀酒酵母菌株胃3124(獻(xiàn)1&;11以3-52;Ieu2-3，112;his3-D200;pep4-1137;prcl::HIS3;prbl::LEU2;cir+)以供就木聚糖酶活性篩選褐孢長(zhǎng)毛盤菌菌株CBS804.70表達(dá)文庫。將米曲霉菌株BECh2(α-淀粉酶陰性)用于表達(dá)褐孢長(zhǎng)毛盤菌ghlOa基因。培養(yǎng)基和溶液PDA平板組成為39g的馬鈴薯右旋糖瓊脂和去離子水加至I升。MEX-I培養(yǎng)基組成為20g的大豆粉，15g的麥麩，IOg的微晶纖維素(AVICEL；FMC,Philadelphia,PA,USA)，5g的麥芽糊精，3g的Bactopeptone,O.2g的Pluronic,Ig的橄欖油，去離子水加至I升。LB培養(yǎng)基組成為10g的胰蛋白胨，5g的酵母提取物，和5g的氯化鈉，去離子水加至I升。LB氨芐青霉素培養(yǎng)基組成為50mg的氨芐青霉素(經(jīng)過濾滅菌，在高壓滅菌之后添加)每升的LB培養(yǎng)基。LB氨芐青霉素平板組成為15g的細(xì)菌用瓊脂每升的LB氨芐青霉素培養(yǎng)基。YPD培養(yǎng)基組成為1%酵母提取物，2%蛋白胨，和在高壓滅菌之后添加過濾滅菌的2%葡萄糖。含葡萄糖或半乳糖SC-URA培養(yǎng)基組成為100ml的IOXBasal鹽，25ml的20%不含維生素的酪蛋白氨基酸，IOml的1%色氨酸，4ml的5%蘇氨酸(經(jīng)過濾滅菌，在高壓滅菌之后添加)，和IOOml的20%葡萄糖或IOOml的20%半乳糖(經(jīng)過濾滅菌，在高壓滅菌之后添加)，去離子水加至I升。IOXBasal鹽溶液組成為75g的YeastNitrogenBase(酵母氮基)，113g的琥拍酸，68g的NaOH，去離子水加至I升。SC-瓊脂平板組成為20g的瓊脂每升的SC-URA培養(yǎng)基(如指示含葡萄糖或半乳糖)。含半乳糖的O.P/oAZCL木聚糖SC-URA瓊脂平板組成為20g的瓊脂每升的含半乳糖的SC-URA培養(yǎng)基和O.1%AZCL燕麥木聚糖(Megazyme,Wicklow,Ireland)。含半乳糖的SC-URA培養(yǎng)基組成為900ml的SC-GrundAgar(經(jīng)高壓滅菌的)，4ml的5%蘇氨酸(經(jīng)過濾滅菌的)，和IOOml的20%半乳糖(經(jīng)過濾滅菌的)。SC-GrundAgar組成為7.5gYeastNitrogenBase(無氛基酸)，11.3g的玻拍酸，6.8g的氫氧化鈉，5.6g的酪蛋白氨基酸，0.Ig的L-色氨酸，20g的瓊脂，去離子水加至I升°COVE平板組成為342.3g的蔗糖，25g的Noble瓊脂，20ml的COVE鹽溶液，IOmM乙酰胺，20mMCsCl，去離子水加至I升。在高壓滅菌之前將溶液調(diào)整至pH7.0。COVE鹽溶液組成為26g的KCl，26g的MgSO4·7Η20，76g的KH2PO4,50ml的COVE痕量金屬溶液，去離子水加至I升。COVE痕量金屬溶液組成為0.04g的NaB4O7·IOH20,0.4g的CuSO4·5H20,1.2g的FeSO4·7Η20，0·7g的MnSO4·H20,0.8g的Na2MoO2·2H20,IOg的ZnSO4·7H20，去離子水加至I升°MDU2BP培養(yǎng)基組成為45g的麥芽糖，Ig的MgSO4·7H20,Ig的NaCl，2g的K2SO4,12g的KH2PO4,7g的酵母提取物，2g的尿素，0.5ml的AMG痕量金屬溶液；pH5.O,去離子水加至I升。AMG痕量金屬溶液組成為14.3g的ZnSO4·7H20,2.5g的CuSO4·5H20,0.5g的NiCl2·6H20,13.8g的FeSO4·7Η20，8·5g的MnSO4·7H20，3g的檸檬酸，去離子水加至I升。實(shí)施例I:在釀酒酵母中構(gòu)建褐孢長(zhǎng)毛盤菌CBS804.70cDNA表達(dá)文庫將褐孢長(zhǎng)毛盤菌CBS804.70接種于PDA平板上，并在28°C溫育7天。將幾個(gè)菌絲體-PDA瓊脂栓接種入含有IOOml的MEX-I培養(yǎng)基的750ml搖瓶。將搖瓶在37°C以150rpm攪拌9日。通過過濾經(jīng)過M1RACLOTH(Calbiochem，SanDiego,CA，USA)然后凍結(jié)于液氮收獲真菌菌絲體，。然后將菌絲體通過在用液氮預(yù)冷的咖啡磨中將凍結(jié)的菌絲體與等體積的干冰一同磨制來粉碎為粉末。將粉末轉(zhuǎn)移至液氮預(yù)冷的杵和研缽，并用少量烘烤的石英砂(quartzsand)研磨至細(xì)粉。將粉末狀菌絲體材料保存在_80°C直至使用。從凍結(jié)的、粉末狀褐孢長(zhǎng)毛盤菌CBS804.70的菌絲體根據(jù)Chirgwin等，1979，Biochemistry18:5294-5299通過用硫氰酸胍提取接著通過5.7MCsCl墊(cushion)的超離心來制備總RNA。根據(jù)Aviv等,1972,Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:1408-1412通過寡聚(dT)纖維素親和層析分離多聚A富集的RNA。雙鏈cDNA根據(jù)Gubler和Hoffman,1983，Gene25:263-269;Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniantis,T.Molecularcloning:ALaboratoryManual,2nded.,1989,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork;以及Kofod等，1994，J.Biol.Chem.269:29182-29189的一般性方法使用多聚A-NotI引物(PromegaCorp.，Madison,Wisconsin,USA)來合成。在合成之后，將cDNA用綠豆核酸酶處理，用T4DNA聚合酶平端化，并連接于50倍摩爾過量的EcoRI銜接頭(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA,USA)。用NotI切割cDNA,并將cDNA通過使用AArMTris喊,AArM硼酸，O.5mMEDTA(TBE)緩沖液的O.8%瓊脂糖凝膠電泳來進(jìn)行大小分級(jí)。將700bp和更大的cDNA的級(jí)分從凝膠切出，并使用GFXPCRDNA和GelBandPurificationKit(AmershamBiosciences,UnitedKingdom)根據(jù)生產(chǎn)商的指示純化。將定向的，經(jīng)大小分級(jí)的cDNA連接入EcoRI-NotI切割的pYES2.O(lnvitrogen，Carlsbad,CA，USA)。連接反應(yīng)通過在16°C溫育12小時(shí)，然后在70°C加熱20分鐘,最后將10μI水添加至每個(gè)試管來進(jìn)行。如Sambrook等，1989，見上所述將一μI的每個(gè)連接混合物電穿孔入40μI的電感受態(tài)大腸桿菌DHlOB細(xì)胞(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA,USA)。在由匯集物組成的大腸桿菌中構(gòu)建褐孢長(zhǎng)毛盤菌CBS804.70文庫。每個(gè)匯集物通過將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌鋪板于LB氨芐青霉素平板來制備，在37°C溫育24小時(shí)之后產(chǎn)生15，000-30,000個(gè)菌落/平板。將二十ml的LB培養(yǎng)基添加至平板，并將細(xì)胞懸于其中。將細(xì)胞懸液在37°C在50ml管中振蕩I小時(shí)。使用MidiPlasmidKit(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA),根據(jù)生產(chǎn)商的指不從褐孢長(zhǎng)毛盤菌CBS804.70的幾種文庫匯集物分離質(zhì)粒DNA，并儲(chǔ)藏于_20°C。實(shí)施例2:就木聚糖酶活性篩選褐孢長(zhǎng)毛盤菌CBS804.70表達(dá)文庫將來自幾種文庫匯集物的純化的質(zhì)粒DNA的一μI等分試樣通過電穿孔(Becker和Guarante,1991，MethodsEnzymol.194:182-187)轉(zhuǎn)化入釀酒酵母W3124,并將轉(zhuǎn)化體鋪板于含有2%葡萄糖的SC-瓊脂平板上，并在30°C溫育?？偣矎拿總€(gè)匯集物獲得了含有250-400個(gè)酵母菌落的50-100個(gè)平板。在3_5日的溫育之后，將SC瓊脂平板復(fù)制鋪板(replicaplate)于一組含半乳糖的O.1%AZCL木聚糖(燕麥)SC-URA瓊脂平板上。將平板在30°C溫育2-4日，然后將由藍(lán)色暈圈包圍的菌落鑒定為木聚糖酶陽性菌落。將陽性菌落劃線純化并作為單菌落獲得。實(shí)施例3:褐孢長(zhǎng)毛盤菌CBS804.70ghl0a基因的表征將木聚糖酶表達(dá)酵母菌落接種于25ml管中的5ml的YPD培養(yǎng)基。將試管在30°C振蕩過夜。離心一ml的培養(yǎng)物以沉淀酵母細(xì)胞。根據(jù)WO94/14953分離DNA，并重新溶解于50μI的水。將DNA使用標(biāo)準(zhǔn)步驟(Sambrook等，1989，見上)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DHlOB。從大腸桿菌轉(zhuǎn)化體使用標(biāo)準(zhǔn)步驟(Sambrook等，1989，見上)分離質(zhì)粒DNA。使用兩種pYES引物作為測(cè)序引物對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。發(fā)現(xiàn)一個(gè)命名為TF12Xyll70的1283bp的特定質(zhì)粒克隆編碼家族10糖苷水解酶蛋白，并對(duì)其進(jìn)一步表征。通過使用基于起始序列設(shè)計(jì)的如下所示的特異性引物對(duì)所述片段進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)序獲得了更加可靠的序列TF12Xyll70Fl5，-TGAAATGGGATGCTACTGA-3，(SEQIDNO:3)TF12Xyll70F25，-CAACGACTACAACATCGAGG-3’(SEQIDNO:4)TF12Xyll70Rl5，-ATTTGCTGTCCACCAGTGAA-3’(SEQIDNO:5)將一個(gè)匹配起始cDNA序列的質(zhì)粒命名為pTF12Xyll70，并將含有該克隆的大腸桿菌菌株命名為大腸桿菌pTF12Xyll70，并于2009年7月28日保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)，Peoria,IL,USA),并分配登錄號(hào)NRRLB-50309。褐孢長(zhǎng)毛盤菌ghlOa基因的核苷酸序列(SEQIDNO:I)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:2)示于圖I。編碼序列為1197bp，包括終止密碼子。編碼的預(yù)測(cè)的蛋白含有398個(gè)氨基酸。基因編碼區(qū)的％G+C為53.6%，而成熟多肽編碼區(qū)的％G+C亦為53.6%。使用SignalP程序，版本3(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10:1-6),預(yù)測(cè)了19個(gè)殘基的信號(hào)肽。預(yù)測(cè)的成熟蛋白含有379個(gè)氨基酸，具有40.4kDa的預(yù)測(cè)的分子量。用Interproscan程序(Zdobnov和Apweiler,2001,Bioinformatics17:847-848)分析ghlOa基因推導(dǎo)的氣基酸序列顯不GHlOA蛋白含有家族10糖昔水解酶典型的核心序列，從預(yù)測(cè)的成熟多肽的大約氨基酸殘基65延伸至殘基377。GH10A蛋白亦含有類型I真菌纖維素結(jié)合域(CBMI)的序列特征。該稱作PrositeEntryPS00562(Sigrist等，2002，BriefBioinform.3:265-274)的存在于預(yù)測(cè)的成熟多肽的氨基酸殘基8至殘基35。使用如EMBOSS的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，J.Mol.Biol.48:443-453)以缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為O.5和EBL0SUM62矩陣確定了氨基酸序列的比較逐對(duì)全局比對(duì)。該比對(duì)顯示編碼GHlOA成熟多肽的褐孢長(zhǎng)毛盤菌基因的推導(dǎo)的氨基酸序列與來自黃孢平革菌和巨多孔菌的家族10糖苷水解酶蛋白的推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為登錄號(hào)UNIPR0T:B7SIW2和GENESEQP:AAW23327)分別享有62.6%和62.0%同一性(排除缺口)。實(shí)施例4:褐孢長(zhǎng)毛盤菌CBS804.70ghl0a基因在米曲霉中的表達(dá)使用BamHI和XhoI從pTF12xyll70切出褐孢長(zhǎng)毛盤菌CBS804.70ghl0a基因，并使用標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，1989，見上)連接入亦用BamHI和XhoI消化的曲霉屬表達(dá)載體pDAul09(W02005/042735)。將連接反應(yīng)物根據(jù)生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TOPlO化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)。將八個(gè)菌落在LB氨芐青霉素培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過夜，并使用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)根據(jù)生產(chǎn)商的指示分離質(zhì)粒DNA。對(duì)含有正確大小插入的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序以確定插入的完整性和取向。發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pDAu81#5不含錯(cuò)誤，并因此選擇用于放大。如WO95/02043中所述制備米曲霉BECH2的原生質(zhì)體。如WO00/139322中所述構(gòu)建米曲霉BECh2。將一百微升的原生質(zhì)體懸液與IOyl的STC中的5-25μ8的曲霉屬表達(dá)載體pDAu81#5混合，所述STC組成為I.2M山梨醇，IOmMTris-HCl,pH7.5，IOmMCaCl2(Christensen等，1988，Bio/Technology6:1419-1422)。將混合物在室溫靜置25分鐘。添加兩百微升的60%PEG4000(BDH,Poole,England)(聚乙二醇，分子量4，000)，IOmMCaCl2,和IOmMTris-HClρΗ7·5，并輕柔地混合，并最終添加O.85ml的相同溶液，并輕柔地混合。將混合物在室溫靜置25分鐘，然后以2，500xg離心15分鐘。將沉淀懸于2ml的1.2M山梨醇。重復(fù)該沉積過程，并將原生質(zhì)體鋪板于COVE平板。在37°C溫育4-7日之后，挑取孢子，并鋪板于含有0.01%TRITONX-100的COVE平板上以供分離單個(gè)菌落。將鋪板在含有IM鹿糖和IOmM硝酸鈉的COVE鹿糖培養(yǎng)基(Cove,1996,Biochim.Biophys.Acta133:51-56)上再重復(fù)兩次。將十個(gè)轉(zhuǎn)化體分別接種于IOml的YPG培養(yǎng)基。在30°C，200rpm溫育3-4日之后，去除上清，并如生產(chǎn)商推薦通過SDS-PAGE10%Bis-Tris凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分析。用考馬斯藍(lán)對(duì)凝膠染色，且所有的分離物顯示35至45kDa的彌散條帶。進(jìn)一步就木聚糖酶活性在pH6使用修飾的AZCL阿拉伯木聚糖作為底物(小麥；MegazymeInternationalIreland,Ltd.,Bray,Co.Wicklow,Ireland)在含有0.01%TRITON'x-100的0.2M磷酸鈉pH6.0緩沖液中根據(jù)生產(chǎn)商的指示對(duì)這些轉(zhuǎn)化體進(jìn)行分析。選擇產(chǎn)生最高水平的活性的轉(zhuǎn)化體以供產(chǎn)生木聚糖酶。使用標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)產(chǎn)生最高水平的活性的轉(zhuǎn)化體。使用Whatmann玻璃濾器GF/D，GF/A,GF/C,GF/F(分另Ij為2.7μm，I.6μm，I.2μm和0.7μm)(Whatman,Piscataway,NJ,USA)接著使用NALGENE⑧瓶頂O.45μm過濾器(ThermoFisherScientific,Rochester,NY,USA)過濾來過濾培養(yǎng)液。將硫酸銨添加至過濾的培養(yǎng)液至3M的終濃度，并在以10，OOOxg離心30分鐘后收集沉淀。將沉淀溶解于IOmMTris/HClpH8.O并針對(duì)10mMTris/HClpH8.O進(jìn)行透析過夜。將透析的制備物施于用IOmMTris/HClpH8.0平衡的150mlQSEPHAROSEFastFlow柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA),并用IOmMTris/HClpH8.0中1050ml(7個(gè)柱體積)0至IMNaCl的線性鹽梯度洗脫酶。接著在280nm進(jìn)行洗脫，并收集級(jí)分，并就木聚糖酶活性在37°C使用含有0.01%TRITONX-100的0.2M磷酸鈉緩沖液pH6.O中的來自小麥的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖進(jìn)行測(cè)定。匯集含有木聚糖酶活性的級(jí)分，并儲(chǔ)藏于-20°C。實(shí)施例5:煙曲霉NN055679Cel7A纖維二糖水解酶I的制備對(duì)煙曲霉部分基因組序列(TheInstituteforGenomicResearch,Rockville,MD)的tfasty檢索(Pearson等，1997，Genomics46:24-36)使用來自里氏木霉的Cel7纖維二糖水解酶蛋白序列(登錄號(hào)P00725)作為查詢序列進(jìn)行?；谂c查詢序列在氨基酸水平的高度相似性，將幾個(gè)基因鑒定為推定的家族GH7同源物。選擇一個(gè)與查詢序列具有顯著同一性的基因組區(qū)進(jìn)行進(jìn)一步研究，并將相應(yīng)的基因命名為cel7A。設(shè)計(jì)了如下所示的兩個(gè)合成寡核苷酸引物以從如WO2005/047499中所述制備的煙曲霉的基因組DNAPCR克隆煙曲霉NN055679cel7A纖維二糖水解酶I基因(SEQIDNO:6[DNA序列]和SEQIDNO:7[推導(dǎo)的氨基酸序列])。正向引物5'-gggcATGCTGGCCTCCACCTTCTCC-3'(SEQIDNO:8)反向引物5'-gggttaattaaCTACAGGCACTGAGAGTAA-3’(SEQIDNO:9)大寫字母代表編碼序列。剩余序列提供在正向和反向序列中分別提供了SphI和PacI的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。使用這些引物，使用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法擴(kuò)增了煙曲霉cel7A基因，并通過使用40mMTris堿-20mM乙酸鈉-ImMEDTA二鈉鹽(TAE)的1%瓊脂糖凝膠電泳來分離反應(yīng)產(chǎn)物，并使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)根據(jù)生產(chǎn)商的指示純化。將片段用SphI和PacI消化，并連接入亦用SphI和PacI根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟消化的表達(dá)載體pAlLo2(W02004/099228)。將連接反應(yīng)物根據(jù)生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XLlOSOLOPACK細(xì)胞(Stratagene，LaJolla,CA,USA)。通過限制性消化檢測(cè)出了含有正確大小的質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體，并使用BIOROBOT⑧9600(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)制備質(zhì)粒DNA。來自該質(zhì)粒的插入基因的DNA測(cè)序用Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XLAutomatedDNASequencer(Perkin-Elmer/AppliedBiosystems,Inc.,FosterCity,CA,USA)使用染料終止子化學(xué)(Giesecke等，1992，JournalofVirologyMethods38:47-60)和引物步移策略進(jìn)行。就品質(zhì)審視核苷酸序列，且以PHRED/PHRAP軟件(UniversityofWashington,Seattle,WA,USA)的協(xié)助將所有序列相互比較。顯示核苷酸序列匹配由TIGR確定的基因組序列(SEQIDNO:6[DNA序列]和SEQIDNO:7[推導(dǎo)的氨基酸序列])。所得的質(zhì)粒命名為pEJG93。根據(jù)Christensen等，1988，見上的方法制備米曲霉JaL250(W099/61651)原生質(zhì)體，并用5μg的pEJG93(以及PAlLo2作為載體對(duì)照)轉(zhuǎn)化。該轉(zhuǎn)化產(chǎn)生100個(gè)轉(zhuǎn)化體。將十個(gè)轉(zhuǎn)化體分離至單個(gè)PDA平板。用5ml的0.01%TWEEN20洗滌十個(gè)轉(zhuǎn)化體中的五個(gè)的匯合PDA平板，并分別接種入125ml玻璃搖瓶中的25ml的MDU2BP培養(yǎng)基，并在34°C，250rpm溫育。在溫育之后五日，使用8-16%Tris_GlycineSDS-PAGE凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)根據(jù)生產(chǎn)商的指示分析來自每個(gè)培養(yǎng)的0.5μI的上清。培養(yǎng)物的SDS-PAGE概貌顯示轉(zhuǎn)化體之一具有大約70kDa的主要條帶，該轉(zhuǎn)化體命名為米曲霉JaL250EJG93。將五百ml的搖瓶培養(yǎng)基添加至2800ml搖瓶。搖瓶培養(yǎng)基組成為45g的麥芽糖，2g的K2HPO4,12g的KH2PO4,Ig的NaCl,Ig的MgSO4·7Η20，7g的酵母提取物，2g的尿素，O.5ml的痕量元素溶液，去離子水加至I升。所述痕量元素溶液組成為13.8g的FeSO4·7H20,14.3g的ZnSO4·7H20，8.5g的MnSO4·H2O,2.5g的CuSO4·5H20，O.5g的NiCl2·6H20，3g的檸檬酸，去離子水加至I升。將兩個(gè)搖瓶用含O.01%TWEEN80的米曲霉JaL250EJG93的PDA平板的懸液接種，并在34°C在定軌振蕩器以200rpm溫育120小時(shí)。使用O.7μmWhatman玻璃過濾器GF/F(Whatman,Piscataway,NJ,USA)繼以O(shè).22μmEXPRESSPlusMembrane(Millipore,Bedford,MA,USA)來過濾培養(yǎng)液。濃縮經(jīng)過濾的培養(yǎng)液，并將其用20mMTris-HClpH8.5使用配置有IOkDa聚醚諷膜(PallFiltron,Northborough,MA,USA)的切線流濃縮器(PaliFiltron,Northborough,MA,USA)進(jìn)行緩沖液交換。使用MicroplateBCAProteinAssayKit(ThermoFischerScientific,Waltham,MA,USA)確定蛋白濃度，其中使用牛血清白蛋白作為蛋白標(biāo)樣。實(shí)施例6:嗜熱毀絲霉CBS117.65Cel6A纖維二糖水解酶II的制備根據(jù)如下所述的步驟獲得嗜熱毀絲霉CBS117.65Cel6A纖維二糖水解酶II(SEQIDNO:10[DNA序列]和SEQIDNO:11[推導(dǎo)的氨基酸序列])。將一百ml的搖瓶培養(yǎng)基添加至500ml搖瓶。所述搖瓶培養(yǎng)基組成為15g的葡萄糖，4g的K2HPO4,Ig的NaCl,O.2g的MgSO4·7H20，2g的MES游離酸，Ig的細(xì)菌用蛋白胨，5g的酵母提取物，2.5g的檸檬酸，O.2g的CaCl2*2H20,5g的NH4NO3,Iml的痕量元素溶液，去離子水加至I升。所述痕量元素溶液組成為I.2g的FeSO4·7H20,IOg的ZnSO4·7H20,0.7g的MnSO4·H2O,O.4g的CuSO4·5H20,0.4g的Na2B4O7·IOH2O,O.8g的Na2MoO2·2H20,去離子水加至I升。將搖瓶用來自嗜熱毀絲霉菌株CBS117.65的固體平板培養(yǎng)物的兩個(gè)栓(plug)接種搖瓶，并在45°C以200rpm振蕩溫育48小時(shí)。使用五十ml的搖瓶培養(yǎng)液以接種2升發(fā)酵容器。發(fā)酵批次培養(yǎng)基組成為5g的酵母提取物，176g的粉末狀纖維素，2g的葡萄糖，Ig的NaCl，Ig的細(xì)菌用蛋白胨，4g的K2HPO4,0.2g的CaCl2·2H20，0.2g的MgSO4·7Η20，2·5g的檸檬酸，5g的NH4NO3,1.8ml的消泡劑，Iml的痕量元素溶液(見上)，去離子水加至I升。發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)基組成為水和消泡劑。將總共I.8升的發(fā)酵批次培養(yǎng)基添加至兩升玻璃夾套發(fā)酵罐(ApplikonBiotechnology,Schiedam,Netherlands)。將發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)基以4g/l/hr的速率施用72小時(shí)的時(shí)間。將發(fā)酵容器保持在45的溫度，并使用Applikon1030控制系統(tǒng)(ApplikonBiotechnology,Schiedam,Netherlands)將pH控制于5.6+/-0.I的設(shè)定點(diǎn)。將空氣以Ivvm白勺速率添加至容器，并用以1100至1300rpm旋轉(zhuǎn)的Rushton葉輪攪拌培養(yǎng)液。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，從容器收獲全培養(yǎng)液，并以3000xg離心以去除生物質(zhì)。將如上所述獲得的收獲的培養(yǎng)液在500ml瓶中在4°C以13，OOOxg離心20分鐘，然后使用O.22μm聚醚砜膜(Millipore，Bedford，MA，USA)滅菌過濾。濃縮過濾的培養(yǎng)液，并用20mMTris-HClpH8.5使用配置有IOkDa聚醚砜膜的切線流濃縮器以大約20psi進(jìn)行緩沖液交換。為了減少色素的量，將濃縮物施于用20mMTris-HClpH8.5平衡的60mlQSEPHAR0SEBigBead柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)，并用含有600mMNaCl的平衡緩沖液進(jìn)行逐步洗脫。在用GELCODEBlueStainReagent(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)染色的8-16%CRITERIONSDS-PAGE凝膠(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)上分析流過物和洗脫物級(jí)分。如根據(jù)對(duì)應(yīng)于通過SDS-PAGE所得的蛋白表觀分子量(大約75kDa)的條帶的存在判斷，流過物級(jí)分含有嗜熱毀絲霉Cel6A纖維二糖水解酶。使用配置有IOkDa聚醚砜膜的超濾裝置(Millipore,Bedford,MA,USA)在40psi，4°C濃縮流過物級(jí)分，并與等體積的含有3.4M硫酸銨的20mMTis-HClpH7.5混合至I.7M硫酸銨的終濃度。過濾樣品(O.2μM注射器式濾器(syringefiIter),聚醚砜膜，Whatman,Maidstone,UnitedKingdom)以去除顆粒狀物質(zhì)，然后加載于用20mMTris-HClpH7·5中的I.7Μ硫酸銨平衡的PHENYLSUPER0SE柱(HR16/10,GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)。用12柱體積的20mMTris-HClpH7·5中I.7Μ硫酸銨至OM硫酸銨的減少鹽梯度洗脫結(jié)合的蛋白。如上所述通過8-16%SDS-PAGE凝膠電泳分析級(jí)分，其揭示嗜熱毀絲霉Cel6A纖維二糖水解酶在梯度最末端洗脫(大約20mM硫酸銨)。匯集含有Cel6A纖維二糖水解酶的級(jí)分，并在20mMTris-HClpH9.O中稀釋10倍(以降低鹽并增加pH)，然后施于用20mMTris-HClpH9.O平衡的RESOURCEQ柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)。用20柱體積20mMTris_HClpH9.O中的OmM至550mMNaCl的鹽梯度洗脫結(jié)合的蛋白。嗜熱毀絲霉Cel6A纖維二糖水解酶II作為單峰在梯度早期洗脫(大約25mMNaCl)。如通過SDS-PAGE判斷，纖維二糖水解酶II為>90%純。使用BCAProteinAssayKit確定蛋白濃度,其中牛血清白蛋白用作蛋白標(biāo)樣。實(shí)施例7:里氏木霉RutC30Cel7B內(nèi)切葡聚糖酶I的制備根據(jù)WO2005/067531使用米曲霉JaL250作為宿主重組制備里氏木霉RutC30Cel7B內(nèi)切葡聚糖酶I(EGI)(SEQIDNO:12[DNA序列]和SEQIDNO:13[推導(dǎo)的氨基酸序列])。將收獲的培養(yǎng)液在500ml瓶中在4°C以13，OOOxg離心20分鐘，然后使用0.22μm聚醚砜膜(Millipore，Bedford，MA，USA)進(jìn)行過濾滅菌。將過濾的培養(yǎng)液濃縮，并用20mMTris-HClpH8.5使用配置有IOkDa聚醚砜膜的切線流濃縮器進(jìn)行緩沖液交換。將樣品加載于用20mMTris-HClpH8.5平衡的QSEPHAROSEHighPerformance柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)上，并用含有600mMNaCl的平衡緩沖液進(jìn)行逐步洗脫。通過SGS-PAGE使用CRITERION無染色顯影系統(tǒng)(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules，CA,USA)分析流過物和洗脫物級(jí)分。將含有里氏木霉Cel7BEGI的洗脫物級(jí)分匯集，濃縮，并緩沖液交換入20mMTris-HClpH8.5。使用MicroplateBCAProteinAssayKit確定蛋白濃度，其中使用牛血清白蛋白作為蛋白標(biāo)樣。實(shí)施例8:嗜熱毀絲霉CBS202.75Cel5A內(nèi)切葡聚糖酶II的制備根據(jù)WO2007/109441使用米曲霉HowB104作為宿主重組制備嗜熱毀絲霉CBS202.75Cel5A內(nèi)切葡聚糖酶II(EGII)(SEQIDNO:14[DNA序列]和SEQIDNO:15[推導(dǎo)的氨基酸序列])。將培養(yǎng)濾過物使用HIPREP26/10脫鹽柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)根據(jù)生產(chǎn)商的指示脫鹽并緩沖液交換入20mMTrispH8.0。將經(jīng)緩沖液交換的樣品施于用20mMTrispH8.O平衡的MonoQ柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA),并用O至500mM氯化鈉的梯度洗脫結(jié)合的蛋白。匯集級(jí)分，并濃縮于20mMTrispH8.0。使用MicroplateBCAProteinAssayKit確定蛋白濃度，其中使用牛血清白蛋白作為蛋白標(biāo)樣。實(shí)施例9:具有纖維素分解增強(qiáng)活性的橙橘嗜熱子囊菌CGMCC0583GH61A多肽的制備根據(jù)WO2005/074656使用米曲霉JaL250作為宿主重組制備具有纖維素分解增強(qiáng)活性的橙橘嗜熱子囊菌CGMCC0583GH61A多肽(SEQIDNO:16[DNA序列]和SEQIDN0:17[推導(dǎo)的氨基酸序列])。將重組產(chǎn)生的橙橘嗜熱子囊菌GH61A多肽首先通過使用IOkDa膜的超濾進(jìn)行濃縮，緩沖液交換至20mMTris-HClpH8.0，然后使用100mlQSEPHAROSEBigBeads柱用600ml的相同緩沖液中0_600mMNaCl線性梯度進(jìn)行純化。收集IOml的級(jí)分，并基于SDS-PAGE匯集。然后將匯集的級(jí)分(9Oml)使用2OmlMONOQ⑧柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)用500ml的相同緩沖液中的0_500mMNaCl線性梯度進(jìn)一步純化。收集6ml的級(jí)分，并基于SDS-PAGE匯集。將匯集的級(jí)分(24ml)通過使用IOkDa膜的超濾濃縮，然后使用320mlSUPERDEX75SEC柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)以大約I.3升的150mMNaCl-20mMTris-HClpH8.O的等度洗脫來進(jìn)行層析。收集20ml的級(jí)分，并基于SDS-PAGE匯集。使用MicroplateBCATMProteinAssayKit確定蛋白濃度,其中牛血清白蛋白用作蛋白標(biāo)樣。實(shí)施例10:具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢霉NRRL8126GH61E多肽的制備根據(jù)美國(guó)專利號(hào)7，361，495使用米曲霉JaL250作為宿主重組制備具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢霉NRRL8126GH61E多肽(SEQIDNO:18[DNA序列]和SEQIDNO:19[推導(dǎo)的氨基酸序列])。將過濾的培養(yǎng)液使月jHlPRbPK26/10DesaltingColumn根據(jù)生產(chǎn)商的指示脫鹽并緩沖液交換入20mM乙酸w-i5umMINaClpH5.O。使用MicroplateBCAProteinAssayKit確定蛋白濃度,其中使用牛血清白蛋白作為蛋白標(biāo)樣。實(shí)施例11:巴西青霉IBT20888Cel3A^-葡糖苷酶的制備根據(jù)WO2007/019442使用米曲霉作為宿主重組制備巴西青霉IBT20888Cel3AP-葡糖苷酶(SEQIDNO:20[DNA序列]和SEQIDNO:21[推導(dǎo)的氨基酸序列])。將過濾的培養(yǎng)液濃縮，并使用配置有IOkDa聚醚砜膜(PaliFiltron,Northborough,MA,USA)的切線流濃縮器(PallFiltron,Northborough,MA,USA)用20mMTris-HClpH8.O進(jìn)行緩沖液交換。將樣品加載于在20mMTrispH8.O中平衡的QSEPHAROSEHighPerformance柱上,并用0_600mM氯化鈉的梯度洗脫結(jié)合的蛋白。將級(jí)分濃縮入20mMTrispH8.0。使用MicroplateBCAProteinAssayKit確定蛋白濃度，其中使用牛血清白蛋白作為蛋白標(biāo)樣。實(shí)施例12:經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿水解測(cè)定在美國(guó)能源部國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(U.S.DepartmentofEnergyNationalRenewableEnergyLaboratory)(NREL)使用1.4wt%硫酸在165°C和107psi將玉米稻桿預(yù)處理8分鐘。預(yù)處理的玉米秸桿(PCS)中的水不溶性固形物含有56.5%纖維素，4.6%半纖維素和28.4%木質(zhì)素。通過兩階段硫酸水解,接著通過使用NRELStandardAnalyticalProcedure#002的高效液相色譜分析糖來確定纖維素和半纖維素。在用硫酸水解纖維素和半纖維素級(jí)分之后使用NRELStandardAnalyticalProcedure#003以重量分析法確定木質(zhì)素。未磨制、未洗滌的PCS(全漿料PCS)通過藉由添加IOMNaOH及充分混合將PCS的pH調(diào)整至5.0，然后在120°C高壓滅菌20分鐘來制備。全漿料PCS的干重量為29%。使用用水洗滌或不洗滌的PCS。通過在CosmosICMG40濕式多用途研磨器(EssEmmCorporation,TamilNadu,India)中磨制全衆(zhòng)料PCS來制備磨制的、未洗漆的PCS(干重量32.35%)。以相同方式，接著用去離子水洗滌，并反復(fù)傾去上清級(jí)分來制備磨制的、洗滌的PCS(干重量32.35%)。PCS的水解使用2.2ml深孔板(Axygen,UnionCity,CA,USA)在I.0ml的總反應(yīng)體積中進(jìn)行。水解用50mg的PCS(在未洗滌的PCS的情況下為不溶性固形物，而在洗滌的PCS的情況下為總固形物)每ml的50mM含有ImM硫酸錳的乙酸鈉pH5.O緩沖液和多種蛋白加載的多種酶組合物(表示為mg蛋白每克纖維素)進(jìn)行。制備酶組合物，然后以50μI至200μI范圍的體積同時(shí)添加至所有孔，使得每個(gè)反應(yīng)中終體積為1ml。然后使用ALPS-300平板熱密封器(Abgene,Epsom,UnitedKingdom)密封平板，充分混合，并在特定溫度溫育72小時(shí)。所有報(bào)道的反應(yīng)重復(fù)三次進(jìn)行。在水解之后，使用0.45μmMULTISCREEN96孔過濾板(Millipore,Bedford,MA,USA)過濾樣品，然后如下所述就糖含量分析濾過物。當(dāng)不立即使用時(shí)，將過濾的等分試樣凍結(jié)于-20°C。稀釋于0.005MH2SO4的樣品的糖濃度使用4.6x250mmAMINEXHPX-87H柱(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)通過在65°C用0.05%w/w苯甲酸-0.005MH2SO4以0.6ml每分鐘的流速洗脫，和通過來自由純糖樣品校正的折光率檢測(cè)(CHEMSTATION;AGILENT'1100HPLC，AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)的葡萄糖、纖維二糖和木糖信號(hào)的積分的定量來進(jìn)行測(cè)量。使用所得的葡萄糖和纖維二糖當(dāng)量對(duì)于每個(gè)反應(yīng)計(jì)算纖維素轉(zhuǎn)化的百分比。分別測(cè)量葡萄糖、纖維二糖和木糖。就合適的稀釋因子調(diào)整測(cè)得的糖濃度。在未洗滌的PCS的情況下，酶法產(chǎn)生的糖的凈濃度通過就在零時(shí)點(diǎn)未洗滌的PCS中相應(yīng)的背景糖濃度調(diào)整測(cè)得的糖濃度來確定。所有HPLC數(shù)據(jù)處理使用MICROSOFTEXCEL軟件(Microsoft,Richland,WA,USA)進(jìn)行。使用下式計(jì)算纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的程度％轉(zhuǎn)化=葡萄糖濃度/限制消化中的葡萄糖濃度。為了計(jì)算總轉(zhuǎn)化，將葡萄糖和纖維二糖值合并。纖維二糖濃度乘以1.053以換算為葡萄糖當(dāng)量，并將其與葡萄糖濃度相加?？偫w維素轉(zhuǎn)化程度使用下式計(jì)算％轉(zhuǎn)化=[葡萄糖濃度+1.053x(纖維二糖濃度)]/[限制消化中(葡萄糖濃度+1.053x(纖維二糖濃度)]。對(duì)于纖維二糖的I.053系數(shù)考慮了纖維二糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖時(shí)質(zhì)量的增加。為了計(jì)算％轉(zhuǎn)化，基于纖維素酶對(duì)照(50-100mg的里氏木霉纖維素酶每克纖維素)設(shè)定100%轉(zhuǎn)化點(diǎn)，并將所有值除以該數(shù)值并接著乘以100。將三次重復(fù)數(shù)據(jù)點(diǎn)取平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)施例13:在50°C，55°C和60°C使用磨制的、洗滌的PCS衡量褐孢長(zhǎng)毛盤菌GHlO木聚糖酶與高溫酶組合物的協(xié)同作用在50°C，55°C和60°C測(cè)定褐孢長(zhǎng)毛盤菌GHlO木聚糖酶與高溫酶組合物的協(xié)同作用。所述高溫酶組合物含有45%煙曲霉Cel7ACBHI，25%嗜熱毀絲霉Cel6ACBHII,5%里氏木霉Cel7BEGI,5%嗜熱毀絲霉Cel5AEGII,5%具有纖維素分解增強(qiáng)活性的橙橘嗜熱子囊菌GH61A多肽，5%具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢霉GH61E多肽和10%巴西青霉Cel3AP_葡糖苷酶。將褐孢長(zhǎng)毛盤菌GHlO木聚糖酶以O(shè).35mg蛋白每g纖維素(10%)添加至高溫酶組合物，其以3.5mg蛋白每g纖維素加載。將對(duì)于補(bǔ)充木聚糖酶的組合物(3.85mg蛋白每g纖維素)的結(jié)果與對(duì)于未補(bǔ)充的組合物的結(jié)果相比較，后者在兩個(gè)蛋白加載3.5和3.85mg蛋白每g纖維素測(cè)試。如實(shí)施例12進(jìn)行該測(cè)定。用5%磨制的、洗滌的PCS進(jìn)行的Iml反應(yīng)在含有ImM硫酸錳的50mM乙酸鈉pH5.O緩沖液中進(jìn)行72小時(shí)。所有反應(yīng)重復(fù)三次進(jìn)行，并涉及水解開始時(shí)的單次混合。結(jié)果示于圖2。褐孢長(zhǎng)毛盤菌GHlO木聚糖酶顯示與高溫酶組合物的顯著協(xié)同作用。補(bǔ)充褐孢長(zhǎng)毛盤菌GHlO木聚糖酶的酶組合物在72小時(shí)與未補(bǔ)充的高溫酶組合物相比較，在相等的蛋白加載(3.85mg蛋白每g纖維素)達(dá)成顯著較高的纖維素至葡萄糖的轉(zhuǎn)化。實(shí)施例14:將不同水平的褐孢長(zhǎng)毛盤菌GHlO木聚糖酶添加至恒定加載的高溫酶組合物，并與基于里氏木霉的纖維素酶SaMe-MF268(XCL-533)相比較通過將不同水平的褐孢長(zhǎng)毛盤菌GHlO木聚糖酶(I.25%，2.5%，5%，10%和20%)添加至恒定加載的高溫酶組合物(3mg蛋白每g纖維素)來進(jìn)一步檢查褐孢長(zhǎng)毛盤菌GHlO木聚糖酶與高溫酶組合物在60°C協(xié)同的能力。所述高溫酶組合物含有45%煙曲霉Cel7ACBHI，25%嗜熱毀絲霉Cel6ACBHII，5%里氏木霉Cel7BEGI，5%嗜熱毀絲霉Cel5AEGII,5%具有纖維素分解增強(qiáng)活性的橙橘嗜熱子囊菌GH61A多肽，5%具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢霉GH61E多肽，和10%巴西青霉Cel3Ai3-葡糖苷酶。將在60°C的高溫酶組合物與在50°C的基于里氏木霉的纖維素酶SaMe-MF268(XCL-533)相比較?；诶锸夏久沟拿附M合物SaMe-MF268如WO2008/151079中所述獲得。所述組合物包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的橙橘嗜熱子囊菌GH61A多肽，包含特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V核心多肽融合于野生型米曲霉β-葡糖苷酶的β-葡糖苷酶融合蛋白，里氏木霉纖維二糖水解酶I(Cel7A)，里氏木霉纖維二糖水解酶II(Cel6A)，里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(Cel7B)，里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(Cel5A)，里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(Cel45A)和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(Cell2A)。如實(shí)施例12中所述進(jìn)行測(cè)定。用5%洗滌的、磨制的PCS進(jìn)行的Iml反應(yīng)在含有ImM硫酸錳的50mM乙酸鈉pH5.O緩沖液中進(jìn)行72小時(shí)。所有反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行三次，并涉及在水解開始時(shí)的單次混合。圖3中所示的結(jié)果說明，將褐孢長(zhǎng)毛盤菌GHlO木聚糖酶添加至高溫酶組合物在72小時(shí)的水解之后顯著改善了洗滌的PCS的纖維素轉(zhuǎn)化的程度。對(duì)于褐孢長(zhǎng)毛盤菌GHlO木聚糖酶最優(yōu)的添加水平為約5%。補(bǔ)充5%的褐孢長(zhǎng)毛盤菌GHlO木聚糖酶的高溫酶組合物在72小時(shí)與用相同加載的未添加的高溫酶組合物(3.15mg蛋白每g纖維素)獲得的65%纖維素轉(zhuǎn)化相比較，取得了83%纖維素轉(zhuǎn)化。如圖3中所示，補(bǔ)充褐孢長(zhǎng)毛盤菌GHlO木聚糖酶的高溫酶組合物在60°C與基于里氏木霉的纖維素酶SaMe-MF268(XCL-533)在其50°C的最適溫度相比，性能上顯著地勝過后者。實(shí)施例15:在洗滌的和未洗滌的PCS的水解中含有褐孢長(zhǎng)毛盤菌GHlO木聚糖酶的高溫酶組合物與基于里氏木霉的纖維素酶SaMe-MF268(XCL-533)的比較在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，使用磨制的、洗滌的和磨制的、未洗滌的PCS將含有來自褐孢長(zhǎng)毛盤菌的GHlO木聚糖酶的改善的高溫酶組合物的蛋白加載概貌與基于里氏木霉的纖維素酶SaMe-MF268(XCL-533)的蛋白加載概貌相比較。所述高溫酶組合物含有45%煙曲霉Cel7ACBHI，25%嗜熱毀絲霉Cel6ACBHII，5%里氏木霉Cel7BEGI，5%嗜熱毀絲霉Cel5AEGII,5%具有纖維素分解增強(qiáng)活性的橙橘嗜熱子囊菌GH61A多肽，5%具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢霉GH61E多肽，5%巴西青霉Cel3Aβ-葡糖苷酶，和5%褐孢長(zhǎng)毛盤菌GHlO木聚糖酶。將高溫酶組合物和SaMe-MF268(XCL-533)在五個(gè)不同的蛋白加載，2.0,3.0,4.0，5.O和6.Omg蛋白每g纖維素進(jìn)行測(cè)試。所有用高溫酶組合物進(jìn)行的反應(yīng)在60°C進(jìn)行，而所有用SaMe-MF268(XCL-533)進(jìn)行的反應(yīng)在50°C進(jìn)行。如實(shí)施例12中所述進(jìn)行測(cè)定。將用磨制的、洗滌的或磨制的、未洗滌的PCS進(jìn)行的Iml反應(yīng)在含有ImM硫酸錳的50mM乙酸鈉pH5.O緩沖液中進(jìn)行72小時(shí)。以5%總固形物使用洗滌的PCS，而以5%不溶性固形物使用未洗滌的PCS。所有反應(yīng)重復(fù)三次進(jìn)行，并涉及在水解開始時(shí)的單次混合。結(jié)果示于表I和圖4。含有褐孢長(zhǎng)毛盤菌GHlO木聚糖酶的高溫酶組合物與SaMe-MF268(XCL-533)相比較，對(duì)于洗滌和未洗滌的PCS底物具有顯著較佳的性能，與SaMe-MF268(XCL-533)相比較，在72小時(shí)需要顯著較低的蛋白加載以實(shí)現(xiàn)80%的纖維素至葡萄糖的轉(zhuǎn)化。表I:在72小時(shí)實(shí)現(xiàn)洗滌和未洗滌的PCS的80%纖維素酶轉(zhuǎn)化所需的蛋白加載(mg蛋白每g纖維素)。溫度對(duì)于高溫酶組合物為60°C，對(duì)于SaMe-MF268(XCL-533)為50°C。_酶組合物__洗滌的PCS__未洗滌的PCS_SaMe-MF268(XCL-533)____488_含褐孢長(zhǎng)毛盤菌GHlO木聚糖酶的入，，2.464.18_雨溫酶組合物___生物材料的保藏下述的生物材料已經(jīng)依據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心(農(nóng)業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心)，北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection(NRRL),NorthernRegionalResearchCenter,Peoria,IL,USA)，并給予下述的登錄號(hào)保藏登錄號(hào)保藏日期大腸桿菌TF12Xyll70NRRLB-503092009年7月28日所述菌株于下述條件下保藏確保在本專利申請(qǐng)未決期間，依據(jù)該外國(guó)專利法律的授權(quán)的人能夠獲得所述培養(yǎng)物。所述保藏物為所保藏菌株的基本上純的培養(yǎng)物。在提交了該申請(qǐng)的副本，或其后續(xù)文本的國(guó)家，依據(jù)該外國(guó)專利法律可以獲得所述保藏物。然而，應(yīng)當(dāng)理解，保藏物的獲得并不構(gòu)成對(duì)實(shí)施本發(fā)明的許可，實(shí)施本發(fā)明是對(duì)政府行為所授予的專利權(quán)的侵犯。通過下述編號(hào)段落進(jìn)一步描述本發(fā)明[I]一種具有木聚糖酶活性的分離的多肽，其選自下組(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少65%同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少中等嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或()的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(C)多肽,其由多核苷酸編碼,所述多核苷酸包含核苷酸序列,所述核苷酸序列與SEQIDNOil的成熟多肽編碼序列具有至少65%同一性；和(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。[2]段I的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少65%同一性。[3]段2的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70%同一性。[4]段3的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少75%同一性。[5]段4的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少80%同一性。[6]段5的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少85%同一性。[7]段6的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少90%同一性。[8]段7的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少95%同一性。[9]段8的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少97%同一性。[10]段I的多肽，它包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其具有木聚糖酶活性的片段，或由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其具有木聚糖酶活性的片段組成。[11]段10的多肽，其包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，或由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成。[12]段10的多肽，其包含SEQIDNO:2的成熟多肽，或由SEQIDNO:2的成熟多肽組成。[13]段I的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少中等嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[14]段13的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少中-高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[15]段14的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[16]段15的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[17]段I的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列具有至少65%同一性。[18]段17的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列具有至少70%同一性。[19]段18的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列具有至少75%同一性。[20]段19的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列具有至少80%同一性。[21]段20的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列具有至少85%同一性。[22]段21的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列具有至少90%同一性。[23]段22的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列具有至少95%同一性。[24]段23的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列具有至少97%同一性。[25]段I的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDNO:I的核苷酸序列或其編碼具有木聚糖酶活性的片段的亞序列，或所述多核苷酸由SEQIDN0:1的核苷酸序列或其編碼具有木聚糖酶活性的片段的亞序列組成。[26]段25的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDNO:I的核苷酸序列或由SEQIDNO:I的核苷酸序列組成。[27]段25的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列組成。[28]段I的多肽，其中所述多肽是SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。[29]段I的多肽，其由包含于大腸桿菌NRRLB-50309中的質(zhì)粒pTF12Xyll70所包含的多核苷酸編碼。[30]段1-29任一項(xiàng)的多肽，其中所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸20至398。[31]段1-30任一項(xiàng)的多肽，其中所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:I的核苷酸58至1194。[32]一種分離的多核苷酸,其包含編碼段1-31任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列。[33]一種核酸構(gòu)建體，其包含段32的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接于一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))指導(dǎo)所述多肽在表達(dá)宿主中產(chǎn)生的調(diào)控序列。[34]一種重組表達(dá)載體，其包含段32的多核苷酸。[35]一種重組宿主細(xì)胞，其包含段32的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接于一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))指導(dǎo)具有木聚糖酶活性的多肽的產(chǎn)生的調(diào)控序列。[36]一種產(chǎn)生段1-31任一項(xiàng)的多肽的方法,包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽的細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。[37]一種產(chǎn)生段1-31任一項(xiàng)的多肽的方法，包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)包含核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體包含編碼所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。[38]一種產(chǎn)生親本細(xì)胞突變體的方法，包括破壞或缺失編碼段1-31任一項(xiàng)的多肽或其部分的多核苷酸，其導(dǎo)致所述突變體與親本細(xì)胞相比較產(chǎn)生較少的所述多肽。[39]一種通過段38的方法產(chǎn)生的突變體細(xì)胞。[40]段39的突變體細(xì)胞，進(jìn)一步包含編碼天然或異源蛋白的基因。[41]一種產(chǎn)生蛋白的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生所述蛋白的條件下培養(yǎng)段39或40的突變體細(xì)胞；和(b)回收所述蛋白。[42]一種產(chǎn)生段1-31任一項(xiàng)的多肽的方法，包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述植物或植物細(xì)胞包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。[43]一種轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其用編碼段1-31任一項(xiàng)的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化。[44]一種雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，包含段32的多核苷酸的亞序列，其中任選地所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。[45]段44的雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其長(zhǎng)度為約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個(gè)雙鏈體核苷酸。[46]一種在細(xì)胞中抑制具有木聚糖酶活性的多肽的表達(dá)的方法，包括向細(xì)胞施用或在細(xì)胞中表達(dá)段44或45的雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子。[47]—種分離的多核苷酸,其編碼信號(hào)肽,所述信號(hào)肽包含SEQIDN0:2的氨基酸I至19，或由SEQIDNO:2的氨基酸I至19組成。[48]一種核酸構(gòu)建體，其包含編碼蛋白的基因，所述基因可操作地連接于段47的多核苷酸，其中所述基因?qū)τ谒龆嗪塑账崾峭庠吹摹49]一種重組表達(dá)載體，其包含段47的多核苷酸。[50]一種重組宿主細(xì)胞，其包含段47的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接于編碼蛋白的基因，其中所述基因?qū)τ谒龆嗪塑账崾峭庠吹摹51]一種產(chǎn)生蛋白的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生所述蛋白的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼蛋白的基因，所述基因可操作地連接于段47的多核苷酸，其中所述基因?qū)τ谒龆嗪塑账崾峭庠吹?；?b)回收所述蛋白。[52]一種組合物，其包含段1-31任一項(xiàng)的多肽。[53]一種降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料或含木聚糖材料的方法，包括在段1-31任一項(xiàng)的多肽的存在下用酶組合物處理纖維素材料或含木聚糖材料。[54]段53的方法，其中所述纖維素材料或含木聚糖材料經(jīng)預(yù)處理。[55]段53或54的方法，進(jìn)一步包括回收降解的纖維素材料或含木聚糖材料。[56]段53-55任一項(xiàng)的方法,其中所述酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的酶纖維素酶、半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶和膨脹素。[57]段56的方法，其中所述纖維素酶為一種或多種(幾種)選自下組的酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[58]段56的方法，其中所述半纖維素酶為一種或多種(幾種)選自下組的酶木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。[59]段53-58任一項(xiàng)的方法，其中所述經(jīng)降解的纖維素材料或含木聚糖材料是糖。[60]段59的方法，其中所述糖選自下組葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。[61]一種產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括(a)在段1_31任一項(xiàng)的多肽的存在下用酶組合物糖化纖維素材料或含木聚糖材料；(b)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(C)從發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。[62]段61的方法，其中所述纖維素材料或含木聚糖材料經(jīng)預(yù)處理。[63]段61或62的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的酶纖維素酶、半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶和膨脹素。[64]段63的方法，其中所述纖維素酶是一種或多種(幾種)選自下組的酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[65]段64的方法，其中所述半纖維素酶是一種或多種(幾種)選自下組的酶木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。[66]段61-65任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)和(b)在同步糖化和發(fā)酵中同時(shí)進(jìn)行。[67]段61-66任一項(xiàng)的方法,其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇、有機(jī)酸、酮、氨基酸或氣體。[68]一種發(fā)酵纖維素材料或含木聚糖材料的方法，包括用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料，其中所述纖維素材料或含木聚糖材料是在段1-31任一項(xiàng)的多肽存在下用酶組合物糖化的。[69]段68的方法，其中所述纖維素材料或含木聚糖材料在糖化之前經(jīng)預(yù)處理。[70]段68或69的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的酶纖維素酶、半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶和膨脹素。[71]段70的方法，其中所述纖維素酶是一種或多種(幾種)選自下組的酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[72]段70的方法，其中所述半纖維素酶是一種或多種(幾種)選自下組的酶木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。[73]段68-72任一項(xiàng)的方法，其中所述纖維素材料或含木聚糖材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。[74]段73的方法，進(jìn)一步包括從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。[75]段73或74的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇、有機(jī)酸、酮、氨基酸或氣體。本文描述和要求保護(hù)的本發(fā)明并不局限于本文公開的具體方面的范圍內(nèi)，因?yàn)檫@些方面旨在作為本發(fā)明幾個(gè)方面的說明。旨在將任何等同的方面包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上，從前面的說明中，除本文所顯示和描述的之外，本發(fā)明的多種修改對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。這些修改也旨在落入所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在沖突的情況下，將以包括定義部分的本公開為準(zhǔn)。權(quán)利要求1.一種具有木聚糖酶活性的分離的多肽，其選自下組(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:2的成熟多肽具有至少65%同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少中等嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列具有至少65%同一性；和(d)SEQIDN0:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。2.權(quán)利要求I的多肽，其包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其具有木聚糖酶活性的片段，或其由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其具有木聚糖酶活性的片段組成。3.權(quán)利要求I的多肽，其由包含于大腸桿菌NRRLB-50309中的質(zhì)粒pTF12Xyll70所包含的多核苷酸編碼。4.一種分離的多核苷酸,其包含編碼權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列。5.—種產(chǎn)生權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多肽的方法,包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽的細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。6.—種產(chǎn)生權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多肽的方法,包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)包含核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體包含編碼所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。7.—種產(chǎn)生親本細(xì)胞的突變體的方法，包括破壞或缺失編碼權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述多肽或其部分的多核苷酸，其導(dǎo)致所述突變體與親本細(xì)胞相比較產(chǎn)生較少的所述多肽。8.—種產(chǎn)生權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多肽的方法,包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述植物或植物細(xì)胞包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。9.一種轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其用編碼權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化。10.一種雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，包含權(quán)利要求9的多核苷酸的亞序列，其中任選地所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。11.一種在細(xì)胞中抑制具有木聚糖酶活性的多肽的表達(dá)的方法，包括向細(xì)胞施用或在細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求10的雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子。12.—種分離的多核苷酸,其編碼信號(hào)肽,所述信號(hào)肽包含SEQIDNO:2的氨基酸I至19，或由SEQIDNO:2的氨基酸I至19組成。13.—種產(chǎn)生蛋白的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生所述蛋白的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼蛋白的基因，所述基因可操作地連接于權(quán)利要求12的多核苷酸，其中所述基因?qū)τ谒龆嗪塑账崾峭庠吹模缓?b)回收所述蛋白。14.一種降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料或含木聚糖材料的方法，包括在權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多肽的存在下用酶組合物處理所述纖維素材料或含木聚糖材料。15.權(quán)利要求14的方法，進(jìn)一步包括回收降解的纖維素材料或含木聚糖材料。16.—種產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法,包括(a)在權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多肽的存在下用酶組合物糖化纖維素材料或含木聚糖材料；(b)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料或含木聚糖材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(C)從所述發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。17.一種發(fā)酵纖維素材料或含木聚糖材料的方法，包括用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料或含木聚糖材料，其中所述纖維素材料或含木聚糖材料是在權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多肽存在下用酶組合物糖化的。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述纖維素材料或含木聚糖材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。19.權(quán)利要求18的方法，進(jìn)一步包括從所述發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。20.權(quán)利要求18或19的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇、有機(jī)酸、酮、氨基酸或氣體。全文摘要本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及用于制備和使用所述多肽的方法。文檔編號(hào)C12N9/42GK102639697SQ201080050237公開日2012年8月15日申請(qǐng)日期2010年11月5日優(yōu)先權(quán)日2009年11月6日發(fā)明者B.麥克布雷爾,D.斯科夫倫德,E.弗拉森科,S.蘭德維克申請(qǐng)人:諾維信公司,諾維信股份有限公司