專利名稱：來自中國倉鼠的糖基轉(zhuǎn)移酶以及相關(guān)方法
來自中國倉鼠的糖基轉(zhuǎn)移酶以及相關(guān)方法本申請要求于2009年11月11日提交的美國臨時專利申請序列號61/260，232的優(yōu)先權(quán)，其全部披露內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。根據(jù)37CFR 1.52(e) (5)，將處于文本文件形式的序列表(名稱為“序列表.txt”，產(chǎn)生于2010年11月10日，41千字節(jié))以其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。
背景技術(shù)：
末端半乳糖1，3_半乳糖聚糖(在此稱為Gal-a -Gal)可能是對N-糖基化蛋白的ー種功能結(jié)果性修飾，當(dāng)提供在異源衍生的生物學(xué)治療劑上時，在人體中產(chǎn)生它的潛在免疫原性。在內(nèi)源性蛋白質(zhì)上的這種碳水化合物表位的存在顯得是高度種類特異性的，例如在豬、小鼠、以及大鼠體內(nèi)檢測出，但是在靈長類體內(nèi)不存在。因此，該表位可以存在于從某些生物體(例如，小鼠NSO或SP/2細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因豬)得到的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的重組生物制品上。單克隆抗體西妥昔單抗(Erbitux )是ー個這樣的在小鼠衍生的細(xì)胞系中產(chǎn)生的商業(yè)性蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品的實例，并且還報道含有Gal-α -Gal碳水化合物表位(Chung等人(2008)《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》(N Engl J Med)358:1109-1117)。Gal-α 1，3_Gal 聚糖的酶促生物合成被歸因于1，3糖基轉(zhuǎn)移酶-I (在此稱為Ggtal) (Taylor等人(2003)《糖生物學(xué)》(Glycobiology) 13:327-337 ;Smith 等人(1990)《生物化學(xué)期刊》(J Biol Chem)265:6225-6234)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是至少部分地基于在CHO細(xì)胞自其衍生的中國倉鼠(Cricetulusgriseus)以及用于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的CHO細(xì)胞系兩者中的α-1，3糖基轉(zhuǎn)移酶-I (Ggatl)基因序列的發(fā)現(xiàn)。因此，本發(fā)明涉及與發(fā)現(xiàn)的基因相關(guān)的核酸和多肽組合物、以及相關(guān)的載體和細(xì)胞(例如，被基因工程化以降低、消除或増加Ggtal活性的CHO細(xì)胞以及用于產(chǎn)生這類細(xì)胞的載體)。此外，本發(fā)明涉及鑒定的序列在各種方法中的用途，例如檢測CHO細(xì)胞中的Ggtal活性(包括Ggtal轉(zhuǎn)錄活性和/或酶活性)的方法，例如用于針對產(chǎn)生Gal-a -Gal結(jié)構(gòu)的能力篩選CHO細(xì)胞，或用于鑒定和定量CHO細(xì)胞(例如用于產(chǎn)生治療性糖蛋白的細(xì)胞)中的Ggtal的表達(dá)或活性。
在此披露的Ggtal序列列于表I中表I:
來源(名稱)_T序列的類型_「SEQ ID NO
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(I冬I 3)
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—_L_(W 6) _因此，在ー個第一方面，本發(fā)明的特征是一種分離的核酸分子，該分子包括編碼中國倉鼠或CHO細(xì)胞Ggtal多肽、或它的具有ー種或多種Ggtal活性(例如在此所述的ー種Ggtal活性)的ー個活性部分的核苷酸序列。在一個實施方案中，該分離的核酸分子包括與(a)具有編碼SEQ ID N0:2、或SEQID N0:4或SEQ ID NO:7的氨基酸殘基序列的序列的DNA分子或(b) (a)的DNA分子的互補(bǔ)物具有至少大約75%序列一致性、或至少大約80%序列一致性、或至少大約85%序列一致性、或至少大約90%序列一致性、或至少大約91%序列一致性、或至少大約92%序列一致性、或至少大約93%序列一致性、或至少大約94%序列一致性、或至少大約95%序列一致性、或至少大約96%序列一致性、或至少大約97%序列一致性、或至少大約98%序列一致性、或至少大約99%序列一致性的核苷酸序列。該分離的核酸分子可以編碼具有ー種或多種Ggtal活性的一種多肽。在一個實施方案中，該分離的核酸分子包括SEQ ID NO: 2、或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7的序列。在一個實施方案中，該分離的核酸分子與SEQ ID N0:1或SEQ ID NO:3, SEQIDN0:5或SEQ ID N0:6的序列具有至少大約90%序列一致性、或至少大約91%序列一致性、或至少大約92%序列一致性、或至少大約93%序列一致性、或至少大約94%序列一致性、或至少大約95%序列一致性、或至少大約96%序列一致性、或至少大約97%序列一致性、或至少大約98%序列一致性、或至少大約99%序列一致性。該分離的核酸分子可以編碼具有ー種或多種Ggtal活性的ー種多肽。在一個實施方案中，該分離的核酸分子在高嚴(yán)緊條件下與包含SEQ ID NO: K SEQID NO:3, SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6的核苷酸序列的核酸分子雜交。在一個實施方案中，該分離的核酸分子包括SEQ ID N0:1或SEQ ID NO: 3,SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的核苷酸序列。本發(fā)明的分離的核酸分子可以相應(yīng)于ー種天然發(fā)生的核酸分子，例如相應(yīng)于編碼一種表達(dá)的Ggtal蛋白的天然發(fā)生的CHO核酸序列。在一些實施方案中，該核酸分子可以編碼具有ー種或多種Ggtal活性的一種多肽，無論該核酸分子是否是天然發(fā)生的。例如，該分離的核酸分子是中國倉鼠或CHO細(xì)胞Ggtal序列的ー種非天然發(fā)生的變異體。在ー個實施方案中，該分尚的核酸序列是一種反義核酸分子、一種RNAi分子(例如dsRNA或siRNA)、一種核酶、或ー種肽核酸，其中該反義分子抑制在此所述Ggtal的產(chǎn)生。在一個實施方案中，該分離的核酸分子編碼連接到一種異源氨基酸序列上的在此所述的ー種Ggtal多肽,例如它編碼ー種Ggtal融合蛋白，例如一種表位標(biāo)記的Ggtal。在ー個第二方面，本發(fā)明的特征是包括SEQ ID N0:1或其互補(bǔ)物、SEQ ID N0:3或其互補(bǔ)物、SEQ ID NO:5或其互補(bǔ)物、或SEQ ID NO:6或其互補(bǔ)物的至少10個連續(xù)核苷酸(例如至少12、15、18、20、25、30、35、40、45或50個連續(xù)核苷酸)并且少于500個連續(xù)核苷酸(例如，少于 450、400、350、300、250、200、180、160、140、130、125、120、100、90、80、75、60、或50個連續(xù)核苷酸)的寡核苷酸。在一個實施方案中，該寡核苷酸長度在10至200個核苷酸 之間，長度在20至200個核苷酸之間，長度在20至100個核苷酸之間，長度在15至100個核苷酸之間，長度在10至100個核苷酸之間，長度在20至75個核苷酸之間，長度在25至50個核苷酸之間，長度在20至50個核苷酸之間，長度在15至50個核苷酸之間，長度在10至50個核苷酸之間，長度在10至40個核苷酸之間，長度在10至30個核苷酸之間，或長度在10至25個核苷酸之間。這樣的寡核苷酸可以在多種方法中用作例如引物、標(biāo)簽或探針來檢測和/或測量CHO細(xì)胞中Ggtal的表達(dá)(例如，使用多種方法，如PCR、DNA芯片、或基因表達(dá)系列分析(SAGE))。在一個實施方案中，該寡核苷酸具有或包括在表2或表4中所不的序列。在一個實施方案中，該寡核苷酸具有以下特征的ー項或多項50-65%的GC含量，缺乏實質(zhì)性ニ級結(jié)構(gòu)，50° C至60° C之間的熔點(Tm)，沒有長于3個堿基的GC重復(fù)，在末端的GC對，跨越ー個內(nèi)含子-外顯子邊界。在一個實施方案中，本發(fā)明的特征是一組兩個這樣的寡核苷酸(例如引物對)，它們一起能夠擴(kuò)增從CHO細(xì)胞得到的Ggtal DNA的至少一部分(例如通過PCR)。一個示例性的引物組包括一個退火到Ggtal核酸分子的編碼鏈上的正向引物以及ー個退火到Ggtal核酸分子的非編碼鏈上的反向引物。在另ー個實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸可操作地連接到一個調(diào)節(jié)元件上(例如可操作地連接到ー個載體構(gòu)建體中的啟動子上)。在一些實施方案中，該寡核苷酸處于正義方向。在其他實施方案中，該寡核苷酸處于反義方向。在ー個第三方面，本發(fā)明的特征是ー種核酸構(gòu)建體，如一種載體(例如，ー種質(zhì)粒、粘粒、病毒顆?；蚴删w)，該載體包括在此所述的核酸分子或寡核苷酸的序列，其可操作地連接到用于表達(dá)或克隆的至少ー個調(diào)節(jié)元件上，例如連接到一個啟動子上。該載體可以包括另外的元件，如一種增強(qiáng)子、ー種信號序列、一個復(fù)制起點、一種或多種標(biāo)記基因、以及ー種轉(zhuǎn)錄終止序列的ー項或多項。在一個實施方案中，該載體被設(shè)計成在宿主細(xì)胞(例如，一種原核(例如大腸桿菌)或真核細(xì)胞(例如，哺乳動物細(xì)胞，如CHO細(xì)胞))中表達(dá)在此所述的中國倉鼠或CHO細(xì)胞Ggtal多肽。在一個實施方案中，該載體包括在反義方向上克隆到表達(dá)載體中的本發(fā)明的ー種DNA分子。
在一個實施方案中，該載體包含在此所述的ー種核酸分子，例如在此所述的ー種中國倉鼠或CHO細(xì)胞Ggtal核酸分子，該分子被配置成允許它重組到宿主細(xì)胞基因組的特異性位點中，例如配置成修飾、斷裂、或敲除宿主細(xì)胞中的一種內(nèi)源性Ggtal基因。在ー個第四方面，本發(fā)明特征是用在此所述的核酸分子、寡核苷酸、或核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的分離的宿主細(xì)胞。這些宿主細(xì)胞可以是原核的(例如大腸桿菌)或真核的(例如植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞例如CHO細(xì)胞)。在一個實施方案中，這些宿主細(xì)胞被進(jìn)ー步基因工程化用來表達(dá)ー種重組治療性糖蛋白。在一個實施方案中，這些宿主細(xì)胞是用在此所述的ー種核酸分子、寡核苷酸、或核酸構(gòu)建體(例如包括在此所述的Ggtal-a、Ggtal-b或Ggtal-c編碼序列的的ー種載體)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，其中這些CHO細(xì)胞相對于親本CHO細(xì)胞表達(dá)增加水平的Ggtal。在這些實施方案中，這些宿主細(xì)胞相比于親本細(xì)胞有可能能夠產(chǎn)生具有增加水平的末端半乳糖-al，3-半乳糖聚糖的糖蛋白(例如，重組治療性糖蛋白)。本發(fā)明還提供了通過使用這些宿主細(xì)胞來產(chǎn)生這種糖蛋白來生產(chǎn)具有増加水平的末端半乳糖- α 1，3-半乳糖聚的糖蛋白(例如重組治療性糖蛋白)的方法。 在另ー個實施方案中，這些宿主細(xì)胞是用在此所述的ー種核酸分子、寡核苷酸、或核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的(例如，用ー種Ggtal-a、Ggtal-b或Ggtal_c dsRNA、siRNA、或敲除載體轉(zhuǎn)染的)CHO細(xì)胞，其中與未轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞相比較(例如這些宿主細(xì)胞是Ggtal敲低或敲除細(xì)胞)，該CHO細(xì)胞降低了在此所述的Ggtal的表達(dá)。在這樣的實施方案中，這些宿主細(xì)胞與宿主細(xì)胞的親本細(xì)胞相比較有可能能夠產(chǎn)生具有降低水平的末端半乳糖-α 1，3-半乳糖聚糖的糖蛋白(例如，重組治療性糖蛋白)。本發(fā)明還提供了通過使用這樣的宿主細(xì)胞來生產(chǎn)具有降低水平的末端半乳糖-α I, 3-半乳糖聚糖的糖蛋白(例如重組治療性糖蛋白)的方法。在ー個第五方面，本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)糖蛋白(例如重組治療性糖蛋白)的聚糖結(jié)構(gòu)的方法，例如調(diào)節(jié)存在于重組治療性糖蛋白中的末端半乳糖-α I, 3-半乳糖聚糖的水平。該方法包括在適合糖蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)在此所述的宿主細(xì)胞(例如，Ggtal-轉(zhuǎn)染的或Ggtal敲低或敲除的宿主細(xì)胞)。在ー個第六方面，本發(fā)明提供了一種分離的多肽，該多肽包括在此所述的Ggtal的氨基酸序列、或其ー個活性片段。在一個實施方案中，該多肽包括由在此所述的分離的核酸序列的任一項編碼的氨基酸序列。在ー個具體的實施方案中，該多肽包括包含SEQ ID NO: 2,SEQ ID Ν0:4或SEQ IDNO:7序列的氨基酸序列。在另ー個實施方案中，該多肽包括與SEQ ID NO: 2, SEQ ID Ν0:4或SEQ ID NO: 7的氨基酸殘基序列具有至少大約90%序列一致性，例如，至少大約91%序列一致性，例如，至少大約92%序列一致性，例如，至少大約93%序列一致性，例如，至少大約94%序列一致性，例如,至少大約95%序列一致性，例如，至少大約96%序列一致性，例如，至少大約97%序列一致性,例如,至少大約98%序列一致性，例如，至少大約99%序列一致性的氨基酸序列。該多肽可以具有ー種或多種Ggtal活性。在另ー個實施方案中，該Ggtal多肽或其片段不同于SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:4或SEQ ID NO: 7的對應(yīng)序列。在一個實施方案中，它以至少ー個但是小于20、15、10或5個氨基酸殘基而不同。在另ー個實施方案中，它與SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO:4或SEQ ID NO: 7中的對應(yīng)序列以至少一個殘基但是少于這些殘基的10%或5%而不同。在一個實施方案中，這些差異包括保守置換。在另ー個實施方案中，這些差異包括非保守置換。該多肽可以具有ー種或多種Ggtal活性。在一個實施方案中，在此所述的Ggtal多肽連接到一個異源氨基酸序列上，例如該多肽是ー種Ggtal融合蛋白，例如一種表位標(biāo)記的Ggtal。在一個第七方面，本發(fā)明提供了ー種抗體或其抗原結(jié)合片段，其特異性地結(jié)合到在此所述的ー種CHO細(xì)胞或中國倉鼠Ggtal多肽上。任選地，該抗體是ー種單克隆抗體、一種功能性抗體片段(例如ー種Fab片段)或一種單鏈抗體。 在一個實施方案中，與結(jié)合到來自小鼠、大鼠、?；蚬返末`種或多種的天然發(fā)生的Ggtal上相比較，該抗體或其功能性片段以更大的結(jié)合親和カ結(jié)合到ー種CHO細(xì)胞或中國倉鼠Ggtal上。例如，與結(jié)合到來自小鼠、大鼠、牛或狗的ー種或多種的天然發(fā)生的Ggtal上相比較，該抗體或其功能性片段以20%、25%、30%、40%、50%、60%或更大的親和カ結(jié)合到一種CHO細(xì)胞或中國倉鼠Ggtal上。在一個實施方案中，該抗體或其功能性片段結(jié)合到在此所述的ー種CHO細(xì)胞或中國倉鼠Ggta I上，并且不結(jié)合到來自小鼠、大鼠、牛或狗的ー項或多項的天然發(fā)生的Ggtal上?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法來確定結(jié)合親和力，例如放射免疫測定(RIA)、ELISA、或以柱載體形式結(jié)合。通過增加變性條件，或通過與相關(guān)配體競爭來進(jìn)行解離。通過斯卡恰特作圖來確定解離常數(shù)(Kd)。在ー個第八方面，本發(fā)明的特征是用于檢測并且任選地定量CHO細(xì)胞中的Ggtal表達(dá)和/或活性的方法。在一個實施方案中，該方法包括使來自CHO細(xì)胞群的核酸樣品與在此所述的中國倉鼠或CHO細(xì)胞Ggtal寡核苷酸或分離的核酸分子相接觸，以獲得針對CHO群中的Ggtal表達(dá)或活性水平的ー個值(例如相對值或絕對值)。在一個實施方案中，該方法包括在雜交方法(例如，DNA印跡或RNA印跡)、原位雜交(例如，熒光原位雜交或FISH)、陣列雜交、PCR (例如，RT-PCR、qPCR)分析、基因表達(dá)系列分析(SAGE)、RNA酶保護(hù)、分支DNA夾心核酸雜交(例
如，Quantigene 系統(tǒng))中使用在此所述的ー種Ggtal探針或引物或核酸分子。在一個實施
方案中，這些CHO細(xì)胞表達(dá)ー種重組治療性糖蛋白。這類方法可以用于例如針對Ggtal基因的差異表達(dá)來篩選CHO細(xì)胞克隆。在另ー個實施方案中，該方法包括使來自ー個CHO細(xì)胞群的蛋白質(zhì)樣品與在此所述的中國倉鼠或CHO細(xì)胞Ggtal多肽或抗體相接觸，以獲得針對CHO群中的Ggtal存在、表達(dá)或活性水平的ー個值(例如相對值或絕對值)。在一個實施方案中，該方法包括在ー種基于抗體的檢測方法(例如酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、免疫沉淀、免疫熒光、酶免疫測定法(EIA)、放射免疫測定(RIA)、蛋白質(zhì)印跡分析、表面等離子體共振(SPR))中使用在此所述的ー種Ggtal抗體或其片段。在一個實施方案中，這些CHO細(xì)胞表達(dá)ー種重組治療性糖蛋白。這類方法可以用于例如針對Ggtal的差異存在、表達(dá)或活性來篩選CHO細(xì)胞克隆。在一個實施方案中，該方法包括進(jìn)行定量實時PCR反應(yīng)(qPCR)來評定CHO細(xì)胞制劑中的Ggtal表達(dá)。在一個實施方案中，該qPCR方法使用在此所述的ー組Ggtal寡核苷酸，例如使用在此所述的ー個引物對(例如表2或表4中所述的ー個引物對)。在一個實施方案中，將針對CHO群中的Ggtal表達(dá)或活性水平獲得的值與ー個參考值(例如，ー個對照值，ー個預(yù)定值，或針對ー個第二 CHO細(xì)胞群中的Ggtal表達(dá)或活性的一個值)進(jìn)行比較。例如，可以將獲得的值與從在不同生物過程條件下(例如不同的培養(yǎng)基配方和/或規(guī)模)生長的CHO細(xì)胞中獲得的值進(jìn)行比較。在一個第九方面，本發(fā)明的特征是ー種評定從CHO細(xì)胞得到的樣品的方法。該方法包括提供從ー種CHO細(xì)胞(例如從表達(dá)重組治療性糖蛋白的ー種CHO細(xì)胞)中得到的ー種核酸樣品，以及確定該樣品的基因表達(dá)譜，其中該譜包括代表該CHO細(xì)胞中的Ggtal表達(dá)水平的ー個值、以及代表該CHO細(xì)胞中的另ー個基因(例如另ー種酶)的表達(dá)水平的一個值。該方法可以包括使該樣品與在此所述的ー種或多種Ggtal核酸分子或探針或引物相接觸。該方法可以進(jìn)一歩包括將該值或譜(即多個值)與一個參考值或參考譜相比較?？梢酝ㄟ^在此所述的任何方法獲得樣品的基因表達(dá)譜(例如，通過提供來自該樣品的ー種核酸并且使該核酸與包括在此所述Ggtal探針的ー個陣列相接觸)。該方法可以用來確定在其他基因的表達(dá)或活性的水平中的在CHO細(xì)胞中的Ggtal表達(dá)或活性的水平。
在一個第十方面，本發(fā)明的特征是具有多個地址的ー個ニ維陣列，該多個地址中的每個地址在位置上可以與該多個地址中的每個其他地址區(qū)別開，并且該多個地址的每個地址具有ー個獨(dú)特的捕獲探針，例如ー個核酸或肽序列或抗體。該多個地址中的至少ー個地址具有識別在此所述Ggtal分子(例如，在此所述的Ggta-1、Ggtal-b或Ggtal-c分子)的捕獲探針。在一個實施方案中，該捕獲探針是核酸，例如與ー個Ggtal核酸序列互補(bǔ)的探針。在另ー個實施方案中，該捕獲探針是ー種抗體，例如對在此所述的Ggtal多肽具有特異性的ー種抗體。還表征的是通過使樣品(例如來自CHO細(xì)胞的樣品)與前面提到的陣列相接觸并且檢測該樣品與該陣列的結(jié)合來分析樣品的ー種方法。根據(jù)以下詳細(xì)說明、以及根據(jù)權(quán)利要求，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點中將是清楚的。附圖
簡要說明 圖I是從由中國倉鼠腦(泳道3)、腎(泳道4)、卵巣(泳道5)、以及脾臟(泳道6)制成的cDNA庫擴(kuò)增的Ggtal PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分離的照片。泳道I和2以kB顯示了尺寸標(biāo)準(zhǔn)。通過溴化こ錠染色使DNA可視化。圖2是在氨基酸水平上的來自大鼠(NM_145674，其中外顯子5和6缺失)、小鼠(NM_010283，全長)、牛(NM_177511，全長)、狗(XM_548478，全長)、中國倉鼠卵巢(共有序列)、中國倉鼠脾臟(共有序列)的Ggtal、以及CHO細(xì)胞外顯子8和9的多序列比對。NCBI登錄號標(biāo)注在括號中。圖3是從中國倉鼠卵巢得到的cDNA克隆的Ggtal-a序列。這個序列是1110個堿基對(SEQ ID NO: I)并且翻譯成370個氨基酸(SEQ ID NO:2)(具有44，002道爾頓預(yù)測分
子量的ー種蛋白質(zhì))。圖4是從中國倉鼠得到的cDNA克隆的Ggtal-b序列。這個序列是1110個堿基對(SEQ ID NO:3)并且翻譯成370個氨基酸(SEQ ID N0:4)(具有44，016道爾頓預(yù)測分子量的ー種蛋白質(zhì))。圖5是從DHFR-CHO細(xì)胞系擴(kuò)增的Ggtal基因組序列。這個序列由具有插入內(nèi)含子(以小寫字母表示)的外顯子8和9 (大寫字母)組成(SEQ ID NO:5)。圖6是針對CHO細(xì)胞系Ggtal外顯子8和9翻譯的氨基酸序列。這個序列是具有32，597道爾頓預(yù)測分子量的276個氨基酸(SEQ ID NO:6)。
圖7顯示了通過qPCR篩選選擇克隆的PCR循環(huán)譜，用于評定在CHO細(xì)胞系克隆中的Ggtal基因的差異表達(dá)(7A)以及作為引物特異性評定的Tm分析(7B)。圖8是擴(kuò)增的GgtalPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分離的照片。使用引物863和830來擴(kuò)增來自CHO(DHFR-)細(xì)胞系的基因組DNA (泳道2_5)或從相同細(xì)胞系得到的cDNA (泳道6和7)。
圖9是擴(kuò)增的GgtalPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分離的照片。使用跨越兩個外顯子(外顯子8和9)并且設(shè)計成在表達(dá)的基因與基因組拷貝之間有區(qū)別的Ggtal-特異性引物875 (正向)和855 (反向)來圖譜說明表達(dá)CTLA4-Ig的DHFR-CHO細(xì)胞系的三種不同的擴(kuò)增克隆。在通過甲氨喋呤擴(kuò)增之后通過稀釋將這些克隆分離。GgtalPCR產(chǎn)物的預(yù)期尺寸(從cDNA特異性擴(kuò)增的)是324bp。詳細(xì)說明由于表位的潛在免疫原性以及(因此)在生物制品開發(fā)和制造中的調(diào)節(jié)重要性，在重組糖蛋白上的末端半乳糖_ α -1_3-半乳糖殘基(Gal- a -Gal)的存在通常在很大程度上代表重要的翻譯后修飾。然而，Ggtal基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)以及酶活性兩者都未被報道發(fā)生在任何CHO細(xì)胞系中(歷史上用于商業(yè)化生產(chǎn)治療性生物制品的優(yōu)選的哺乳動物表達(dá)平臺)。事實上，科學(xué)文獻(xiàn)表明相反的情況，即由于在中國倉鼠基因組中缺乏Ggtal基因的功能性拷貝或它的在足夠水平上的表達(dá)，CHO細(xì)胞顯然不能產(chǎn)生具有末端Gal-a -Gal結(jié)構(gòu)的N-聚糖(Smith 等人(1990)《生物化學(xué)期刊》(J Biol Chem)265:6225-62343，4) ;Takeuchi等人(1989)《美國國家科學(xué)院院刊》(Proc Natl Acad Sci USA) 86:7819-7822)。在國際申請序列號PCT/US2009/031678 (公開參考號WO 2010/085251)(被授予本申請的受讓人)中具體描述了在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的糖蛋白中末端Gal- a -Gal殘基的出人意料的存在。1，3糖基轉(zhuǎn)移酶-I (Ggtal)從中國倉鼠以及從CHO細(xì)胞的鑒定和克隆(如在此說明的)提供了一種有價值的用于在此所述的方法中的工具，以檢測、測量和控制在生物產(chǎn)品中的含有Gal-a -Gal的聚糖。定義如在此使用的，術(shù)語“核酸分子”包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如，mRNA)以及DNA或RNA的類似物。DNA或RNA類似物可以從核苷酸類似物合成。該核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的。術(shù)語“分離的核酸分子”或“純化的核酸分子”包括從在核酸天然來源中存在的其他核酸分子中分離的核酸分子。例如，就基因組DNA而言，術(shù)語“分離的”包括從該基因組DNA天然地與其結(jié)合的染色體中分離的核酸分子。優(yōu)選地，“分離的”核酸不含有在從中得到該核酸的生物的基因組DNA中天然地位于該核酸側(cè)翼的序列(B卩，定位在該核酸5’和/或3’端處的序列)。例如，在多個實施方案中，分離的核酸分子可以包含在從中得到該核酸的細(xì)胞基因組DNA中天然位于該核酸分子側(cè)翼的小于大約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb、或O. Ikb的5’和/或3’核苷酸序列。此外，當(dāng)通過重組技術(shù)生產(chǎn)吋，“分離的”核酸分子(例如cDNA分子)可以基本上不含有其他細(xì)胞物質(zhì)、或培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時，基本上不含有化學(xué)前體或其他化學(xué)試劑。如在此使用的，術(shù)語“在高嚴(yán)緊度下雜交”說明了在進(jìn)行雜交反應(yīng)中用于雜交和洗漆的條件。這類條件可以在《當(dāng)代分子生物學(xué)實驗手冊'》，John Wiley & Sons,紐約(N. Y.)(2007)，章節(jié)6. 3中找到，通過引用將其結(jié)合在此。在這個參考文件中說明了水性和非水性方法，并且可以使用任何一項。在此提及的特異性雜交條件如下1)低嚴(yán)緊度雜交條件是在大約45° C下在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，之后至少在50° C下(對于低嚴(yán)緊度條件洗滌溫度可以增加到55° C)在O. 2X SSC、0. 1%SDS中洗滌兩次；2)中等嚴(yán)緊度雜交條件是在45° C下在6X SSC中，之后在60° C下在O. 2X SSC、0. 1%SDS中洗滌一次或次；3)高嚴(yán)緊度雜交條件是在約45° C下在6X SSC中，之后在65° C下在O. 2X SSC、0. 1%SDS中洗滌一次或多次；以及4)非常高嚴(yán)緊度雜交條件是在65° C下O. 5M磷酸鈉、7%SDS，之后在65° C下在O. 2X SSC、1%SDS下洗滌一次或多次。如在此使用的，“天然發(fā)生的”核酸分子是指具有自然界中出現(xiàn)的核苷酸序列的一種RNA或DNA分子。例如，一種天然發(fā)生的核酸分子可以編碼由野生型細(xì)胞表達(dá)的一種天然蛋白。如在此使用的，術(shù)語“基因”以及“重組基因”是指包括編碼Ggtal蛋白的至少一、個開放閱讀框的核酸分子。該基因任選地可以進(jìn)一步包括非編碼序列，例如調(diào)節(jié)序列和內(nèi)含子?！胺蛛x的”或“純化的”多肽或蛋白質(zhì)是基本上不含有來自從中得到該蛋白質(zhì)的細(xì)胞或組織來源的細(xì)胞物質(zhì)或其他污染蛋白，或當(dāng)化學(xué)合成時基本上不含有化學(xué)前體或其他化學(xué)試劑。“基本上不含有”表示Ggtal蛋白制劑具有按重量計至少50%Ggtal蛋白。在一個優(yōu)選的實施方案中，Ggtal蛋白制劑具有至少大約30%、20%、10%以及更優(yōu)選5% (按干重計)的非Ggtal蛋白(在此也稱為“污染蛋白”)或化學(xué)前體或非Ggtal化學(xué)試劑。當(dāng)重組生產(chǎn)Ggtal蛋白或其生物活性部分時，優(yōu)選地它也基本上不含有培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基表示小于大約20%、更優(yōu)選小于大約10%，并且最優(yōu)選小于大約5%的蛋白制劑的體積。如在此使用的術(shù)語，“Ggtal多肽”是指以下各項的一種多肽(1)顯示與SEQ IDN0:2、4、或7的一項或多項具有至少大約90%的總序列一致性；(2)包括發(fā)現(xiàn)于SEQ IDN0:2、4、或7中的至少一種特征性序列元件；和/或(3)共享發(fā)現(xiàn)于SEQ ID N0:2、4、或7的多肽中的至少一種生物活性。在一些實施方案中，Ggtal多肽顯示與SEQ ID N0:2、4、或7的一項或多項具有至少大約90%、至少大約91%、至少大約92%、至少大約93%、至少大約94%、至少大約95%、至少大約96%、至少約97%、至少大約98%、至少大約99%或更高的總序列一致性。在一些實施方案中，Ggtal多肽包括發(fā)現(xiàn)于SEQ ID NO:2、4、或7的至少一種序列元件特征性序列元件并且還顯示與SEQ ID N0:2、4、或7具有至少大約90%、至少大約91%、至少大約92%、至少大約93%、至少大約94%、至少大約95%、至少大約96%、至少大約97%、至少大約98%、至少大約99%或更高的總序列一致性。在一些實施方案中，Ggtal多肽具有SEQID N0:2、4、或7的長度的至少大約75%、至少大約80%、至少大約85%、至少大約90%、至少大約91%、至少大約92%、至少大約93%、至少大約94%、至少大約95%、至少大約96%、至少大約97%、至少大約98%、至少大約99%或更多的長度。在一些實施方案中，Ggtal多肽是SEQ IDN0:2、4、或7的一個片段。在一些實施方案中，Ggtal多肽顯示了與SEQ ID N0:2、4、或7的片段至少大約90%、至少91%、至少大約92%、至少大約93%、至少大約94%、至少大約95%、至少大約96%、至少大約97%、至少大約98%、至少大約99%或更高的一致性；在一些這樣的實施方案中，該片段具有至少大約 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、或更多個氨基酸的長度?！氨Ｊ匕被嶂脫Q”是其中用具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換該氨基酸殘基的一種置換。具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族在本領(lǐng)域中已經(jīng)被定義。這些家族包括具有以下各項的氨基酸堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β -分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，在Ggtal蛋白中預(yù)測非必需氨基酸殘基優(yōu)選地用來自相同側(cè)鏈家族的另ー種氨基酸殘基替換?？商娲?，在另ー個實施方案中，可以將突變隨機(jī)地連同Ggtal編碼序列的全部或部分一起引入(如通過飽和誘變)，并且可以針對Ggtal活性篩選出生成的突變體用來鑒定保持活性的突變體。在誘變之后，可以重組地表達(dá)編碼的蛋白質(zhì)并且可以確定該蛋白質(zhì)的活性。對于在此鑒定的序列的“序列一致性百分比(％)”被定義為在比對這些序列和引入空位之后(如果必要)，在候選序列中的氨基酸殘基或核苷酸與參考序列中的氨基酸殘基或核苷酸完全相同的百分比，以實現(xiàn)最大序列一致性百分比。(例如，為了最佳比對，可以將多 個空位引入ー個第一和ー個第二氨基酸或核酸序列之一或兩者中，并且為了比較的目的可以不考慮非同源性序列)。為了確定百分比序列一致性的目的，可以用本領(lǐng)域技術(shù)中的多種方式來實現(xiàn)比對，例如使用公眾可得的計算機(jī)軟件，如BLAST、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定用于測量比對的適當(dāng)參數(shù)，包括為了實現(xiàn)在被比較的序列的全長上進(jìn)行最大比對所需要的任何算法。在一個實施方案中，為了比較的目的所比對的參考序列的長度是參考序列長度的至少30%，例如至少40%，例如至少50%、60%、70%、80%、90%、或100%。然后對相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸進(jìn)行比較。當(dāng)在第一序列中的ー個位置被與在第二序列中的相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，那么這些分子在那個位置是相同的。如在此使用的術(shù)語，“特征性序列元件”是指其個性特征和相對于彼此的相對位置對于ー種特定多肽賦予了感興趣的ー種或多種活性或特征的一組氨基酸。在一些實施方案中，特征性序列元件是該特定多肽所獨(dú)有的ー種元件，因為它未被發(fā)現(xiàn)于缺乏該活性或特征的已知多肽中。在一些實施方案中，特征序列元件包括至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 或更多個氨基酸。在一些實施方案中，參與ー種特征性序列元件的ー些或全部氨基酸是彼此連續(xù)的；在ー些實施方案中，特征性序列元件中的某些殘基可以與處于線性順序中的一個或多個其他殘基分開。在一些實施方案中，特征性序列元件包括當(dāng)多肽鏈折疊時彼此鄰近地定位在ー個三維空間內(nèi)的殘基。如在此使用的，“細(xì)胞制劑”是指細(xì)胞的ー種體外制劑。在來自多細(xì)胞生物(例如植物和動物)細(xì)胞的情況下，純化的細(xì)胞制劑是從該生物中獲得的ー個細(xì)胞亞群，而不是整個的完整生物。在單細(xì)胞微生物(例如，培養(yǎng)的細(xì)胞和微生物細(xì)胞)的情況下，它包括至少10%以及更優(yōu)選地50%的受試者細(xì)胞的制劑。下面進(jìn)ー步詳細(xì)說明本發(fā)明的多個方面。GRtal核酸分子一方面，本發(fā)明提供了如在此說明的分離的或純化的Ggtal核酸分子。所提供的核酸分子可以編碼在此所述的Ggtal多肽，例如全長Ggtal蛋白或其一種活性片段(例如，它的一種催化活性片段)。還包括了不能編碼功能性蛋白但可以用于例如構(gòu)建一種載體來靶向內(nèi)源性中國倉鼠或CHO細(xì)胞Ggtal基因(用于例如敲除或修飾內(nèi)源性Ggtal基因序列)的Ggtal核酸分子或其片段。在一些實施方案中，所提供的Ggtal核酸分子是從中國倉鼠或從CHO細(xì)胞得到的。在一些實施方案中，所提供的Ggtal核酸分子具有與從中國倉鼠或從CHO細(xì)胞得到的Ggtal核酸分子完全相同的核苷酸序列。在一些實施方案中，所提供的Ggtal核酸分子編碼從中國倉鼠或CHO細(xì)胞得到的一種Ggtal多肽。在一個實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子具有SEQ ID NO: 1、3、5或6的核苷酸序列、或任何這些核苷酸序列的一部分。在一些實施方案中，該核酸分子僅包括編碼序列。在其他實施方案中，該核酸分子包括非編碼序列，如5’未翻 譯序列或內(nèi)含子序列。包括正義和反義序列兩者。還包括了適合作為探針、標(biāo)簽、或引物用于例如檢測和/或定量Ggtal表達(dá)的寡核苷酸或核酸分子的片段。這類寡核苷酸或片段可以是SEQ ID N0:l、3、5或6的至少大約10、12或15個、約20或25個，或大約30、35、40、45、50、55、60、65、或75個連續(xù)核苷酸。在某些實施方案中，寡核苷酸是小于約500、400、300、200、150、120、或100個核苷酸長度。在一個實施方案中，將一種探針或引物附著到一種固體載體上，例如在此所述的一種固體載體。在另一個實施方案中，提供了一組引物，例如適合用于PCR反應(yīng)中的引物，它們可以用來擴(kuò)增Ggtal序列的選擇區(qū)域，例如在此所述的結(jié)構(gòu)域、區(qū)域、位點或其他序列。這些引物可以是至少5、10、或50個堿基對長度并且小于100、或小于200個堿基對長度。這些引物應(yīng)當(dāng)是完全相同的，或與在此所述的一個序列或與一種天然發(fā)生的變異體有一個堿基不同。例如，適合用于擴(kuò)增在此所述的Ggtal序列的全部或一部分的引物披露于表2和表4中。在一個實施方案中，一個引物試劑盒包括退火到SEQ ID N0:l、3、5或6的編碼鏈上的一個正向引物以及退火到SEQ ID NO: 1、3、5或6的非編碼鏈上的一個反向引物?？梢詷?biāo)記核酸寡核苷酸，例如在此所述的探針、標(biāo)簽或引物。典型地，這類標(biāo)記是化學(xué)發(fā)光的、熒光的、放射性的、或比色的?？梢灾亟M地生產(chǎn)或合成地生產(chǎn)本發(fā)明的核酸。Ggtal核酸變異體本發(fā)明包括與在此披露的核苷酸序列(如SEQ ID NO: 1、3、5或6)不同的核酸分子。例如，本發(fā)明的分尚的核酸分子可以具有與SEQ ID NO: 1、3、5或6相關(guān)的、或與任何這些核苷酸序列的一部分相關(guān)(例如以特定水平的序列一致性或在高嚴(yán)緊條件下的雜交能力相關(guān))的序列。本發(fā)明的核酸可以具有一種天然發(fā)生的序列(例如，天然發(fā)生的等位基因變異體或突變體的序列)或它可以具有一種非天然發(fā)生的序列。在一個實施方案中，差異可能是由于例如遺傳密碼(以及導(dǎo)致編碼與由在此披露的核苷酸序列編碼的那些相同的Ggtal蛋白的核酸)的簡并性所致。可以針對具有優(yōu)選的或非優(yōu)選的密碼子、或針對特定表達(dá)系統(tǒng)選擇本發(fā)明人的核酸。例如，該核酸可以是其中至少一個密碼子(例如至少10%、或20%的密碼子)已經(jīng)被改變使得該序列針對在特定系統(tǒng)(例如，大腸桿菌、酵母、人類、昆蟲、或CHO細(xì)胞)中表達(dá)而被優(yōu)化的一種核酸。核酸變異體可以是天然發(fā)生的，如等位基因變異體(相同的基因座)、同系物(不同的基因座)，或可以是非天然發(fā)生的?？梢酝ㄟ^誘變技術(shù)(包括應(yīng)用于多核苷酸、細(xì)胞、或生物的那些)制造非天然發(fā)生的變異體。這些變異體可以包含核苷酸置換、缺失、倒位以及插入。變異可以發(fā)生在編碼區(qū)和非編碼區(qū)之一或兩者中。這些變異可以產(chǎn)生保守和非保守氨基酸置換兩者(如在編碼的產(chǎn)物中比較的)。核酸修飾和誘變技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。Ggtal (例如CHO Ggtal)的等位基因變異體包括功能性和非功能性蛋白質(zhì)兩者。功能性等位基因變異體是編碼保持提供酶功能能力的Ggtal蛋白的變異體的天然發(fā)生的核苷酸序列。功能性等位基因變異體將典型地包含SEQ ID NO:2、4或7的一個或多個氨基酸的保守置換、或在該蛋白質(zhì)的非關(guān)鍵區(qū)域中的非關(guān)鍵殘基的置換、缺失或插入。非功能性等位基因變異體是天然發(fā)生的核苷酸序列變異體，它們編碼未保留酶功能的ー種Ggtal多肽。非功能性等位基因變異體可以典型地包括SEQ ID N0:2、4或7的氨基酸序列的ー種非保守置換、缺失、或插入、或成熟前截短，或該蛋白質(zhì)的關(guān)鍵區(qū)的關(guān)鍵殘基的置換、插入、或缺失。
Ggtal反義分子本發(fā)明中還包括對于在此所述的中國倉鼠或CHO細(xì)胞Ggtal是反義的分離的核酸分子。反義試劑的主要類別是反義寡核苷酸類(0DN)、核酶類、DNA酶類以及RNA干擾(RNAi)。這類分子可以用于多種方法中用來抑制Ggtal活性(例如在CHO細(xì)胞中)。“反義”核酸具有與目標(biāo)核酸互補(bǔ)的核苷酸序列。可以設(shè)計出一種反義核酸使得它與Ggtal mRNA的整個編碼區(qū)互補(bǔ)，并且更優(yōu)選地是僅對于Ggtal mRNA的編碼或非編碼區(qū)的一部分是反義的ー種寡核苷酸。例如，該反義寡核苷酸可以與Ggtal mRNA翻譯起始位點周圍的區(qū)域互補(bǔ)(例如，在感興趣的靶基因核苷酸序列的-10至+10區(qū)域之間)。反義寡核苷酸可以具有例如大約 7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、或更多個核苷酸的長度。反義分子將抑制在此所述Ggtal的生產(chǎn)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的步驟使用化學(xué)合成以及酶促連接反應(yīng)來構(gòu)建本發(fā)明的反義核酸。例如，使用設(shè)計成増加分子的生物學(xué)穩(wěn)定性或設(shè)計成増加在反義與正義核酸之間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性的天然發(fā)生的核苷酸或不同修飾的核苷酸，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸，可以化學(xué)合成反義核酸(例如反義寡核苷酸)。還可以使用已經(jīng)將ー種核酸在反義方向上亞克隆到其中的表達(dá)載體在生物學(xué)上產(chǎn)生反義核酸。可以使用在此所述的載體將反義核酸分子遞送到細(xì)胞中。為了實現(xiàn)反義分子的足夠的細(xì)胞內(nèi)濃度，該反義核酸分子置于其中的載體構(gòu)建體可以處于強(qiáng)pol II或pol III啟動子的控制之下。制造和使用反義分子來調(diào)節(jié)生物活性的方法是本領(lǐng)域已知的，參見例如Pan和Clawson,《生物控制的反義應(yīng)用》(Antisense applications for bioloRical control)(2006)《細(xì)胞生物化學(xué)期刊》(J. Cell Biochem. )98(1) :14-35 ;Sioud 和 Iversen，《作為治療齊Li的核酶、DNA 酶以及小干擾 RNA》(Ribozymes, DNAzymes and small interferinR RNAsas therapeutics) (2005)《當(dāng)代藥物革巴標(biāo)》(Curr Drug Targets) 6 (6) :647-53 ；Bhindi等人，((Brothers in arms DNA酶、短干擾RNA、以及基于小分子核酸的基因沉默策略的出現(xiàn)潮流》(Brothers in arms:DNA enzymes, shortinterferinR RNA, and the emerRinR waveof smali—molecule nucleic acid-pased gene—silencing strategies) (2007)《美國柄理學(xué)期刊》(Am J Pathol. ) 171(4) :1079_88)。
Ggtal 多狀另一方面，本發(fā)明的特征是如在此所述的一種分離的Ggtal多肽或蛋白質(zhì)(或其生物活性片段)。典型地，Ggtal蛋白的生物活性片段具有以下特征的一項或多項它有催化Gal-a I, 3-Gal聚糖的合成的能力；它利用UDP-Gal將半乳糖部分轉(zhuǎn)移到現(xiàn)有的含有Gal的N-連接的聚糖上從而產(chǎn)生一種Gal-a -Gal結(jié)構(gòu)以及UDP ;它利用UDP-Gal將半乳糖部分轉(zhuǎn)移到現(xiàn)有的含有Gal的O-連接的聚糖上從而產(chǎn)生Gal-a-Gal結(jié)構(gòu)以及UDP;它利用UDP-Gal將半乳糖部分轉(zhuǎn)移到現(xiàn)有的含有Gal的糖脂上從而產(chǎn)生Gal-a -Gal結(jié)構(gòu)以及UDP ;結(jié)合到UDP-Gal以及以半乳糖封端的聚糖上；結(jié)合到含有Gal-a -Gal的結(jié)構(gòu)上；將UDP-Gal水解成Gal ;如果轉(zhuǎn)染和表達(dá)于真核細(xì)胞中則定位到高爾基區(qū)室中；結(jié)合到中國倉鼠或CHO細(xì)胞特異性抗-Ggtal抗體上；可以利用化學(xué)修飾的UDP-Gal同系物(例如，硫糖、三硝基苯基；2脫氧、2疊氮基，放射化學(xué)標(biāo)記的，例如3H、C14、33P、32P)將半乳糖部分轉(zhuǎn)移 到現(xiàn)有的N-或O-連接的聚糖上?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)從細(xì)胞或組織來源分離出Ggtal多肽或蛋白質(zhì)(或其片段)。在一些實施方案中，從中國倉鼠或從CHO細(xì)胞分離出Ggtal多肽或蛋白。Ggtal多肽或蛋白質(zhì)(或其片段)可以通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)或化學(xué)地合成。本發(fā)明的多肽包括作為多基因、可變轉(zhuǎn)錄事件、可變RNA剪接事件、以及可變翻譯和翻譯后事件的存在的結(jié)果而產(chǎn)生的那些。該多肽可以表達(dá)于當(dāng)在天然細(xì)胞中表達(dá)所表達(dá)的多肽時導(dǎo)致存在基本上相同的翻譯后修飾的系統(tǒng)中(例如培養(yǎng)的細(xì)胞)或?qū)е路g后修飾改變或遺漏的系統(tǒng)中(例如當(dāng)在天然細(xì)胞中表達(dá)時存在糖基化或切割)。在一些實施方案中，本發(fā)明的Ggtal多肽具有SEQ ID N0:2、4或7的序列或其功能性片段。其他實施方案包括含有與SEQ ID N0:2、4或7至少一個不同的氨基酸殘基(但是不大于10%)的蛋白質(zhì)。這些差異可以是在對于活性不重要的氨基酸殘基中。在一些實施方案中，這些差異是在一個非必需殘基處的保守置換或差異或改變。還包括了以一個特定的序列一致性百分比與SEQ ID N0:2、4或7高度相關(guān)的多肽序列。本發(fā)明包括Ggtal嵌合蛋白或融合蛋白。如在此使用的，Ggtal “嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括連接到一種非Ggtal多肽上的一種Ggtal多肽。非Ggtal多肽可以融合到Ggtal多肽的N端或C端上，或可以內(nèi)部融合。在一個實例中，該融合蛋白可以包括對于配體具有高親和力的一個部分。例如，該融合蛋白可以是一種GST-Ggtal融合蛋白，其中這些Ggtal序列融合到GST序列的C端上。這類融合蛋白可以促進(jìn)重組Ggtal的純化。編碼融合部分(例如，GST多肽)的表達(dá)載體是可商購的?？梢詫⒕幋aGgtal的核酸克隆到這類表達(dá)載體中，使得該融合部分在框內(nèi)連接到該Ggtal蛋白上?？商娲?，該融合蛋白可以是在其N端上含有一個異源信號序列的Ggtal蛋白。在某些宿主細(xì)胞中(例如，哺乳動物宿主細(xì)胞)，可以通過使用一種異源信號序列來增加Ggtal的表達(dá)和/或分泌。融合蛋白可以包括血清蛋白的全部或一部分，例如一個IgG恒定區(qū)，或人血清白蛋白。Ggtal多肽的變異體在另一個方面，本發(fā)明還表征了 Ggtal多肽的變異體，例如它作為激動劑(模擬物)或作為拮抗劑起作用。Ggtal蛋白的變異體可以通過誘變產(chǎn)生，例如不連續(xù)點突變、序列的插入或缺失或Ggtal蛋白的截短。Ggtal蛋白的激動劑可以保留Ggtal蛋白的天然發(fā)生形式的基本上相同的、或一個亞類的生物活性。通過例如競爭性調(diào)節(jié)Ggtal蛋白的Ggtal介導(dǎo)的活性，Ggtal蛋白的拮抗劑能夠抑制Ggtal蛋白天然發(fā)生形式的ー種或多種活性。在一些實施方案中，Ggtal多肽的變異體共享“母體”Ggtal多肽(或變異體Ggtal多肽)的氨基酸序列，但是與母體多肽相比較，包括一種或多種共價修飾。例如，在一些實施方案中，這些變異體被聚こニ醇化、糖基化、磷酸化等?？梢酝ㄟ^針對激動或拮抗活性篩選Ggtal蛋白突變體(例如,截短突變體)的組合文庫來鑒定Ggtal蛋白的變異體?？梢詫gtal多肽的變異體(像Ggtal多肽)產(chǎn)生為融合蛋白。Ggtal杭體和杭體產(chǎn)牛在另ー個方面，本發(fā)明提供了特異性地結(jié)合到如在此所述的Ggtal多肽上(和/或Ggtal多肽變異體上)的ー種抗體；本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)這類抗體的方法。術(shù)語“抗體”是指包括能夠結(jié)合中國倉鼠或CHO Ggtal抗原的至少ー個免疫球蛋白可變域或免疫球蛋白可變域序列的ー種蛋白質(zhì)。例如，抗體可以包括ー個重(H)鏈可變區(qū)(在此縮寫為VH)，以及一個輕鏈(L)可變區(qū)(在此縮寫為VL)。在另ー個實例中，抗體包括兩個重(H)鏈可變區(qū)以及兩個輕(L)鏈可變區(qū)。這樣，術(shù)語“抗體”包括多克隆的、単一特異性的、單克隆的、單價的、嵌合的、人源化的、人的、雙特異性的、以及異源偶聯(lián)抗體以及這些的抗原結(jié)合片段。如此使用的，術(shù)語全長抗體的“抗原結(jié)合片段”是指保持特異性結(jié)合到感興趣的靶標(biāo)上的能力的全長抗體的ー個或多個片段。這類片段的實例包括(i) Fab片段，由VL、VH、CL以及CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab’)2片段，包括在鉸鏈區(qū)通過ニ硫鍵連接的兩個Fab片段的ニ價片段；(iii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單個臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段，(V)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段；以及(vi)保留功能性的分離的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)。分離的Ggtal蛋白(包括變異體)或其抗原片段可以用作抗原來生產(chǎn)、篩選或選擇這類抗體?？梢允褂萌魏芜m當(dāng)?shù)募夹g(shù)(包括常規(guī)雜交瘤技術(shù)、重組技術(shù)、組合方法、噬菌體展示技術(shù)、以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其他技木)獲得抗體及其抗原結(jié)合片段。例如，參見《抗體工程:方法和實驗方案》(Antibody EnRineerinRiMethods and Protocols),BennyK. C. Lo, Ed. (Humana Press, 2003);《制造和使用抗體實用手冊'》(MakinR and UsinRAntibodies:A Practical HandbooK),Gary Howard and Matthew Kaser, Eds. (CRC, 2006)；《抗體嗤菌體展不:方法和實驗方案〉〉(Antibody Phage Display:Methods and Protocols),Philippa Obrien and Robert Aitken, Eds. (Humana Press, 2001);《單克隆抗體方法和實驗方案》(Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols), Maher Albitar, Ed.(Humana Press,2007)。本發(fā)明的抗體可以結(jié)合到ー個第二功能部分上，例如該抗體可以結(jié)合到一個標(biāo)記上(例如，ー個突光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、顯像劑)。在一些實施方案中，可以使用ー種抗-Ggtal抗體來檢測Ggtal多肽(例如在細(xì)胞 溶解產(chǎn)物或細(xì)胞上清液中)以便檢測以及任選地測量該蛋白質(zhì)的存在、水平、豐度或表達(dá)模式。通過使抗體結(jié)合(例如物理連接)到可檢測物質(zhì)(例如抗體標(biāo)記)上可以促進(jìn)檢測。可檢測物質(zhì)的實例包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、以及放射性材料。適合的酶的實例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰膽堿酯酶；適合的輔基基團(tuán)復(fù)合物的實例包括鏈霉親和素/生物素以及抗生物素蛋白/生物素；適合的熒光材料的實例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、玫瑰精、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的實例包括魯米諾；生物發(fā)光材料的實例包括螢光素酶、螢光素、以及水母發(fā)光蛋白。
重鉬表汰載體在另一個方面，本發(fā)明包括包含在此所述的核酸的載體(例如，表達(dá)載體、敲除載體、或驅(qū)動反義序列的載體)。如在此使用的，術(shù)語“載體”是指一種核酸分子，該核酸分子能夠轉(zhuǎn)運(yùn)它已經(jīng)連接到其上的另一種核酸，并且可以包括一種質(zhì)粒、粘?；虿《据d體。該載體可以能夠自主復(fù)制或它能夠整合到一個宿主DNA中。載體可以包括一種中國倉鼠或CHO細(xì)胞Ggtal核酸，其處于適合在宿主細(xì)胞中表達(dá)該核酸的一種形式。優(yōu)選地，該重組表達(dá)載體包括可操作地連接到有待表達(dá)的核酸序列上的一個或多個調(diào)節(jié)序列。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”包括啟動子、增強(qiáng)子以及其他表達(dá)控制元件(例如，多腺苷酸化信號)。調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)核苷酸序列的組成型表達(dá)的那些、以及組織特異性調(diào)節(jié)和/或誘導(dǎo)型序列。表達(dá)載體的設(shè)計可以取決于這類因素，如有待轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇、所希望的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等。可以將本發(fā)明的表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞中，由此產(chǎn)生由在此所述的核酸編碼的蛋白或多肽(包括融合蛋白或多肽)(例如，Ggtal蛋白、Ggtal蛋白的突變體形式、融合蛋白等)?？梢葬槍υ谠嘶蛘婧思?xì)胞中的Ggtal多肽的表達(dá)來設(shè)計本發(fā)明的重組表達(dá)載體。例如，本發(fā)明的多肽可以表達(dá)于大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞(例如，使用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞中，優(yōu)選CHO細(xì)胞。當(dāng)用于哺乳動物細(xì)胞中時，可以通過病毒調(diào)節(jié)元件來提供該表達(dá)載體的控制功能。例如，常用的啟動子是來自多瘤病毒、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒以及猿猴病毒40。原核生物中的蛋白質(zhì)表達(dá)最通常是在具有載體的大腸桿菌中進(jìn)行的，這些載體包含指導(dǎo)融合蛋白或非融合蛋白表達(dá)的組成型或誘導(dǎo)型啟動子。融合載體將多個氨基酸添加到在其中編碼的蛋白質(zhì)上，通常是該重組蛋白質(zhì)的氨基端上。這類融合蛋白典型地用于三個目的I)用于增加重組蛋白的表達(dá)；2 )用于增加重組蛋白的溶解度；以及3 )通過在親和純化中作為配體起作用以有助于重組蛋白的純化。通常地，將蛋白裂解位點引入該融合部分與該重組蛋白的結(jié)合處從而能夠在該融合蛋白純化之后從該融合部分中分離出該重組蛋白。這類酶以及它們的同源識別序列包括因子Xa、凝血酶以及腸激酶。典型的融合表達(dá)載體包括 pGEX(Pharmacia Biotech Inc)、pMAL (New England Biolabs,貝弗利市，馬薩諸塞州。).以及PRIT5 (Pharmacia,皮斯卡特維，新澤西州)，它們對應(yīng)地將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白、或蛋白A融合到目標(biāo)重組蛋白上。純化的融合蛋白可以用于Ggtal活性測定(例如，直接測定或競爭性測定)，或用來產(chǎn)生對于Ggtal蛋白具有特異性的抗體。在另一個實施方案中，該啟動子是一種誘導(dǎo)型啟動子，例如由類固醇激素、由多肽激素(例如通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑)、或由異源多肽(例如四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)，“Tet-On”和“Tet-Off”來自Clontech Inc.,加利福尼亞州)調(diào)節(jié)的啟動子。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包括本發(fā)明的DNA分子的一種重組表達(dá)載體，該DNA分子以反義反向克隆到該表達(dá)載體中?？梢赃x擇可操作地連接到以反義方向克隆的核酸上的調(diào)節(jié)序列(例如，病毒啟動子和/或增強(qiáng)子)，它們在多種細(xì)胞類型中指導(dǎo)反義RNA的組成型、組織特異性或細(xì)胞類型特異性表達(dá)。該反義表達(dá)載體可以是處于重組質(zhì)粒、噬菌?；驕p毒病毒的形式。本發(fā)明的另一個方面提供了一種載體，該載體包含在此所述的一種核酸分子，例如在此所述的一種中國倉鼠或CHO細(xì)胞Ggtal核酸分子，該分子被配置成允許它同源地重組到宿主細(xì)胞基因組的特異性位點中，例如配置成修飾、斷裂、或敲除宿主細(xì)胞中的一種內(nèi)源性Ggtal基因?？梢酝ㄟ^常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA引入到宿主細(xì)胞中。如在此使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”旨在是指許多種用于將外來核酸(例如DNA)引入到宿主細(xì)胞中的領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀法、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、或電穿孔?？商娲兀梢允箤⒅亟M表達(dá)載體體外轉(zhuǎn)錄和翻譯(例如使用T7啟動子調(diào)節(jié)序列以及T7聚合酶)。 用于制造和使用包括在此所述核酸的載體的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，這些方法提供于《當(dāng)代分子生物學(xué)實驗手冊》(Current Protocols in Molecular Biology)(2007，John Wiley and Sons, Inc. , Print ISSN: 1934-3639)中。宿主細(xì)胞/基因工程化細(xì)胞宿主細(xì)胞(例如包含在此所述的任何載體的宿主細(xì)胞)可以是任何原核或真核細(xì)胞。例如，一種Ggtal蛋白可以表達(dá)于細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌)、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母或哺乳動物細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)中。其他適合的宿主細(xì)胞對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是已知的。本發(fā)明分離的細(xì)胞可以是被基因工程化的用于相對于親本細(xì)胞表達(dá)增加水平的中國倉鼠或CHO細(xì)胞Ggtal的一種細(xì)胞。因此，本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的宿主細(xì)胞用于生產(chǎn)Ggtal蛋白的方法。在一個實施方案中，該方法包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(編碼Ggtal蛋白的一種重組表達(dá)載體已經(jīng)被引入其中)，從而產(chǎn)生一種Ggtal蛋白。在另一個實施方案中，該方法進(jìn)一步包括從該培養(yǎng)基或該宿主細(xì)胞中分離一種Ggtal蛋白。在另一個方面，本發(fā)明的特征是一種細(xì)胞或包括一種中國倉鼠或CHO細(xì)胞Ggtal轉(zhuǎn)基因的、或另外地錯誤表達(dá)Ggtal的細(xì)胞的純化制劑。例如，本發(fā)明的分離的細(xì)胞是被基因工程化用來表達(dá)比親本細(xì)胞(例如該細(xì)胞是一種Ggtal敲除或敲低CHO細(xì)胞)更低水平Ggtal的一種細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)。用于降低或抑制內(nèi)源性蛋白質(zhì)的表達(dá)的敲除或敲低細(xì)胞的產(chǎn)生是一種已知技術(shù)。例如，一種CHO敲除細(xì)胞最近在Yamane-Ohnuki等人(2004)《生物技術(shù)與生物工程》(Biotechnol. Bioeng) 87:614-622中進(jìn)行了說明。細(xì)胞制劑可以由分離的人類或非人類細(xì)胞(例如，嚙齒動物細(xì)胞(例如倉鼠衍生的)、小鼠或大鼠細(xì)胞、兔細(xì)胞、或豬細(xì)胞或細(xì)胞系(例如CHO細(xì)胞系))組成的。用作本發(fā)明的宿主細(xì)胞的CHO細(xì)胞包括任何CHO株的細(xì)胞，包括CHO Kl (ATCC CCL-61)、CHOpro3-、CHO DG44、CHO-S, CHO P12 或 dhfr-CHO 細(xì)胞系 DUK-BII (Chassin 等人，PNAS77，1980，4216-4220)。
用于在這類宿主細(xì)胞中制造和使用本發(fā)明的宿主細(xì)胞、以及用于制造治療性糖蛋白的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，這些方法提供于《當(dāng)代細(xì)胞生物學(xué)實驗手冊》(Current Protocols in Cell Biology) (2007，John Wiley and Sons，Inc.，Print ISSN: 1934-2500);《當(dāng)代蛋白質(zhì)科學(xué)實驗手冊》(Current Protocols in ProteinScience) (2007, John Wiley and Sons, Inc. , Print ISSN: 1934-3655) ；Wurm,《在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋白治療劑》(Production of recombinant protein therapeuticsin cultivated mammalian cells) (2004)《自然生物技術(shù)》(Nature Biotech.)22:1393-1398 ;《治療性蛋白方法和實驗方案》(Therapeutic Proteins :Methods andProtocols)，Smales and James, eds. (2005，Humana Press, ISBN-10:1588293904)中。用于檢測Ggtal表達(dá)或活性的方法監(jiān)測負(fù)責(zé)N-聚糖上Gal-a-Gal表位的酶添加的α-1，3糖基轉(zhuǎn)移酶-I (Ggtal)的表達(dá)和/或活性的能力是ー種有價值的工具，用于預(yù)測特定細(xì)胞系或克隆群中該表位存 在的可能性。因此，本發(fā)明的特征還在于評估在CHO細(xì)胞中的Ggtal表達(dá)的方法。該方法包括提供來自CHO細(xì)胞群的ー種樣品，以及使該樣品與在此所述的ー種Ggtal核酸或抗體相接觸。這些方法可以用來譜圖說明在潛在不同背景或克隆表型的細(xì)胞中的相對Ggtal表達(dá)。同樣地當(dāng)這類細(xì)胞生長在不同生物過程條件下時(如培養(yǎng)基配方和/或規(guī)模)，它可以用來評定基因表達(dá)的變化。例如，這類方法可以用來評估在表達(dá)或產(chǎn)生治療性糖蛋白的CHO細(xì)胞群中的Ggtal活性或Gal- a -Gal存在或水平。在一些實施方案中，該CHO細(xì)胞群是在生物反應(yīng)器中(例如商用生物反應(yīng)器)的ー個群體。這類方法可以用于例如監(jiān)測在制造過程期間的Ggtal表達(dá)。在其他實施方案中，CHO細(xì)胞群是針對Ggtal活性進(jìn)行篩選的多種CHO細(xì)胞群之一。被篩選的多種CHO細(xì)胞可以在任何數(shù)量的方面上不同，例如它們可以在遺傳背景、生長條件等方面不同。在這類篩選方法中，可以基于Gtal活性的水平選擇CHO細(xì)胞，例如選擇作為用于生產(chǎn)特定治療性糖蛋白的適當(dāng)宿主?？梢詫⒈辉u估的CHO細(xì)胞中的Ggtal活性與Ggtal活性的參考水平(例如，對照水平、預(yù)定水平，或相應(yīng)于在ー個第二 CHO細(xì)胞群中的水平的水平)進(jìn)行比較。基于核酸的檢測方法包括多種雜交或擴(kuò)增測定法，它們包括但不限于DNA印跡或RNA印跡分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析(例如，定量PCR)、SAGE分析、探針陣列或寡核苷酸陣列。用于檢測Ggtal表達(dá)的ー種方法涉及使從CHO細(xì)胞群分離的mRNA的樣品與在此所述的ー種核酸分子(例如探針)相接觸，該核酸分子可以與由Ggtal基因編碼的mRNA雜交。用于檢測Ggtal表達(dá)的另ー種方法涉及使來自CHO細(xì)胞群的mRNA或cDNA的一種樣品與在此所述的引物對相接觸，從而擴(kuò)增Ggtal序列。可以例如通過rtPCR、qPCR、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、自主序列復(fù)制、滾環(huán)復(fù)制、或任何其他核酸擴(kuò)增方法，之后使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來檢測這些擴(kuò)增的分子來評估樣品中的GgtalmRNA的水平。實時定量PCR (或qPCR)代表用于對有限數(shù)量細(xì)胞中的Ggtal的基因表達(dá)水平進(jìn)行定量的特異性的且高敏感的分子譜法(molecular profling method)的一個實例。如在此使用的，適當(dāng)?shù)囊飳Ρ欢x為能夠退火到限定在中間的ー個區(qū)域的基因(對應(yīng)地正鏈和負(fù)鏈，或反之亦然)的5’和3’區(qū)域上的ー對寡核苷酸。通常，擴(kuò)增引物在長度上是從大約10個至30個核苷酸并且位于長度從大約50至200個核苷酸的一個區(qū)域的側(cè)翼。在適當(dāng)條件下并且使用適當(dāng)試劑，這類引物允許擴(kuò)增包括側(cè)翼為這些引物的核苷酸序列的核酸分子?？梢酝ㄟ^原位或通過體外形式兩者來確定在細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)中的Ggtal基因表達(dá)的水平。在一種形式下，將mRNA (或cDNA)固定在一個表面上并且與探針接觸(例如，通過使分離的mRN在瓊脂糖凝膠上移動并且將mRNA從該凝膠轉(zhuǎn)移到膜如硝酸纖維素上)。在一種替代形式中，將探針固定在一個表面上并且使mRNA (或cDNA)與這些探針接觸(例如在以下說明的二維基因芯片陣列中)。熟練的技術(shù)人員可以采用已知的mRNA檢測方法用于檢測由Ggtal基因編碼的mRNA的水平。對于原位方法而言，可以將細(xì)胞或組織樣品制備/處理以及固定在一種載體(典型地一種載玻片)上，進(jìn)而使之與可以雜交到被分析的Ggtal基因上的一種探針接觸。在另一個實施方案中，這些方法進(jìn)一步包括使一種對照樣品與能夠檢測GgtalmRNA、或基因組DNA的一種化合物或試劑相接觸，并且將對照樣品中的Ggtal mRNA或基因組DNA的存在度(presence)與測試樣品中的Ggtal mRNA或基因組DNA的存在度相比較。仍然在另一個實施方案中，使用基因表達(dá)系列分析(例如如美國專利號5，695，937中說明的)來檢測Ggtal轉(zhuǎn)錄本水平。用于檢測Ggtal蛋白的基于抗體的技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、免疫沉淀、免疫熒光、酶免疫測定(EIA)、放射免疫測定(RIA)、蛋白質(zhì)印跡分析、表面等離子共振。其他方法可以包括使用基于質(zhì)譜的方法來檢測Ggtal肽或其片段，包括但不限于LC-MS、MS/MS、MS/MS/MS、MALDI-MS、多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。在一個實施方案中，在此所述的檢測方法是確定樣品的基因表達(dá)譜的一部分，其中該譜包括代表Ggtal表達(dá)水平的一個值(在針對至少一個其他基因的表達(dá)的至少一個其他值之中)。該方法可以進(jìn)一步包括將該值或譜(即多個值)與一個參考值或參考譜進(jìn)行比較?？梢酝ㄟ^在此所述的任何方法獲得樣品的基因表達(dá)譜(例如通過提供來自該樣品的核酸以及使該核酸與一個陣列接觸)。可以使用這種方法來評估或篩選CHO細(xì)胞。在另一個方面，本發(fā)明的特征在于具有多個數(shù)字編碼的數(shù)據(jù)記錄的一種計算機(jī)介質(zhì)。每個數(shù)據(jù)記錄包括代表在樣品中的中國倉鼠或Ggtal表達(dá)水平的一個值、以及該樣品的一個描述符。樣品的描述符可以是該樣品的一個標(biāo)識符，例如從中得到該樣品的細(xì)胞類型(例如CHO細(xì)胞株)、或在其下培養(yǎng)作為該樣品來源的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)條件。在一個實施方案中，該數(shù)據(jù)記錄進(jìn)一步包括代表除了 Ggtal之外的基因的表達(dá)水平的值(例如，與聚糖合成相關(guān)的其他基因，或陣列上的其他基因)。該數(shù)據(jù)記錄可以被結(jié)構(gòu)化為一個表格，例如作為數(shù)據(jù)庫例如關(guān)系數(shù)據(jù)庫(例如Oracle或Sybase數(shù)據(jù)庫環(huán)境的SQL數(shù)據(jù)庫)的一部分的表格。它們的陣列和用涂本發(fā)明的特征還在于具有多個地址的一種二維陣列，該多個地址的每個地址在位置上與該多個地址的每個其他地址可區(qū)別開。該多個地址的每個地址具有獨(dú)特的捕獲探針，例如在此所述的一種核酸或多肽序列或抗體。該多個地址的至少一個地址具有識別在此所述的中國倉鼠或CHO細(xì)胞Ggtal分子(例如,在此所述的Ggta-1、Ggtal-b或Ggtal-c 分子)的捕獲探針。在一個實施方案中，該捕獲探針是核酸，例如與Ggtal核酸序列互補(bǔ)的探針。在另ー個實施方案中，該捕獲探針是ー種抗體，例如對在此所述的Ggtal多肽具有特異性的ー種抗體。特征還在于通過使樣品(例如來自CHO細(xì)胞的樣品)與前面提到的陣列相接觸并且檢測該樣品與該陣列的結(jié)合來分析樣品的ー種方法。該陣列可以具有至少大于10、50、100、200、500、1，000,2, 000、或10，000或更多個地址/cm2(以及在其間的范圍)的密度。在一個優(yōu)選的實施方案中，該多個地址包括至少10、100,500,1, 000,5, 000、10，000,50, 000個地址。在一個優(yōu)選的實施方案中，該多個地址包括等于或少于10、100、500、1，000,5, 000、10，000、或50，000個地址。該基質(zhì)可以是ー種ニ維
基質(zhì)，如載玻片、晶片(例如，ニ氧化硅或塑料)、質(zhì)譜板、或ー種三維基質(zhì)(如凝膠墊)。除了這多個地址之外的地址可以布置在該陣列上。可以通過多種方法產(chǎn)生ー個陣列，例如通過光刻法(參見例如美國專利號5，143，854、5，510，270、以及5，527，681 )、機(jī)械法(例如，如美國專利號5，384，261中說明的定向流動法)、基于插針的方法(例如，如美國專利號5，288，514中說明的)、以及基 于珠粒的技術(shù)(例如，如PCT US/93/04145中說明的)。在另一方面，本發(fā)明的特征在于分析Ggtal表達(dá)的方法。該方法包括提供如上所述的ー個陣列；使該陣列與一個樣品接觸并且檢測Ggtal分子(例如，核酸或多肽)與該陣列的結(jié)合。在一個優(yōu)選實施方案中，該陣列是ー個核酸陣列。任選地該方法進(jìn)ー步包括在與該陣列接觸之前或期間從該樣品中擴(kuò)增核酸。在另ー個實施方案中，該陣列可以用來測定細(xì)胞群(例如，CHO細(xì)胞群)中的基因表達(dá)，特別地是Ggtal的表達(dá)。如果對足夠數(shù)量的多種樣品進(jìn)行分析，可以使用聚類(例如，層次聚類、k-均值聚類、貝葉斯聚類等)來鑒定與Ggtal共調(diào)節(jié)的其他基因。例如，該陣列可以用于定量多基因的表達(dá)。因此，不但可以確定細(xì)胞類型特異性，而且可以確定組織中的一組基因的表達(dá)水平。可以使用定量數(shù)據(jù)基于它們本身的組織表達(dá)以及在該組織中的表達(dá)水平將基因分組(例如聚類)。在一個實例中，可以使用基因表達(dá)的陣列分析來評定不同細(xì)胞培養(yǎng)條件對Ggtal表達(dá)的影響。在ー個第一組條件下可以培養(yǎng)ー個第一細(xì)胞群，并且在ー個第二組條件下可以培養(yǎng)ー個第二細(xì)胞群，并且可以在這樣ー個陣列上分析來自該多個群的核酸。在本發(fā)明的背景下，可以確定培養(yǎng)條件對生物反應(yīng)的影響。類似地，可以比較具有不同遺傳背景的CHO細(xì)胞。調(diào)節(jié)糖蛋白聚糖結(jié)構(gòu)的方法本發(fā)明的特征在于在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生糖蛋白的方法，其中該糖蛋白例如相對于現(xiàn)有技術(shù)中的糖蛋白(例如相對于作為治療性糖蛋白銷售的糖蛋白)具有改變水平的Gal-a-Gal聚糖結(jié)構(gòu)。該方法包括在適合于糖蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)在此所述的宿主細(xì)胞(例如，Ggtal-轉(zhuǎn)染的或Ggtal敲低或敲除的宿主細(xì)胞)。該糖蛋白可以選自在表5中說明的那些。在一個實施方案中，產(chǎn)生了ー種相對于具有相同的或高度相似的多肽序列(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%完全相同的多肽序列)的現(xiàn)有技術(shù)中的糖蛋白具有増加水平的Gal-α -Gal聚糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。該方法包括培養(yǎng)在此所述的ー種CHO宿主細(xì)胞，該細(xì)胞已經(jīng)被基因工程化用于產(chǎn)生相對于親本細(xì)胞(例如過表達(dá)Ggtal的CHO細(xì)胞)具有增加水平的中國倉鼠或CHO細(xì)胞Ggtal，其中該宿主細(xì)胞還包含編碼治療性糖蛋白的轉(zhuǎn)基因；以及從生成的培養(yǎng)細(xì)胞純化該治療性糖蛋白。在另一個實施方案中，產(chǎn)生了一種相對于具有相同或高度相似多肽序列(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%完全相同的多肽序列)的現(xiàn)有技術(shù)中的糖蛋白具有降低水平的Gal-a -Gal聚糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。這種方法包括培養(yǎng)在此所述的一種CHO宿主細(xì)胞，該細(xì)胞已經(jīng)被基因工程化用于產(chǎn)生相對于親本細(xì)胞(例如在此所述的Ggtal敲除或敲低CHO細(xì)胞)具有降低水平的中國倉鼠或CHO細(xì)胞Ggtal，其中該宿主細(xì)胞包含編碼治療性糖蛋白的轉(zhuǎn)基因；以及從生成的培養(yǎng)細(xì)胞中純化該治療性糖蛋白。如此產(chǎn)生的這類糖蛋白可以提供改進(jìn)形式的市售治療性糖蛋白。
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，包括與(a)具有編碼SEQ ID N0:2、或SEQ ID N0:4或SEQ IDNO:7的氨基酸殘基序列或其生物活性片段的序列的DNA分子或(b) (a)的DNA分子的互補(bǔ)物具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。
2.一種分離的核酸分子，該分子編碼SEQ ID NO:2、或SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:7的序列。
3.—種分尚的核酸分子，該分尚的核酸分子與SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 3或SEQ IDNO: 5或SEQ ID NO: 6的序列具有至少90%序列一致性。
4.一種分離的核酸分子，在高嚴(yán)緊條件下該分離的核酸分子與具有SEQ ID NO: I、SEQID NO:3, SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的序列的一種核酸分子或其互補(bǔ)物雜交。
5.—種分尚的核酸分子，該分尚的核酸分子包括SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 3>SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的核苷酸序列、或其互補(bǔ)物。
6.如權(quán)利要求1-5的任一項所述的分離的核酸分子，其中該核酸分子編碼連接到一種異源氨基酸序列上的一種Ggtal多肽。
7.一種選自下組的寡核苷酸，該組由以下各項組成 (a)一種由SEQ ID NO: I或它的互補(bǔ)物的至少10個連續(xù)核苷酸并且小于500個連續(xù)核苷酸組成的寡核苷酸， (b)一種由SEQ ID NO: 3或它的互補(bǔ)物的至少10個連續(xù)核苷酸并且小于500個連續(xù)核苷酸組成的寡核苷酸， (c)一種由SEQ ID NO: 5或它的互補(bǔ)物的至少10個連續(xù)核苷酸并且小于500個連續(xù)核苷酸組成的寡核苷酸， (d)一種由SEQ ID NO:6或它的互補(bǔ)物的至少10個連續(xù)核苷酸并且小于500個連續(xù)核苷酸組成的寡核苷酸， (d)—種具有10至500個核苷酸的寡核苷酸,包括在表2中所不的一個序列，以及 (e)—種具有10至500個核苷酸的寡核苷酸,包括在表4中所不的一個序列。
8.—種核酸構(gòu)建體,包括如權(quán)利要求1-7的任一項所述的核酸分子或寡核苷酸的序列。
9.一種分離的宿主細(xì)胞,該分離的宿主細(xì)胞是用如上述權(quán)利要求的任一項所述的一種核酸分子、寡核苷酸、或核酸構(gòu)建體來轉(zhuǎn)染的。
10.如權(quán)利要求9所述的分離的宿主細(xì)胞，其中與由該宿主細(xì)胞的親本細(xì)胞產(chǎn)生的重組治療性糖蛋白相比較該宿主細(xì)胞產(chǎn)生具有增加水平的末端半乳糖- a 1，3-半乳糖聚糖的重組治療性糖蛋白。
11.如權(quán)利要求9所述的分離的宿主細(xì)胞，其中與由該宿主細(xì)胞的親本細(xì)胞產(chǎn)生的重組治療性糖蛋白相比較該宿主細(xì)胞產(chǎn)生具有降低水平的末端半乳糖- a 1，3-半乳糖聚糖的重組治療性糖蛋白。
12.—種調(diào)節(jié)在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的重組治療性糖蛋白的聚糖結(jié)構(gòu)的方法，該方法包括在足以表達(dá)該糖蛋白的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞。
13.一種分離的多肽，包括與SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:7具有至少90%序列一致性的一種氨基酸序列、或其生物活性片段。
14.一種分離的多肽，包括與SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:7或其生物活性片段以至少一個但是小于20個氨基酸殘基而不同的氨基酸序列。
15.一種分離的多肽，包括SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
16.一種分離的抗體、或其抗原結(jié)合片段，其與如權(quán)利要求13、14或15所述的多肽特異性地結(jié)合。
17.一種檢測在CHO細(xì)胞群中的Ggtal表達(dá)或活性的方法，該方法包括使來自該CHO細(xì)胞群的核酸樣品與如權(quán)利要求1-5的任一項所述的核酸分子或如權(quán)利要求7所述的寡核苷酸相接觸，由此檢測在CHO細(xì)胞群中的Ggtal表達(dá)或活性。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中該方法包括使用PCR來擴(kuò)增在該核酸樣品中的核酸序列。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，進(jìn)一步包括對在CHO細(xì)胞群中的Ggtal表達(dá)的水平進(jìn)行定量。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，進(jìn)一步包括將該CHO細(xì)胞群中的Ggtal表達(dá)的水平與參考水平、對照水平、預(yù)定水平或由一個第二 CHO細(xì)胞群展示的水平進(jìn)行比較。
21.一種檢測CHO細(xì)胞群中的Ggtal表達(dá)或活性的方法，該方法包括使來自該CHO細(xì)胞群的一種樣品與如權(quán)利要求13、14或15所述的多肽或如權(quán)利要求16所述的抗體或其片段相接觸，由此檢測在該CHO細(xì)胞群中的Ggtal表達(dá)或活性。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，進(jìn)一步包括對該CHO細(xì)胞群中的Ggtal表達(dá)的水平進(jìn)行定量。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，進(jìn)一步包括將該CHO細(xì)胞群中的Ggtal表達(dá)的水平與參考水平、對照水平、預(yù)定水平或由一個第二 CHO細(xì)胞群展示的水平進(jìn)行比較。
24.—種具有多個地址的二維陣列，該多個地址的每個地址在位置上可與該多個地址的每個其他地址區(qū)別開，并且該多個地址的每個地址具有一個獨(dú)特的捕獲探針，其中該多個地址的至少一個地址具有包括如權(quán)利要求1-5的任一項所述的核酸分子或如權(quán)利要求7所述的寡核苷酸的捕獲探針。
25.一種具有多個地址的二維陣列，該多個地址的每個地址在位置上可與該多個地址的每個其他地址區(qū)別開，并且該多個地址的每個地址具有一個獨(dú)特的捕獲探針，其中該多個地址的至少一個地址具有包括如權(quán)利要求16所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的捕獲探針。
26.一種分析來自CHO細(xì)胞的樣品的方法，該方法包括使該樣品與如權(quán)利區(qū)域24或25所述的陣列相接觸。
全文摘要
說明了一種來自中國倉鼠的糖基轉(zhuǎn)移酶以及相關(guān)方法。
文檔編號C12Q1/68GK102666844SQ201080050619
公開日2012年9月12日 申請日期2010年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月11日
發(fā)明者J·W·米德三世 申請人:動量制藥公司