專利名稱：使用陣列比較基因組雜交技術(shù)分析核酸突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用陣列比較基因組雜交技術(shù)分析核酸突變的方法，所述方法降低來自分析結(jié)果的假陽性等的影響并且改善分析結(jié)果的可靠性。
背景技術(shù)：
陣列比較基因組雜交(CGH)技術(shù)已知為這樣的方法，其用于在短時間內(nèi)檢測發(fā)生在數(shù)101Λ至數(shù)Mb水平上的基因組結(jié)構(gòu)異常，諸如基因組拷貝數(shù)異常(見，例如，非專利文件1和2)。在使用陣列CGH的用于遺傳性疾病等的診斷陣列的情況中，變得必要的是精確地診斷與病理狀況直接相關(guān)的拷貝數(shù)異常。因此，作為標(biāo)準(zhǔn)的核酸必定不具有拷貝數(shù)變異 (CNV)并且因此應(yīng)當(dāng)進(jìn)行小心的選擇和確認(rèn)包括稀有CNV的情況，以致總是存在麻煩的并且需要復(fù)查的情況。此外，在包括用于全基因組分析的陣列、檢查出拷貝數(shù)異常的情況中，因為難以獲得已被證明為對于目標(biāo)基因組是正常的標(biāo)準(zhǔn)核酸，所以必需對雙親和同胞進(jìn)行連續(xù)檢查并且進(jìn)行重復(fù)地復(fù)查以確認(rèn)所述情況是否是假陽性或假陰性或新發(fā)生(de novo)拷貝數(shù)異常，并且用正常分析物的分析實例和公用數(shù)據(jù)庫驗證(見，例如，非專利文件1)。在判斷出是假陽性或假陰性的情況中，復(fù)查變得必要并且產(chǎn)生這樣的問題，即利用一次檢查不能做出診斷。
背景技術(shù)：
文件非專利文件非專利文件1 :"Arei CGH Shindan Katsuyo Gaido Bukku Shitte Okitai Senshokutai Bisaikozo Ijosho(Arrey CGH Diagnosis Utilization Guidebook, Chromosome Fine Structure Disorder Which Is Need To Know)(陣列CGH診斷使用指南， 需要了解的染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)異常)”由Joji hazawa等編輯，Iyaku (Medicine and Drug (醫(yī)學(xué)和藥物))Journal Co.，Ltd.2 Jssei Imoto, Joji Inazawa “Maikuro Arei Gijusu wo Mochiita CGH Kaiseki :CGH Arei Hou(CGH Analysis Using Microarray Technology :CGH Array Method (使用微陣列技術(shù)的CGH分析CGH陣列方法))，，，Saibo Kogaku (細(xì)胞技術(shù))，卷23， No.03,355-361(2004)。發(fā)明概述本發(fā)明要解決的問題鑒于背景技術(shù)的以上問題，本發(fā)明的一個目的是提供分析核酸突變的方法以及用于執(zhí)行數(shù)據(jù)處理的程序，所述方法減小分析結(jié)果中假陽性和假陰性的影響，尤其是，減小由于標(biāo)準(zhǔn)核酸的CNV所導(dǎo)致的影響(其為常規(guī)陣列比較基因組雜交技術(shù)中的問題)，并且改善分析結(jié)果的可靠性而不需要復(fù)查。此外，本發(fā)明的另一個目的是提供使用分析核酸突變的方法來診斷源于基因突變的疾病的方法。解決所述問題的方式以上問題已經(jīng)由以下方法解決。1. 一種使用陣列比較基因組雜交技術(shù)來分析核酸突變的方法，其包括步驟(a)使用η組相同的探針核酸組，其中多個樣點存在于一個核酸微陣列上并且彼此不同的探針核酸已經(jīng)被固定在多個所述樣點上，使η種標(biāo)記的樣品核酸Sl至Sn逐個地與η組所述探針核酸組接觸以實現(xiàn)雜交，步驟(b)選擇已經(jīng)固定有相同探針核酸的η個樣點Xl至fti，所述樣點Xl至& 選自η組所述探針核酸組，并且獲得已經(jīng)被雜交到η個相應(yīng)的樣點Xl至&中的樣品核酸的標(biāo)記強(qiáng)度Fl至而，步驟(c)將所述樣點Xl的標(biāo)記值Fl與所述標(biāo)記值F2至1 中的每個比較，由此獲得n-1個比較值C2至Cn，并且確定所述比較值中的每個是否落入指定的數(shù)值范圍內(nèi)，以及步驟(d):確定在n-1個所述比較值中在所述步驟(c)中已經(jīng)確定為未落入所述指定的數(shù)值范圍內(nèi)的比較值的數(shù)目是否超過指定數(shù)目，并且在超過所述指定數(shù)目的情況下，判斷所述樣點Xl為陽性，η是3以上的整數(shù)，所述樣品核酸是分析物核酸或標(biāo)準(zhǔn)核酸，至少Sl是分析物核酸，而Xl是已經(jīng)與Sl接觸的樣點。2.根據(jù)以上1的分析核酸突變的方法，其中在η種所述樣品核酸中至少兩種是分析物核酸。3.根據(jù)以上1或2的分析核酸突變的方法，所述方法進(jìn)一步包括步驟(c')確定從F2與Fl的比較值至F2與1 的比較值的n_l個比較值中的每個是否落入指定的數(shù)值范圍，以及步驟(d')確定n-1個比較值中在所述步驟(c')中已經(jīng)確定為未落入所述指定的數(shù)值范圍內(nèi)的比較值的數(shù)目是否超過所述指定數(shù)目，并且在超過所述指定數(shù)目的情況下，判斷樣點X2為陽性，樣點X2是已經(jīng)與不同于以上Sl的樣品核酸S2接觸的樣點。4.根據(jù)以上1至3中任一項的分析核酸突變的方法，其中在η種所述樣品核酸中至少一種是標(biāo)準(zhǔn)核酸。5.根據(jù)以上1至3中任一項的分析核酸突變的方法，其中η種所述樣品核酸都是分析物核酸。6.根據(jù)以上1至5中任一項的分析核酸突變的方法，其中η種所述樣品核酸是來源于屬于分類學(xué)上相同物種的不同個體的核酸。7.根據(jù)以上1至6中任一項的分析核酸突變的方法，其中提供η個相同的探針核酸組NSl至NSn，各探針核酸組NSi被提供在具有ρ個樣點tn至tip的核酸微陣列上，i是整數(shù)并且滿足1 < i < η而ρ是整數(shù)并且滿足2 ( ρ，將彼此不同的探針核酸固定在各探針核酸組NSi的ρ個所述樣點tn至tip上，各探針核酸組NSi的ρ個所述樣點中的一個是樣點Xi，將相同的探針核酸固定到樣點、至tnj上，j是整數(shù)并且滿足1彡j彡P(guān)，
步驟(a)包括使所述標(biāo)記的樣品核酸Si與所述探針核酸組NSi接觸，從而將所述樣品核酸Si雜交到已經(jīng)固定在所述探針核酸組NSi的ρ個所述樣點上的核酸上，步驟(b)包括獲得已經(jīng)雜交到各探針核酸組NSi的所述樣點tn至、中的樣品核酸的標(biāo)記值Fil至Fip，NSl和NSm選自所述探針核酸組NSl至NSn并且m是整數(shù)并且滿足2彡m彡n，所述步驟(c)包括以下步驟(cl)比較所述標(biāo)記值Flj和Riij以確定ρ個比較值Cl “至Cp"，(c2)計算所述比較值Cl"至Cp"的平均值或中央值，以及(c3)基于在所述步驟(c2)中獲得的平均值或中央值，設(shè)定指定的數(shù)值范圍，并且判斷所述比較值Cl"至Cp"是否落入所述指定的數(shù)值范圍內(nèi)。8.根據(jù)以上1至7中任一項的分析核酸突變的方法，其中所述樣品核酸都用相同的標(biāo)記物標(biāo)記。9.根據(jù)以上1至8中任一項的分析核酸突變的方法，其中步驟(b)中的所述標(biāo)記強(qiáng)度？1至而是校正值。10.用于在根據(jù)以上1至9中任一項的分析核酸突變的方法中執(zhí)行數(shù)據(jù)處理的程序，所述程序執(zhí)行以下進(jìn)程⑴和(II)[進(jìn)程⑴比較從Fl與F2的比較值至Fl與1 的比較值的n_l個比較值是否落入指定的數(shù)值范圍][進(jìn)程(II)在以下情況下判斷樣點Xl為陽性在以上⑴中臨時確定的所有n-1 個比較值中，存在的已經(jīng)通過進(jìn)程(I)確定為未落入所述指定的數(shù)值范圍內(nèi)的比較值的數(shù)目超過指定數(shù)目]。11.根據(jù)以上10的程序，其中所述進(jìn)程⑴包括以下進(jìn)程⑴至(ν)[進(jìn)程(i)在存在于η組所述探針核酸組的每個中的ρ個樣點中，從η組所述探針核酸組中選擇一對兩個探針核酸組，所述一對兩個探針核酸組被這樣選擇以致包含樣點XI，以及在所述兩個探針核酸組之間，計算已經(jīng)固定有所述相同的探針核酸的成對的樣點的標(biāo)記強(qiáng)度的比較值][進(jìn)程(ii)對所述探針核酸組中的ρ個成對的樣點中的每個進(jìn)行在進(jìn)程(i)中的比較值的計算]，[進(jìn)程(iii)計算在進(jìn)程(ii)中獲得的ρ個比較值的平均值或中央值]，以及[進(jìn)程(iv)從在進(jìn)程(iii)中獲得的平均值或中央值設(shè)定指定的數(shù)值范圍，并且比較P個比較值中的每個是否超過所述指定的數(shù)值]。12. 一種診斷源于基因突變的疾病的方法，所述方法使用根據(jù)以上1至9中任一項的分析核酸突變的方法。本發(fā)明的優(yōu)勢根據(jù)本發(fā)明的分析核酸突變的方法可以降低假陽性和假陰性在分析結(jié)果中的影響，尤其是，降低由于標(biāo)準(zhǔn)核酸的CNV所導(dǎo)致的影響(其為常規(guī)陣列比較基因組雜交技術(shù)中的問題)，并且可以改善分析結(jié)果的可靠性。更具體地，即使對于在常規(guī)陣列比較基因組雜交技術(shù)中由于假陽性和假陰性的影響而需要復(fù)查的分析物，根據(jù)本發(fā)明的分析核酸突變的方法不需要復(fù)查。因為本發(fā)明的程序在以上分析核酸突變的方法中執(zhí)行數(shù)據(jù)處理，所以可以降低在分析結(jié)果中假陽性和假陰性的影響，尤其是由于CNV所導(dǎo)致的影響，并且可以改善分析結(jié)果的可靠性。因為根據(jù)本發(fā)明的用于診斷來源于基團(tuán)突變的疾病的方法包括使用以上分析核酸突變的方法，所以可以在降低假陽性和假陰性影響的情況下做出診斷。附圖簡述

圖1是流程圖，其顯示作為本發(fā)明的一個實施方案的分析核酸突變的方法。圖2是部分示意圖，其顯示作為本發(fā)明的一個實施方案的分析核酸突變的方法的一個實施方案的部分。圖3是這樣的圖，其顯示分析物DNA No. 1與作為標(biāo)準(zhǔn)的男性基因組DNA的熒光強(qiáng)度比的對數(shù)坐標(biāo)圖的結(jié)果。圖4是這樣的圖，其顯示分析物DNA No. 1與分析物DNA No. 2的熒光強(qiáng)度比的對數(shù)坐標(biāo)圖的結(jié)果。圖5是這樣的圖，其顯示分析物DNA No. 1與分析物DNA No. 3的熒光強(qiáng)度比的對數(shù)坐標(biāo)圖的結(jié)果。圖6是這樣的圖，其顯示分析物DNA No. 1與分析物DNA No. 4的熒光強(qiáng)度比的對數(shù)坐標(biāo)圖的結(jié)果。實施本發(fā)明的方式在本說明書中，表示范圍的“至”顯示這樣的范圍，所述范圍包含分別在詞的前后作為最小值和最大值描述的數(shù)值。根據(jù)本實施方案的分析核酸突變的方法是使用陣列比較基因組雜交技術(shù)的分析方法，所述方法包括以下步驟(a)至(d)。圖1和圖2是示意圖，其顯示根據(jù)本發(fā)明的分析核酸突變的方法的一個優(yōu)選實施方案。在這樣點上，在圖1中作為步驟(d)中判斷標(biāo)準(zhǔn)的樣點的數(shù)目是一半而在圖2中例舉了 η是4的情況，但是本實施方案不限于此。首先，在步驟(a)中，使用η組相同的探針核酸組，其中彼此不同的探針核酸已經(jīng)被固定到核酸微陣列上的P個以上的樣點，使Sl至Sn的η種樣品核酸逐個與所述探針核酸組接觸從而實現(xiàn)雜交。下文中，P是2以上的整數(shù)而η是3以上的整數(shù)。然后，選擇已經(jīng)固定有所述相同的探針核酸的η個樣點Xl至fti，所述樣點Xl至 ft!選自η組探針核酸組中的每個，并且獲得已經(jīng)雜交到相應(yīng)的樣點中的樣品核酸的標(biāo)記強(qiáng)度Fl至1 (樣點Xl =Fl的標(biāo)記強(qiáng)度，樣點X2 :F2的標(biāo)記強(qiáng)度...樣點& =Fn的標(biāo)記強(qiáng)度) (步驟(b))。接下來，確定從F2與Fl的比較值至Fl與而的比較值的n_l個比較值中的每個是否落入指定的數(shù)值范圍(步驟(c))。在圖2中，在步驟3中Fl與F2的比較值C2顯示為 F1/F2而Fl與F3的比較值C3顯示為F1/F3，但是如以下所述比較值的計算方法不限于此。然后，在n-1個比較值中，當(dāng)在步驟(c)中已經(jīng)確定為未落入指定的數(shù)值范圍內(nèi)的比較值的數(shù)目超過指定數(shù)目時，樣點Xl被確定為陽性(步驟(d))。順便提及，此處集中于任意的樣點Xl以進(jìn)行說明，但是也可以用其他樣點代替所述樣點來進(jìn)行說明。優(yōu)選的是用陣列中已經(jīng)雜交有樣品核酸Si的所有樣點代替以上Xl來進(jìn)行分析。此處，陣列比較基因組雜交技術(shù)(下文中有時也稱為陣列CGH技術(shù))是指其中比較基因組雜交技術(shù)在核酸微陣列上進(jìn)行的技術(shù)。例如，該技術(shù)已經(jīng)準(zhǔn)確地描述于由Joji Inazawa等編輯的"Arei CGH Shindan Katsuyo Gaido Bukku Shitte Okitai Senshokutai Bisaikozo Ijosho" (Iyaku(Medicine and Drug(醫(yī)學(xué)和藥物))Journal Co. , Ltd)等中。在常規(guī)陣列CGH技術(shù)中，已知有使用兩色法的技術(shù)，其中不同種類的標(biāo)記化合物被用于標(biāo)準(zhǔn)核酸和分析物并且同時雜交到相同的樣點中。在兩色法中，在相同的陣列中同時評價標(biāo)準(zhǔn)物和分析物，但是，在標(biāo)準(zhǔn)核酸的CNV 未知的情況中，難以確定作為測量結(jié)果出現(xiàn)的增加或減小是否是標(biāo)準(zhǔn)物的增加或減小或分析物影響下的增大或減小(所謂假陽性/假陰性)。為避免這種問題，在兩色法中，事先對標(biāo)準(zhǔn)物的CNV進(jìn)行確認(rèn)。然而，在標(biāo)準(zhǔn)物的CNV未知的情況中，需要很多樣品和實驗以評價標(biāo)準(zhǔn)物的CNV。另一方面，在本實施方案的方法中，作為分析物的核酸和作為對照的一個核酸各自雜交到已經(jīng)固定有相同種類的核酸的不同的樣點并且將測量值彼此比較。然而，甚至在此方法中，當(dāng)分析物核酸添加到陣列1，作為對照的分析物核酸添加到陣列2，各自雜交時， 比較樣點Xl和樣點X2(它們是已經(jīng)固定有相同的探針核酸的樣點)的標(biāo)記強(qiáng)度由此獲得一個比較值，并且基于它判斷陽性或陰性，尤其在對照包含CNV(拷貝數(shù)變異)的情況中，產(chǎn)生由于對照的影響所導(dǎo)致的增加或減小(所謂假陽性/假陰性)并且因此存在需要復(fù)查的情況或發(fā)生判斷錯誤的情況。因此，在本實施方案中，使用η種標(biāo)記的樣品核酸。η是3以上的整數(shù)。具體地， 在η種樣品核酸中集中于一種作為判斷目標(biāo)，使用剩下的η-1種作為對照獲得關(guān)于該判斷目標(biāo)的η-1個比較值，并且進(jìn)行對比較值陽性或陰性的臨時判斷。然后，在η-1個臨時判斷的結(jié)果中，指定數(shù)目以上的結(jié)果是臨時陽性的情況被判斷為真陽性，而判斷為臨時陽性的結(jié)果的數(shù)目小于指定數(shù)目的情況被判斷為真陰性。至于指定數(shù)目，優(yōu)選使用臨時判斷結(jié)果總數(shù)目的30 %至70 %范圍內(nèi)的數(shù)目，而 40 %至60 %的數(shù)目是更優(yōu)選使用的。此處，陽性/陰性與在常規(guī)陣列CGH技術(shù)中是相同的，并且以下情況被稱為陽性 與標(biāo)準(zhǔn)核酸相比在鑒定核酸中已經(jīng)被固定到目標(biāo)樣點的核酸序列以更大的量存在，或者以更小的量存在或者不存在；而量相等的情況被稱為陰性。 通常，在某個樣點中，在分析物核酸與一種對照核酸的比較中，產(chǎn)生假陽性和假陰性(下文中簡稱為假陽性等)的可能性最多是大約1/10，通常是1/100以下。因此，使用 η-1種對照核酸，并且在所得的η-1個臨時判斷的結(jié)果中，指定數(shù)目以上的結(jié)果是臨時陽性的情況被判斷為真陽性，由此很大程度上減小了產(chǎn)生以上假陽性的可能性。如上，通過根據(jù)本實施方案的分析核酸突變的方法，假陽性等可以從測量結(jié)果中減少。此外，因為在本實施方案中以上產(chǎn)生比率變得很低，所以可能不使用標(biāo)準(zhǔn)核酸。用于本實施方案中的樣品核酸的種類η是3以上并且優(yōu)選地是4以上。如上所述，所述效果隨η增加而變高并且η的上限不受限制，但是，為快速獲得數(shù)據(jù)或從簡化計算的觀點來看，η優(yōu)選100以下。最優(yōu)選地η是4至100。下文中，標(biāo)記的η種樣品核酸也被顯示為樣品核酸Si、S2、. . . Sn-1, Sn(η是3以上的整數(shù))。下文中，當(dāng)確認(rèn)樣點(Xl)中的標(biāo)記是否為陽性時，即當(dāng)確認(rèn)核酸突變(Si)在與樣點(Xi)接觸的標(biāo)記的樣品核酸中是否出現(xiàn)時，集中于樣點(Xi)進(jìn)行說明，而樣點(Xi)是任意的樣點。通常，集中于陣列上的P個以上的樣點(P是2以上的整數(shù))中的每個樣點以進(jìn)行實施方案的方法，并且優(yōu)選地，集中于已經(jīng)雜交有樣品核酸的陣列上的所有樣點以進(jìn)行確認(rèn)。此外，在所述樣品核酸中，集中的核酸被用作待判斷的核酸而待比較的相對的一個被用作對照核酸，但是可以集中于任何樣品核酸并且將其用作待判斷的核酸。優(yōu)選的是至少兩種所述樣品核酸是分析物核酸。即，以上核酸如Sl可以任意選自η種所述核酸，并且通過施行本實施方案使用順序地包含在η種核酸中的所有分析物核酸如Sl可以對核酸突變進(jìn)行高度可靠的分析。通過比較關(guān)于樣品核酸的對應(yīng)樣點的標(biāo)記強(qiáng)度，可以判斷多個分析物核酸的真陽性或陰性。此外，對于陣列上的所有樣點中的每個，進(jìn)行雜交的步驟和獲得標(biāo)記強(qiáng)度的步驟通常執(zhí)行一次。在這樣點上，也可能的是關(guān)于其中之前已經(jīng)獲得了雜交后的標(biāo)記強(qiáng)度的數(shù)據(jù)，通過所述實施方案的方法進(jìn)行確認(rèn)。步驟(a)在步驟(a)中，使Sl至Sn的η種標(biāo)記的樣品核酸逐個與已經(jīng)固定有相同的探針核酸的η個樣點Xl至&接觸，由此將樣品核酸雜交到以上被固定的核酸。核酸微陣列是指探針核酸高密度地結(jié)合到固體基底的陣列。用于以上固體基底的固體材料不受特殊限制，只要它是探針核酸可以結(jié)合的材料，例如，玻璃材料諸如通常使用的載玻片以及塑料材料。作為用于本實施方案的核酸微陣列，可以提及BAC-DNA陣列、寡核苷酸微陣列、 c-DNA微陣列等。在根據(jù)本實施方案的分析核酸突變的方法中，可以使用市售的核酸微陣列或者可以使用通過通常方法制備的核酸微陣列。所述樣點是指已經(jīng)大量地高密度地固定有探針核酸的區(qū)域并且多個樣點存在于以上的核酸微陣列上。以上在核酸微陣列上的樣點的數(shù)目不受特殊限制，只要該數(shù)目是ρ個以上，但是通常，5個至1，000, 000個的數(shù)目是優(yōu)選的而300個至5，000個的數(shù)目是優(yōu)選的。所述樣點在以上核酸微陣列上的布置不受特殊的限制，并且可以提及在多個區(qū)域中具有陣列并且能夠在一個基底上測量多個樣品核酸的多分析物陣列，在一個基底上組合多個陣列并且復(fù)制大量樣點的帶環(huán)(tie ring)陣列等。探針核酸是指這樣的核酸，所述核酸已經(jīng)固定在核酸微陣列的基底上(優(yōu)選地以多個樣點的形式)并且優(yōu)選地是包含已知序列的核酸。探針核酸的大小優(yōu)選地是10個堿基(b)至101Λ，更優(yōu)選50b至51Λ，并且進(jìn)一步優(yōu)選IOOb至2kb?！跋嗤奶结樅怂帷币舶ㄔ趪?yán)格條件下和與以上探針核酸互補(bǔ)的核酸雜交的核酸。在本實施方案中，分別用在已經(jīng)固定有相同的探針核酸的η個樣點中的不同樣品核酸進(jìn)行雜交。此處，已經(jīng)固定有相同的探針核酸的樣點被表示為樣點XI、Χ2、... Xn-U fti (η是3以上的整數(shù))。η個樣點XI、Χ2、. . . Xn-UXn可以存在于相同的核酸微陣列上但是優(yōu)選地存在于 η個不同的核酸微陣列上。例如，在η個樣點分別存在于η個相同種類的核酸微陣列上的情況中，優(yōu)選的是使用具有相同區(qū)編號(block number)、列編號或行編號的樣點作為η個以上的樣點。待固定的探針核酸的量優(yōu)選為每樣點0. 8至5 μ g，更優(yōu)選為1. 0至2. 0 μ g。在步驟(a)中，“探針核酸組”是指一組編碼特定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的基因的探針核酸。在本實施方案中，探針核酸組的數(shù)目通常對應(yīng)陣列上的樣點的數(shù)目。對于一個探針核酸組，在每個樣點上可以固定一種探針核酸或者可以固定多個探針核酸，只要在單獨的樣點之間固定的探針核酸的種類是不同的。通常，一個探針核酸組固定在一個陣列上。在步驟(a)中，η組探針核酸組是指η組相同的探針核酸組并且也可以包括在嚴(yán)格條件下和與特定探針核酸組互補(bǔ)的探針核酸組雜交的探針核酸組。以上相同的探針核酸組對應(yīng)于樣品核酸的種類并且是η組。至于以上的探針核酸，可以提及化學(xué)合成的核酸、cDNA、BAC(細(xì)菌人工染色體)、 YAC (酵母人工染色體)、PAC (來源于Pl的人工染色體)、通過使用基因工程技術(shù)擴(kuò)增它們獲得的那些。此外，通過化學(xué)修飾天然核酸諸如DNA和RNA獲得的核酸可以用作探針核酸。可以使用例如，PNA (肽核酸),BNA (橋接核酸)、膦酸甲酯類DNA、硫代磷酸酯類DNA、氨基磷酸酯類DNA、硼烷磷酸酯(boranophosphate)類DNA等。此外，也可以采用嵌合體類核酸。至于將探針核酸結(jié)合到固體基底上的方法，可以提及使用已經(jīng)結(jié)合有由基因芯片 (Gene Chip)代表的發(fā)光基團(tuán)的亞酰胺(amidite)單體以及使用掩膜逐個化學(xué)合成核苷酸的方法，或者通過噴墨方法將亞酰胺單體點樣于固體基底上從而化學(xué)合成所需的序列的方法，通過改變電極上溶液的PH并且利用pH改變除去保護(hù)基團(tuán)而在基底上合成核酸的方法， 純化之前化學(xué)合成的核酸并將其點樣在基底上的方法，使用點樣儀(spotter)點樣cDNA的方法等。至于點樣方法，可以提及噴墨法、插針(Pin)陣列法等。樣品核酸是指用于根據(jù)本實施方案的分析核酸突變的方法的單鏈或雙鏈核酸并且可以是DNA、RNA等中的任何一個。樣品核酸的來源不受特殊限制并且，例如，可以提及分析目標(biāo)諸如包含樣品核酸的細(xì)胞，使用核酸微陣列對其核酸的表達(dá)量和現(xiàn)有量、基因組中的拷貝數(shù)等進(jìn)行測量；或?qū)ζ溥M(jìn)行評價諸如診斷的細(xì)胞，并且也可以提及組織、器官、一個個體等，并且所述來源不限于細(xì)胞自身。尤其地，樣品核酸的來源優(yōu)選能夠從被認(rèn)為具有特定疾病的人類患者、動物等獲得的細(xì)胞等。至于疾病，可以包括所有疾病，諸如癌癥、遺傳疾病和傳染性疾病，核酸可以具有關(guān)于所述疾病的某些信息，并且所述疾病不受特殊的限制。本實施方案的方法適于檢查突變數(shù)目相對小的先天遺傳疾病。非入侵性位點諸如粘膜、毛發(fā)和指甲以及體液諸如血液、 淋巴、骨髓、精子和羊水優(yōu)選地用作樣品。η種樣品核酸優(yōu)選地是來源于分類上屬于相同物種的不同個體的核酸或來源于相同個體的不同細(xì)胞的核酸，更優(yōu)選來源于人類不同個體的核酸或來源于相同人類個體的不同細(xì)胞(例如，正常細(xì)胞和癌細(xì)胞)的核酸。來源于人類不同個體的核酸是最優(yōu)選的。此外，本實施方案的方法優(yōu)選地用于檢查這樣的個體，所述個體不是根據(jù)患有特定遺傳疾病的可能性等選擇的(對新生兒等的全數(shù)檢查)。在樣品核酸的制備(例如，純化、斷裂)方面，優(yōu)選的是通過純化處理除去溶于細(xì)胞的物質(zhì)諸如蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。這是因為在用熒光等標(biāo)記時發(fā)生不同副反應(yīng)并且當(dāng)不進(jìn)行純化時溶于細(xì)胞的物質(zhì)諸如蛋白質(zhì)和脂質(zhì)很大程度上也影響背景噪音，以致核酸微陣列的性能顯著降低。至于用于純化的方法，可以提及使用用二氧化硅、纖維素化合物等的核酸吸附膜支撐的柱體(cartridge)的方法，用乙醇沉淀或用異丙醇沉淀，用酚氯仿萃取等。此外，可以提及以下方法使用離子交換樹脂的固相萃取柱、色譜等，與疏水取代基諸如十八烷基鍵合的二氧化硅支持物(support)，具有尺寸排阻作用的樹脂。樣品核酸的長度不受特殊限制并且，例如，可以是全基因組，但是可以在以下的斷裂處理后進(jìn)行以上的純化處理。在這樣點上，標(biāo)記的樣品核酸的長度不受特殊限制，但是通過標(biāo)記/斷裂處理，所述核酸通常被斷裂為1，000個堿基(11Λ)或堿基對(bp)至5，OOOb或bp。至于斷裂處理，可以提及酶處理、超聲處理、機(jī)械破碎處理、化學(xué)處理等。至于用于酶處理的酶，優(yōu)選使用限制酶或核酸酶。至于限制酶的種類，也可能使用多個酶。至于機(jī)械破碎處理，可以提及使用玻璃球、不銹鋼球、氧化鋯球等裂開核酸的方法。以上核酸可以經(jīng)受扣除法(subtraction method)的處理?？鄢ㄊ侵高@樣的方法在目標(biāo)基因的拷貝數(shù)或表達(dá)存在差異的情況中，通過以扣除的方式扣除存在于基因中的差異來有效地分離基因。可以采用例如，PCR選擇法、RDA(代表性差別分析)法、DsDD(雙鏈特異性直接消化)法等。尤其，在本實施方案中，在使用來源于癌細(xì)胞的樣品核酸的情況中，因為大量正常細(xì)胞與癌細(xì)胞一起包含在癌組織中，所以存在這樣的情況，其中核酸微陣列的性能顯著下降，但是可以通過所述扣除法在一定程度上防止所述性能下降。至于η種樣品核酸，其優(yōu)選包括至少多種分析物核酸和至少一種、優(yōu)選兩種以上的標(biāo)準(zhǔn)核酸。此外，作為本實施方案的另一個實施方案，可能不使用樣品核酸，S卩，所有的η種樣品核酸都可以是分析物核酸。分析物核酸是所謂獲得自分析物的核酸，S卩，核酸突變未知并且所述核酸突變由本實施方案分析的目標(biāo)核酸。例如，提取自正常細(xì)胞(非癌化細(xì)胞)的核酸或提取自異常細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞)的核酸可以用作分析物核酸。標(biāo)準(zhǔn)核酸是在上面用于與分析物核酸比較的核酸，并且是使用者(分析核酸突變的方法的實施者)事先在某種程度上掌握其關(guān)于突變等的一些信息的核酸。具體地，關(guān)于拷貝數(shù)變異(CNV)等，優(yōu)選拷貝數(shù)變異的位置和數(shù)目已知的核酸并且更優(yōu)選堿基序列已知的核酸。此外，例如，當(dāng)癌癥在具有CNV或某些嵌合體的患者體內(nèi)產(chǎn)生時，在獲得自癌細(xì)胞的核酸和獲得自相同患者的不同于所述癌細(xì)胞的正常細(xì)胞的核酸的情況中，所述CNV或某些嵌合體被抵消，以致在獲得自正常細(xì)胞的核酸作為標(biāo)準(zhǔn)核酸的使用中不出現(xiàn)問題。因此， 即使當(dāng)基因組中的拷貝數(shù)不同于它在該生物物種中通常存在的量時，所述核酸可以用作標(biāo)準(zhǔn)核酸，只要可以從與分析物核酸的比較中獲得信息，例如，在相同固體的情況中。各以上樣品核酸優(yōu)選地標(biāo)記以相同的標(biāo)記。 標(biāo)記是指結(jié)合到核酸的可檢測物質(zhì)。所述可檢測物質(zhì)不受特殊限制并且可以提及熒光物質(zhì)、酶、放射性同位素、誘發(fā)FRET (熒光共振能量轉(zhuǎn)移)的化合物等。優(yōu)選的是具有熒光物質(zhì)的熒光標(biāo)記物。所述熒光物質(zhì)不受特殊限制并且可以使用異硫氰酸熒光素(FITC)、Cy染料、 Alexa、綠色熒光蛋白(GFP)、藍(lán)色熒光蛋白(BFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、紅色熒光蛋白 (RFP)、吖啶、DAPI、溴化乙錠、SYBR綠、德克薩斯紅、稀土熒光標(biāo)記試劑、TAMRA, ROX等。優(yōu)選用Cy染料諸如Cy-3或Cy_5進(jìn)行熒光標(biāo)記。此外，關(guān)于標(biāo)記，可以使用地高辛(Digoxigein) (DIG)、生物素等。作為使用生物素的實例，當(dāng)抗生物素蛋白與已經(jīng)結(jié)合到探針的生物素結(jié)合時，已經(jīng)結(jié)合有生物素的堿性磷酸酶結(jié)合于其上，并且添加堿性磷酸酶的底物氮藍(lán)四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯，觀察到紫色顯色并且因此可以用于檢測。此外，可以以非酶的方式進(jìn)行標(biāo)記。也可以使用例如，ULS陣列CGH標(biāo)記試劑盒 (由 Kreatech Biotechnology BV 公司生產(chǎn))等。至于用于熒光標(biāo)記的方法，可以使用直接標(biāo)記法和間接標(biāo)記法中的任一標(biāo)記方法。直接標(biāo)記方法是指這樣的方法，其中將核酸轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂満怂?，將短鏈核酸雜交于其上， 并且將已經(jīng)結(jié)合有熒光物質(zhì)(例如，Cy染料)的核苷酸化合物與核苷酸混合，由此在一步中標(biāo)記核酸。間接標(biāo)記法是指這樣的方法，其中將核酸轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂満怂?，將短鏈核酸雜交于其上，將具有能夠結(jié)合熒光物質(zhì)(例如，Cy染料)的取代基的核苷酸化合物(例如，具有氨基烯丙基的核苷酸化合物)與天然核苷酸混合在一起，首先合成具有取代基的核酸，然后經(jīng)由氨基烯丙基結(jié)合熒光物質(zhì)(例如，Cy染料)，由此核酸得到標(biāo)記。至于用于將標(biāo)記化合物諸如熒光物質(zhì)引入到核酸中的方法，可以使用隨機(jī)引物法 (引物延伸法)、切口平移法、PCR(聚合酶鏈反應(yīng))法、末端標(biāo)記法等。尤其，在本實施方案中，可以合適地使用隨機(jī)弓I物法。隨機(jī)引物法是這樣的方法，其中雜交幾bp (堿基對)至超過IObp的隨機(jī)引物核酸并且使用聚合酶同時進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo)記，由此合成標(biāo)記的核酸。切口平移法是這樣的方法，其中，例如，使已經(jīng)用DnaseI引入切口的雙鏈核酸經(jīng)受DNA聚合酶的作用以分解DNA并且通過聚合酶的活性同時合成標(biāo)記的核酸。PCR法是這樣的方法，其中制備兩種引物并且使用所述引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，由此同時進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo)記從而獲得標(biāo)記的核酸。末端標(biāo)記法是這樣的方法，其中，在標(biāo)記5'端的方法中，通過與T4多核苷酸激酶的磷酸化反應(yīng)將標(biāo)記化合物諸如熒光物質(zhì)結(jié)合到用堿性磷酸酶去磷酸化的核酸的5'端。標(biāo)記3'端的方法是這樣的方法，其中用末端轉(zhuǎn)移酶將標(biāo)記化合物諸如熒光物質(zhì)加到核酸的3'端。
至于標(biāo)記的樣品核酸等，也可能使用含有標(biāo)記的樣品核酸等的未純化溶液。在使用這種未純化溶液的情況中，酶等仍然保留在所述溶液中并且因此，在制備后，優(yōu)選使留在所述溶液中的酶活性失活。這是基于避免影響數(shù)據(jù)再現(xiàn)性的觀點。至于使酶失活的方法，任何方法都是可能的，只要它們能夠使酶失活，但是優(yōu)選進(jìn)行添加螯合劑或60°C以上熱處理的方法中的任一種或兩種。加熱溫度優(yōu)選60°C以上，更優(yōu)選63°C以上。充分的加熱時間是1分鐘以上并且更優(yōu)選地，優(yōu)選在65°C以上進(jìn)行5分鐘以上的熱處理。此外，在使用克列諾片段(klenow fragment)的標(biāo)記方法的情況中，也可能使用渦旋混合器等使酶的活性喪失。雜交在步驟(a)中，為了將η種標(biāo)記的樣品核酸Sl至Sn逐個地提供給以上η組探針核酸組中的每個，作為用于使樣品核酸逐個結(jié)合到以上各樣點中的方法，可以使用任何方法諸如吸管吸移。在步驟(a)中，探針核酸和樣品核酸可以通過將它們在雜交溶液中孵育來雜交。孵育條件不受特殊限制但是孵育優(yōu)選在25至50°C進(jìn)行，更優(yōu)選在30至45°C進(jìn)行，并且進(jìn)一步優(yōu)選在37至42°C進(jìn)行。此外，用于雜交的時間優(yōu)選8至96小時，更優(yōu)選12 至72小時，并且進(jìn)一步優(yōu)選16至48小時。對于用于步驟(a)中的雜交的雜交溶液，沒有特殊的限制，只要探針核酸和樣品核酸在所述溶液中雜交。優(yōu)選具有這樣性質(zhì)的溶液探針核酸和樣品核酸合適地雜交，并且更優(yōu)選具有這樣作用的溶液加速探針核酸和樣品核酸的序列之間高符合度的雜交，并且另一方面抑制所述序列之間低符合度的雜交。雜交溶液優(yōu)選包含具有排除體積效應(yīng)(extruded volume effect)的物質(zhì)，用于降低樣品核酸熔點的物質(zhì)和用于調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度的溶液。作為具有排除體積效應(yīng)的物質(zhì)，可以提及聚乙二醇(PEG，見，例如， JP-A-2000-325099)、葡聚糖硫酸酯等。作為用于降低樣品核酸熔點的物質(zhì)，可以提及甲酰胺、甘油、甲醛、二甲亞砜 (DMSO)、N, N- 二甲基甲酰胺(DMF)、硫氰酸胍(GuSCN)、碘等。作為用于調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度的溶液，可以提及SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉)、 SSPE(150mM NaClUOmM NaH2PO4. H2O、ImM EDTA pH7. 4)、MES 雜交緩沖液等。在所述雜交溶液中，可以加入封閉劑(blocking agent)、表面活性劑等。作為表面活性劑，可以提及陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑等。作為陰離子表面活性劑，可以提及十二烷基硫酸鈉(SDS)等。作為非離子表面活性劑，可以提及Tween(注冊商標(biāo))、Trit0n X(注冊商標(biāo))等。以上封閉劑用于在雜交時減少對非特異性雜交的檢測。例如，可以提及tRNA(轉(zhuǎn)移RNA)、經(jīng)修飾的鮭魚精子DNA、聚A(聚腺苷酸)、聚dA(聚脫氧腺苷酸)、脫脂乳等，其主要具有減少核酸微陣列的背景噪音的作用。同樣，可以使用通常市售的封閉劑。此外，在本實施方案中，如在JP-A-2005-087109中描述的，作為雜交溶液的一種組成，也可以使用磷脂、Denhardt溶液(包含聚蔗糖(ficoll)、聚乙烯吡咯烷酮和牛血清清蛋白作為主要組分的溶液)、季銨鹽甜菜堿(Biochemistry (生物化學(xué))32，137-144 (1993))、TMAC (氯化四甲銨)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國科學(xué)院院刊),82,1585-1588 (1985))、 市售雜交溶液，例如 ExpressHyb (由 Clontech 公司制造)、PerfectHyb (由 TOYOBO Co.， Ltd.制造)、ULTRAhyb (由Ambion公司制造)等。對于雜交，優(yōu)選在嚴(yán)格條件下使得目標(biāo)核酸和探針核酸雜交。作為具體的雜交條件，例如，在37°C進(jìn)行16小時的雜交反應(yīng)后，作為洗滌條件，可以提及⑴用5mL 2XSSC溶液在室溫洗滌30秒，(2)用5mL 50%甲醛/2XSSC(pH7. 0)溶液在50°C洗滌15分鐘，(3) 用 5mL 2XSSC/0. 1% SDS (pH7. 0)溶液在 50°C洗滌 30 分鐘，(4)用 5mL 2 X SSC 溶液在室溫洗滌5分鐘。步驟(b)在步驟(b)中，獲得在η個樣點Xl至&中雜交的樣品核酸的標(biāo)記值Fl至而。在步驟(b)中，用于在雜交后在核酸微陣列上獲得標(biāo)記強(qiáng)度的方法不受特殊限制，只要標(biāo)記強(qiáng)度可以得到測量。在步驟(b)中，樣點Xl的標(biāo)記強(qiáng)度顯示為F1，樣點X2的標(biāo)記強(qiáng)度顯示為F2，...樣點紐-1的標(biāo)記強(qiáng)度顯示為而-1，而樣點)(n的標(biāo)記強(qiáng)度顯示為而。η是3以上的整數(shù)。例如，在放射性同位素的情況中，可以使用X射線膠片、BASS(由FUJIFILM公司生產(chǎn))等。在熒光物質(zhì)用作標(biāo)記物質(zhì)的情況中，優(yōu)選使用熒光掃描儀。作為熒光掃描儀，例如，可以提及FLA系列(由FUJIFILM公司生產(chǎn))、GenePix系列(由Axon Instruments Inc. 生產(chǎn))、LS Reloaded (由TECAN公司生產(chǎn))等。步驟(c)在步驟(c)中，將樣點Xl的標(biāo)記值Fl與標(biāo)記值F2至而中的每個相比，由此獲得 n-1個比較值C2至Cn，并且進(jìn)行確定各比較值是否落入指定的數(shù)值范圍。換言之，進(jìn)行臨時確定各比較值的大小是否對應(yīng)陽性。不包括步驟(d)的常規(guī)方法中的陽性/陰性(尤其是與S2至Sn中的標(biāo)準(zhǔn)核酸的比較值的確定結(jié)果)對應(yīng)于本文中的臨時確定的陽性/陰性。比較值是通過彼此比較相同種類的兩個樣點的標(biāo)記強(qiáng)度獲得的數(shù)值，并且可以提及標(biāo)記強(qiáng)度比、標(biāo)記強(qiáng)度之間的差等。比較值優(yōu)選標(biāo)記強(qiáng)度比，更優(yōu)選標(biāo)記強(qiáng)度比的對數(shù)值 (Log值)，并且進(jìn)一步優(yōu)選以2為底的標(biāo)記強(qiáng)度比的對數(shù)值(LO&值)。用于臨時判斷各比較值陽性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)，S卩，指定的數(shù)值范圍可以與常規(guī)陣列比較基因組雜交技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)相等并且，例如，準(zhǔn)備已知為陽性的樣品核酸(陽性對照)和已知為陰性的樣品核酸(陰性對照)并且可以使用它們的中間值作為閾值進(jìn)行判斷。此外，因為可能用于雜交的η種樣品核酸的量彼此不同，所以優(yōu)選包括用于校正樣品核酸的量的步驟。這種步驟不受特殊限制，并且可以應(yīng)用在比較不同探針核酸組中獲得的標(biāo)記強(qiáng)度的單色法雜交中通常使用的歸一化。例如，可以使用整體歸一化等。例如，可以提及這樣的方法使每個陣列中的P個樣點的標(biāo)記強(qiáng)度的平均值，或如之后在步驟(^)中描述的，中央值在待比較的陣列中相等，以及這樣的方法在獲得一對陣列間的每個樣點的每個比較值后，使所述一對陣列間的P個比較值的平均值或中央值等于另一對陣列間的P個比較值的平均值或中央值。具體地，可以提及這樣的方法用通過用單個標(biāo)記強(qiáng)度或比較值除以各陣列內(nèi)的P個樣點的標(biāo)記強(qiáng)度的平均值或中央值獲得的比率，通過減去標(biāo)記強(qiáng)度的平均值或中央值獲得的值，或偏差值表示。通過包括這種步驟，可以校正如上所述的由樣品核酸的量引起的差異。此處，用于校正的方法不受特殊限制并且，例如，可以提及這樣的方法使標(biāo)記強(qiáng)度乘以和除以平均值或中央值，排除與平均值或中央值偏離一定值以上的值。此外，在以上的校正步驟中，在通過除以平均值或中央值獲得的比率的情況中，所得的值是對應(yīng)于拷貝數(shù)的值。至于前述步驟(C)中的指定的數(shù)值范圍，可以根據(jù)各測量值 (尤其是獲得自對已知突變測量的值)設(shè)定這樣的值，所述值能夠排除突變明顯發(fā)生的區(qū)域，或者可能基于可能作為理論拷貝數(shù)的數(shù)值設(shè)定值。對于后者，具體地，在存在于不含異常的常染色體上的特定核酸區(qū)域的數(shù)目是1個拷貝而一對的以上染色體對的拷貝數(shù)是1的情況中，理論上可能的拷貝數(shù)是間隔0.5的值，諸如0、0.5、1、1.5、2..。因此，對于用于在以上步驟(c)中進(jìn)行確定的標(biāo)準(zhǔn)，可能使用以上間隔的一半(即0.25)作為閾值來判斷臨時陽性或陰性，或者排除中間值(例如，0.2至0. 3)而不像以前那樣作為假陽性進(jìn)行判斷。可以與在常規(guī)陣列比較基因組雜交中陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)相似地設(shè)定比較值的指定的數(shù)值范圍。例如，在使用熒光強(qiáng)度比的情況中，理論上，可以提及諸如0.8至1.2的值，但是考慮到序列的鑒定等，所述值可以任意設(shè)定。例如，在進(jìn)行之后要提及的修正的情況中，可以在這種程度上進(jìn)行乘或除。S卩，在本實施方案中，以上步驟(C)優(yōu)選對存在于η組探針核酸組中的每個中的P 個樣點進(jìn)行以下步驟(cl)至(c3)的步驟。S卩，總共計算(n-l)Xp個比較值。[步驟(cl)從以上η組探針核酸組中選擇一對兩個探針核酸組，這樣選擇以致其包括樣點XI，以及在所述兩個探針核酸組之間比較ρ對固定有相同的探針核酸的樣點的每對的標(biāo)記強(qiáng)度，以計算P個比較值][步驟(c2)計算步驟(Cl)中獲得的ρ個比較值的平均值或中央值][步驟(c3)基于步驟(c2)中獲得的平均值或中央值設(shè)定指定的數(shù)值范圍并且確定P個比較值中的每個是否超過指定的數(shù)值范圍]更具體地，本實施方案包括以下步驟提供η個相同的探針核酸組NSl至NSn，各探針核酸組NSi提供具有ρ個樣點tn至tip的核酸微陣列，i是整數(shù)并且滿足 l^i^nMp是整數(shù)并且滿足2彡p，將彼此不同的探針核酸固定在各探針核酸組NSi的ρ個樣點tn至、上。各探針核酸組NSi的ρ個樣點中的一個是樣點Xi，將相同的探針核酸固定到所述樣點、至tnj上，j是整數(shù)并且滿足1彡j彡P(guān)，步驟(a)包括使標(biāo)記的樣品核酸Si與探針核酸組NSi接觸從而將樣品核酸Si雜交到已經(jīng)固定在探針核酸組NSi的ρ個樣點上的核酸，步驟(b)包括獲得已經(jīng)雜交到各探針核酸組NSi的樣點tn至、中的樣品核酸的標(biāo)記值Fil至Fip，NSl和NSm選自探針核酸組NSl至NSn并且m是整數(shù)并且滿足2彡m彡n，步驟(c)包括以下步驟(cl)比較標(biāo)記值Flj與Fmj以確定ρ個比較值Cl"至Cp"，(c2)計算比較值Cl"至Cp"的平均值或中央值，以及(c3)基于在步驟(c2)中獲得的平均值或中央值設(shè)定指定的數(shù)值范圍并且判斷比較值Cl"至Cp"是否落入指定的數(shù)值范圍。在步驟(c!3)中，優(yōu)選的是比較值是標(biāo)記強(qiáng)度比并且根據(jù)標(biāo)記強(qiáng)度比的平均值或中央值的偏差進(jìn)行對陽性或陰性的臨時判斷。例如，基于平均值或中央值的偏差設(shè)定閾值 (指定的數(shù)值范圍)，并且與平均值或中央值的偏差超過以上閾值的情況可以臨時地被判斷為陽性(或陰性)。在獲得如上所述的比較值前，也可以通過計算各探針核酸組中的ρ個樣點的單個標(biāo)記強(qiáng)度的平均值或中央值并且將它與單個的標(biāo)記強(qiáng)度相比來實施計算比較值的平均值或中央值的步驟以及將它與步驟(c2)和(c3)中的單個的比較值比較的步驟。即，在本實施方案中，以上步驟(c)可以是以下步驟[步驟(CC)計算η組探針核酸組中的單個樣點的標(biāo)記強(qiáng)度的平均值或中央值，在η組探針核酸組的每個中，基于所述平均值或中央值計算單個樣點的偏差值 (F' UF' 2. . . F' η),計算在η組探針核酸組中的一對兩個組之間相同種類的成對的樣點的標(biāo)記強(qiáng)度的比較值，并且根據(jù)η組的平均值或中央值，確定從成對的F' 1和F' 2的比較值至成對的F' 1和F' η的比較值的η-1個比較值中的每個是否落入指定的數(shù)值范圍]。順便提及，在本實施方案中，為了說明的緣故，將單個的步驟編號成不同的數(shù)以進(jìn)行說明，但是所述編號不限制其次序并且也不排除同時處理。步驟(d)在步驟(d)中，在已經(jīng)確定為未落在指定的數(shù)值范圍的數(shù)目超過η-1中的指定數(shù)目的情況中，樣點Xl被確定成陽性。指定數(shù)目優(yōu)選地是η-1的一半并且η是4以上和指定數(shù)目是η-1的70%的情況是更優(yōu)選的。此外，確定的數(shù)目是某個數(shù)目以下的情況優(yōu)選地被確定為陰性，但是同樣優(yōu)選的是限定特定的范圍而落入限定范圍內(nèi)的情況被判斷為假陽性并且進(jìn)行復(fù)查。甚至在進(jìn)行復(fù)查的情況中，與常規(guī)方法相比，預(yù)期在很大程度上減小需要復(fù)查的可能性。此外，在進(jìn)行復(fù)查的情況中，優(yōu)選改變比較主體來進(jìn)行復(fù)查。在這樣點上，在步驟(d)中，在比較值已經(jīng)被確定為未落入指定的數(shù)值范圍的情況的數(shù)目沒有超過η-1中的指定數(shù)目的情況中，可以判斷樣點Xl中的數(shù)據(jù)缺少可靠性并且可以進(jìn)行處理諸如復(fù)查。此外，樣點(Xl)是任意樣點并且通常，在包含樣點Xl的相同的陣列中的多個樣點 (優(yōu)選地所有樣點)中，在替換以上(Xl)的情況下進(jìn)行與本實施方案的步驟(a)至(d)相同的步驟或處理(i)至(iii)。標(biāo)記強(qiáng)度校正以上在步驟(b)中獲得的標(biāo)記強(qiáng)度優(yōu)選為經(jīng)校正的值。具體地，在步驟(b)中獲得的標(biāo)記強(qiáng)度優(yōu)選獲得自以下步驟的值。優(yōu)選的是包括這樣的步驟使標(biāo)記的樣品核酸與某個樣點上的固定的探針核酸雜 、-
父，加入標(biāo)記的鑒定核酸并且將加入的核酸雜交到探針核酸的步驟，所述標(biāo)記的鑒定核酸具有可以雜交到以上探針核酸的至少一部分的序列并且標(biāo)記以不同于標(biāo)記的樣品核酸的標(biāo)記物的標(biāo)記物，獲得以上樣點中雜交的經(jīng)標(biāo)記的樣品核酸的標(biāo)記強(qiáng)度的步驟，
測量所述樣點中雜交的經(jīng)標(biāo)記的樣品核酸的標(biāo)記強(qiáng)度的步驟，以及基于鑒定核酸的標(biāo)記強(qiáng)度檢測所述樣點中固定的探針核酸的量并且通過檢測的量校正樣品核酸的標(biāo)記強(qiáng)度的步驟。校正方法可以使用描述于例如JP-A-2010-004873中的方法。此處，優(yōu)選的是使得標(biāo)記的樣品核酸雜交的步驟和使得標(biāo)記的鑒定核酸(B)雜交的步驟同時進(jìn)行，并且測量經(jīng)雜交的標(biāo)記的樣品核酸的量的步驟和測量經(jīng)雜交的鑒定核酸的量的步驟同時進(jìn)行。此處，鑒定核酸是指具有可以雜交到探針核酸的至少一部分的序列的核酸，并且可以用于檢測由多個樣點雜交能力(具體地固定在每個樣點的探針核酸的量)的不均導(dǎo)致的變化，并且可以進(jìn)一步用于校正樣點之間的探針核酸的量的變化。因此，充分地，鑒定核酸是可以雜交到固定在核酸微陣列上的所有樣點中的探針核酸的核酸并且可以具有任何序列和鏈長度。此處，所有的樣點表示可能使相同溶液中的分析物或標(biāo)準(zhǔn)物起反應(yīng)的所有樣點，并且通常是單一核酸微陣列上的所有樣點但是不限于此。此外，鑒定核酸可以是任何核酸，只要它可雜交并且可以是天然核酸諸如DNA和 RNA以及同樣地通過對天然核酸諸如DNA和RNA進(jìn)行化學(xué)修飾獲得的核酸。例如，可以使用PNA、甲基磷酸酯類DNA、硫代磷酸酯類DNA、嵌合體類核酸等。至于優(yōu)選作為鑒定核酸的序列，可以提及重復(fù)性序列。重復(fù)性序列也被稱為重復(fù)序列，并且是每隔某一數(shù)目的堿基就重復(fù)出現(xiàn)的序列，諸如限制酶識別位點?？梢蕴峒捌渲卸痰膲A基序列的模式重復(fù)多次的序列，例如，聚d(AT)和聚d(GC)，以及其中長序列(一個單元可以達(dá)到數(shù)千個堿基對)重復(fù)多次的序列，并且已知在高等動物諸如人中這種序列以高頻率出現(xiàn)在基因組中。在本實施方案中，例如，可以合適地使用從^witrogen公司商業(yè)獲取的 Cot-IDNA。已知Cot-IDNA是這樣的核酸，其在核酸微陣列測量中用于封閉獲得自哺乳動物的分析物的重復(fù)序列。通過標(biāo)記至少一部分的Cot-IDNA并且將標(biāo)記的Cot-IDNA與未標(biāo)記的Cot-IDNA 一起使用，也可能加強(qiáng)對特異性雜交的檢測靈敏度并且減小樣點間的差異。作為鑒定核酸，與分析物核酸不同，同樣優(yōu)選使用不同于分析物核酸并且具有所有探針核酸組通常具有的序列的核酸。例如，也可能使用這樣的合成寡核苷酸作為鑒定核酸，所述合成寡核苷酸具有與通常存在于探針核酸中的核酸序列部分基本互補(bǔ)的核酸序列。此外，也可能使用具有被認(rèn)為在陣列的制備中存在于所有樣點中的序列的核酸作為鑒定核酸，諸如在陣列的制備中使用的載體(質(zhì)粒、BAC、YAC、PAC、粘粒、病毒等)的核酸， 大腸桿菌的基因組等。在本實施方案中，優(yōu)選地以與樣品核酸的摩爾比為1以上的量使用鑒定核酸。通過以1以上的摩爾比使用它，核酸微陣列的性能得到改善。鑒定核酸的大小優(yōu)選20bp以上，更優(yōu)選20bp至IMbp，并且進(jìn)一步優(yōu)選IOObp至 500kb。使用的鑒定核酸的量與分析物或標(biāo)準(zhǔn)核酸的摩爾比優(yōu)選地在0. 5至2的范圍內(nèi)。
自動化根據(jù)本實施方案的分析核酸突變的方法的所有步驟可以手工進(jìn)行或者所述步驟可以借助部分自動的機(jī)器進(jìn)行或者所有步驟可以借助全自動機(jī)器進(jìn)行。通過自動化，工人免于繁重的工作，人員經(jīng)費可以得到減小，由熟練程度的差異導(dǎo)致的結(jié)果的差異可以降低，并且可以避免人為失誤。程序以下將說明本實施方案的程序。實施方案的程序是在以上說明的分析核酸突變的方法中用于執(zhí)行數(shù)據(jù)處理的程序，其執(zhí)行以下進(jìn)程⑴和(II)[進(jìn)程(I)比較從Fl與F2至Fl與1 的n_l個比較值是否落入指定的數(shù)值范圍][進(jìn)程(II)在以下情況中判斷樣點Xl為陽性在以上⑴中臨時確定的所有n-1
個比較值中，已經(jīng)由進(jìn)程(I)確定為未落入指定的數(shù)值范圍內(nèi)的比較值的數(shù)目超過指定數(shù)目]。進(jìn)程⑴優(yōu)選地包括以下進(jìn)程⑴至(V)[進(jìn)程(i)在存在于η組探針核酸組的每個中的ρ個樣點中，從η組探針核酸組中選擇一對兩個探針核酸組，所述一對兩個探針核酸組被這樣選擇以致包含樣點XI，以及在所述兩個探針核酸組之間，計算已經(jīng)固定有相同的探針核酸的成對的樣點的標(biāo)記強(qiáng)度的比較值][進(jìn)程(ii)對探針核酸組中ρ個成對的樣點中的每個進(jìn)行進(jìn)程(i)中的比較值計算]，[進(jìn)程(iii)計算在進(jìn)程(ii)中獲得的ρ個比較值的平均值或中央值]，以及[進(jìn)程(iv)從在進(jìn)程(iii)中獲得的平均值或中央值設(shè)定指定的數(shù)值范圍并且比較P個比較值中的每個是否超過指定的數(shù)值]。通過使用本實施方案的程序，在對通過測量上述標(biāo)記強(qiáng)度獲得的數(shù)據(jù)的處理中可以有效地進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所述程序通常以這樣的方式提供它被記錄在可在計算機(jī)上讀取的記錄介質(zhì)上。 記錄介質(zhì)不受特殊限制，只要它在計算機(jī)上可讀。本實施方案的記錄介質(zhì)包括便攜的記錄介質(zhì)和固定類型的記錄介質(zhì)兩者，并且可以提及高密度磁盤(CD)、軟盤(FD)、硬盤、半導(dǎo)體存儲器等?？梢酝ㄟ^將本實施方案的程序記錄在以上的記錄介質(zhì)上來傳送它，或者可以以下述形式傳送它它被記錄在計算機(jī)的存儲設(shè)備上并且經(jīng)由網(wǎng)絡(luò)傳遞到另一個計算機(jī)。以下將說明用于根據(jù)本實施方案診斷來源于基因突變的疾病的方法。用于根據(jù)本實施方案診斷來源于基因突變的疾病的方法使用以上說明的分析核酸突變的方法。作為以上的診斷目標(biāo)疾病，可以包括所有疾病諸如癌癥、遺傳疾病和傳染性疾病，對于所述疾病核酸可以具有某些信息，并且所述疾病不受特殊的限制。在根據(jù)實施方案的診斷方法中，通過將提取自正常細(xì)胞(非癌化細(xì)胞)的核酸作為標(biāo)準(zhǔn)核酸而提取自異常細(xì)胞(例如來源于癌癥患者、遺傳性疾病患者或傳染性疾病患者的細(xì)胞)的核酸作為分析物核酸應(yīng)用于以上說明的分析核酸突變的方法，可以診斷提供分析物的患者或者被用作分析物的細(xì)胞的病變，而不受由CNV等所導(dǎo)致的假陽性和假陰性的影響。
實施例以下將根據(jù)實施例說明本發(fā)明。顯示于以下實施例中的材料、試劑、物質(zhì)的量和比率、操作等可以適當(dāng)?shù)馗淖?，只要它們不偏離本發(fā)明的本質(zhì)。因此，本發(fā)明的范圍不限于以下具體的實施例。在以下實施例中，Cy3男性表示通過用Cy3標(biāo)記男性DNA獲得的樣品。相似地，Cy5 男性表示通過用Cy5標(biāo)記男性DNA獲得的樣品。此外，Cy5-Cot_lDNA等相似地表示標(biāo)記有相應(yīng)標(biāo)記化合物的核酸。[實施例1]1.制備標(biāo)記的樣品核酸向微管中放入 3 μ L(0. 75 μ g)Human Genomic DNA male (人男性基因組 DNA)(由 Promega公司生產(chǎn)，貨號G152 ；下文中稱為男性基因組DNA)，8 μ L水(不含DNAsejnase的蒸餾水，GIBC0)，20 μ L 用于陣列 CGH(BioI^rime (注冊商標(biāo))Array CGH Genomic Labeling System(陣列CGH基因組標(biāo)記系統(tǒng))(invitrogen))的標(biāo)記系統(tǒng)的2. 5XRandom Primers Solution (隨機(jī)引物溶液)anvitrogen公司)，接著使用塊型孵育器(block incubator) 在95°C熱處理5分鐘并且在37°C靜置15分鐘。向其中加入5 μ L的以上標(biāo)記系統(tǒng)的IOXdCTP Nucleotide Mix (核苷酸混合物) (Invitrogen 公司)，3 μ L Cy3_dCTP Bulk Pack 250nmol (由 GEHealthcare Bioscience 公司生產(chǎn))，lyL BioI^rime (注冊商標(biāo))Array CGH Genomic Labeling System(陣列 CGH 基因組標(biāo)記系統(tǒng))的Exo-Klenow Fragment Qnvitrogen公司)，接著使用塊型孵育器在37°C 與標(biāo)記反應(yīng)同時地進(jìn)行2小時擴(kuò)增反應(yīng)。然后，使用塊型孵育器整體加熱到65°C以使包含在反應(yīng)溶液中的Exo-Klenow Fragment失活。以上操作，遵從puregene OjIAgen公司)的實驗方法從Coriell醫(yī)學(xué)研究所的細(xì)胞株GM07189(下文中稱為分析物核酸No. 1)、細(xì)胞株GM07189 (下文中稱作分析物核酸 No. 2)、細(xì)胞株GM13451(下文中稱作分析物核酸No. 3)和細(xì)胞株GM13451 (下文中稱作分析物核酸No. 4)實施基因組提取。對于提取的DNA，使用NanoDrop (Scrum Inc.)測量0D。在因此獲得的基因組上，進(jìn)行與在以上人男性基因組DNA的情況中相同的操作，以獲得未純化的標(biāo)記的樣品核酸。同樣，對于這些，使用Cy3_dCTP(由GE Healthcare Bioscience公司生產(chǎn))作為標(biāo)記化合物。2. 1.制備標(biāo)記的鑒定核酸除了將3μ g(13y L)Cot_lDNA(由 hvitrogen 公司生產(chǎn)，貨號 15279-011)用于微管中和使用 3μ L Cy5-dCTP Bulk Pack 250nmol (由 GE Healthcare Bioscience 公司生產(chǎn))作為標(biāo)記化合物外，以相同的方式獲得標(biāo)記的鑒定核酸(未純化的)。2. 2制備包含標(biāo)記的鑒定核酸的雜交溶液向微管加入21 μ L標(biāo)記的核酸Cy5-Cot-lDNA，62 μ L未標(biāo)記的Cot_lDNA(62 μ g, 由Invitrogen公司生產(chǎn))，0. 3yg酵母tRNA，以及9yL 3M醋酸鈉(pH 5. 2)，并且向其中加入-20°C 360 μ L 99. 5% (ν/ν)乙醇，以實現(xiàn)乙醇沉淀。干燥后，添加8. 7 μ L水、6. 5 μ L 甲醛以及16.8yL 20% SDS0向其中加入32 μ L葡聚糖-甲酰胺溶液，所述葡聚糖-甲酰胺溶液通過將水加入Ig葡聚糖、5mL甲酰胺和ImL 20 X SSC至7mL的體積而獲得，接著將全部完全溶解。之后，收集到一個管中，并且將各30 μ L分散在多個管中。向其加入IOyL的以上標(biāo)記的樣品核酸的基因組中的每個，并且將整體充分?jǐn)嚢琛Ｈ缓?，?5°C孵育15分鐘后，使產(chǎn)物在42°C保持30分鐘以上。3.制備BAC陣列載玻片從已經(jīng)插入人基因組的BAC文庫，每個染色體隨機(jī)選擇包含被認(rèn)為是含有先天性異常的基因區(qū)域的BAC，并且在50mL LB培養(yǎng)基(+氯霉素)中培養(yǎng)過夜。選擇每個染色體具有特定長度的以上BAC，并且最終制成340個樣點。遵從所附實驗方法使用QIAGEN公司的質(zhì)粒中提試劑盒(plasmid midi kit)提取它。在調(diào)節(jié)到Uyg/ieyL TE后，分別使用限制酶Rsal、DpnI和HaeIII進(jìn)行2小時的消化，然后在80°C持續(xù)20分鐘使所述酶失活，并且將這三種消化物混合。此外，力口入序列為 SEQ No. 1 5 ‘ -aattccggcggccgcccgatg-3 ‘的銜接子和序列為 SEQ No. 2 5 ‘ -P-catcgggcggccgcgg-3 ‘ (5 ‘端磷酸化)的它的互補(bǔ)鏈，在 95 °C、5 分鐘，70°C、 15 分鐘，65 °C、15 分鐘，60°C、15 分鐘，55 °C、15 分鐘，50°C、15 分鐘，45 °C、15 分鐘，40°C、 15分鐘，35°C、15分鐘，30°C、15分鐘，25°C、15分鐘的限制酶消化后，所述銜接子連接到DNA片段上，并且加入5 μ L10XT4連接酶緩沖液和2. 5 μ L Τ4連接酶，以使限制酶處理后的DNA片段與銜接子結(jié)合。然后，使用Nucleospin試劑盒(由MACHEREY-NAGEL公司生產(chǎn))純化DNA片段。使用EX-Taq (由Takara Bio Inc.生產(chǎn))和序列為SEQ No. 3 5' -NH2-ggaattccgcggccgcccgatg-3‘的 5'端胺化引物進(jìn)行 PCR。PCR進(jìn)行 15 個循環(huán)作為第一次PCR并且10個循環(huán)作為第二次PCR。通過在MICR0C0N柱上進(jìn)行超濾來純化產(chǎn)物到Iyg/μ L的終濃度，其被用作探針核酸。將它送至NGK Insulators Ltd.并且通過壓電法在Matsunami Glass Ind.的載玻片上進(jìn)行點樣，以形成BAC陣列。此外，根據(jù)JP-A-2002-176977中描述的方法使BAC陣列經(jīng)歷封閉和熱變性。4，雜交使用ALOKA Co.，Ltd 的 HYBRIMASTER HS300 進(jìn)行雜交。放置BAC陣列載玻片，將溫度設(shè)定為37°C并且，在加入雜交溶液后，在攪拌下進(jìn)行 16小時的雜交。在此情況下，使用50%甲酰胺ΛX SSC作為濕潤液體。之后，在25°C用5mL 2 X SSC進(jìn)行漂洗5分鐘并且用1011^2\33(漂洗5分鐘，在501用51^ 50%甲酰胺/2 X SSC 漂洗14分鐘并且用5mL 0. 1% SDS/2 X SSC漂洗30分鐘，并且在25°C用2 X SSC漂洗5分鐘。5.熒光圖像的加載和數(shù)據(jù)處理使用gen印ix 4000B(由axon Inc.生產(chǎn))加載熒光圖像?；谄渲袌D像被數(shù)字化的gpr文件進(jìn)行計算。關(guān)于計算方法，使用cy5即Cot-IDNA的熒光值作為校正的指標(biāo)， 對用cy3標(biāo)記的標(biāo)記的基因組的熒光強(qiáng)度進(jìn)行校正，然后完成比較。使用減去背景熒光值后的值作為熒光值。計算方法log2(基因組分析物核酸的熒光強(qiáng)度/標(biāo)記的cot-1 (分析物)/基因組標(biāo)準(zhǔn)核酸的熒光強(qiáng)度χ標(biāo)記的cot-1 (標(biāo)準(zhǔn)))
對由此與分析物核酸No. 1雜交的所有成對的所有樣點以及與標(biāo)準(zhǔn)人男性基因組 DNA雜交的所有樣點中相同類型的樣點進(jìn)行此計算。對于通過以上計算獲得的所有樣品對的值，通過除以所有樣點對的中央值進(jìn)行整體歸一化。因此，進(jìn)行分析物核酸No. 1與標(biāo)準(zhǔn)人男性基因組DNA的比較。然而，因為標(biāo)準(zhǔn)核酸的CNV是未知的，有可能比較結(jié)果可以包含假陽性和假陰性。因此，分別使用分析物核酸No. 2,No. 3和No. 4代替標(biāo)準(zhǔn)人男性基因組DNA進(jìn)行與分析物核酸No. 1的比較。6.結(jié)果圖3至圖6顯示以上計算的結(jié)果?？v坐標(biāo)軸表示熒光強(qiáng)度比而橫坐標(biāo)軸表示樣點編號(探針核酸編號)。在圖3至圖6中， 表示落入閾值內(nèi)的數(shù)據(jù)，□表示落在閾值外的數(shù)據(jù)(在正向上偏離的數(shù)據(jù))，而Δ表示落在閾值外的數(shù)據(jù)(在負(fù)向上偏離的數(shù)據(jù))。閾值設(shè)為0. 8和1. 2。圖3是這樣的圖，其顯示分析物DNANo. 1與作為標(biāo)準(zhǔn)核酸的男性基因組DNA的熒光強(qiáng)度比的對數(shù)坐標(biāo)圖的結(jié)果。圖4是這樣的圖，其顯示分析物DNANo. 1與分析物DNANo. 2的熒光強(qiáng)度比的對數(shù)坐標(biāo)圖的結(jié)果。圖5是這樣的圖，其顯示分析物DNANo. 1與分析物DNANo. 3的熒光強(qiáng)度比的對數(shù)坐標(biāo)圖的結(jié)果。圖6是這樣的圖，其顯示分析物DNANo. 1與分析物DNANo. 4的熒光強(qiáng)度比的對數(shù)坐標(biāo)圖的結(jié)果。在各個圖中，對應(yīng)于常染色體并且落在閾值外的樣點是以下樣點。圖 3 :4、17、81、111、127、135、145、146、147、163、197、202、221、225、226、227、228、 229、230、231、232、244、245、264、310、328圖 4 :31、181、197、219、225、226、227、228、229、230、231、232、281、291、314、318、 319、320、321、322圖 5 :1、6、10、13、15、19、20、21、27、29、30、35、36、44、47、51、52、55、57、59、64、66、 72、80、86、94、96、113、137、141、157、167、174、178、181、185、204、215、216、217、225、226、 227、228、229、230、231、232、236、256、267、269、278、279、287、290、291、299、305、307、334圖 6 :1、2、3、4、5、6、7、8、10、17、29、31、52、86、111、113、163、174、197、216、217、 226、227、228、230、231、232、236、245、273、287、290、306、342結(jié)果，在197以及225至232的每個樣點中，所述比率超出了圖3至圖6中的多數(shù)結(jié)果中的閾值，所以所述樣點可以判斷為是陽性。超過以上閾值的其他樣點可以被判斷為是假陽性或假陰性。以上可見，發(fā)現(xiàn)No. 1樣品具有異常拷貝數(shù)在對應(yīng)于固定在樣點197以及225至 232中的核酸的基因中增加。此外，對于No. 2至No. 4樣品以及作為標(biāo)準(zhǔn)的男性，通過用其代替以上的No. 1樣品進(jìn)行類似測量，可以測量它們的拷貝數(shù)變異。順便提及，盡管在本實施例中沒有相關(guān)的實例，但是在陣列之間的某個樣點的比較結(jié)果中出現(xiàn)值在正向上落在閾值外和值在負(fù)向上落在閾值外的兩種結(jié)果的情況(例如， No. η樣點在圖3和圖4中是□并且No. η樣點在圖5和圖6中是Δ的情況)中，優(yōu)選不判斷所述樣點為陽性。從以上結(jié)果可見，應(yīng)當(dāng)理解可以通過本發(fā)明的方法確定陽性或陰性而不受假陽性
等的影響。工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明的分析核酸突變的方法、程序以及診斷方法可以降低分析結(jié)果中假陽性和假陰性的影響，尤其是，降低由于標(biāo)準(zhǔn)核酸的CNV所導(dǎo)致的影響(其為常規(guī)陣列比較基因組雜交技術(shù)中的問題)，并且能夠改善分析結(jié)果的可靠性。雖然已經(jīng)詳細(xì)地并且根據(jù)其具體實施方案描述了本發(fā)明，但是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是可以在其中進(jìn)行各種改變和改良而不背離它的精神和范圍。本申請基于在2009年9月10提交的日本專利申請?zhí)?009-209578，并且其內(nèi)容通過引用結(jié)合于此。
權(quán)利要求
1.一種使用陣列比較基因組雜交技術(shù)來分析核酸突變的方法，其包括步驟(a)使用η組相同的探針核酸組，其中多個樣點存在于一個核酸微陣列上并且彼此不同的探針核酸已經(jīng)被固定在多個所述樣點上，使η種標(biāo)記的樣品核酸Sl至Sn逐個地與η組所述探針核酸組接觸以實現(xiàn)雜交，步驟(b)選擇已經(jīng)固定有相同探針核酸的η個樣點乂1至&1，所述樣點乂1至&!選自 η組所述探針核酸組，并且獲得已經(jīng)被雜交到η個相應(yīng)的樣點Xl至)(r!中的樣品核酸的標(biāo)記強(qiáng)度Fl至而，步驟(c)將所述樣點Xl的標(biāo)記值Fl與所述標(biāo)記值F2至而中的每個比較，由此獲得 n-1個比較值C2至Cn，并且確定所述比較值中的每個是否落入指定的數(shù)值范圍內(nèi)，以及步驟(d):確定在n-1個所述比較值中在所述步驟(c)中已經(jīng)確定為未落入所述指定的數(shù)值范圍內(nèi)的比較值的數(shù)目是否超過指定數(shù)目，并且在超過所述指定數(shù)目的情況下，判斷所述樣點Xl為陽性，η是3以上的整數(shù)，所述樣品核酸是分析物核酸或標(biāo)準(zhǔn)核酸，至少Sl是分析物核酸，而 Xl是已經(jīng)與Sl接觸的樣點。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分析核酸突變的方法，其中在η種所述樣品核酸中至少兩種是分析物核酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的分析核酸突變的方法，所述方法進(jìn)一步包括步驟(c')確定從F2與Fl的比較值至F2與1 的比較值的n-1個比較值中的每個是否落入指定的數(shù)值范圍，以及步驟(d')確定n-1個比較值中在所述步驟(c')中已經(jīng)確定為未落入所述指定的數(shù)值范圍內(nèi)的比較值的數(shù)目是否超過所述指定數(shù)目，并且在超過所述指定數(shù)目的情況下， 判斷樣點X2為陽性，樣點X2是已經(jīng)與不同于以上Sl的樣品核酸S2接觸的樣點。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的分析核酸突變的方法，其中在η種所述樣品核酸中至少一種是標(biāo)準(zhǔn)核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的分析核酸突變的方法，其中η種所述樣品核酸都是分析物核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項的分析核酸突變的方法，其中η種所述樣品核酸是來源于屬于分類學(xué)上相同物種的不同個體的核酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項的分析核酸突變的方法，其中提供η個相同的探針核酸組NSl至NSn，各探針核酸組NSi被提供在具有ρ個樣點tn至tip的核酸微陣列上，i是整數(shù)并且滿足1彡i彡η而P是整數(shù)并且滿足2 ( ρ，將彼此不同的探針核酸固定在各探針核酸組NSi的ρ個所述樣點tn至、p上， 各探針核酸組NSi的ρ個所述樣點中的一個是樣點Xi， 將相同的探針核酸固定到樣點、至tnj上，j是整數(shù)并且滿足1彡j彡P(guān)， 步驟(a)包括使所述標(biāo)記的樣品核酸Si與所述探針核酸組NSi接觸，從而將所述樣品核酸Si雜交到已經(jīng)固定在所述探針核酸組NSi的ρ個所述樣點上的核酸，步驟(b)包括獲得已經(jīng)雜交到各探針核酸組NSi的所述樣點tn至、p中的樣品核酸的標(biāo)記值Fil至Fip，NSl和NSm選自所述探針核酸組NSl至NSn并且m是整數(shù)并且滿足2彡m彡n， 所述步驟(c)包括以下步驟(cl)比較所述標(biāo)記值Flj和Fmj以確定ρ個比較值Cl"至Cp"， (c2)計算所述比較值Cl"至Cp"的平均值或中央值，以及(c3)基于在所述步驟(c2)中獲得的平均值或中央值，設(shè)定指定的數(shù)值范圍并且判斷所述比較值Cl"至Cp"是否落入所述指定的數(shù)值范圍內(nèi)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項的分析核酸突變的方法，其中所述樣品核酸都用相同的標(biāo)記物標(biāo)記。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項的分析核酸突變的方法，其中步驟(b)中的所述標(biāo)記強(qiáng)度？1至而是校正值。
10.用于在根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的分析核酸突變的方法中執(zhí)行數(shù)據(jù)處理的程序，所述程序執(zhí)行以下進(jìn)程⑴和(II)[進(jìn)程⑴比較從Fl與F2至Fl與而的n-1個比較值是否落入指定的數(shù)值范圍] [進(jìn)程(II)在以下情況下判斷樣點Xl為陽性在以上⑴中臨時確定的所有n-1個比較值中，存在的已經(jīng)通過進(jìn)程(I)確定為未落入所述指定的數(shù)值范圍內(nèi)的比較值的數(shù)目超過指定數(shù)目]。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的程序，其中所述進(jìn)程⑴包括以下進(jìn)程⑴至(V) [進(jìn)程(i)在存在于η組所述探針核酸組的每個中的ρ個樣點中，從η組所述探針核酸組中選擇一對兩個探針核酸組，所述一對兩個探針核酸組被這樣選擇以致包含樣點XI，以及在所述兩個探針核酸組之間，計算已經(jīng)固定有所述相同的探針核酸的成對的樣點的標(biāo)記強(qiáng)度的比較值][進(jìn)程(ii)對所述探針核酸組中的P個成對的樣點中的每個進(jìn)行在進(jìn)程(i)中的比較值計算]，[進(jìn)程(iii)計算在進(jìn)程(ii)中獲得的P個比較值的平均值或中央值]，以及 [進(jìn)程(iv)從在進(jìn)程(iii)中獲得的平均值或中央值設(shè)定指定的數(shù)值范圍，并且比較 P個比較值中的每個是否超過所述指定的數(shù)值]。
12.—種診斷源于基因突變的疾病的方法，所述方法使用根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的分析核酸突變的方法。
全文摘要
本發(fā)明提供了使用陣列比較基因組雜交技術(shù)分析核酸突變的方法，所述方法減少了假陽性和假陰性并且改善了分析結(jié)果的可靠性。使用陣列比較基因組雜交技術(shù)分析核酸突變的方法包括[步驟(a)使多個標(biāo)記的樣品核酸逐個與多個相同的探針核酸組接觸以實現(xiàn)雜交]，[步驟(b)獲得已經(jīng)雜交到樣點X1至Xn的每個樣點中的樣品核酸的標(biāo)記強(qiáng)度F1至Fn，所述樣點已經(jīng)雜交有相同的探針核酸]，[步驟(c)確定從F1與F2的比較值至F1與Fn的比較值的n-1個比較值中的每個是否落入指定的數(shù)值范圍]，以及[步驟(d)比較已經(jīng)確定為未落入指定的數(shù)值范圍內(nèi)的比較值的數(shù)目是否超過指定數(shù)目并且，在超過指定數(shù)目的情況中，判斷樣點X1為陽性]。n是3以上的整數(shù)。
文檔編號C12N15/09GK102482719SQ20108004021
公開日2012年5月30日 申請日期2010年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月10日
發(fā)明者倉光昌之, 巖木義英, 氏原大 申請人:富士膠片株式會社