專利名稱：人的產(chǎn)生il-17的輔助性t細(xì)胞的檢測用標(biāo)記物及試劑、以及人的產(chǎn)生il-17的輔助性t細(xì) ...的制作方法
人的產(chǎn)生IL-17的輔助性T細(xì)胞的檢測用標(biāo)記物及試劑、以及人的產(chǎn)生IL-17的輔助性T細(xì)胞的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測人的產(chǎn)生IL-17的輔助性T細(xì)胞(以下，也稱為“Thl7細(xì)胞”) 的標(biāo)記物及試劑、以及檢測人Thl7細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(以下，稱為“RA”)是以關(guān)節(jié)炎作為主要的臨床癥狀的全身性的炎癥性自身免疫疾病。RA基于如關(guān)節(jié)的疼痛一樣的自覺癥狀及腫脹的程度、由骨X線的見解等，通過視覺的方法判斷其病勢，但未確立定量的指標(biāo)。從而，目前也未確立繼續(xù)監(jiān)控治療效果的定量的方法。RA的發(fā)癥原因的詳細(xì)雖不明了，但認(rèn)為，細(xì)菌感染等成為誘因，經(jīng)免疫細(xì)胞群及細(xì)胞因子組的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，發(fā)生關(guān)節(jié)組織的炎癥。擔(dān)負(fù)免疫反應(yīng)之中心的是輔助性T細(xì)胞群。未成熟的輔助性T細(xì)胞(幼稚T細(xì)胞)一旦從抗原呈遞細(xì)胞被呈遞抗原，則分化成輔助性T細(xì)胞，但此時由特定的細(xì)胞因子存在，幼稚T細(xì)胞分化誘導(dǎo)成4種的細(xì)胞種。4種的細(xì)胞種是產(chǎn)生干擾素(IFN)-Y的輔助性T細(xì)胞(Thl細(xì)胞)、產(chǎn)生白細(xì)胞介素(IL)-4的輔助性T細(xì)胞(Th2細(xì)胞)、產(chǎn)生IL-17的輔助性T細(xì)胞(Thl7細(xì)胞)及有免疫抑制效果的控制性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)。在這些的輔助性T細(xì)胞之中，越來越明了 Thl7細(xì)胞可與RA的發(fā)癥相關(guān)。例如，在特開2000-186046號公報(專利文獻(xiàn)1)中示，在RA患者的關(guān)節(jié)滑液中， 相比變形關(guān)節(jié)炎的患者的關(guān)節(jié)滑液，IL-17的量更顯著地高，RA患者來源的滑液組織中的T 細(xì)胞中存在IL-17陽性細(xì)胞，因此示IL-17與RA的病態(tài)形成、特別是關(guān)節(jié)-骨破壞深深相關(guān)。再者，專利文獻(xiàn)1記載，可將IL-17作為RA的診斷標(biāo)記物來使用。另外，在特開2007-506100號公報(專利文獻(xiàn)2)記載，當(dāng)分析自RA患者的末梢血血清中的細(xì)胞因子時，IFN- y、IL-I β、TNF- α、G-CSF, GM-CSF、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13、 IL-5及IL-7的水平在RA患者中是顯著地高的值，IL_2、CXCL8/IL_8、IL-12及CCL2/MCP-1 是不算高的值。另一方面，對于Thl7 細(xì)胞而言，通過 Ivanov 等(Cell, 2006,126,p. 1121-1133 # 專利文獻(xiàn) 1) > Stumhofer 等(Nature Immunology, 2006, vol. 7，ρ· 937-945 非專利文獻(xiàn) 2)、 Wilson 等(Nature Immunology，2007，vol. 8，ρ· 950-957 非專利文獻(xiàn) 3)等的研究，明白了以下的事實。 被稱為RORYt的核內(nèi)受體在Thl7細(xì)胞的分化中發(fā)揮重要的作用?！?Ι -6、Ι -23&Τ6Ρ-β誘導(dǎo)從未成熟的輔助性T細(xì)胞(幼稚T細(xì)胞)向Thl7 細(xì)胞的分化。 表達(dá) IL-17A、IL-17F、IL-6、IL-22、IL_26、TNF、IFN-γ、CCL20。 在Thl7細(xì)胞的表面存在IL-23受體或IL-12受體β。專利文獻(xiàn)1 特開2000-186046號公報
專利文獻(xiàn)2 特開2007-506100號公報非專利文獻(xiàn) 1 :Ivanov等，"The Orphan Nuclear Receptor RORyt Directs the Differentiation Program of Proinflammatory IL-17+THelper Cells " , Cell,2006, 126，p.1121-1133# 專禾I」JC ^ 2 Stumhofer‘‘ Interleukin 27negatively regulates the development of interleukin 17-producing T helper cells during chronic inflammation of the central nervous system " Nature Immunology,2006, vol.7, p.937-945非專利文獻(xiàn) 3 :Wilson 等，"Development, cytokine profile and function of human interleukin 17-producing helper T cells" Nature Immunology,2007, vol.8, p. 950-95
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的技術(shù)課題在上述的非專利文獻(xiàn)1 3中，使用利用對于IL-17特異性的抗體的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)來測定IL-17的量。但是認(rèn)為，通過確立不僅測定IL-17的量，還檢測Thl7細(xì)胞自體的方法，可更深理解自身免疫疾病、優(yōu)選是RA和Thl7細(xì)胞的關(guān)聯(lián)。本發(fā)明人以發(fā)現(xiàn)可特異性地檢測人Thl7細(xì)胞的分子標(biāo)記物作為目的。解決課題的技術(shù)方案本發(fā)明人通過從健康的成人的末梢血分離Thl7細(xì)胞，鑒定在得到的Thl7細(xì)胞中特異性地表達(dá)的基因而完成本發(fā)明。從而，本發(fā)明是人Thl7細(xì)胞檢測用多核苷酸標(biāo)記物，其為有選自下列的至少1種基因的堿基序列的多核苷酸、其變異型及片段由下列組成的編碼膜蛋白質(zhì)的基因ADAM12(ADAM金屬肽酶域12)、ANKSlB (錨蛋白重復(fù)子及不育α基序域含1B)、ATP6V0A4(ATP酶，H+運輸，溶酶體VO亞基a4)、ATP9A(ATP 酶，II類，9A型)、BVES (血管心外膜物質(zhì))>C5orf40 (第5染色體開放閱讀框40)、CDH4 (鈣粘蛋白4，1型，R-鈣粘蛋白(視網(wǎng)膜))、DI02(脫碘酶，碘甲狀腺原氨酸，II型)、DMD(肌營養(yǎng)不良蛋白)、GPR34(G蛋白-偶聯(lián)的受體34)、IRS2(胰島素受體底物2)、KCNE3(鉀電壓_選通的通道，Isk-相關(guān)的家族，成員3)、LlCAM(Li細(xì)胞粘著分子)、MCAM(黑色素瘤細(xì)胞粘著分子)、MFAP3L(微原纖維-相關(guān)的蛋白3-樣)、MY07A(肌球蛋白VIIA)、PTPRM(蛋白酪氨酸磷酸酶，受體類型，M)、SHR00M2(shrOOm家族成員2)、SLC16A4 (溶質(zhì)載體家族 16，成員4( 一元羧酸轉(zhuǎn)運蛋白5))、SLC02B1(溶質(zhì)載體有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白家族，成員 2B1)、TANC2(三十四肽重復(fù)子，錨蛋白重復(fù)子及卷曲螺旋含2)、TJPl (緊密連接蛋白1 (閉鎖小帶1))、TMEM163(跨膜蛋白163)、TNS3(張力蛋白3)、UPKlB(尿路血小板溶素1B)、 WDFY3 (WD重復(fù)子及FYVE域含3)、DRD2 (多巴胺受體D2) ,GJCl (縫隙連接蛋白，Y 1，45kDa)、 PGBD5(L0C100134440) (piggyBac可轉(zhuǎn)座元件來源的5 (類似于PGBD5蛋白))、MS4A7(跨膜 4-域，亞家族A，成員7)、0DZ4(odz，odd 0z/ten-m同系物4)、PHKA1 (磷酸化酶激酶，α 1)、 RGSl (G-蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)物1) ,SHB (Src同源性2域含銜接子蛋白B)、SLC44A3 (溶質(zhì)載體家族44，成員3)、SLC6A15 (溶質(zhì)載體家族6 (中性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白)，成員15)、SYNGR3 (突觸循環(huán)蛋白3)、AKAP12 (A激酶(PRKA)錨蛋白12)、C9orf 125 (第9染色體開放閱讀框 125)、DPY19L2 (dpy-19-樣2)、HRH4 (組胺受體H4)、MUC20 (粘蛋白20，細(xì)胞表面相關(guān)的)、 P0PDC3 (popeye域含3)、SORBSl (山梨糖及SH3域含1)、TANCl (三十四肽重復(fù)子，錨蛋白重復(fù)子及卷曲螺旋含1)、TMEM44(跨膜蛋白44)及UNC13C (imc-13同系物C)；由下列組成的編碼分泌蛋白質(zhì)的基因CXCL13(趨化因子(C_X_C基序)配體13)、 PC0LCE2 (原膠原C-內(nèi)肽酶增強子2)、PNOC (前原痛敏肽)、SMPDL3A (鞘磷脂磷酸二酯酶， 酸-樣3A)、TGFBI (轉(zhuǎn)化生長因子，β -誘導(dǎo)型)、C17orf99 (第17染色體開放閱讀框99)、 EBI3 (Epstein-Barr病毒誘導(dǎo)型3)、ILlA (白細(xì)胞介素1，α)及WNT3 (無翅-M型MTV整合位點家族，成員3)；由下列組成的編碼細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的基因BCAT1 (支鏈氨基轉(zhuǎn)移酶1，細(xì)胞溶質(zhì))、 BHLHE22 (堿性螺旋-環(huán)-螺旋家族，成員e22)、C13orfl8 (L0C728970)(第13染色體開放閱讀框18 (假定L0C728970))、CA2 (碳酸酐酶II)、CCDC3 (卷曲螺旋域含3)、CDSl (CDP- 二酰甘油合酶(磷脂酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶)1)、CHN1 (嵌合素(嵌合素)1)、CLIC5 (L0C100131610) (氯細(xì)胞內(nèi)通道5(類似于氯細(xì)胞內(nèi)通道5))、CTSH(組織蛋白酶H)、CYP7B1 (細(xì)胞色素 P450，家族7，亞家族B，多肽1)、DAPK2 (死亡-相關(guān)的蛋白激酶2)、DMRTl (雙性及mab-3相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子1)、DSE (硫酸皮膚素表異構(gòu)酶)、FBXL17 (F-盒及亮氨酸-富含的重復(fù)子蛋白17)、FBXL21 (F-盒及亮氨酸-富含的重復(fù)子蛋白21)、FH0D3 (成蛋白同源性2域含3)、 H2AFY2(H2A組蛋白家族，成員Y2)、HLX(H2. 0-樣同源異形盒)、IRAK3(白細(xì)胞介素_1受體_相關(guān)的激酶3)、MACCl (轉(zhuǎn)移相關(guān)的in結(jié)腸癌1)、MAML3 (策劃者-樣3)、MY010 (肌球蛋白X)、0TUB2 (0TU域，泛素醛結(jié)合2)、PAPSS2 (3 ‘-磷酸腺苷5 ‘-磷酰硫酸合酶2)、 PCBP3(Poly(rC)結(jié)合蛋白3 (PCBP3)，轉(zhuǎn)錄物變體2)、PDE4DIP (磷酸二酯酶4D相互作用蛋白)、PLDl (磷脂酶Dl，磷脂酰膽堿-特異性)、PPARG (過氧化物酶體增殖子-活化的受體Y)、PTPN13(蛋白酪氨酸磷酸酶，非-受體13型(AP0-1/CD95 (Fas)-相關(guān)的磷酸酶))、 RGS18(G-蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)物 18)、SIMl (single-minded 同系物 1)、SNAI2 (snail 同系物 2)、S0X2(SRY(性別決定區(qū) Y)-盒 2)、SPIREl (spire 同系物 1)、TBC1D12(TBC1 域家族， 成員12)、TGM5(轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶5)、TMODl (原肌球調(diào)節(jié)蛋白1)、TUBB6 (微管蛋白，β 6)、 DDIT4L(DNA-損傷-誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄物4-樣)、DHRS9 (脫氫酶/還原酶(SDR家族)成員9)、 ERC2 (ELKS/RAB6-相互作用 /CAST 家族成員 2)、FERMT2 (fermitin 家族同系物 2)、HHEX (造血性地表達(dá)的同源異形盒)、HS3ST1 (硫酸乙酰肝素(葡萄糖胺)3-0-磺基轉(zhuǎn)移酶1)、 NR5A2 (核受體亞家族5，組A，成員2) ,PHLDAl (組同源性-樣域，家族A，成員1)、RBM20 (RNA 結(jié)合基序蛋白 20)、NINL (ninein-樣)、RTN2 (reticulon2)、SH3RF2 (SH3 域含環(huán)指 2)、 TSHZ2(teashirt鋅指同源異形盒2) ,EMLl (棘皮動物微管相關(guān)的蛋白樣1)、HIST1H2BC (組蛋白簇l，H2bc)、MAP3K4 (絲裂原-活化的蛋白激酶激酶激酶4)、PDK4 (丙酮酸脫氫酶激酶， 同工酶4)、RGS2(G-蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)物2)及RGS20(G-蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)物20)；由下列組成的基因Clorfl06(第1染色體開放閱讀框106)、C6orf 145 (第6 染色體開放閱讀框145)、L0C401097(類似于L0C166075)、MAMLD1(策劃者-樣域含1)、 ZC3H12C (鋅指CCCH-類型含12C)、C12orf64(第1染色體2開放閱讀框64)、C6orfl68(第 6染色體開放閱讀框168)、CAMSAP1L1 (鈣調(diào)素調(diào)節(jié)的血影蛋白-相關(guān)的蛋白1_樣1)及MAGED4 (MAGED4B)(黑色素瘤抗原家族D，4，(黑色素瘤抗原家族D，4B))、以及包含選自SEQ ID NO 147 151、157 162及167 174的至少一個堿基序列的基因。本發(fā)明也提供人Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物，其為由至少1種上述的基因編碼的蛋白質(zhì)、其功能上同等的變異型及片段。再者，本發(fā)明提供檢測人Thl7細(xì)胞的方法，包括在包含人來源的細(xì)胞的樣品中， 檢測至少1種人Thl7細(xì)胞檢測用多核苷酸標(biāo)記物或至少1種人Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物的存在。另外，本發(fā)明提供人Thl7細(xì)胞檢測用試劑，其包含選自下列的至少1種與上述的多核苷酸標(biāo)記物特異性地雜交的核酸探針；及與上述的蛋白質(zhì)標(biāo)記物特異性地結(jié)合的，核酸適體、抗體、配體或受體。發(fā)明效果通過檢測至少1種本發(fā)明的人Thl7細(xì)胞檢測用多核苷酸標(biāo)記物或蛋白質(zhì)標(biāo)記物， 可特異性地檢測人Thl7細(xì)胞。另外認(rèn)為，可檢測該患者罹患被認(rèn)為Thl7細(xì)胞相關(guān)的疾病、 例如RA等的自身免疫疾病的可能性。

圖1是示在1111、1112、1^叩及11117的各細(xì)胞中，已知的Thl7細(xì)胞特異性表達(dá)基因(IL23R、IL17A、IL17F、IL22、IL26&R0RC)的表達(dá)量的坐標(biāo)圖。圖2是示從MCAM測定用樣品的解析得到的熒光強度的直方圖。圖3是示從PTPRM測定用樣品的解析得到的熒光強度的直方圖。圖4是示從GPR34測定用樣品的解析得到的熒光強度的直方圖。圖5是示從CCR6測定用樣品的解析得到的熒光強度的直方圖。圖6是示從IL-17A測定用樣品的解析得到的熒光強度的直方圖。圖7是示從IFN-Y測定用樣品的解析得到的熒光強度的直方圖。圖8是示從IL-4測定用樣品的解析得到的熒光強度的直方圖。圖9是示從F0XP3測定用樣品的解析得到的熒光強度的直方圖。實施方式本發(fā)明的人Thl7細(xì)胞檢測用多核苷酸標(biāo)記物是有選自上述的基因的至少1種基因的堿基序列的多核苷酸、其變異型及片段。優(yōu)選是，上述的多核苷酸是有選自下列的至少1種基因的堿基序列的多核苷酸由下列組成的編碼膜蛋白質(zhì)的基因ADAM12、ATP6V0A4、ATP9A、BVES, C5orf40、CDH4、DI02、GPR34、L1CAM、MCAM, PTPRM、SHR00M2、ΤΜΕΜ163、UPK1B、DRD2、 PGBD5 (L0C100134440)、0DZ4、SLC6A15、AKAP12、C9orfl25、P0PDC3 及 UNC13C ；由下列組成的編碼分泌蛋白質(zhì)的基因PC0LCE2、PNOC, TGFBI及ILlA ；以及由下列組成的編碼細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的基因BHLHE22、PPARG, SIMl及SNAI2。本發(fā)明的人Thl7細(xì)胞檢測用多核苷酸標(biāo)記物是發(fā)現(xiàn)相比人末梢血來源的其他輔助性T細(xì)胞(Thl、Th2及Treg細(xì)胞)，在Thl7細(xì)胞中特異性地存在的多核苷酸、其變異型或片段。
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從而，通過檢測至少1種上述的多核苷酸標(biāo)記物，可將Thl7細(xì)胞與Thl、Th2及 Treg細(xì)胞區(qū)別而特異性地檢測，及檢查被認(rèn)為Thl7細(xì)胞相關(guān)的疾病的在活體中的活動性指標(biāo)。在本說明書中，基因與所述技術(shù)中一般地使用的用語具有同等的含義，是轉(zhuǎn)錄成 mRNA而翻譯成蛋白質(zhì)的基因組上之一部分。在本說明書中，包括選自SEQ ID NO :147 151、157 162及167 174的至少 1個堿基序列的基因是包括各序列編號所示的至少1個堿基序列或與其堿基序列互補的堿基序列的轉(zhuǎn)錄成mRNA的基因。S卩，在包含選自SEQ ID NO 147 151、157 162及167 174的至少1個堿基序列的基因中包括包含與選自SEQ ID NO :147 151、157 162及 167 174的至少1個堿基序列互補的堿基序列的基因。在本說明書中，膜蛋白質(zhì)是指存在于細(xì)胞膜，包括在細(xì)胞的膜級分的蛋白質(zhì)。分泌蛋白質(zhì)是指在細(xì)胞內(nèi)合成，向細(xì)胞質(zhì)膜外分泌的蛋白質(zhì)。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)是指其所在位置主要在細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。在本說明書中，某多核苷酸在Thl7細(xì)胞中“特異性地表達(dá)的”是指相比在Thl7細(xì)胞以外的細(xì)胞的該多核苷酸的表達(dá)，在Thl7細(xì)胞內(nèi)的該多核苷酸的表達(dá)顯著地高。具體而言是指，在Thl7細(xì)胞內(nèi)該多核苷酸的表達(dá)是在Thl7細(xì)胞以外的細(xì)胞的該多核苷酸的表達(dá)的約2倍以上。優(yōu)選是，在Thl7細(xì)胞內(nèi)的該多核苷酸的表達(dá)是在Thl7細(xì)胞以外的輔助性T細(xì)胞(Thl細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th22細(xì)胞及Treg細(xì)胞)的該多核苷酸的表達(dá)的約2倍以上。本發(fā)明的多核苷酸標(biāo)記物的堿基序列已經(jīng)公知。這些可知，例如Unigene (由美國國立醫(yī)學(xué)圖書館的國立生物信息中心(National Center for Biotechnology Information =NCBI)提供的數(shù)據(jù)庫)。本發(fā)明的多核苷酸標(biāo)記物的堿基序列的Unigene編碼示于表9。在本說明書中，多核苷酸的“變異型”是指導(dǎo)入了不變化由上述的基因編碼的蛋白質(zhì)的性質(zhì)的變異的多核苷酸。這樣的變異包括在上述的基因的堿基序列中的1或多個核苷酸的缺失或取代、或者1或多個核苷酸的附加。在本說明書中，多核苷酸的“片段”是指連續(xù)具有上述的基因的堿基序列之一部分，可與后述的人Thl7細(xì)胞檢測用核酸探針特異性地雜交的長度的多核苷酸。作為本發(fā)明的人Thl7細(xì)胞檢測用多核苷酸標(biāo)記物的多核苷酸的變異型與上述的各基因的堿基序列有通常至少80%、優(yōu)選是至少85%、更優(yōu)選是至少90%、特別更優(yōu)選是至少95%的序列相同性。在本說明書中，堿基序列及氨基酸序列的序列相同性是將BLASTN、BLASTP、BLASTX 或TBLASTN(例如，可從http://www. ncbi.nlm.nih. gov利用)用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定使用而算出。上述的多核苷酸標(biāo)記物是DNA或RNA之任何也可，是上述的基因本身(DNA)、mRNA、 cDNA或cRNA之任何也可。通過檢測至少1種由上述的基因編碼的蛋白質(zhì)，也可檢測人Thl7細(xì)胞。從而，作為由至少1種上述的基因編碼的蛋白質(zhì)、其功能上同等的變異型及片段的人Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物也是本發(fā)明之一。優(yōu)選是，上述的蛋白質(zhì)是由選自下列的至少1種基因編碼的蛋白質(zhì)
由下列組成的編碼膜蛋白質(zhì)的基因ADAM12、ATP6V0A4、ATP9A、BVES, C5orf40、CDH4、DI02、GPR34、L1CAM、MCAM, PTPRM、SHR00M2、ΤΜΕΜ163、UPK1B、DRD2、 PGBD5 (L0C100134440)、0DZ4、SLC6A15、AKAP12、C9orfl25、P0PDC3 及 UNC13C ；由下列組成的編碼分泌蛋白質(zhì)的基因PC0LCE2、PNOC, TGFBI及ILlA ；以及由下列組成的編碼細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的基因BHLHE22、PPARG、SIM1及SNAI2。更優(yōu)選是，上述的蛋白質(zhì)是由選自下列的至少1種基因編碼的膜蛋白質(zhì)GPR34、 MCAM 及 PTPRM。這樣的蛋白質(zhì)標(biāo)記物的氨基酸序列可基于從上述的Unigene等得到的多核苷酸標(biāo)記物的堿基序列知。另外，也可從由如上所述的NCBI提供的數(shù)據(jù)庫知。對于本發(fā)明的人 Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物的氨基酸序列的NCBI的編碼編號示于表9。上述的人Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物是由至少1種上述的基因編碼的蛋白質(zhì)、 其功能上同等的變異型及片段。在本說明書中，蛋白質(zhì)的“功能上同等的變異型”是指導(dǎo)入了不變化蛋白質(zhì)的功能的變異的蛋白質(zhì)。這樣的變異包括在公知的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中1或多個氨基酸的缺失或取代、或者1或多個氨基酸的附加。在本說明書中，蛋白質(zhì)的“片段”是指連續(xù)具有由上述的基因編碼的蛋白質(zhì)或其功能上同等的變異型的氨基酸序列之一部分，可與后述的人Thl7細(xì)胞檢測用的核酸適體、抗體、配體或受體特異性地結(jié)合的蛋白質(zhì)。作為本發(fā)明的人Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物的蛋白質(zhì)的功能上同等的變異型與由上述的基因編碼的蛋白質(zhì)的公知的氨基酸序列有通常至少80%、優(yōu)選是至少85%、更優(yōu)選是至少90%、特別更優(yōu)選是至少95%的序列相同性?？膳c本發(fā)明的人Thl7細(xì)胞檢測用多核苷酸標(biāo)記物特異性地雜交的分子由于可為了檢測該標(biāo)記物而使用，所以作為人Thl7細(xì)胞檢測用探針有用。該探針是可與上述的多核苷酸標(biāo)記物特異性地雜交的DNA、RNA等的核酸探針、肽探針之任何也可。人Thl7細(xì)胞檢測用探針而言，優(yōu)選為用于檢測多核苷酸標(biāo)記物的核酸探針、特別是DNA探針。在本說明書中，“可特異性地雜交”是指在嚴(yán)格的條件下可與目標(biāo)核酸分子(上述的多核苷酸標(biāo)記物)雜交。在本說明書中，嚴(yán)格的條件是指人Thl7細(xì)胞檢測用探針可與目標(biāo)多核苷酸標(biāo)記物，以相比該目標(biāo)多核苷酸標(biāo)記物以外的多核苷酸更可檢測的大的程度(例如，超背景的至少2倍)雜交的條件。再有，嚴(yán)格的條件通常是序列依賴性的，然后在各種的環(huán)境中不同。一般而言，嚴(yán)格的條件選擇為相比在規(guī)定的離子強度及PH的特定的序列的熱的熔點(thermal melting point)更低約5°C。此Tm是(以規(guī)定的離子強度、pH及核酸組成之下)與上述的目標(biāo)序列互補的探針的50%平衡而雜交的溫度。這樣的條件是以往公知的多核苷酸的雜交法、例如PCR法、微陣列法、DNA印跡法等中，在多核苷酸的雜交中使用的條件也可。具體而言，pH 7. 0 9. 0而，鹽濃度相比約1. 5M Na離子更低，更具體而言，可例舉是約0.01 l.OMNa離子濃度(或者其他鹽)，至少約30°C的條件。例如，在微陣列法中的嚴(yán)格的條件包括于37°C在50%甲酰胺、IM NaClU % SDS中的雜交、及在60 65°C的在0. IXSSC中的清洗。另外，在PCR法中的嚴(yán)格的條件可例舉pH7 9、0. 01 0. IM的Tris HC1、0.05 0. 15MK離子濃度(或者其他鹽)、至少約55°C的條件。上述的人Thl7細(xì)胞檢測用核酸探針的序列可由本領(lǐng)域技術(shù)人員適宜確定為，基
于所述技術(shù)常識及上述的多核苷酸標(biāo)記物的序列，可與上述的多核苷酸標(biāo)記物特異性地雜 、-父。上述的人Thl7細(xì)胞檢測用核酸探針可使用例如，從一般而言利用可能的引物設(shè)計軟件(例如，可禾1J 用 Primer3 (http//frodo. wi. mit. edu/cgi-bin/primer3/primer3. cgi)或DNASIS Pro(日立軟件工程股份公司))來確定。上述的人Thl7細(xì)胞檢測用核酸探針可通過所述技術(shù)中公知的多核苷酸的合成方法來制備。上述的人Thl7細(xì)胞檢測用核酸探針用所述技術(shù)中通常使用的標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記也可。通過使用標(biāo)記的該探針，可簡便地進(jìn)行人Thl7細(xì)胞檢測用多核苷酸標(biāo)記物的檢測、即人Thl7細(xì)胞的檢測。上述的標(biāo)記物質(zhì)可為32P等的放射性同位素、熒光素等的熒光物質(zhì)、堿性磷酸酶、 辣根過氧化物酶等的酶、生物素等的所述技術(shù)中通常使用的標(biāo)記物質(zhì)。上述的人Thl7細(xì)胞檢測用核酸探針可通過使用僅1種，或者將多種組合使用而特異性地檢測人Thl7細(xì)胞。例如，通過使用所述技術(shù)中公知的方法將該探針1種以上固定化到基板上，可制備用于檢測人Thl7細(xì)胞檢測用多核苷酸標(biāo)記物的DNA芯片或微陣列。上述的人Thl7細(xì)胞檢測用核酸探針可為用于通過例如PCR法等的核酸擴(kuò)增法擴(kuò)增上述的多核苷酸標(biāo)記物的2種以上的引物的組。可與本發(fā)明的人Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物特異性地結(jié)合的分子由于可為了檢測該標(biāo)記物而使用，所以在檢測人Thl7細(xì)胞中有用。這樣的分子也可為可與人Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物特異性地結(jié)合的DNA、RNA等的核酸適體、抗體、配體或受體等之任何， 但優(yōu)選是抗體。另外，在人Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物是酶時，通過使該酶與底物作用而發(fā)色、發(fā)光、發(fā)生熒光等而可檢測該標(biāo)記物。上述的人Thl7細(xì)胞檢測用抗體可例如，通過如下所述的以往公知的順序來制備。 基于上述的人Thl7細(xì)胞檢測用多核苷酸標(biāo)記物的堿基序列或蛋白質(zhì)標(biāo)記物的氨基酸序列，將編碼有蛋白質(zhì)標(biāo)記物的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA分子導(dǎo)入適宜的表達(dá)載體。將得到的表達(dá)載體導(dǎo)入適宜的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，得到目的的蛋白質(zhì)。將得到的蛋白質(zhì)純化而作為免疫原，使用免疫原和根據(jù)需要佐劑，免疫適宜的哺乳動物、例如大鼠、小鼠等。從免疫的動物的脾臟細(xì)胞等，通過篩選選擇產(chǎn)生針對目的的免疫原的抗體的抗體產(chǎn)生細(xì)胞。將得到的抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而得雜交瘤，通過將其篩選，可得產(chǎn)生與由上述的基因編碼的蛋白質(zhì)有特異性結(jié)合性的抗體的產(chǎn)生抗體的雜交瘤。通過培養(yǎng)得到的抗體產(chǎn)生雜交瘤，可得目的的抗體。可為了檢測上述的人Thl7細(xì)胞而使用的核酸適體可通過例如，如下所述的以往公知的順序來制備。通過公知的方法制成有隨機的核酸的堿基序列的核酸庫，通過試管內(nèi)進(jìn)化法(SELEX法)等可選擇可與目標(biāo)的蛋白質(zhì)(上述的蛋白質(zhì)標(biāo)記物)特異性地結(jié)合的適體。可與上述的人Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物特異性地結(jié)合的分子也可通過所述技術(shù)中通常使用的標(biāo)記物質(zhì)來標(biāo)記。通過使用標(biāo)記的人Thl7細(xì)胞檢測用抗體，可簡便地進(jìn)行人Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物的檢測、即人Thl7細(xì)胞的檢測。上述的標(biāo)記物質(zhì)可為32P等的放射性同位素、熒光素等的熒光物質(zhì)、堿性磷酸酶、 辣根過氧化物酶等的酶、生物素等的所述技術(shù)中通常使用的標(biāo)記物質(zhì)。通過在包含人來源的細(xì)胞的樣品中，檢測至少1種人Thl7細(xì)胞檢測用多核苷酸標(biāo)記物或至少1種人Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物的存在而檢測人Thl7細(xì)胞的方法也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在此方法中，從提高檢測靈敏度的觀點，優(yōu)選為檢測多種人Thl7細(xì)胞檢測用多核苷酸標(biāo)記物或人Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物的存在。在本發(fā)明的檢測人Thl7細(xì)胞的方法中，包含人來源的細(xì)胞的樣品而言，可例舉包括從人采集的活體樣品或人工地培養(yǎng)的人細(xì)胞的樣品。活體樣品而言，可例舉血液、組織、 關(guān)節(jié)液、腦脊髓液、胸水、腹水等。對檢測人Thl7細(xì)胞檢測用多核苷酸標(biāo)記物的存在的方法某實施方式進(jìn)行說明。首先，從包含人來源的細(xì)胞的樣品，通過使用苯酚提取及乙醇沉淀、市售的DNA提取試劑盒等的所述技術(shù)中公知的方法來提取核酸(DNA或RNA)。接下來，檢測得到的核酸樣品中的上述的多核苷酸標(biāo)記物的存在。在此檢測中，優(yōu)選為使用上述的人Thl7細(xì)胞檢測用核酸探針。特別是，通過PCR法、RT-PCR法、實時PCR 法、LAMP (環(huán)-介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增)法等的核酸擴(kuò)增法檢測上述的多核苷酸標(biāo)記物的存在時， 人Thl7細(xì)胞檢測用核酸探針而言，優(yōu)選為使用用于通過核酸擴(kuò)增法擴(kuò)增該多核苷酸標(biāo)記物的引物組。另外，人Thl7細(xì)胞檢測用多核苷酸標(biāo)記物的存在也可通過如Southern雜交、 Northern雜交、FISH(熒光原位雜交)一樣的雜交法、DNA芯片或微陣列法等的所述技術(shù)中公知的方法來檢測。這些的方法在上述的嚴(yán)格的條件下進(jìn)行，通過檢測上述的標(biāo)記物質(zhì)等檢測上述的人Thl7細(xì)胞檢測用核酸探針形成雜交體，從而可檢測多核苷酸標(biāo)記物的存在。接下來，對檢測人Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物的存在的方法的某實施方式進(jìn)行說明。例如，當(dāng)作為檢測對象的人Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物是在細(xì)胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)時，使用所述技術(shù)中公知的方法，從包含人來源細(xì)胞的樣品提取蛋白質(zhì)。從該樣品的蛋白質(zhì)的提取可通過超聲波的細(xì)胞的破碎、使用細(xì)胞可溶化液的可溶化等的公知的方法來進(jìn)行。然后，使用與該蛋白質(zhì)標(biāo)記物特異性地結(jié)合的分子，可檢測得到的蛋白質(zhì)提取液中的上述的蛋白質(zhì)標(biāo)記物。具體而言，人Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物可通過ELISA法、蛋白印記法等的所述技術(shù)中公知的方法來檢測。在檢測中，與上述的蛋白質(zhì)標(biāo)記物特異性地結(jié)合的分子優(yōu)選為上述的核酸適體、抗體、配體或受體、優(yōu)選是使用上述的人Thl7細(xì)胞檢測用抗體。例如，當(dāng)作為檢測對象的人Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物是分泌蛋白質(zhì)時，使用與該蛋白質(zhì)標(biāo)記物特異性地結(jié)合的分子，可檢測分泌到包含上述細(xì)胞的樣品中的蛋白質(zhì)標(biāo)記物。
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另外，從包含人來源的細(xì)胞的樣品采集細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)，使用抗CD3抗體、抗 CD28抗體、伴刀豆球蛋白A、PHA(植物凝血素)、PMA(肉豆蔻酰乙酸佛波酯)、離子霉素等刺激采集的細(xì)胞之后，使用與蛋白質(zhì)標(biāo)記物特異性地結(jié)合的分子，可檢測分泌的蛋白質(zhì)標(biāo)記物。具體而言，人Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物可通過ELISA法、蛋白印記法等的所述技術(shù)中公知的方法來檢測。在檢測中，與上述的蛋白質(zhì)標(biāo)記物特異性地結(jié)合的分子優(yōu)選為上述的核酸適體、抗體、配體或受體、優(yōu)選是使用上述的人Thl7細(xì)胞檢測用抗體。例如，當(dāng)作為檢測對象的人Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物是在細(xì)胞的表面存在的蛋白質(zhì)時，使用與該蛋白質(zhì)標(biāo)記物特異性地結(jié)合的分子，可檢測在包含人來源的細(xì)胞的樣品中的細(xì)胞的表面存在的蛋白質(zhì)標(biāo)記物。另外，從包含人來源的細(xì)胞的樣品采集細(xì)胞的膜級分，使用與上述的蛋白質(zhì)標(biāo)記物特異性地結(jié)合的分子，可檢測得到的膜級分中的該蛋白質(zhì)標(biāo)記物。具體而言，可通過基于 ELISA法、蛋白印記法、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)的方法等的所述技術(shù)中公知的方法來檢測。在檢測中，與上述的蛋白質(zhì)標(biāo)記物特異性地結(jié)合的分子優(yōu)選為上述的核酸適體、抗體、配體或受體、優(yōu)選是使用上述的人Thl7細(xì)胞檢測用抗體。例如，通過FCM檢測人Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物時，可通過如下所述的順序進(jìn)行檢測。首先，使包含人來源的細(xì)胞的樣品與用適宜的標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的上述的人Thl7細(xì)胞檢測用抗體接觸。只要存在，人Thl7細(xì)胞與此標(biāo)記的抗體在細(xì)胞表面結(jié)合。從而，通過使包含與標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞的樣品通過流式細(xì)胞儀，可檢測人Thl7細(xì)胞。另外，根據(jù)需要，也可將與標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合的人Thl7細(xì)胞使用細(xì)胞分選儀來瓣別-分離。這樣的基于FCM的方法被本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，反應(yīng)的條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員適宜確定?？稍谏鲜龅谋景l(fā)明的檢測人Thl7細(xì)胞的方法中使用的，人Thl7細(xì)胞檢測用試劑也是本發(fā)明之一。那樣的試劑包含選自下列的至少1種與上述的人Thl7細(xì)胞檢測用多核苷酸標(biāo)記物特異性地雜交的核酸探針、以及與上述的人Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物特異性地結(jié)合的核酸適體、抗體、配體及受體。
實施例以下通過實施例詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實施例的限制。實施例1在人末梢血來源培養(yǎng)Thl7細(xì)胞中的高表達(dá)基因的解析1.從人末梢血的Thl、Th2、Treg及Thl7細(xì)胞的單離(1)從人末梢血的Thl、Th2及Thl7細(xì)胞的單離從健康的成人的末梢血得到的血沉棕黃層覆蓋到Ficoll-paque plus溶液(GE HEALTHCARE Bioscience股份公司)上，通過將其離心分離，得到單核細(xì)胞級分。接下來，使用結(jié)合抗⑶4抗體的磁珠(Miltenyi Biotec公司)，從上述的級分粗純化⑶4陽性細(xì)胞。將如此得到的CD4陽性細(xì)胞使用表1所示的熒光標(biāo)記抗體染色之后，使用細(xì)胞分選儀(FACS Aria =Becton Dickinson公司)，分離ThU Th2及Thl7的各細(xì)胞。另外，分離的選通如表2所示進(jìn)行。表1
權(quán)利要求
1.人的產(chǎn)生IL-17的輔助性T細(xì)胞的檢測用多核苷酸標(biāo)記物，其為有選自下列的至少 1種基因的堿基序列的多核苷酸、其變異型及片段由下列組成的編碼膜蛋白質(zhì)的基因ADAM12、ANKSlB、ATP6V0A4、ATP9A、BVES、C5orf40、 CDH4、DI02、DMD、GPR34、IRS2、KCNE3、L1CAM、MCAM、MFAP3L、MY07A、PTPRM、SHR00M2、SLC16A4、 SLC02B1、TANC2、TJPU TMEM163、TNS3、UPK1B、WDFY3、DRD2、GJCU PGBD5 (L0C100134440)、 MS4A7、0DZ4、PHKAl、RGSl、SHB, SLC44A3、SLC6A15、SYNGR3、ΑΚΑΡ12、C9orfl25、DPY19L2、 HRH4、MUC20、P0PDC3、SORBSl、TANCl、ΤΜΕΜ44 及 UNC13C ；由下列組成的編碼分泌蛋白質(zhì)的基因CXCLl3、PC0LCE2、PNOC、SMPDL3A、TGFBI、 C17orf99、EBI3、ILlA 及 WNT3 ；由下列組成的編碼細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的基因BCAT1、BHLHE22、C13orf 18 (L0C728970)、 CA2、CCDC3、CDSl、CHNl、CLIC5 (L0C100131610)、CTSH、CYP7B1、DAPK2、DMRTl、DSE、FBXLl7、 FBXL21、FH0D3、H2AFY2、HLX、IRAK3、MACCl、MAML3、MYOlO、0TUB2、PAPSS2、PCBP3、PDE4DIP、 PLDl、PPARG, PTPNl3, RGS18、SIMl、SNAI2, S0X2、SPIREl、TBC1D12、TGM5、TMODl、TUBB6、 DDIT4L、DHRS9、ERC2、FERMT2、HHEX, HS3ST1、NR5A2、PHLDAl、RBM20、NINL、RTN2、SH3RF2、 TSHZ2、EML1、HIST1H2BC、MAP3K4、PDK4、RGS2 及 RGS20 ；由下列組成的基因:Clorfl06、C6orfl45、L0C401097、MAMLDU ZC3H12C、C12orf64、 C6orfl68、CAMSAPILl 及 MAGED4 (MAGED4B)、以及包含選自SEQ ID NO 147 151、157 162及167 174的至少一個堿基序列的基因。
2.權(quán)利要求1所述的人的產(chǎn)生IL-17的輔助性T細(xì)胞的檢測用多核苷酸標(biāo)記物，其中上述多核苷酸是有選自下列的至少1種基因的堿基序列的多核苷酸由下列組成的編碼膜蛋白質(zhì)的基因ADAM12、ATP6V0A4、ATP9A、BVES, C5orf40、CDH4、 DI02、GPR34、L1CAM、MCAM、PTPRM、SHR00M2、TMEM163、UPK1B、DRD2、PGBD5 (L0C100134440)、 0DZ4、SLC6A15、AKAP12、C9orfl25、P0PDC3 及 UNC13C ；由下列組成的編碼分泌蛋白質(zhì)的基因PC0LCE2、PNOC、TGFBI及ILlA ；以及由下列組成的編碼細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的基因BHLHE22、PPARG、SIM1及SNAI2。
3.人的產(chǎn)生IL-17的輔助性T細(xì)胞的檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物，其為由權(quán)利要求1所述的至少1種基因編碼的蛋白質(zhì)、其功能上同等的變異型及片段。
4.權(quán)利要求3所述的人的產(chǎn)生IL-17的輔助性T細(xì)胞的檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物，其中上述蛋白質(zhì)是由選自下列的至少1種基因編碼的蛋白質(zhì)由下列組成的編碼膜蛋白質(zhì)的基因ADAM12、ATP6V0A4、ATP9A、BVES, C5orf40、CDH4、 DI02、GPR34、L1CAM、MCAM、PTPRM、SHR00M2、TMEM163、UPK1B、DRD2、PGBD5 (L0C100134440)、 0DZ4、SLC6A15、AKAP12、C9orfl25、P0PDC3 及 UNC13C ；由下列組成的編碼分泌蛋白質(zhì)的基因PC0LCE2、PNOC、TGFBI及ILlA ；以及由下列組成的編碼細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的基因BHLHE22、PPARG、SIM1及SNAI2。
5.權(quán)利要求4所述的人的產(chǎn)生IL-17的輔助性T細(xì)胞的檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物，其中上述蛋白質(zhì)是由選自下列的至少1種基因編碼的膜蛋白質(zhì)GPR34、MCAM及PTPRM。
6.檢測人的產(chǎn)生IL-17的輔助性T細(xì)胞的方法，其包括在包含人來源的細(xì)胞的樣品中，檢測至少1種權(quán)利要求1所述的Thl7細(xì)胞檢測用多核苷酸標(biāo)記物或至少1種權(quán)利要求3所述的Thl7細(xì)胞檢測用蛋白質(zhì)標(biāo)記物的存在。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其使用與上述多核苷酸標(biāo)記物特異性地雜交的核酸探針來檢測上述多核苷酸標(biāo)記物。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中上述核酸探針是用于將上述多核苷酸標(biāo)記物通過核酸擴(kuò)增法擴(kuò)增的引物組。
9.權(quán)利要求6所述的方法，其使用與上述蛋白質(zhì)標(biāo)記物特異性地結(jié)合的核酸適體、抗體、配體或受體來檢測上述多核苷酸標(biāo)記物。
10.人的產(chǎn)生IL-17的輔助性T細(xì)胞的檢測用試劑，其包含選自下列的至少1種 與權(quán)利要求1所述的多核苷酸標(biāo)記物特異性地雜交的核酸探針；及與權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)標(biāo)記物特異性地結(jié)合的核酸適體、抗體、配體或受體。
全文摘要
本發(fā)明涉及可特異性地檢測人的產(chǎn)生IL-17的輔助性T細(xì)胞(人Th17細(xì)胞)的標(biāo)記物、特異性地檢測人Th17細(xì)胞的方法及人Th17細(xì)胞檢測用試劑。
文檔編號C12Q1/68GK102482667SQ20108003987
公開日2012年5月30日 申請日期2010年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月29日
發(fā)明者倉田寬一, 岡澤貴裕, 宇賀均, 宮本佳昭, 柳田匡俊, 池田昌郁, 田中聰, 門脅正和 申請人:希森美康株式會社