專(zhuān)利名稱(chēng)：：廣泛反應(yīng)性的dr限制性表位的鑒定的制作方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本發(fā)明申請(qǐng)為1997年1月23日提交的USSN60/036,713和1997年2月7日提交的USSN60/037,432的部分繼續(xù)申請(qǐng)，這兩篇申請(qǐng)都在納入本文為參考。
背景技術(shù)：
：輔助(性)T淋巴細(xì)胞(HTL)在對(duì)病原體的免疫中發(fā)揮著多種重要功能。首先，它們輔助誘導(dǎo)CTL和抗體應(yīng)答。通過(guò)直接接觸和通過(guò)分泌淋巴因子(如IL2和IL4)，HTL支持和促進(jìn)了T細(xì)胞和B細(xì)胞前體細(xì)胞的擴(kuò)張和分化成效應(yīng)細(xì)胞。此外，HTL可能自身也是效應(yīng)細(xì)胞，這種活性也是由直接細(xì)胞接觸和分泌淋巴因子(如IFN-γ和TNFα)所介導(dǎo)的。已表明，在腫瘤以及病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)和真菌感染的情況下，HTL有直接的效應(yīng)器活性。HTL識(shí)別II類(lèi)MHC分子與抗原肽(通常長(zhǎng)10-20個(gè)殘基，平均大小為13-16個(gè)氨基酸)形成的復(fù)合物。肽-II類(lèi)(分子)之間的相互作用在結(jié)構(gòu)和功能水平上已被詳細(xì)分析，從而提出了對(duì)人和小鼠的II類(lèi)MHC分子的特異性肽基序。在過(guò)去數(shù)年內(nèi)，以表位為基礎(chǔ)的疫苗作為開(kāi)發(fā)新的預(yù)防疫苗和免疫治療策略的一種可能手段，已經(jīng)受到了很大的關(guān)注。選擇合適的T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，可使免疫系統(tǒng)集中針對(duì)那些以序列高可變性為特征的病原體(如HIV、HCV和瘧疾)的保守表位。此外，使免疫應(yīng)答反應(yīng)集中針對(duì)選定的決定簇，在各種慢性病毒疾病和癌癥中可能有價(jià)值，其中針對(duì)優(yōu)勢(shì)免疫表位的T細(xì)胞可能已被滅活，而針對(duì)亞優(yōu)勢(shì)(subdominant)表位特異的T細(xì)胞可能逃逸T細(xì)胞耐受性。使用以表位為基礎(chǔ)的疫苗還可避開(kāi)“抑制性”T細(xì)胞決定簇，這些決定簇會(huì)在需要TH1應(yīng)答的情況下卻誘導(dǎo)TH2應(yīng)答，或反之亦然。最后，以表位為基礎(chǔ)的疫苗還能提供一種機(jī)會(huì)，即在疫苗構(gòu)建物中包含經(jīng)基因工程改造的表位以調(diào)節(jié)其效力或是增加MHC結(jié)合親和力，或者是改變其TCR接觸殘基，或二者兼而有之。包含完全人工合成的非天然或遺傳上與病原體無(wú)關(guān)的表位(例如衍生自TT的“通用”表位)，也提供了一種調(diào)節(jié)HTL應(yīng)答向TH1或TH2表型(轉(zhuǎn)移)的可能手段。一旦確定了合適的表位決定簇，它們可以被歸類(lèi)并通過(guò)各種不同方法，包括脂肽、病毒輸送載體、病毒顆?；蚝铣傻念w粒、裸cDNA或顆粒吸附的cDNA來(lái)輸送。然而，在確定合適的表位之前，一個(gè)主要障礙必須被克服，即人群中表達(dá)的MHC分子的極高度多態(tài)性。事實(shí)上，已經(jīng)鑒定了200種以上不同類(lèi)型的I類(lèi)和II類(lèi)HLA分子。已表明，在I類(lèi)HLA分子的情況下，已鑒別出能夠結(jié)合數(shù)種不同I類(lèi)HLA分子的肽。事實(shí)上，已知的I類(lèi)HLA分子60％以上可被歸入4個(gè)大的HLA超型，其特征是具有類(lèi)似的肽結(jié)合特異性(HLA超基序)。對(duì)于III類(lèi)分子，也已知道，的確存在能夠結(jié)合多種HLA型并且在不同HLA分子情況下具有免疫原性的肽。然而，到目前為止，還沒(méi)有開(kāi)發(fā)出一種通用的鑒別它們的方法，這可能至少反映了這樣的事實(shí)即定量的DR結(jié)合試驗(yàn)是費(fèi)力的事情而且大量的等位基因必須被考慮在內(nèi)。本發(fā)明針對(duì)這些及其他需求。發(fā)明概述本發(fā)明(至少部分)根據(jù)的是世界人群的各種代表性DR分子的特異性基序的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證以及分析系統(tǒng)。還描述了它們?cè)阼b別廣泛簡(jiǎn)并的HLAII類(lèi)結(jié)合肽方面的應(yīng)用。定義在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“肽”與“寡肽”可互換使用，指一系列互相連接的殘基，通常為L(zhǎng)-氨基酸，通常是通過(guò)相鄰氨基酸的α-氨基和羰基之間的肽鍵一個(gè)與另一個(gè)相連。本發(fā)明的寡肽長(zhǎng)度小于約50個(gè)殘基，通常為10-30個(gè)殘基，更通常為12-25個(gè)殘基，最好為15-20個(gè)殘基。“免疫原(性)肽”是含有等位基因特異性基序的肽，因而該肽會(huì)與MHC分子結(jié)合并誘導(dǎo)HTL應(yīng)答。本發(fā)明的免疫原性肽能與適當(dāng)?shù)腍LA分子結(jié)合并誘導(dǎo)針對(duì)衍生出該免疫原性肽的抗原的HTL應(yīng)答?！氨Ｊ匦詺埢笔钦紦?jù)肽基序中特定位點(diǎn)的保守氨基酸，通常是位于MHC結(jié)構(gòu)提供的與免疫原性肽的接觸點(diǎn)處的殘基。在限定長(zhǎng)度的肽中有1-3個(gè)(通常2個(gè))保守性殘基，它們確定了免疫原性肽的基序。這些殘基通常與肽結(jié)合溝槽(groove)緊密接觸，殘基的側(cè)鏈被埋在溝槽自身的特異空穴(pocket)中術(shù)語(yǔ)“基序”指確定長(zhǎng)度(通常為約8-11氨基酸)的肽上的殘基(序列)模式，這種模式可被某特定的MHC等位基因(產(chǎn)物)識(shí)別。術(shù)語(yǔ)“超基序”指這樣的基序，當(dāng)它存在于免疫原性肽中時(shí)，可使該肽能與一種以上的HLA抗原結(jié)合。超基序能被至少一種，較佳地至少2種，更佳地至少3種，最佳地3種以上在人群中廣泛分布的HLA等位基因(產(chǎn)物)所識(shí)別。詞語(yǔ)“分離的”或“生物純的”指材料大致或基本上不含有那些在自然狀態(tài)下常與其伴隨的成分。因此，本發(fā)明的肽不含有在原來(lái)環(huán)境中通常與其相伴的物質(zhì)，即抗原呈遞細(xì)胞上的MHCI分子。即使將蛋白質(zhì)分離至均質(zhì)或主要條帶，但仍有5-10％與所需蛋白質(zhì)一起純化的天然蛋白質(zhì)痕量污染物。本發(fā)明的分離肽不含有這種內(nèi)源性的同時(shí)純化的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“殘基”指通過(guò)酰胺鍵或類(lèi)酰胺鍵摻入寡肽的氨基酸或類(lèi)氨基酸。附圖簡(jiǎn)述圖1是當(dāng)20種天然存在氨基酸中的每種氨基酸占據(jù)了相對(duì)于P1-P6主錨著位點(diǎn)的某個(gè)特定位置時(shí)，對(duì)DR4w4結(jié)合能力的正面或負(fù)面影響圖。圖2是當(dāng)20種天然存在氨基酸中的每種氨基酸占據(jù)了相對(duì)于P1-P6主錨著位點(diǎn)的某個(gè)特定位置時(shí)，對(duì)DR1結(jié)合能力的正面或負(fù)面影響圖。圖3是當(dāng)20種天然存在氨基酸中的每種氨基酸占據(jù)了相對(duì)于P1-P6主錨著位點(diǎn)的某個(gè)特定位置時(shí)，對(duì)DR7結(jié)合能力的正面或負(fù)面影響圖。優(yōu)選例的描述本發(fā)明涉及用于預(yù)防、治療或診斷大量病癥(如病毒、真菌、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)性疾病和癌癥)的組合物和方法。具體地講，本發(fā)明提供了能與選定的II類(lèi)主組織相容性復(fù)合體(MHC)分子結(jié)合并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的新穎的肽。肽與MHC分子的結(jié)合是由MHC分子的等位基因類(lèi)型和肽的氨基酸序列所決定的。MHCI類(lèi)結(jié)合肽通常在其序列中含有2個(gè)保守(“錨著”)殘基，該殘基與MHC分子中對(duì)應(yīng)的結(jié)合穴相互作用。與人MHC(HLA，組織相容性白細(xì)胞抗原)的數(shù)種等位基因形式結(jié)合而所需的錨著殘基的特定組合(通常稱(chēng)為“MHC基序”)，在國(guó)際申請(qǐng)WO94/03205和WO94/20127中有描述。明確了特異性的MHC基序，使得人們可以根據(jù)各蛋白質(zhì)的氨基酸序列來(lái)預(yù)測(cè)哪個(gè)肽對(duì)CTL有潛在的免疫原性。這些申請(qǐng)描述了免疫原性肽制備方法以及在疾病治療中的用途。此處描述的肽還可作為輔助性T細(xì)胞肽與誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的肽組合使用。這在WO95/07077有描述。出于預(yù)防和/或治療的目的，可將本發(fā)明的DR結(jié)合肽或其編碼核酸用于哺乳動(dòng)物，尤其是人。當(dāng)本發(fā)明的肽用作輔助性肽時(shí)，DR肽可用于加強(qiáng)針對(duì)與肽一起施用的其它免疫原的免疫應(yīng)答。例如，本發(fā)明肽與誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的肽的混合物，可用于治療和/或預(yù)防病毒感染和癌癥?；蛘?，可使用能誘導(dǎo)抗體應(yīng)答的免疫原。可用DR肽和其它免疫原構(gòu)成的免疫原性混合物來(lái)治療的疾病的例子包括前列腺癌、乙型肝炎、丙型肝炎、AIDS、腎癌、宮頸癌、淋巴瘤、CMV和尖銳濕疣。DR結(jié)合肽或其編碼核酸，還可用于治療涉及T細(xì)胞不良反應(yīng)性的各種疾病?？捎肈R結(jié)合肽治療的疾病的例子包括自身免疫疾病(如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化和重癥肌無(wú)力)、同種移植排斥反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)(如花粉過(guò)敏)、萊姆病、肝炎、LCMV、鏈球菌引起的心內(nèi)膜炎、或腎小球性腎炎，以及食物過(guò)敏。用于治療時(shí)，本發(fā)明的免疫原性組合物或者DR結(jié)合肽或其編碼核酸用于已經(jīng)患有癌癥、自身免疫疾病或已被有關(guān)病毒感染的個(gè)體?？蓡为?dú)使用DR結(jié)合肽或免疫原性復(fù)合體、或結(jié)合其它療法(只要合適)，來(lái)對(duì)疾病潛伏期或發(fā)作期的病人進(jìn)行治療。用于治療時(shí)，給予病人含有免疫原性成分的組合物，其用量足以引發(fā)對(duì)病毒或腫瘤抗原的有效免疫應(yīng)答，從而治愈或至少部分抑制癥狀和/或并發(fā)癥。與此類(lèi)似，可給予病人足量的含有DR結(jié)合肽的組合物，以治愈或至少部分抑制疾病癥狀及其并發(fā)癥。足以達(dá)到上述效能的劑量被定義為“治療有效劑量”。對(duì)于此用途而言的有效量將取決于例如肽組份、給藥方式、接受治療的疾病病期及嚴(yán)重性、病人的體重和總體健康狀況、以及開(kāi)方醫(yī)師的判斷。本發(fā)明的免疫原性組合物的治療有效量，對(duì)于初次免疫(這是對(duì)治療和預(yù)防性給藥而言)一般范圍約為1.0μg至10,000μg肽/70kg病人，通常為100-8000微克，較佳地為200-6000微克。隨后數(shù)周至數(shù)月內(nèi)的加強(qiáng)免疫方案中，所用的加強(qiáng)劑量約為1.0μg至1000μg肽，這取決于病人的應(yīng)答和狀況，這可通過(guò)測(cè)定病人血液中特異性的免疫原活性而確定。必須記住，本發(fā)明的組合物通?？捎糜诩膊?yán)重期，即危及生命或?qū)ι袧撛谕{的情況。在這種情況下，鑒于本復(fù)合物的外源物質(zhì)極少和相對(duì)無(wú)毒的性質(zhì)，因此給予大大過(guò)量的這些組合物是可能的并且治療醫(yī)師也許會(huì)認(rèn)為是需要的。用于預(yù)防時(shí)，應(yīng)施用于高危人群。例如，通過(guò)預(yù)防性地施用本發(fā)明的組合物，從而增強(qiáng)免疫力，可以起保護(hù)作用以免患瘧疾、肝炎或AIDS病。治療性施用，必須在疾病出現(xiàn)首次癥狀，或作出診斷或手術(shù)切除腫瘤后，或剛確診急性感染后就開(kāi)始。這之后是給予加強(qiáng)劑量直到至少癥狀顯著緩解為止，并再維持一段時(shí)間。在慢性感染中，可能需要在加強(qiáng)劑量前給予負(fù)荷劑量(loadingdose)。用本發(fā)明組合物治療受感染個(gè)體，可以促進(jìn)急性感染個(gè)體中感染的消除。對(duì)那些易于(或預(yù)先有傾向)發(fā)展成慢性感染的個(gè)體，該組合物特別適用于防止急性感染發(fā)展成慢性感染的治療方法。例如，如本文所述，在感染之前或之中診斷出某些易感個(gè)體，那么就可以給他們服用該組合物，從而最大程度降低給更大群體用藥的需求。肽混合物或復(fù)合物可用于治療慢性感染并刺激免疫系統(tǒng)殺滅攜帶者體內(nèi)被病毒感染的細(xì)胞。重要的是所提供的制劑中的免疫加強(qiáng)肽的數(shù)量和給藥方式應(yīng)足以有效激發(fā)細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)。所以，對(duì)于慢性感染的治療，代表性劑量的范圍是70kg的病人每劑約為1.0μg-5000μg，較佳地為5μg-1000μg?？赡茉诖藙┝棵庖吆箝L(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，需要按既定間隔時(shí)間(例如1至4周)給予加強(qiáng)劑量以有效地免疫個(gè)體。在慢性感染中，必須持續(xù)給藥直至臨床癥狀或?qū)嶒?yàn)室檢測(cè)表明病毒感染已消除或基本緩解，并再持續(xù)給藥一段時(shí)間。用于治療性或預(yù)防性處理的藥物組合物，可經(jīng)非腸胃道、表面、口服或局部給藥。通常，藥物組合物為非腸胃道給藥，例如靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或肌內(nèi)給藥。因?yàn)槭┯梅奖?，本發(fā)明的疫苗組合物特別適合于口服給藥。所以，本發(fā)明提供了非腸胃道給藥的組合物，它包括溶解或懸浮于可接受載體(較佳地是水性載體)中的肽或復(fù)合物溶液。有許多水性載體可供使用，例如水、緩沖水溶液、0.9％鹽水、0.3％甘氨酸、透明質(zhì)酸等。這些組合物可用常規(guī)的、熟知的滅菌技術(shù)進(jìn)行滅菌，或者也可過(guò)濾除菌。所得的水溶液可經(jīng)包裝供直接使用，或者凍干，凍干制劑在使用前與無(wú)菌溶液混合。組合物中還可以按照近似生理?xiàng)l件所需含有藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖液、滲透壓調(diào)節(jié)劑、濕潤(rùn)劑等，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、單月桂酸山梨酯、油酸三乙醇胺等。根據(jù)選定的特定給藥形式，藥物制劑中本發(fā)明的DR和/或CTL刺激肽的濃度變化范圍很寬，即按重量計(jì)可從不足約0.1％，通常為或至少約為2％，到多達(dá)20％至50％或更多，并且主要是根據(jù)液體體積、粘度等來(lái)選擇。本發(fā)明的肽和復(fù)合物還可以通過(guò)脂質(zhì)體來(lái)給藥，脂質(zhì)體可使復(fù)合物靶向特定組織(例如淋巴樣組織)或選擇性地靶向被感染細(xì)胞，并可延長(zhǎng)肽組合物的半衰期。脂質(zhì)體包括乳劑、泡沫、膠束、不溶性單層、液晶、磷脂分散系、薄片層(lamellarlayer)等。在這些制劑中，將欲輸送的肽摻入作為脂質(zhì)體的一部分，肽可以單用或與可結(jié)合于(例如)淋巴樣細(xì)胞中的主要受體的分子(例如結(jié)合CD45抗原的單克隆抗體)聯(lián)用，或與其它治療性或免疫原性組合物聯(lián)用。所以，內(nèi)含所需要的本發(fā)明的肽或復(fù)合物的脂質(zhì)體可被導(dǎo)向淋巴樣細(xì)胞部位，然后脂質(zhì)體在那里遞送了所選定的治療性/免疫原性肽組合物。用于本發(fā)明的脂質(zhì)體是由標(biāo)準(zhǔn)的成囊(vesicle-forming)脂類(lèi)所形成的，這些脂類(lèi)通常包括中性和帶負(fù)電的磷脂和甾醇，例如膽固醇。對(duì)脂類(lèi)的選擇通常要考慮到以下因素例如脂質(zhì)體的大小、酸不穩(wěn)定性和脂質(zhì)體在血液中的穩(wěn)定性。有許多方法可用于制備脂質(zhì)體，比如以下文獻(xiàn)中所述的方法如Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9，467(1980)；美國(guó)專(zhuān)利4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369，均納入本文作參考。為了靶向免疫細(xì)胞，可將配體摻入脂質(zhì)體，配體包括，例如對(duì)所需免疫系統(tǒng)細(xì)胞的細(xì)胞表面決定簇特異的抗體或其片段。含有肽或復(fù)合物的脂質(zhì)體懸液可通過(guò)靜脈內(nèi)、局部、體表面等途徑給藥，其劑量可根據(jù)(尤其是)給藥方式、被輸送的復(fù)合物和被治療疾病的病期而變化?；蛘?，可將編碼一種或多種DR肽，或編碼含有一個(gè)或多個(gè)CTL表位或抗體誘導(dǎo)表位的多肽的DNA或RNA，引入病人體內(nèi)以獲得針對(duì)該核酸所編碼的多肽的免疫應(yīng)答。Wolff等人，科學(xué)(Science)2471465-1468(1990)描述了使用核酸來(lái)導(dǎo)致核酸編碼基因的表達(dá)。這種用途還公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利No.5,580,859和5,589,466中。核酸還可用(例如)美國(guó)專(zhuān)利No.5,204,253中所述的轟擊輸送法(ballisticdelivery)給藥?？梢越o予只由DNA構(gòu)成的顆粒?；蛘撸珼NA可以粘附于顆粒(例如金顆粒)上。核酸還可以與陽(yáng)離子化合物(如陽(yáng)離子脂類(lèi))復(fù)合的形式來(lái)輸送。脂質(zhì)介導(dǎo)的基因輸送方法在(例如)下列文獻(xiàn)中有所描述WO96/18372；WO93/24640；Mannino和Gould-Fogerite(1988)BioTechniques6(7)；682-691；Rose的美國(guó)專(zhuān)利No.5,279,833；WO91/06309；和Felgner等人(1987)美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)847413-7414。本發(fā)明的肽還可由減毒病毒宿主(例如痘苗病毒和禽痘病毒)表達(dá)。這種方法涉及將痘苗病毒用作載體來(lái)表達(dá)編碼本發(fā)明肽的核苷酸序列。一旦被引入急性或慢性感染的宿主或被引入未感染宿主，重組的痘苗病毒就會(huì)表達(dá)免疫原性肽，從而引發(fā)宿主的CTL應(yīng)答。用于免疫方案中的痘苗載體和方法在例如美國(guó)專(zhuān)利4,722,848中有描述，該文獻(xiàn)納入本文作為參考。另一種載體是BCG(卡介苗)。BCG載體在Stover等人的文獻(xiàn)(Nature351456-460(1991))中有所描述，該文獻(xiàn)納入本文作為參考。根據(jù)上面的描述，本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員將顯然能找到各種各樣能用于治療或免疫接種的本發(fā)明肽的其他載體，如鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphi)載體等。一種給予編碼本發(fā)明肽的核酸的優(yōu)選方法，是使用編碼多個(gè)本發(fā)明的肽和CTL誘導(dǎo)肽的小基因構(gòu)建物。為了產(chǎn)生編碼所選定的DR表位和CTL表位的DNA序列以便在人類(lèi)細(xì)胞中表達(dá)，可以對(duì)該表位的氨基酸序列進(jìn)行反向翻譯。可利用人類(lèi)密碼子使用表來(lái)指導(dǎo)選擇每個(gè)氨基酸的密碼子。這些編碼表位的DNA序列可直接毗鄰連接，從而產(chǎn)生連續(xù)的多肽序列。為了優(yōu)化表達(dá)和/或免疫原性，可以在小基因設(shè)計(jì)中引入額外元件。能夠被反向翻譯并包含在小基因序列中的氨基酸序列例子包括本發(fā)明的DR肽、前導(dǎo)(信號(hào))序列、一種或多種CTL表位、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號(hào)。此外，通過(guò)包含合成的序列(如聚丙氨酸)或天然存在的與CTL表位相鄰的側(cè)翼序列，可以提高M(jìn)HC對(duì)CTL表位的呈遞作用。通過(guò)裝配編碼小基因的正鏈和負(fù)鏈的寡核苷酸，可以將小基因序列轉(zhuǎn)變成DNA。重疊寡核苷酸(長(zhǎng)30-100堿基)，可以在合適的條件下用熟知的技術(shù)合成、磷酸化、純化、并退火。寡核苷酸末端可用T4DNA連接酶連接。然后，可將這種合成的、編碼CTL表位多肽的小基因克隆入所需的表達(dá)載體中?？蓪⒈绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)調(diào)控序列包含在載體中以確保在靶細(xì)胞中的表達(dá)。幾種載體元件是需要的啟動(dòng)子，其下游有插入小基因的克隆位點(diǎn)；用于有效終止轉(zhuǎn)錄的聚腺苷酸化信號(hào)；大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；和大腸桿菌選擇標(biāo)記(如氨芐青霉素或卡那霉素抗性)。有許多啟動(dòng)子可用于該目的，例如人巨細(xì)胞病毒(hCMV)啟動(dòng)子。其他合適的啟動(dòng)子序列，可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,580,859和5,589,466。為了優(yōu)化小基因的表達(dá)和免疫原性，可能需要附加的載體修飾。在某些情況下，為了有效表達(dá)基因需要內(nèi)含子，因而可以將一種或多種合成的或天然存在的內(nèi)含子引入小基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)域。還可考慮引入mRNA穩(wěn)定化序列以增加小基因的表達(dá)。最近提出，免疫刺激序列(ISSs或CpGs)在DNA疫苗的免疫原性中起作用。如果發(fā)現(xiàn)能夠提高免疫原性，這些序列可包含在載體中小基因編碼序列之外。在某些實(shí)例中，可以使用雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體，以便產(chǎn)生小基因編碼的表位和包含的第二種蛋白質(zhì)，從而提高或降低免疫原性。共表達(dá)時(shí)能夠有利地提高免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)或多肽的例子包括細(xì)胞因子(如IL2、IL12、GM-CSF)、誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分子(如LeIF)或共刺激性分子。本發(fā)明的HTL表位可連接于胞內(nèi)導(dǎo)向信號(hào)并且與CTL表位分開(kāi)來(lái)表達(dá)。這可以將HTL表位導(dǎo)向不同于CTL表位的細(xì)胞區(qū)室。如果需要，這能夠促使HTL表位更有效地進(jìn)入MHCII類(lèi)途徑，從而提高CTL誘導(dǎo)。與CTL誘導(dǎo)相反，在某些疾病中，也許通過(guò)共表達(dá)免疫抑制性分子(如TGF-β)來(lái)特異性地降低免疫應(yīng)答是有利的。一旦選定表達(dá)載體，就可將小基因克隆入載體下游的多接頭區(qū)域。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入合適的大腸桿菌宿主，并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備DNA。載體中所包含的小基因的取向和DNA序列以及其它元件，可用限制性酶切圖譜和DNA序列分析加以證實(shí)?？蓪y帶正確質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞儲(chǔ)藏起來(lái)作為母細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù)。通過(guò)在大腸桿菌中發(fā)酵，然后純化，生產(chǎn)治療量的質(zhì)粒DNA。按照熟知的技術(shù)，將工作細(xì)胞庫(kù)的等份細(xì)胞接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(如Terrific肉湯)，在搖瓶或生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)至飽和。質(zhì)粒DNA可用標(biāo)準(zhǔn)生物分離技術(shù)(如Quiagen供應(yīng)的固相陰離子交換樹(shù)脂)進(jìn)行純化。如果需要，用凝膠電泳或其他方法，可從開(kāi)環(huán)或線性形式的DNA分離出超螺旋的DNA。可用各種配方來(lái)制備純化的質(zhì)粒DNA，以用于注射。其中最簡(jiǎn)單的形式就是在無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中重建凍干的DNA。各種不同方法已有描述，而且也有新的方法可供使用。如上所述，核酸可方便地用陽(yáng)離子脂類(lèi)進(jìn)行配制。此外，糖脂、融合脂質(zhì)體、肽和通稱(chēng)為“保護(hù)性、相互作用的、非凝集性(PINC)”的化合物，也可與純化的質(zhì)粒DNA復(fù)合，以影響諸如穩(wěn)定性、肌內(nèi)分散性等因素，或者對(duì)運(yùn)輸至特定器官或細(xì)胞類(lèi)型產(chǎn)生影響。靶細(xì)胞致敏可用于小基因編碼的CTL表位的表達(dá)和MHCI類(lèi)分子呈遞的功能性測(cè)定。將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入適于用作標(biāo)準(zhǔn)CTL鉻釋放試驗(yàn)靶細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。所用轉(zhuǎn)染方法將取決于最終的配方。電穿孔可用于“裸露的”DNA，而陽(yáng)離子脂質(zhì)則允許直接體外轉(zhuǎn)染。可以共轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的質(zhì)粒，以便用熒光激活細(xì)胞分揀法(FACS)富集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。然后用鉻-51對(duì)這些細(xì)胞作標(biāo)記，并用作檢測(cè)表位特異性CTL系的靶細(xì)胞。51Cr釋放檢測(cè)到細(xì)胞溶解即表明產(chǎn)生了小基因編碼的CTL表位的MHC呈遞。體內(nèi)免疫原性是小基因DNA配方功能測(cè)試的第二種方法。用DNA產(chǎn)物免疫接種表達(dá)合適入MHC分子的轉(zhuǎn)基因小鼠。給藥劑量與途徑與配方有關(guān)(例如，對(duì)于IM用PBS配的DNA，對(duì)于IP用脂質(zhì)復(fù)合的DNA)。免疫21天后，收獲脾細(xì)胞，在編碼待試各表位的肽存在下再刺激1周。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定這些效應(yīng)細(xì)胞中負(fù)載了肽的、鉻-51標(biāo)記的靶細(xì)胞的細(xì)胞溶解。被對(duì)應(yīng)于小基因編碼表位的肽的MHC負(fù)載所致敏的靶細(xì)胞的裂解，證明該DNA疫苗具有體內(nèi)誘導(dǎo)CTL的功能。對(duì)于固體組合物，可采用常規(guī)的無(wú)毒固體載體，例如包括藥劑級(jí)甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。對(duì)于口服，可以通過(guò)摻入任何一種常用賦形劑(例如前面列出的那些載體)而形成藥學(xué)上可接受的無(wú)毒性組合物，它通常含有10％-95％活性成分(即一種或多種本發(fā)明的偶聯(lián)物)，更佳的濃度為25％-75％。對(duì)于氣霧劑給藥，肽最好和表面活性劑及推進(jìn)劑一起以細(xì)分(微滴)形式提供。偶聯(lián)物的典型百分比為0.01-20％(重量)，更佳為1-10％。當(dāng)然，表面活性劑必須無(wú)毒性，而且最好溶于推進(jìn)劑中。這類(lèi)試劑的代表是含有6-22個(gè)碳原子的脂肪酸(例如己酸、辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、油硬脂酸和油酸)與α脂族多元醇或其環(huán)狀酐的酯或部分酯?？梢允褂没旌硝?，例如混合的或天然的甘油酯。表面活性劑可占組合物的0.1-20％(重量)，更佳為0.25-5％。組合物的其余部分通常為推進(jìn)劑。如果需要還可包括一種載體，例如用于鼻內(nèi)給藥的卵磷酯。本發(fā)明另一方面涉及疫苗，它含有免疫有效量的本文所述免疫原性DR肽或CTL/DR肽偶聯(lián)物或其編碼核酸作為活性成分?？蓪⑴悸?lián)物引入某宿主(包括人)，其形式可以是連于其自身的載體或者是活性肽單元的均聚物或異聚物。這種聚合物具有增加免疫反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)用不同的肽構(gòu)成聚合物時(shí)還能夠誘導(dǎo)與病毒或腫瘤細(xì)胞的不同抗原決定簇反應(yīng)的抗體和/或CTL。可以使用的載體是本領(lǐng)域公知的，包括例如甲狀腺球蛋白、白蛋白如牛血清白蛋白，破傷風(fēng)類(lèi)毒素，聚氨基酸(如聚(賴(lài)氨酸谷氨酸))，乙型肝炎病毒核心蛋白，乙型肝炎病毒重組疫苗等。疫苗還可含有生理上可接受的稀釋劑如水、磷酸鹽緩沖鹽水、或鹽水，通常還含有佐劑。諸如不完全Freund佐劑，磷酸鋁，氫氧化鋁，或明礬之類(lèi)的佐劑是本領(lǐng)域公知的材料。而且如上所述，通過(guò)將本發(fā)明的肽偶連于脂質(zhì)如P3CSS，可以引起CTL應(yīng)答。通過(guò)注射、氣霧劑、口服、透皮或其他途徑用本文所述的肽組合物進(jìn)行免疫，則宿主的免疫系統(tǒng)會(huì)對(duì)疫苗接種作出應(yīng)答反應(yīng)產(chǎn)生大量針對(duì)所需抗原的特異性CTL，因而宿主至少對(duì)以后的感染有部分免疫力或能防止演變?yōu)槁愿腥?。含有本發(fā)明的DR肽的疫苗組合物可以給予易感或有患病(例如病毒感染或癌癥)風(fēng)險(xiǎn)的患者，以引發(fā)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)，并因此增強(qiáng)患者自身的免疫應(yīng)答能力，例如用**中描述的CTL表位。這種用量被定義成“致免疫有效劑量”。在這樣的應(yīng)用中，精確的用量同樣取決于患者的健康狀況和體重、給藥方式、配方的性質(zhì)等，但對(duì)于每位70kg患者而言，通常為1.0μg至約5000μg，更常用每70kg體重10-500μg。在某些情況下，可能希望將本發(fā)明的肽疫苗和能誘導(dǎo)針對(duì)感興趣病毒(尤其是病毒包膜抗原)的中和抗體應(yīng)答反應(yīng)的疫苗聯(lián)合使用。例如，PADRE肽可以與肝炎疫苗聯(lián)合使用，以增強(qiáng)藥效或擴(kuò)大人群覆蓋率。能以這種方式使用的合適肝炎疫苗包括RecombivaxHB(Merk)和Engerix-B(Smith-Kline)。對(duì)于治療或免疫目的，本發(fā)明的肽還可以由減毒的病毒宿主如牛痘或禽痘(fowlpox)病毒來(lái)表達(dá)。這種方法涉及使用牛痘病毒作為表達(dá)編碼本發(fā)明肽的核苷酸序列的載體。將其引入急性或慢性感染的宿主中或未感染的宿主中，重組的牛痘病毒便會(huì)表達(dá)免疫原性肽，從而引發(fā)宿主的CTL應(yīng)答。免疫方案中所用的牛痘載體和方法在例如美國(guó)專(zhuān)利4,722,848中有所描述，該文獻(xiàn)納入本文作為參考。另一種載體是BCG(卡介苗)。BCG載體在Stover等人的著作中(Nature351456-460(1991))有所描述，該文獻(xiàn)納入本文作為參考。用于本發(fā)明肽的治療性給藥和免疫的其它各種載體(例如鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphi)載體等)，是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文描述能明顯找到的?？乖耘悸?lián)物還可以用來(lái)在體外引發(fā)CTL。得到的CTL能用于治療患者的慢性感染(病毒性或細(xì)菌性)或腫瘤，而這些患者對(duì)其他常規(guī)形式的治療方法無(wú)反應(yīng)或者對(duì)于肽疫苗治療方法不會(huì)產(chǎn)生應(yīng)答。對(duì)特定病原(感染因子或腫瘤抗原)的體外CTL應(yīng)答，可以通過(guò)在組織培養(yǎng)物中將患者的CTL前體細(xì)胞(CTLp)和某來(lái)源的抗原呈遞細(xì)胞(APC)及合適的免疫原性肽一起孵育來(lái)誘導(dǎo)。孵育適當(dāng)時(shí)間后(通常為1-4周)，在此期間CTLp被激活，成熟并擴(kuò)展成效應(yīng)CTL，將細(xì)胞輸回患者，在患者體內(nèi)它們會(huì)破壞其特異性靶細(xì)胞(感染細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞)。本發(fā)明的肽還可用來(lái)制備單克隆抗體。這些抗體可用作潛在的診斷或治療劑。本發(fā)明的肽可以用作診斷試劑。例如，本發(fā)明的肽可以用于確定特定個(gè)體對(duì)采用肽或相關(guān)肽的治療方案的易感性，因而能夠有助于修改已有的治療方案或有助于確定受感染個(gè)體的預(yù)后。此外，該肽還可以用于預(yù)測(cè)哪些個(gè)體將會(huì)有演變成慢性感染的實(shí)際風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)施例材料和方法細(xì)胞。采用下列EB病毒(EBV)轉(zhuǎn)化的純合細(xì)胞系作為人HLAII類(lèi)分子的來(lái)源LG2[DRB1c0101(DR1)1；GM3107[DRB50101(DR2w2a)]；MAT(DRB10301(DR3)1；PREISS[DRB10401(DR4w4)1；BIN40[DRB10404(DR4w14)1；SWEIG[DRB11101(DR5w11)]；PIOUT[DRB10701(DR7)](a)；KT3[DRB0405(DR4w15)]；Herluf[DRB11201(DR5w12)]；HO301[DRB11302(DR6w19)]；OLL[DRB10802(DR8w2)]；和HTC9074[DRB10901(DR9)，由哥倫比亞大學(xué)PaulHarris博士慷慨提供]。在一些情況下，采用了轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞L466.1[DRB11501(DR2w2b)]；TR81.19[DRB30101(DR52a)]；和L257.6[DRB40101(DRw53)]。(Valli等人，J.Clin.Invest.91616(1993))。細(xì)胞通過(guò)培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)基中在體外維持，培養(yǎng)基中添加了2mML-谷氨酰胺[GIBCO，GrandIsland，NY]、50μM2-ME和10％熱滅活的FCS[IrvineScientific，SantaAna，CA]。細(xì)胞中還添加了100μg/ml鏈霉素和100U/ml青霉素[IrvineScientific]。大量細(xì)胞生長(zhǎng)在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)中。以PBS使?jié)舛葹?08細(xì)胞/毫升的細(xì)胞裂解，該P(yáng)BS中含有1％NP-40[FlukaBiochemika，Buchs，Switzerland]、1mMPMSE[CalBioChem，LaJolla，CA]、5mMNa-原釩酸、和25mM碘乙酰胺[SigmaChemical，St.Louis，Mo]。用10,000xg離心20分鐘，除去裂解液中的碎片和細(xì)胞核。HLA-DR分子的親和純化。如以前所述的那樣(Sette等人，J.Immunol.14235(1989)和Gorga等人，J.Bio1.Chem.26216087(1987))，用偶聯(lián)于Sepharose4B珠的單克隆抗體LB3.1對(duì)II類(lèi)分子進(jìn)行親和層析純化。使裂解液過(guò)濾通過(guò)0.8和0.4μM濾膜，再通過(guò)抗DR柱，然后用15倍柱體積的10mMTRIS以(以1％NP-40配)、PBS和2倍柱體積的含0.4％正辛基葡糖苷PBS洗柱。最后，用50mM二乙胺(用含0.4％正辛基葡糖苷的0.15MNaCl，pH11.5配)洗脫DR。在洗脫液中加入1/25體積的2.0MTris(pH6.8)，使pH降低至約為8.0，然后在Centriprep30濃縮器(Amicon，Beverly，MA)中2000rpm離心濃縮。II類(lèi)肽結(jié)合試驗(yàn)。本研究中采用了一組13種不同特異性DR-肽試驗(yàn)。選擇這些試驗(yàn)作為DR等位基因最常見(jiàn)的代表。表I中列出了試驗(yàn)中采用的各個(gè)DR抗原、采用的代表性等位基因產(chǎn)物、用作DR源的細(xì)胞系以及放射性標(biāo)記探針。使純化的人II類(lèi)分子[5-500nM]在蛋白酶抑制劑混合物的存在下，在含5％DMSO的PBS中與各種未標(biāo)記的肽抑制劑和1-10nM125I放射性標(biāo)記的探針肽一起培育48小時(shí)。所用的放射性標(biāo)記探針是HAY307-319(DR1)、破傷風(fēng)毒素[TT]830-843(DR2w2a，DR5w11，DR7，DR8w2，DR8w3，DR9)，MBPY85-100(DR2w2b)，TT1272-1284(DR52a)，MT65kDY3-13(Y7用F代替的DR3)，帶有序列YARFQSQTTLKQKT(DR4w4，DR4w15，DRw53)的非天然(Valli等人，同上)，對(duì)于DR5w12是從細(xì)胞系CIR中洗脫出的天然加工的肽EALIHQLINPYVLS(DR5w12)，以及對(duì)于DR6w19是650.22肽(TT830-43A-S836類(lèi)似物)。用氯胺-T方法碘化放射性標(biāo)記肽。肽抑制劑通常在1201μg/ml-1.2ng/ml的濃度范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)試。然后將數(shù)據(jù)繪圖，測(cè)定產(chǎn)生50％抑制(IC50)的劑量。在合適的化學(xué)計(jì)量條件下，未標(biāo)記的測(cè)試肽對(duì)于純化的DR的IC50是相互作用親和力(Kd)的合理的近似值。在2-4個(gè)完全獨(dú)立的試驗(yàn)中對(duì)肽進(jìn)行測(cè)試。蛋白酶抑制劑的最終濃度為1mMPMSF，1.3nM1.10二氮雜啡，73μM抑胃酶肽，8mMEDTA和200μMNα-p-甲苯磺酰基-L-賴(lài)氨酸氯甲基酮(TLCK)[所有蛋白酶抑制劑來(lái)自CalBioChem，LaJolla，CA]。培育混合物中的最終洗滌劑濃度為0.05％NonidetP-40。除DR3在pH4.5下進(jìn)行、DRw53在pH5.0下進(jìn)行外，所有試驗(yàn)在pH7.0下進(jìn)行。如以前所述的那樣(Sette等人，J.Immunol.148844(1992))調(diào)節(jié)pH。在TSK2000柱(TosoHass16215，Montgomeryville，PA)上凝膠過(guò)濾，從游離肽中分離出II類(lèi)肽復(fù)合物，如前所述(Sette等人，(1989)同上)那樣計(jì)算結(jié)合的肽組分。在基礎(chǔ)試驗(yàn)中，在固定量的放射性標(biāo)記肽存在下滴定DR制備物，以測(cè)定結(jié)合總放射活性10-20％所需的II類(lèi)分子的濃度。隨后的所有抑制和直接結(jié)合試驗(yàn)用II類(lèi)分子的這些濃度來(lái)進(jìn)行。DR4w15，DR6w19，DR8w2，DR8w3和DR9試驗(yàn)的DRB1特異性由于用于純化的抗體是α鏈特異性的，因此未從β3(和/或β4和β5)分子中分離出β1分子。關(guān)于DRβ鏈特異性試驗(yàn)的發(fā)展和驗(yàn)證已經(jīng)在上述關(guān)于DR等位基因的許多文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述(108)。這里我們首先描述DR4w15，DR6w19，DR8w2，DR8w3和DR9試驗(yàn)。本章節(jié)中描述的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了這些新試驗(yàn)的β鏈特異性。DR4w15。β4產(chǎn)物DRw53和DR4w15共同表達(dá)，DR4w15結(jié)合試驗(yàn)特異性的確定由于DR4w15和DRw53結(jié)合試驗(yàn)采用相同的放射性標(biāo)記配體而復(fù)雜化。由于β1鏈通常比其它β鏈的表達(dá)水平高5-10倍，且所有結(jié)合試驗(yàn)均采用有限量的DR，因此可以預(yù)計(jì)，試驗(yàn)中檢測(cè)到的主要的特異性是DR4w15。為了證實(shí)事實(shí)確實(shí)如此，查驗(yàn)了推定的DR4w15特異性試驗(yàn)中的一組58種不同的合成肽的結(jié)合方式以及DRw53特異性試驗(yàn)中獲得的結(jié)合方式(采用DRw53成纖維細(xì)胞作為II類(lèi)分子來(lái)源)。注意到有兩種非常不同的結(jié)合方式，在一些場(chǎng)合下，肽與一種DR分子高親和力結(jié)合，且不與另一種結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。DR6w19。DR6w19試驗(yàn)采用共同表達(dá)DRB30301(DR52a)的EBV轉(zhuǎn)化的純合細(xì)胞系H0301作為II類(lèi)分子的來(lái)源。盡管DR6w19試驗(yàn)中所用的放射性標(biāo)記配體與DR52a試驗(yàn)中的不同，但是此配體與高親和力的DR52a結(jié)合物是相關(guān)的(即是單一的取代類(lèi)似物)。如DR4w15例子中所作的那樣，分析一組天然存在的肽對(duì)DR6w19和DR52a的結(jié)合能力，研究了該試驗(yàn)的特異性。兩個(gè)試驗(yàn)證明了完全不同的結(jié)合特異性。例如，在相對(duì)結(jié)合方面，DR52a試驗(yàn)中的TT1272-1284結(jié)合比DR6w19試驗(yàn)中高63倍。相反，DR6w19試驗(yàn)中的不變鏈肽結(jié)合高189倍?？傊?，這些數(shù)據(jù)證明了放射性標(biāo)記肽650.22與H0301細(xì)胞系純化II類(lèi)MHC分子的結(jié)合對(duì)于DR6w19是特異性的。DR8w2和DR8w3。DR8w2和SR8w3試驗(yàn)的β1特異性是明顯的，因?yàn)棣?(和/或β4和β5)分子沒(méi)有表達(dá)。DR9。以前的研究已經(jīng)表明TT830-834放射性標(biāo)記探針肽不結(jié)合DRw53分子(Alexander等人，Immunity1751(1994))可以推斷出DR9試驗(yàn)有特異性。結(jié)果DR限制性T細(xì)胞識(shí)別的抗原性肽的DR結(jié)合親和力為了確定DR結(jié)合親和力的臨界值(在生物學(xué)上這被認(rèn)為是很重要)，我們編輯了一組32個(gè)給定T細(xì)胞表位的DR限制性報(bào)道例子的親和力。在大約一半的例子中，DR限制性與低于100nM的親和力有關(guān)，在另一半例子中，IC50％在100-1000nM范圍內(nèi)。32個(gè)例子中只有1個(gè)(3.1％)的DR限制性與1000nM或更高的IC50％有關(guān)。注意到親和力的這一分布與以前報(bào)道的HLAI類(lèi)表位(大多數(shù)表位以50nM或更低的IC50％結(jié)合(Sette等人，JI，1994))不同。II類(lèi)限制性表位相互作用的這一相對(duì)較低的親和力可能解釋了為什么II類(lèi)限制性T細(xì)胞的激活通常需要比I類(lèi)限制性T細(xì)胞更多的抗原的原因。總之，該分析提示了，1000nM可定為與DR分子免疫原性有關(guān)的親和力臨界值，由于這個(gè)原因，它是我們研究中的合適的靶。P1和P6錨著是DRB10401結(jié)合所必須的但還不夠幾個(gè)獨(dú)立的研究指出，靠近肽N端的1位上的大芳香族或疏水性殘基以及9個(gè)殘基的核心區(qū)(殘基1至9)在DRB10401結(jié)合中起關(guān)鍵作用。另外，證實(shí)了該9個(gè)殘基核心區(qū)的6位(P6)殘基起重要作用。在該位置上，短的和/或疏水性殘基通常是較佳的(O’Sullivan等人，JI1472663，1991；Sette等人，JI1513163，1993；Hammer等人，Cell74197，1993和Marshall等人，JI1545927，1995)。在本組試驗(yàn)中，分析了384種肽的文庫(kù)對(duì)DRB10401的結(jié)合能力并篩選出P1-P6基序(即，F(xiàn)、W、Y、L、I、V或M在P1，以及S、T、C、A、P、V、I、L或M在P6，距離肽C端至少9個(gè)殘基)的存在。該組384個(gè)肽含有總共80個(gè)DR4w4結(jié)合物(binder)(具體地說(shuō)，有27種好的結(jié)合物[IC50為100nM或更低]，53種中間型結(jié)合物[IC50在100-1000范圍內(nèi)])。80種DR4w4結(jié)合物中有77種(96％)攜帶了P1-P6基序。然而，應(yīng)注意，大多數(shù)不結(jié)合DR4w4的肽也含有P1-P6基序。在我們的數(shù)據(jù)庫(kù)中包括的384種肽中，只有125種是“P1-P6陰性的”。與“P1-P6陽(yáng)性”表位的77/259(30％)相比，其中只有3種(6％)明顯結(jié)合純化的DR4w4。因此，這些結(jié)果證明合適的P1和P6錨著的存在是DRB10401結(jié)合所必需的，但還不夠。DRB10401肽相互作用的詳細(xì)圖表下面對(duì)于每個(gè)P1-P6排列的核心區(qū)域，以類(lèi)似于以前用于詳細(xì)描述I類(lèi)肽相互作用的策略，計(jì)算每個(gè)位置攜帶特定殘基的肽相對(duì)于其它基團(tuán)的平均結(jié)合親和力。在進(jìn)行該方法后，匯編出平均相對(duì)結(jié)合(ARB)值的表。該表還表示20種天然存在氨基酸每一個(gè)在占據(jù)相對(duì)于主要P1-P6錨位的特定位置時(shí)，對(duì)于DRB10401結(jié)合能力的正面或負(fù)面影響的圖表(圖1)。ARB值變化大于4倍(ARB大于等于4或小于等于0.25)就認(rèn)為是顯著的，并表示給定殘基對(duì)于DR-肽相互作用有次級(jí)效應(yīng)。大多數(shù)次級(jí)效應(yīng)與4、7和9位有關(guān)。這些位置對(duì)應(yīng)于DR分子上的次級(jí)錨位嚙合淺穴位。另外，3位的M(ARB＝12.8)、3位的T(ARB＝4.34)和5位的I(ARB＝4.4)檢測(cè)到有明顯的次級(jí)效應(yīng)。DRB10401具體算法的開(kāi)發(fā)下面，用ARB表開(kāi)發(fā)出DRB10401的具體算法。為了預(yù)測(cè)0401的結(jié)合傾向，通過(guò)乘以每個(gè)位置的合適氨基酸的ARB值，對(duì)于每種P1-P6排列序列進(jìn)行評(píng)分。根據(jù)該程序，獲得以數(shù)字表示的“算法評(píng)分”。如果P1-P6排列有多種可能，則計(jì)算每一種排列的結(jié)合評(píng)分并選出最佳的評(píng)分。該方法預(yù)測(cè)0401結(jié)合能力的效果顯示在表IIa中。僅考慮算法評(píng)分高于-17.00的肽，從而將預(yù)測(cè)的肽組縮小到156個(gè)。該組中仍含有總共80個(gè)高的或中等的DR結(jié)合物中的72個(gè)(90％)。將算法評(píng)分的截?cái)嘀堤岣叩?16.44或更高，仍鑒定出了80個(gè)DR4w4結(jié)合肽中的60個(gè)(75％)。在總共為107個(gè)肽的組中，有25個(gè)是良好的或中等的結(jié)合物。換句話說(shuō)，如所預(yù)計(jì)的那樣，提高算法評(píng)分的嚴(yán)謹(jǐn)度預(yù)示了存在該組中的總結(jié)合物的更少部分，但是同時(shí)也確定了更少的假陽(yáng)性肽。DRB10401具體算法預(yù)測(cè)能力的盲試驗(yàn)為了驗(yàn)證我們算法的預(yù)測(cè)能力不僅僅能反映采用相同數(shù)據(jù)組可測(cè)試和確定算法本身，我們還進(jìn)一步在盲預(yù)測(cè)試驗(yàn)中檢驗(yàn)了它的效果。對(duì)于這一范圍，我們采用了獨(dú)立的50個(gè)肽組的數(shù)據(jù)，這些肽的結(jié)合親和力是已知的，但是并未用來(lái)獲得算法。如表IIb所示，此算法在預(yù)測(cè)該獨(dú)立肽組的DR4w4結(jié)合能力上是有效的。-17.00的算法評(píng)分鑒定出總共18個(gè)肽。該組含有整個(gè)50個(gè)肽的測(cè)試組中所有(3/3(100％))好的結(jié)合物，以及所有中等結(jié)合物的70％(8/11)。將截?cái)嘀堤岣叩?16.44，鑒定出9個(gè)肽，其中7個(gè)(78％)是好的或中等的結(jié)合物。該組含有盲預(yù)測(cè)肽組所含14個(gè)結(jié)合物中的7個(gè)(50％)。結(jié)論是，這些數(shù)據(jù)證實(shí)了上述DR4w4具體算法是正確的。DRB10401，DRB10101以及DRB10701肽結(jié)合特異性的詳細(xì)圖表下面，我們分析用于確定DR4w4算法的同一組的384個(gè)肽與純化的DR1和DR7分子的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)該組分別含有120個(gè)和59個(gè)DR1和DR7等位基因的結(jié)合物?？偣灿?58個(gè)肽能與DR1、DR4w4或DR7結(jié)合。其中大部分(73/158；46％)也是簡(jiǎn)并結(jié)合物，它們能與有待考慮的三個(gè)等位基因中的兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合。而且，我們還發(fā)現(xiàn)超過(guò)90％的DR1或DR7的好的和中等的結(jié)合物攜帶了P1-P6基序。最重要的是，73個(gè)簡(jiǎn)并DR結(jié)合物中有72個(gè)(99％)攜帶了該基序(數(shù)據(jù)未顯示)。結(jié)論是，這一分析表明，P1-P6為基礎(chǔ)的算法可用于有效地預(yù)測(cè)簡(jiǎn)并DR結(jié)合物。以類(lèi)似于上述DR4w4分子的方法，設(shè)計(jì)DR1和DR7等位基因的具體算法。圖2A和2B詳細(xì)描述了根據(jù)本發(fā)明確定的等位基因特異性圖表。在DRB10401例子中，大多數(shù)次級(jí)效應(yīng)集中于4、7和9位。在DR1例子中，4位是尤其顯著的，而7位是DR7的最顯著的次級(jí)錨位。根據(jù)這些圖表開(kāi)發(fā)出具體的算法，并發(fā)現(xiàn)，預(yù)測(cè)75％或90％的結(jié)合物所需的截?cái)嘀祵?duì)于DR1來(lái)說(shuō)是-19.32和-20.28，對(duì)于DR7來(lái)說(shuō)為20.91和-21.63。根據(jù)所選的特定等位基因或截?cái)嘀?，預(yù)測(cè)的肽40-60％實(shí)際上是良好的或中等的結(jié)合物(數(shù)據(jù)未顯示)。DR1-4-7組合算法的開(kāi)發(fā)最后，我們檢驗(yàn)了是否可用組合算法來(lái)預(yù)測(cè)簡(jiǎn)并結(jié)合物。出于這個(gè)目的，用三個(gè)(DR1，4w4和7)具體算法來(lái)同時(shí)篩選我們的數(shù)據(jù)庫(kù)中384個(gè)肽的序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預(yù)測(cè)(用75％截?cái)嘀?到有100個(gè)肽與所考慮的等位基因中的兩個(gè)或三個(gè)結(jié)合。該組含有73個(gè)實(shí)際上能1-4-7簡(jiǎn)并結(jié)合(定義為能結(jié)合DR1，4w4或7等位基因中一個(gè)以上的等位基因)的肽中的59個(gè)(81％)(表III)。代表全世界人口的DR特異性目標(biāo)組的定義前面章節(jié)中列出的數(shù)據(jù)描述了怎樣用組合的″1-4-7″算法來(lái)鑒定能結(jié)合多個(gè)DR等位基因的肽。下面，我們希望檢驗(yàn)表現(xiàn)出1-4-7簡(jiǎn)并結(jié)合行為的肽是否還與其它常見(jiàn)的DR類(lèi)型結(jié)合。我們的試驗(yàn)策略的第一步是，試圖確定一組代表全球人口大部分(80％)的靶DR類(lèi)型(不管人種群起源如何)。出于這個(gè)目的，還考慮了其它7個(gè)DR抗原。對(duì)于本研究中考慮的每一個(gè)DR抗原(包括DR1，4和7)，根據(jù)最近的HLA研討會(huì)(第11期，1991)，不同人種中的估計(jì)的頻率以及有待鑒定的主要亞型顯示在表IVa中。為了測(cè)定肽對(duì)不同DR分子的結(jié)合親和力，，對(duì)于每種DR抗原選擇一個(gè)代表性亞型(表I)。應(yīng)注意，對(duì)應(yīng)于大多數(shù)抗原，有一種亞型迄今是最豐富的，或者每種DR抗原的不同的最豐富的亞型表現(xiàn)出的結(jié)合方式可能存在很大程度的相似性(見(jiàn)表IVb的評(píng)論欄)。DR4抗原代表了該常見(jiàn)趨勢(shì)的一個(gè)例外，已經(jīng)報(bào)道DR4抗原在0401和0405之間的肽特異性有明顯差異。由于這兩個(gè)等位基因均是非常常見(jiàn)的(分別在白種人和東方人中)，因此我們?cè)诖硇訢R結(jié)合試驗(yàn)組中包括了DR0401和0405。我們的代表性試驗(yàn)組主要側(cè)重于基因的等位基因產(chǎn)物，因?yàn)檫@些分子看來(lái)表達(dá)最為豐富，起著所分析的大多數(shù)人III類(lèi)應(yīng)答主要限制性元件的作用，而且血清學(xué)方法很準(zhǔn)確，又很容易獲得DNA分類(lèi)。然而，在我們的分析試驗(yàn)中，我們還考慮了DRB3/4/5分子的代表性(表IVc)。這些分子起著功能性限制元件作用，前經(jīng)表明，它們的肽結(jié)合特異性與幾種常見(jiàn)DRβ1等位基因產(chǎn)物的特異性有某些相似性。預(yù)測(cè)DR-簡(jiǎn)并結(jié)合物的總和策略為了測(cè)試1-4-7組合算法是否也能預(yù)測(cè)與其他常見(jiàn)DR型的簡(jiǎn)并性結(jié)合，我們測(cè)定了三組不同合成肽結(jié)合一組純化HLADR分子的能力。這三組不同的肽是A)在組合算法1-4-7中分值不為正(非預(yù)測(cè))的36條肽，B)截留比為75％時(shí)的1-4-7算分為正值，預(yù)測(cè)DR-簡(jiǎn)并結(jié)合物的總策略為了測(cè)試1-4-7組合算法是否也預(yù)測(cè)與其他常見(jiàn)DR型的簡(jiǎn)并性結(jié)合，我們測(cè)定了三組不同合成肽結(jié)合一組純化HLADR分子的能力。這三組不同的肽是A)在組合算法1-4-7中分值不為正(非預(yù)測(cè))的36條肽，B)截留比為75％時(shí)的1-4-7算分為正，但經(jīng)實(shí)際試驗(yàn)卻不是1-4-7簡(jiǎn)并結(jié)合物(錯(cuò)誤預(yù)測(cè))的36條肽，和C)在1-4-7組合算法中分值為正，而且經(jīng)試驗(yàn)證明的確是1-4-7簡(jiǎn)并結(jié)合物(正確預(yù)測(cè))的29條肽。以上分析的結(jié)果見(jiàn)表V。在“非預(yù)測(cè)”肽組中，34條中只有3條(9％)結(jié)合至少DR分子、4w4或7分子中的兩種。有趣的是，這3條肽中的2條(1136.04和1136.29)有相當(dāng)?shù)慕徊娣磻?yīng)性，還與其他DR型結(jié)合(1136.04結(jié)合DR2w2β2、DR4w15、5w11和8w2，1136.29結(jié)合2w2β2、4w15、9和5w12)。“錯(cuò)誤預(yù)測(cè)”組中的肽(表V5)，至多只明確結(jié)合DR1、4w4或DR7分子之一，而且簡(jiǎn)并性很低，或是其他DR型，其中只有兩條肽(1136.22和1188.35)與上述3種DR分子都結(jié)合。在這組肽中，沒(méi)有一種肽結(jié)合4種或4種以上被測(cè)DR分子(數(shù)據(jù)未顯示)。以上結(jié)果與由以下肽獲得的數(shù)據(jù)相反，這組肽對(duì)應(yīng)于最初用組合算法1、4、7預(yù)測(cè)并經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明為簡(jiǎn)并結(jié)合DR1-4-7的肽。29條肽中有14條(48％)結(jié)合總共5個(gè)或5個(gè)以上等位基因。其中4條具有明顯的簡(jiǎn)并性(1188.16，1188.32，1188.34和F107.09)，并結(jié)合總共11種被測(cè)DR分子中的9種。所以，以上結(jié)果顯示依次使用組合的DR1、4、7算法和定量的DR1、4、7結(jié)合實(shí)驗(yàn)，該基礎(chǔ)上的策略可用來(lái)鑒定具有廣泛交叉反應(yīng)性的DR結(jié)合肽。HLA-DR1-4-7超型的定義以上數(shù)據(jù)還表明幾種常見(jiàn)DR型的特點(diǎn)在于高度重疊的肽結(jié)合特性。通過(guò)分析表Va和b中32條肽(都是真DR1-4-7結(jié)合物)的結(jié)合方式對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行了更詳細(xì)地研究，。其中31條(97％)結(jié)合DR1，22條(69％)結(jié)合DR4w4，21條(66％)結(jié)合DR7。這些數(shù)據(jù)與就其他非簡(jiǎn)并結(jié)合肽所觀察到的低結(jié)合百分比(針對(duì)DR1、4w4和7分別為17/67(25％)，8/67(12％)和7/67(10％))(表VII)形成對(duì)照。有趣的是，1-47簡(jiǎn)并結(jié)合物中大部分還結(jié)合其他常見(jiàn)DR型。其中16條(50％)結(jié)合DR2w2，18條(56％)結(jié)合DR6w19，18條(56％)結(jié)合DR2w2b，20條(62％)結(jié)合DR9。在各種情況下，非1-4-7簡(jiǎn)并肽的結(jié)合頻率都低得多(表VIII)。DR4w15、DR5w11和DR8w2也有盡管較較低但是明顯的交叉反應(yīng)頻率(介于28至37％)。最后，DR3和5w12和DR53僅表現(xiàn)微不足道的交叉反應(yīng)性。進(jìn)一步的研究將涉及這兩組分子(一組是DR4w15、DR5w11和DR8w2，另一組是DR3和5w12和DR53)是否屬于不同的DR超型。總之，以上信息表明包括DR1、4w4、2w2a、2w2b、7、9和6w19在內(nèi)的DR分子大組其特征在于具有高度重疊的肽結(jié)合特性。討論本報(bào)告中，我們已經(jīng)分析了一組13種不同DR分子的肽結(jié)合特異性，它們代表著世界人群中常見(jiàn)的幾種DR型。由其中3種(DR4w4、DR1和DR7)得到了次級(jí)錨位和次級(jí)相互作用的詳細(xì)圖譜。而且，我們還證明一組包含至少7種不同DR型的分子所共有的重疊性肽結(jié)合特性；因此，這種廣泛簡(jiǎn)并的HLADR結(jié)合肽相對(duì)常見(jiàn)。以上研究還描述了極其有助于鑒定這類(lèi)簡(jiǎn)并肽的計(jì)算機(jī)程序。我們希望討論有關(guān)II類(lèi)肽相互作用的現(xiàn)有知識(shí)，以及最近報(bào)道的I類(lèi)超基序的以上數(shù)據(jù)。最后，還應(yīng)該考慮II類(lèi)表位的廣泛簡(jiǎn)并性對(duì)基于表位的疫苗設(shè)計(jì)的影響。首先，我們的研究闡明了本研究中接受分析的、以良好的親和性結(jié)合DR4w4、DR1、DR7和其他大多數(shù)DR型(數(shù)據(jù)未顯示)中絕大多數(shù)肽如何以P1-P6基序?yàn)樘卣?，這一基序與最先由O’Sullivan等所提出的一致。對(duì)DR1-肽復(fù)合物的晶相分析揭示這些位置上的殘基占據(jù)了DR1分子上兩個(gè)互補(bǔ)的空穴，P1位置對(duì)應(yīng)于最關(guān)鍵的錨著殘基，而且是最深的疏水穴。我們的分析還顯示其他“次級(jí)錨著”位置如何以等位基因特異性方式顯著影響著肽結(jié)合能力。第4位被發(fā)現(xiàn)對(duì)于結(jié)合DR1來(lái)說(shuō)尤其重要，第9位對(duì)結(jié)合DR4w4特別重要，第7位對(duì)結(jié)合DR7尤其重要。以上數(shù)據(jù)與最早描述這種等位基因特異性錨著的結(jié)果一致，也與顯示這些殘基如何占據(jù)DR分子上空穴的晶相數(shù)據(jù)一致。其次，我們的研究說(shuō)明了以大型肽文庫(kù)的排列和平均相對(duì)結(jié)合值的計(jì)算得出的方法如何確定了預(yù)測(cè)結(jié)合能力的定量算法。本研究將觀察結(jié)果擴(kuò)展到了另兩種常見(jiàn)HLA-DR型，還闡明了組合使用算法1-4-7如何幫助鑒定廣泛簡(jiǎn)并性DR結(jié)合肽。本文中的數(shù)據(jù)提示至少包括DR1、DR2w2a、DR2w2b、DR4w4、DR6w19、DR7和DR9在內(nèi)的一組常見(jiàn)DR等位基因都具有有高度重疊的肽結(jié)合特性。Lanzavechia，Sinigallia研究小組和Rothbard研究小組最早記述了簡(jiǎn)并肽結(jié)合多種DR等位基因并識(shí)別多種等位基因的相同表位。本研究對(duì)從屬于主要HLA-DR超型(DR1-4-7樣)的等位基因(其中包括DR1、DR2w2a、DR2w2b、DR4w4、DR6w19、DR7和DR9)進(jìn)行了分類(lèi)。根據(jù)本文信息，至少還另有兩組等位基因存在。第一組(DR4w15、8w2、5w11)編碼與1-4-7樣超型明顯重疊但是程度較低的分子。顯然，另一組等位基因(5w12、3w17和w35)幾乎不具有與1-4-7相關(guān)的特性。因此必須注意，Hammer等曾提出良好的DR5w11結(jié)合肽常以帶正電的P6錨位(無(wú)法與本發(fā)明提出的1-4-7超基序相比)為特征。還必須注意的是，Sidney等曾提出DR3w17結(jié)合與其他DR型所結(jié)合的肽極其不同的一組肽。進(jìn)一步的研究要確定的是以上列出的任何一種分子是否可以歸為其他DR超型。我們研究組目前研究的是對(duì)沿肽結(jié)合穴排列的多形性殘基的分析是否能夠用來(lái)幫助HLADR超型的分類(lèi)和預(yù)測(cè)。我們想要評(píng)論的是本文所述HLADR超型與最近報(bào)道的HLAI類(lèi)超型之間的差異。I類(lèi)超基序是明確的，而且是非重疊性的(作為一條規(guī)則)。據(jù)報(bào)道，其中4種在世界人群中具有幾乎相同的頻度。相比之下，本文所定義HLADR超型庫(kù)是不明確的，是與其他等位基因庫(kù)相互重疊的，至少部分重疊。而且，根據(jù)本文表I和IV中的數(shù)據(jù)，即使存在其它DR超型，DR1-4-7看來(lái)也是迄今世界上最多的。最后，我們想指出的是以上數(shù)據(jù)在開(kāi)發(fā)基于表位的疫苗方面可能有關(guān)聯(lián)。II類(lèi)限制性HTL已經(jīng)作為處方用于預(yù)防和治療多種重要的疾病。將定義明確的II類(lèi)表位包含在預(yù)防或治療用疫苗中將使得免疫應(yīng)答集中針對(duì)保守性表位或亞優(yōu)勢(shì)表位成為可能，而且避開(kāi)了抑制決定簇。根據(jù)本文數(shù)據(jù)(表IV)，DR1-4-7超型包括了人群50至80％的范圍，這還具體取決于所考慮的種族。所以，通過(guò)考慮數(shù)量很有限的肽結(jié)合特異性，就可能實(shí)現(xiàn)廣泛但是非種族偏向性的人群覆蓋。根據(jù)以上結(jié)果，瀏覽各種感興趣抗原的序列，檢測(cè)是否存在DR1-4-7基序。用該方法鑒定出的肽具有廣泛的交叉反應(yīng)性，是II類(lèi)限制性T細(xì)胞表位。表VIII列出了這些肽，它們來(lái)自HBV、HCV、HIV和惡性瘧原蟲(chóng)(Pf)?？偣茶b定得到146條肽35條來(lái)自HBV，16條來(lái)自HCV，50條來(lái)自HIV，45條來(lái)自Pf。應(yīng)用時(shí)，使用的是標(biāo)準(zhǔn)的保守性(conservancy)標(biāo)準(zhǔn)。以上實(shí)施例用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，而不限定本發(fā)明的范圍。對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的其他變化形式是顯而易見(jiàn)的。出于各種目的，本文將在此引用的所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)均納為參考。表I本研究使用的HLA-DR結(jié)合試驗(yàn)代表性試驗(yàn)抗原等位基因別名細(xì)胞系放射性標(biāo)記探針文獻(xiàn)評(píng)論DR1DRBl*0101(DR1)LG2HAY307-3191)(8)01是最主要的DR1等位基因。DR2DRB1*1501(DR2w2b)L466.1MBP88-102Y2)(8)0101是最主要的DR2等位基因。DR3DRBl*0301(DR3w17)MATMT65kDY3-13(8)01在大多數(shù)人群中是同系物3)最主要的DR3等位基因。01和02在NABlack中平均割裂(split)。DR4DRBl*0401(DR4w4)Preiss非天然YAR肽4)(8)01是最主要的DR4等位基因。DRBl*0405(DR4w15)KT3非天然YAR肽本論文05是東方人中最主要的DR4等位基因。DR7DRB1*0701(DR7)PitoutTT830-8435)(8)01/02的第1位不同，該位置在結(jié)合溝之外。DR8DRB1*0802(DR8w2)OLLTT830-843本論文02在大多數(shù)主要人群中是優(yōu)勢(shì)的。02和03具有幾乎相同的結(jié)合特異性(J.Sidney&amp;A.Sette，尚未公開(kāi))。DR9DRB1*0901(DR9)9074TT830-843本論文DR9割裂是沉默突(HID)變的產(chǎn)物。DR11DRB1*1101(DR5w11)SweigTT830-843(8)01是迄今最主要的DR11等位基因。DR12DRB1*1201(DR5w12)HerlufC1R衍生肽6)(9)01/02分布相當(dāng)。兩等位基因的第67位不同，這似乎并不明顯影響肽結(jié)合特性。DR13DRB1*1302(DR6w19)HO301650.22(TT830-(10)02比01略為多843同系物)7)見(jiàn)。兩等位基因的第86為不同(對(duì)決定P1錨特異性是關(guān)鍵性的)。DR51DRB5*0101(DR2w2a)GM3107TT830-8435)(8)0101是最主要的割裂。DR53DRB4*0101(DR4，DR7，L257.6非天然YAR肽4)(8)0101實(shí)際上是唯一DR9)的等位基因。1)YPKYVKQNTLKLAT6)EALIHQLKINPYVLS2)VVHFFKNIVTPRTPPY7)QYIKANAKFIGITE3)YKTIAFDEEARR8)Vellietal.，J.Clin.Invest.91616，1993.4)YARFQSQTTLKQKT9)Falketal..Immunogenetics39230，1994.表II預(yù)測(cè)DRB1*結(jié)合能力的算法a)原始肽組肽編號(hào)(結(jié)合濃度nM)選擇標(biāo)準(zhǔn)高≤100中等100-000無(wú)＞1000總數(shù)無(wú)2753304384P1-P62750182259-17.00274584156-16.442535471071)預(yù)測(cè)所有結(jié)合物中90％的計(jì)算值2)預(yù)測(cè)所有結(jié)合物中70％的計(jì)算值b)預(yù)測(cè)DRB1*0401結(jié)合能力的盲試算法肽編號(hào)(結(jié)合濃度nM)選擇標(biāo)準(zhǔn)高≤100中等100-1000無(wú)＞1000總數(shù)無(wú)3113650P1-P6392840-17.0038718-16.443429表III“1-4-7”組合算法選擇標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)并結(jié)合物1)總簡(jiǎn)并結(jié)合物百分比無(wú)73/384100％P1-P672/25999％組合算法(截?cái)嘀?7/14792％90％)組合算法(截?cái)嘀?9/10081％90％)4)簡(jiǎn)并結(jié)合物即至少結(jié)合DR1、4w4和7分子中兩種的肽，IC50不超過(guò)1μM。表IV10種主要HLA-DR抗原的表型頻率<p>表VA)非預(yù)測(cè)結(jié)合能力DR1，4，7其它等位基因結(jié)合等肽DR1DR4w4DR7DR2w2bDR2w2aDR3DR4w15DR5w11DR6w19DR8w2DR9DR5w12位基因總數(shù)1136.293243271381.1468-7456250-2970183100071136.04242033331264741-56369-552885-61136.1978119151323861250-445183166750523125-41136.49--505-702-250645-15814167909141136.02.01a806--284416--1379-338-992731136.35116--2459--10861268750306-136431136.52-703155639571667-563---2419-21136.0379865420332431250-1689--73133947357121136.0619231364--3136977-6908750---21136.23962--262-2727--3182---21136.3237--17171739-6266250-1976--21136.3352--82736250-7600183587503161-47621136.44.01526780----65524000-6364--21136.62.01a----449--396-29703000-21136.42-1875--769--95248750---11136.548333-------761--272711136.07.01b1190-463015422857--1980-1225261421411136.05-492----------11136.08-9375378873------2027-11136.251163-6250283846---2917--384611136.3445455453247-------5000-11136.36204--5688------12931-11136.64-225----1267-5000---11136.69--------54-5769-11136.40454515468333-4348---7000---01136.50-1875----66677143-5506--01136.56-4500----3918-3500---01136.57-8654-6500--57581626-51044688-01136.61----------7979-01136.66------------01136.68------------01136.70-------3704----01136.72------------01136.63.01a----1905--7692-4298--0-表示結(jié)合親和力≥10,00034條中的2條(59％)對(duì)5種活5種以上DR型具有簡(jiǎn)并性。表VB)正確預(yù)測(cè)結(jié)合能力(IC50％nM)DR1，4，7其它等位基因結(jié)合等DR1DR4w4DR7DR2w2bDR2w2aDR3DR4w15DR5w11DR6w19DR8w2DR9DR5w12位基因總數(shù)1188.163.77.114125123-47304284628-91188.323.144167-29-1402117.11912685191188.34141266370148133295927033.768194979F107.094.114395028286-32496346938529-927.41214282138-323--312053590249581188.45269.057260123757105725323.92816-81136.161.621446162534-7413571129648868-71136.212.25152284462-27012122591420132-71136.110.89999615603261-84315-52919743243727.39241449333102499-166812039.888362-627.41756-425210251--47118422177859251261136.38701222404258741-133400038-8627321627.388505737497181635-141054266-708-527.403784146207132875--73-1672423348851136.715.177696-1212-95015381400-375-51136.145.3478710081135-792---7732-51136.2418258443915069524-1357-6.5---427.38466-281357----65-458-41188.13116692358382--1069-0.77-142-4F107.10120272867807--1647-5.5-135-4F107.17221388---48785705-76764029934784F107.2316357131414413--6770-14-151-41136.121057201429142128-1583-34329172500-41136.472.24072119303755-53524255----41136.280.2384936232.21481-6667952431827538-447831136.55651382451---27145455000---31136.59.01a13039--29-3140-----327.4152011754718653---671222348997--21136.46689855814---------2-表示結(jié)合親和力≥10,000表VI“1-4-7”簡(jiǎn)并結(jié)合物結(jié)合能力(IC50％nM)DR1，4，7其它等位基因肽序列結(jié)合等位DR1DR4w4DR7DR2w2bDR2w2aDR3DR4w15DR5w11DR6w19DR8w2DR9DR5w12基因總數(shù)1188.34HNWVNHAVPLAMKLI+++++-+-++++101188.32GLAYKFVVPGAATPY+++-+--+++++91188.16KSKYKLATSVLAGLL+++-+-+++++-9F107.09KYKLATSVLAGLLGN+++-+-+++++-91188.45RHNWVNHAVPLAMKL++++++--+++-927.412AYKFVVPGAATPYAG+++-+--++++-81136.11VVFPASFFIKLPIILA++-++-++-+--71136.16LTSQFFLPALPVFTWL+++-+-+--++-71136.21IPQEWKPAITVKVLPA+++-+-+-+-+-71136.29GPPTALRSFGFAFGYM+-+++-+---++727.392SSVFNVVNSSIGLIM++++----+++-727.417VKNVIGPFMKAVCVE+-+++--++-+-71136.04LFHYYFLSEKAPGSTV++--+-++-+--627.388MRKLAILSVSSFLFV+-++---++-+-61136.38SSIIFGAFPSLHSGCC++-++-+---+-627.403LVNLLIFHINGKIIK+-++---++-+-61136.71EPQGSTYAASSATSVD+++---+---+-51136.14FATCFLIPLTSQFFLP+-+++-+-----527.384FNVVNSSIGLIMVLS+-++----+-+-51188.13AGLLGNVSTVLLGGV+-++----+-+-5F107.10LAGLLGNVSTVLLGG+-++----+-+-51136.47THHYFVDLIGGAMLSL++-++-------41136.12IKLPIILAFFATCFLIP++-+----+---4F107.23VFNVVNSSIGLIMVL+-+-----+-+-41136.24NLSNVLATTTTGVLDI+-++----+---4F107.17KFVVPGAATPYAGEP++------+-+-41136.28LAAIIFLFGPPTALRS++-+--------31136.55QEIDPLSYNYIPVNSN++----+-----31136.59.01aRVYQEPQVSPPQRAET++--+-------327.415NVKYLVIVFLIFFDL-+++--------31136.46LWWSTMYLTHHYFVDL++----------21136.44.01WLFPRFKFVWVTYASW++----------2312221181611291810203-表示結(jié)合親和力≥10,00029條中的16條(55％)對(duì)5種活5種以上DR型具有簡(jiǎn)并性。表VII結(jié)合物頻率DR型1-4-7簡(jiǎn)并結(jié)合物(％)非1-4-7簡(jiǎn)并結(jié)合物(％)131/32(97)17/67(25)4w422/32(69)8/67(12)721/32(66)7/67(10)920/32(62)2/67(3.0)6w1918/32(56)6/67(8.9)2w2βb18/32(56)16/67(24)2w2βa16.32(50)10/67(15)4w1512/32(37)4/67(6.0)8w210/32(31)3/67(4.5)5w119/32(28)6/67(8.9)5w123/32(9.4)4/67(6.0)3w171/32(3.1)0/67(0)w532/16(13)7/43(16)表VIII<</tables>II類(lèi)肽肽AA序列來(lái)源008.0016SALLSSDITASVNCAKHEL81-96200.0616SALSEGATPQDLNTMLHIVgp2541-56213.1016NKALELFRKDIAAKYKSp.W.myo.132-147506.0120NKALELFRKDIAAKYKELGYSWMyo132-151506.0518ALELFRKDIAAKYKELGYSp.Wmyo.134-151506.0316ELFRKDIAAKYKELGYSp.Wmyo.136-151570.0116MAKTIAYDEEARRGLEHeatShockProt705.0620KVYLPRMKMEEKYNLTSVLMOva279-298717.0414YASFVKTTTLRKFT-NH2組合的優(yōu)化的DR2857.0220PHHTALROAILCWGELMTLAHBVcore50-69865.0115YKMKMVHAAHAKMKMOVAKM核心延伸F050.0320GFYTTGAVRQIFGDYKTTICPLP91-110F089.0115QNILLSNAPLGPQFP酪氨酸酶56-70F098.0320AAYAAQGYKVLVLNPSVAATHCVNS31242-1261F098.0420GYKVLVLNPSVAATLGFGAYHCVNS31248-1267F098.0514GYKVLVLNPSVAATHCVNS31248-1261F098.0619SYVNTNMGLKFRQLLWFHIHBV核心87-105F098.1012GLKFRQLLWFHIHBV核心94-105F134.0420TLHGPTPLLYRLGAVQNETTHCVNS41-20F134.0520NFISGIQYLAGLSTLPGNPAHCVNS4151-170F134.0821GEGAVQWMNRUAFASRGNHVHCVNS4293-313(1914-1934)IA-p517KPVSQMRMATPLLMRPM小鼠非變異鏈85-101Tr-28p124LPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPM人非變異鏈80-10327.027915EYLVSFGVWIRTPPAHBVNUC11727.028015GVWIRTPPAYRPPNAHBVNUC12327.028115RHYLHTLWKAGILYKHBVPOL14527.028315VPNLQSLTNLLSSNLHBVPOL40927.028815WVTVYYGVPVWKEATHIV1ENV4727.029315YYGVPVWKEATTTLFHIV1ENV5127.029415VPVWKEATTTLFCASHIV1ENV5427.029515LSGIVQQQNNLLRAIHIV1ENV71127.029615QQHLLQLTVWGIKQLHIV1ENV72827.029715QHLLQLTVWGIKQLQHIV1ENV72927.029815LLQLTVWGIKQLQARHIV1ENV73127.030415QGQMVHQAISPRTLNHIV1GAG17127.030715SPEVIPMFSALSEGAHIV1GAG19727.031015QEQIGWMTNNPPIPVHIV1GAG27627.031115GEIKRWIILGLNKIHIV1GAG29427.031215YKRWIILGLNKIVRMHIV1GAG29727.031315KRWIILGLNKIVRMYHIV1GAG29827.031415WIILGLNKIVRMYSPHIV1GAG30027.031515VKNWMTRTLLVQNANHIV1GAG34827.032215GTVLVGPTPVNIIGRHIV1POL15327.032415PVNIIGRNLLTQIGCHIV1POL16127.032615GRNLLTQIGCTLNFPHIV1POL16627.032815TLNFPISPIETVPVKHIV1POL17627.032915NFPISPIETVPVKLKHIV1POL17827.034115FRKYTAFTIPSINNEHIV1POL30327.034415SPAIFQSSMTKILEPHIV1POL33527.034515PAAIFQSSMTKILEPFHIV1POL33627.034915QKLVGKLNWASQIYAHIV1POL43727.035015VGKLNWASQIYAGIKHIV1POL44027.035115NREILKEPVHGVYYDHIV1POL48527.035315IPEWEFVNTPPLVKLHIV1POL59327.035415WEFVNTPPLVKLWYQHIV1POL69627.036015EQLIKKEKVYLAWVPHIV1POL70527.036115EKVYLAWVPAHKGIGHIV1POL71127.036415HSNWRAMASDFNLPPHIV1POL75827.037015ASGYIEAEVIPAETGHIV1POL82227.037215AEHLKTAVQMAVFIHHIV1POL91127.037315KTAVQMAVFIHNFKRHIV1POL91527.037715QKQITKIQNFRVYYRHIV1POL95627.037915KLLWKGEGAVVIQDNHIV1POL98227.038115ENRWQVMIVWQVDRMHIV1VIF227.038215VEAIIRILQQLLFIHHIV1VPR5727.038415FNVVNSSIGLIMVLSPfCSP41327.038715MNYYGKQENWYSLKKPfCSP5327.038815MRKLAIISVSSFLFVPfCSP227.039015NSSIGLIMVLSFLFLPfCSP41727.039215SSVFNVVNSSIGLIMPfCSP41027.039315MKILSVFFLALFFIIPfEXP1127.039815FILVNLLIFHINGKIPfLSA11127.040015HILYISFYFILVNLLPfLSA1327.040215LLIFHINGKIIKNSEPfLSA11627.040315LVNLLIFHINGKIIKPfLSA11327.040615NLLIFHINGKIIKNSPfLSA11527.040815QTNFKSLLRNLGVSEPfLSA19427.041215AYKFVVPGAATPYAGPfSSP251427.041515NVKYLVIVFLIFFDLPfSSP2627.041715VKNVIGPFMKAVCVEPfSSP222327.041815WENVKNVIGPFMKAVPfSSP22201186.0415CSVVRRAFPHCLAFSHBVPOL5341186.0615FVQWFVGLSPTWVLSHBVENV3421186.1015LAQFTSAICSWRRAHBVPOL5261186.1515LVPFVQWFVGLSPTVHBVENV3391186.1815NLSWLSLDVSAAFYHHBVPOL4221186.2515SFGVWIRTPPAYRPPHBVNUC1211186.2615SPFLLAQFTSAICSVHBVPOL5221186.2715SSNLSWLSLDVSAAFHBVPOL4201188.0115DKELTMSNVKNVSQTPfLSA1811188.1315AGLLGNVSTVLLGGVPfEXP1821188.1616KSKYKLATSVLAGLLPfEXP1711188.3215GLAYKFVVPGAATPYPfSSP25121188.3415HNWVNHAVPLAMKLIPfSSP2621188.3515IGPFMKAVCVEVEKTPfSSP22271188.3815KYKIAGGIAGGLALLPfSSP24941188.4515RHNWVNHAVPLAMKLPfSSP261F091.1515IKQFINMWQEVGKAMYHIV1ENV566F107.0315LQSLTNLLSSNLSWLHBVPOL412F107.0415PFLLAQFTSAICSVVHBVPOL523F107.0915KYKLATSVLAGLLGNPfEXP173F107.1015LAGLLGNVSTVLLGGPfEXP181F107.1115RHPFKIGSSDPADNAPfEXP1107F107.1415ANQLVVILTDGIPDSPfSSP2153F107.1715KFVVPGAATPYAGEPPfSSP2516F107.2315VFNVVNSSIGLIMVLPfCSP41235.009315VGPLTVNEKRRLKLIHBVPOL9635.009615ESRLWVDFSQFSRGNHBVPOL38735.010015LCQVFADATPTGWGLHBVPOL68335.010615VVVVATDALMTGYTGHCV143735.010715TVDFSLDPTFTIETTHCV146635.012515AETFYVDGAANRETKHIVPOL61935.012715EVNIVTDSQYALGIIHIVPOL67435.013115WAGIKQEFGIPYNPQHIVPOL87435.013315GAVVIQDNSDIKVVPHIVPOL98935.013515YRKILRQRKIDRLIDHIVVPU3135.017115PDSIQDSLKESRKLNPfSSP216535.017215KCNLYADSAWENVKNPfSSP22111280.0215IGTVLVGPTPVNIIGHIVPOL1521280.0315KVYLAWVPAHKGIGGHIVPOL7121280.0415TKELQKQITKIQNFRHIVPOL9521280.0615AGFFLLTRILTIPQSHBVENV1801280.0815GFFLLTRILTIPQSLHBVENV1811280.0915GTSFVYVPSALNPADHBVPOL7741280.1215IIFLFILLLCLIFLLHBVENV2441280.1315KFAVPNLQSLTNLLSHBVPOL4061280.1515LHLYSHPIILGFRKIHBVPOL5011280.1615LLCLIFLLVLLDYQGHBVENV2511280.2115VGLLGFAAPFTQCGYHBVPOL6371280.2215FYFILVNLLIFHINGPfLSA191280.2315KSLLRNLGVSENIFLPfLSA1981280.2515RGYYIPHQSSLPQDNPfLSA116691283.0215VYLLPRRGPRLGVRAHCV核心341283.1015GHRMAWDMMMNWSPTHCVE13151283.1115CGPVYCFTPSPVVVGHCVNS1/E25061283.1215VYCFTPSPVVVGTTDHCVNS1/E25091283.1315GNWFGCTWMNSTGFTHCVNS1/E25501283.1415FTTLPALSTGLIHLHHCVNS1/E26841283.1615SKGWRLLAPITAYAQHCVNS310251283.1715DLYLVTRHADVIPVRHCVNS311341283.2015AQGYKVLVLNPSVAAHCVNS312511283.2115GYKVLVLNPSVAATLHCVNS312531283.2215VLVLNPSVAATLGFGHCVNS312561283.2415GARLVVLATATPPGSHCVNS313451283.2615DVVVVATDALMTGYTHCVNS314361283.3015FTLGTHIDAHFLSQTHCVNS315671283.3115YLVAYQATVCARAQAHCVNS315911283.3315LEVVTSTWVLVGGVLHCVNS416581283.3415TWVLVGGVLAALAAYHCVNS416641283.3615AKHMWNFISGIQYLAHCVNS417671283.3715IQYLAGLSTLPGNPAHCVNS417771283.4415MNRLIAFASRGNHVSHCVNS419211283.5015SYTWTGALITPCAAEHCVNS524561283.5515GSSYGFQYSPGQRVEHCVNS526411283.5715LELITSCSSNVSVAHHCVNS528131283.6115ASCLRKLGVPPLRVWHCVNS529391298.0215VGNFTGLYSSTVPVFHCVPOL531298.0315TNFLLSLGIHLNPNKHCVPOL5681298.0415KQCFRKLPVNRPIDWHCVPOL6151298.0615KQAFTFSPTYKAFLCHCVPOL6611298.0715AANWILRGTSFVYVPHCVPOL7641298.0815PDRVHFASPLHVAWRHCVPOL8241298.1015IRPVVSTQLLLNGSLHIV1ENV3331298.1115RSELYKYKVVKIEPLHIV1ENV6371298.1315DRFYKTLRAEQASOEHIV1GAG3331298.1615KVILVAVHVASGYIEHIV1POL813F125.0217LVNLLIFHINGKIIKNSPfLSA113F125.0416RHNWVNAVPLAMKLIPfSSP6權(quán)利要求1.一種組合物，它包含誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的分離的肽和含有9個(gè)殘基基序的T輔助細(xì)胞肽，其中所述基序N末端起首位是Y、F、W、L、I、V、M，所述基序N末端起第6位是S、T、C、A、P、V、I、L、M。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中的T輔助細(xì)胞肽由約10至24個(gè)殘基構(gòu)成。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中的T輔助細(xì)胞肽由病毒抗原衍生而得。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中的病毒抗原來(lái)自HIV、HBV或HCV。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中的T輔助細(xì)胞肽由寄生蟲(chóng)衍生得到。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述的抗原是惡性瘧原蟲(chóng)。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的肽與T輔助細(xì)胞肽相連。8.一種在患者體內(nèi)誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的方法，該方法包括將患者的細(xì)胞毒性T細(xì)胞與誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的分離的肽及含有9個(gè)殘基基序的T輔助細(xì)胞肽接觸，其中所述基序N末端起首位是Y、F、W、L、I、V、M，所述基序N末端起第6位是S、T、C、A、P、V、I、L、M。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中的接觸步驟通過(guò)給予患者包含CTL應(yīng)答的肽和T輔助細(xì)胞肽的編碼核酸的藥物組合物來(lái)進(jìn)行。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的肽與T輔助細(xì)胞肽相連。11.一種組合物，它包含表VIII中列出的肽。12.一種在患者體內(nèi)誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞應(yīng)答的方法，該方法包括將輔助性T細(xì)胞與權(quán)利要求11中的肽接觸。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中的接觸步驟通過(guò)給予患者包含所述肽的藥物組合物來(lái)進(jìn)行。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中的接觸步驟通過(guò)給予患者包含編碼所述肽的核酸的藥物組合物來(lái)進(jìn)行。全文摘要本發(fā)明基于HLADR4w4、DR1和DR7的肽結(jié)合特異性。結(jié)合于這些DR分子的肽具有一基序,該基序的特征是在1位上為大芳香族殘基或疏水殘基(Y、F、W、L、I、V、M)以及在6位上為小的、不帶電荷的殘基(S、T、C、A、P、V、I、L、M)。此外,確定了等位基因特異性的二級(jí)效應(yīng)和二級(jí)錨位,這些結(jié)果被用于推導(dǎo)等位基因特異性算法。通過(guò)聯(lián)合利用這些算法,鑒別出具有簡(jiǎn)并DR1、4、7結(jié)合能力的肽。文檔編號(hào)A61K38/00GK1251042SQ98803631公開(kāi)日2000年4月19日申請(qǐng)日期1998年1月23日優(yōu)先權(quán)日1997年1月23日發(fā)明者A·塞特,J·悉尼,S·索思伍德申請(qǐng)人:埃皮繆納股份有限公司