專利名稱：莖部加速的等溫核酸擴增技術(shù)的制作方法
莖部加速的等溫核酸擴增技術(shù)本專利申請主張申請日為2009年6月15日的英國專利申請GB0910302. 9的優(yōu)先權(quán)，該英國專利申請的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合于此。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種核酸擴增技木，尤其涉及ー種方法，該方法改善了測試樣本的快速和特異擴增及檢測。
背景技木在許多研究和診斷領(lǐng)域中，核酸擴增技術(shù)(NAAT)都是ー種非常寶貴和強大的エ具。核酸擴增技術(shù)能夠以較高的靈敏度和特異性對樣本中的核酸進行檢測和量化，并且能夠?qū)颖局械暮怂徇M行量化分析。核酸擴增可用來確定樣本中是否存在特定的模板核酸，這可以通過執(zhí)行特定的核酸擴增技術(shù)之后是否存在擴增產(chǎn)物來判斷。相反，如果不存在任何擴增產(chǎn)物，則表明樣本中不存在模板核酸。這些技術(shù)在診斷領(lǐng)域中至關(guān)重要，比如用來確定樣本中是否存在病原體?，F(xiàn)有技術(shù)中具有許多用于核酸擴增的熱循環(huán)和等溫技木。熱循環(huán)技木，比如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)通過溫度循環(huán)來促進不斷重復(fù)的DNA合成循環(huán)，從而導(dǎo)致合成了數(shù)量與模板核酸的原始數(shù)量成一定比例的大量新的DNA。已經(jīng)形成了許多并不依賴熱循環(huán)來促進擴增反應(yīng)的等溫技木。已經(jīng)形成了用于不涉及RNA-合成步驟的擴增反應(yīng)的等溫技木，這些等溫技術(shù)使用具有鏈置換活性的DNA聚合酶。類似地，對于涉及RNA合成步驟的擴增反應(yīng)而言，已經(jīng)形成了等溫技術(shù)，這些等溫技術(shù)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H和/或依賴DNA 的 RNA 聚合酶(參見比如 Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies-Areview. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids,第 27 卷，2008 年 3 月第 3 期，第224-243 頁)。通常將通過所采用的擴增技術(shù)生成的多核酸稱為擴增子。所產(chǎn)生的擴增子的特性針對所進行的核酸擴增技術(shù)具有較大差異。例如，核酸擴增技術(shù)比如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可能產(chǎn)生尺寸和序列實質(zhì)上相同的擴增子。而另ー些核酸擴增技術(shù)可能產(chǎn)生尺寸差異較大的擴增子，其中，這些擴增子由不同數(shù)量的重復(fù)序列組成，因此擴增子是不同長度的串聯(lián)體的集合。這些串聯(lián)體中的重復(fù)序列反映了多核酸的序列，該多核酸是所執(zhí)行的實驗的對象。鑒于核酸擴增技術(shù)在許多領(lǐng)域中比如診斷領(lǐng)域中具有相當(dāng)?shù)闹匾?，因此，業(yè)界仍然有提供速度、靈敏度及特異性得到改善的核酸擴增技術(shù)的需求。本發(fā)明提供一種簡單及成本效益劃算的方法來改善速度、靈敏度及特異性。此外，本發(fā)明具有有益效果通過本發(fā)明方法實現(xiàn)的速度増加能夠抵消序列依賴性問題所導(dǎo)致的擴展速度的減小，這些序列依賴性問題導(dǎo)致針對特定核酸擴增技術(shù)的引物設(shè)計變得次優(yōu)化。這種速度増加可進ー步降低基于特定核酸擴增技術(shù)的實驗成本，因為可以不必使用其他成本較高的増加擴增速度的方法。
具體實施方式本發(fā)明提供ー種改進的多核酸擴增方法因此，在一個實施例中，本發(fā)明提供ー種合成多核酸的方法，該方法包括如下步驟a)提供包括至少第一和第二交互引物結(jié)合區(qū)的目標(biāo)模板；b)提供包括第一和第二片段的第一引物，其中所述第一片段實質(zhì)上與所述模板上的第一交互引物結(jié)合區(qū)互補，并且所述第二片段包括序列，該序列實質(zhì)上與第一引物中的另ー個區(qū)域或第一引物的第一片段所生成的擴增子中的ー個區(qū)域互補，從而使得第二片段能夠形成環(huán)狀物；c)提供包括第一片段及可選的第二片段的第二引物，其中所述第一片段實質(zhì)上與模板上的第二引物結(jié)合區(qū)互補，并且所述可選的第二片段包括序列，該序列實質(zhì)上與第二引物中的另ー個區(qū)域或第二引物的第一片段所生成的擴增子中的ー個區(qū)域互補，從而使得第二區(qū)域能夠形成環(huán)狀物；d)提供至少ー個引物，其能夠與第一和第二交互引物結(jié)合區(qū)之間的區(qū)域結(jié)合；e)提供合成所述多核酸所必須的試劑和條件；f)執(zhí)行多核酸的合成。本發(fā)明的潛在原理是已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)提供一個或多個“莖部引物”，即，與正向交互引物結(jié)合區(qū)和反向交互引物結(jié)合區(qū)之間的區(qū)域結(jié)合的引物，能夠顯著增強一定的核酸擴增技術(shù)的速度和靈敏度。“正向交互引物結(jié)合位點”及“反向交互引物結(jié)合位點”指的是模板DNA和/或擴增子上正向和反向交互引物結(jié)合于其上的區(qū)域。文中使用的術(shù)語“交互引物”指的是兩個或更多引物，這些引物用于劃定在擴增過程中指數(shù)級擴增的原始模板多核苷酸區(qū)域的邊界(參考圖Ia和lb)。在一些實施例中，額外的引物可以結(jié)合到正向交互引物和/或反向交互引物的區(qū)域5’中。在使用這些額外弓丨物的情況下，正向交互弓丨物結(jié)合位點和/或反向交互引物結(jié)合位點可以包圍這些額外引物的結(jié)合區(qū)及交互引物自身的結(jié)合區(qū)。比如在ー些實施例中，該方法可以使用結(jié)合到位于正向和/或反向交互引物結(jié)合區(qū)的區(qū)域5’上的ー個或多個額外引物。比如，國際專利申請W00028082揭露了這種方法，該專利申請揭露了 “置換弓丨物”或“外部引物”的使用。國際專利申請W00028082描述了用于形成環(huán)狀物的引物(LFP)的使用?？梢詫⑿纬森h(huán)狀物的引物理解為包括第一和第二片段。其中，第一片段實質(zhì)上與模板上的引物結(jié)合區(qū)互補，并且第二片段包括序列，該序列實質(zhì)上與第一引物的第一片段生成的擴增子中的區(qū)域互補，從而使得第二片段能夠形成環(huán)狀物。并且提到除了使用形成環(huán)狀物的引物之夕卜，核酸擴增技術(shù)還使用了兩個“外部引物”。這些引物的特征在于“第一外部引物”將3’結(jié)合到模板中的“F2”位點(即，第一外部引物與“F3”位點結(jié)合，參考圖14b)，而“第二外部引物”將3’結(jié)合到第二個形成環(huán)狀物的引物的結(jié)合區(qū)“ R2c”位點(即，第二外部引物結(jié)合到“R3c”位點，參考圖14b)。因此，這些引物并沒有在擴增子的莖部區(qū)域內(nèi)結(jié)合，其位于形成環(huán)狀物的引物的引物結(jié)合位點的5’上。正向和反向交互引物結(jié)合區(qū)之間的區(qū)域表示用于確保形成擴增子的一部分但通常自身并沒有提供任何引物結(jié)合位點的區(qū)域。在文中將該區(qū)域稱為擴增子的“莖部引物”。在文中，將結(jié)合到頸部區(qū)域的引物稱為“頸部引物”(參考圖lc、圖2a_2e)?？梢詫⑶o部引物定義為結(jié)合到莖部區(qū)域的引物。也可以將這些莖部引物進ー步定義為結(jié)合到正向鏈的正向交互引物結(jié)合區(qū)的區(qū)域3’上和結(jié)合到反向鏈的反向交互引物結(jié)合區(qū)的區(qū)域3’上的引物?？梢岳斫饨换ヒ锝Y(jié)合位點與莖部引物的結(jié)合位點沒有明顯地重疊。優(yōu)選地，交互引物結(jié)合位點與莖部引物的結(jié)合位點完全沒有重疊。描述引物結(jié)合區(qū)的重疊程度時使用的詞語“明顯地”指的是引物結(jié)合位點的重疊少于10個核苷酸,少于9個核苷酸,少于8個核苷酸,少于7個核苷酸,少于6個核苷酸,少于5個核苷酸,少于4個核苷酸,少于3個核苷酸,少于2個核苷酸,或者少于I個核苷酸。優(yōu)選地，上述引物結(jié)合位點完全沒有重疊?？梢詫⑶o部引物仍然進一步定義為結(jié)合到正向鏈的正向交互引物結(jié)合區(qū)的區(qū)域3’上和結(jié)合到反向鏈的反向交互引物結(jié)合區(qū)的區(qū)域3’上 的引物，但是引物結(jié)合區(qū)并沒有顯著地與作為特定的核酸擴增技術(shù)所采用的引物尤其是用于形成環(huán)狀物的引物(LFP)的直接結(jié)果而生成的分子內(nèi)的ニ級結(jié)構(gòu)重疊(參考圖Id)。已經(jīng)驚奇發(fā)現(xiàn)使用莖部引物顯著地増加了擴增速度。其明顯優(yōu)點是比如診斷測試，可以在更短時間內(nèi)形成測試結(jié)果，即診斷測試用戶的共同數(shù)值?？焖贁U增的另ー個好處是可減小假陽性結(jié)果的可能性，進而可以增加測試的特異性。本申請發(fā)明人的經(jīng)驗是隨著擴增所需時間的増加，采用了鏈置換聚合酶的核酸擴增技術(shù)逐漸變得傾向于非特異擴増。因此，快速擴增也可以導(dǎo)致結(jié)果更精確。莖部引物不僅提供了更快速的擴增，而且提供了至少兩點關(guān)鍵好處。第一，使用莖部引物増加核酸擴增技術(shù)的擴增速度，比如増加環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)、模板重引發(fā)擴增(template re-priming amplification, TRA)、自擴張擴增(self-extendingamplification, SEA)和智能擴增過程(smart amplification process, SMAP)的擴增速度(將在下文中討論)避免了使用昂貴的替代物來實現(xiàn)速度更快的擴增，比如使用更多的聚合酶或更多的脫氧三磷酸核苷(dNTP)。比如在2009年的價格中，LAMP反應(yīng)中的Bst DNA聚合酶的數(shù)量加倍導(dǎo)致實驗成本増加了 60%，脫氧三磷酸核苷的數(shù)量加倍導(dǎo)致實驗成本增加20 %，然而增加兩個莖部弓I物僅僅導(dǎo)致實驗成本増加4 %，因為引物通常并不貴。第二，莖部引物為給定目標(biāo)模板的引物選擇提供了更大靈活性。比如，為了檢測核酸序列具有顯著差異的特定ー組病原體，將會把引物設(shè)計在病原體族基因組中顯示的序列差異最小的區(qū)域上。然而，這可能需要將ー個或多個引物放置在非優(yōu)化位點上。這對NAAT比如LAMP形成一定問題(將在下文中討論)，因為在此，最多6個不同引物的位置需要按照一定的形式調(diào)整。由于莖部引物的放置位置可以與NATT中使用的其他引物的放置位置大大不同，因此可以使用特定目標(biāo)模板中的莖部引物結(jié)合位點，否則將難以使用莖部引物結(jié)合位點。實際上在通常情況下，使用莖部引物允許將LAMP (或SMAP)方法中使用的其他引物省略棹。比如對于特定的目標(biāo)模板，發(fā)現(xiàn)所謂的“置換引物”(即，在圖14b、14c和14e中占據(jù)位置R3、F3的引物)中的其中ー個引物的優(yōu)化結(jié)合位點很困難，并且結(jié)果是測試性能受到不利影響。然而，如果目標(biāo)模板上具有適當(dāng)?shù)那o部引物結(jié)合位點的話，則增加莖部引物可以恢復(fù)置換引物的缺乏所引起的性能損失(參考圖19)。可以將該原理簡單地應(yīng)用到LAMP或SMAP中所采用的某些其它引物中。本發(fā)明方法可以通過任何NAAT得到實施，只有該NAAT導(dǎo)致形成了串聯(lián)體。文中使用的術(shù)語“串聯(lián)體”指的是多核酸，該多核酸具有實質(zhì)上類似的核苷酸序列，這些核苷酸序列在單鏈中交替鏈接。這些排列后的序列可以是相互之間的簡單重復(fù)、反向重復(fù)或其組
ム
ロ O適于生成串聯(lián)體的NAAT已為業(yè)界所熟知，并且通常包括“等溫”擴增技木。這意味著與已知的熱循環(huán)技術(shù)比如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相反，多核酸的擴增不需要培養(yǎng)溫度的變化。ー些等溫擴增技術(shù)依賴于作為擴增過程一部分的轉(zhuǎn)錄，比如基于核酸序列的擴增(NASBA，參見美國專利5409818)和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增(TMA，參見美國專利5399491)，而其他等溫擴增技術(shù)則依賴于螺旋酶或重組酶的作用，比如依賴于螺旋酶的擴增(HAD ； W02004027025)和重組酶聚合酶擴增((RPA ;W003072805)，而其他等溫擴增技術(shù)則依然依賴于一定的DNA聚合酶的鏈置換活性，比如鏈置換擴增(SDA ；US5455166)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP ；W00028082, W00134790, W00224902)、嵌合體置換反應(yīng)(RDC ;W09794126)、滾環(huán)擴增(RCA ；Lizardi, P. Μ.等· Nature Genetics, (1998) 19. 225-231)、核酸的等溫嵌合體擴增(ICAN;W00216639)、智能擴增過程(SMAP ;W02005063977)、線性等溫多聚體擴增(LIMA;Isothermal amplification and multimerization of DNA by Bst DNA polymerase,Hafner G. J. , Yang I. C. , Wolter L. C. , Stafford M. R. , Giffard P. M, BioTechniques,2001，vol. 30，no4，pp. 852-867)。以上方法同時描述于US6743605 (此后將其稱為“模板重引發(fā)擴增”或TRA)及W09601327 (此后將其稱為“自擴張擴增”或SEA)。這些NAAT的ー個特點是它們提供了通過單個引物或ー組引物的作用實現(xiàn)的多核酸的拷貝和通過單個或多個交互引物實現(xiàn)的再拷貝。從而能夠成倍速度地生成原始多核酸的拷貝。當(dāng)提及一般意義上的NAAT時，這有助于將該方法檢測到的核酸的物理片段與該原始核酸制成的第一份拷貝區(qū)別開，與該原始核酸制成的拷貝的第一份拷貝區(qū)別開，與該拷貝的拷貝的其他拷貝區(qū)別開。為簡明起見，將使用以下定義將來源于被分析的樣本中的核酸稱為“目標(biāo)模板”(參考圖3a);將實施的NAAT中的目標(biāo)模板的第一份依賴于引物的拷貝稱為“主擴增子”(參考圖3a);將實施的NAAT中的主擴增子的第一份拷貝稱為“第一代擴增子”(參考圖3b);將第一代擴增子的進ー步的拷貝籠統(tǒng)稱為“下一代擴增子”(參考圖3c)。主擴增子、第一代擴增子及下一代擴增子都是總擴增子的子集。這是可能的雙鏈擴增子包括上述子集的組合或由目標(biāo)模板自身組成。此外，這也是可能的下一代擴增子與第一代擴增子相同。進ー步可能的是根據(jù)下一代擴增子生成與第一代擴增子相同的多核酸分子。本發(fā)明的主題涉及下一代擴增子，因為下一代擴增子提供了更進一歩的下一代擴增子傳播機制，并且以提供了結(jié)果拷貝的進一歩再拷貝的方式傳播。上述擴增子的子集通常具有不同特性。主擴增子可能具有不同長度，因為可以從所采用的特定NAAT中的引物所描述的核酸區(qū)域之外的第一引物位點拷貝得到目標(biāo)模板。一般而言，NAAT的關(guān)鍵特征是提供ー種方法，該方法使得主擴增子可供所討論的NAAT所采用的另ー個交互引物使用，從而能夠生成第一代擴增子。主擴增子的依賴于引物的引發(fā)所形成的第一代擴增子將具有所使用的引物所描述的離散長度。同樣，NAAT的關(guān)鍵特征是提供ー種方法，該方法使得第一代擴增子變得可用，以便被交互引物進ー步引發(fā)，從而生成下一代擴增子。同樣，所討論的NAAT的關(guān)鍵特征是提供ー種方法，以便進一歩再拷貝下一代擴增子。對于某些NAAT而言，下一代擴增子可能實質(zhì)上與第一代擴增子不同，尤其是下一代擴增子可能是第一代擴增子的串聯(lián)體。直接從線性目標(biāo)模板產(chǎn)生串聯(lián)體形式的擴增子的方法包括LAMP、TRA、SEA和SMAP (后者是LAMP和SEA的混合形式)。在每ー種情況下，串聯(lián)體來自包括第一代擴增子的過程(參考圖3b)。因此優(yōu)選地，多核酸的合成過程通過來自以下小組的NAAT執(zhí)行LAMP、TRA、SEA和SMAP。因此，在每種情況下，本發(fā)明涉及ー種NAAT，該NAAT提供了ー個或多個引物，這些引物具有直接從線性目標(biāo)模板生成串聯(lián)體的能力。RCA也可以生成串聯(lián)體。然而在這種情況下，需要目標(biāo)模板特定的探針連接，以便形成共價閉環(huán)DNA分子。因此，在沒有任何交互引物的協(xié)助下或不要求任何包含第一和第ニ片段的引物的情況下，這種擴增子本質(zhì)上將是串聯(lián)體形式。其中，所述第一片段實質(zhì)上與所述模板上的第一交互引物結(jié)合區(qū)互補，并且所述第二片段包括序列，該序列實質(zhì)上與第一引物中的另ー個區(qū)域或第一引物的第一片段所生成的擴增子中的ー個區(qū)域互補，從而使得第二片段能夠形成環(huán)狀物。因此，RCA本身并不是本發(fā)明的主題。因此，LAMP、TRA、SEA和SMAP的共同特征是在第一代擴增子作為引物本身使用的情況下，分子內(nèi)事件或分子間事件導(dǎo)致的依賴于第一代擴增子的引發(fā)導(dǎo)致生成了下一代擴增子(文中將使用該術(shù)語表示第一代擴增子的更進一歩的拷貝以及這些拷貝的拷貝，參考圖3c)，該下一代擴增子的尺寸大于第一代擴增子并且本質(zhì)上是串聯(lián)體形式。事實上，這些NAAT的ー個特性是較短的擴增子生成了越來越長的擴增子，從而使得擴增過程中的莖部引物的結(jié)合位點的數(shù)量成倍増加，進而增強了莖部引物加快擴增速度的能力。理解引物在這些NAAT中生成串聯(lián)體的作用機制有助于理解這些莖部引物的作用效果。此外，熟悉串聯(lián)體生成機制的普通技術(shù)人員將容易想到其他可以在本發(fā)明方法中使用的適當(dāng)NAAT。圖4詳細(xì)展示了 LAMP形成串聯(lián)體結(jié)構(gòu)的過程?？梢灶A(yù)料到TRA方法通過相同的機制形成串聯(lián)體形式的擴增子。事實上，圖4b-4c展示了至少兩種形成串聯(lián)體的機制，一個是通過分子內(nèi)的機制(圖4b)，而另ー個是通過分子間的機制(圖4c)。事實上，如圖所示，從第一代和下一代擴增子的結(jié)構(gòu)方面講，兩種機制具有相同結(jié)果(比較圖4b(iv)與圖4c (iv))。應(yīng)當(dāng)理解圖4中僅僅結(jié)合正向交互引物結(jié)合區(qū)展示的流程可以均等地適用于反向交互引物結(jié)合區(qū)。此外，應(yīng)當(dāng)將上述流程理解為可以由下一代擴增子重復(fù)，從而可以形成越來越長的串聯(lián)體。通過SEA生成的串聯(lián)體基本上與LAMP和TRA生成的串聯(lián)體一祥，區(qū)別在于引物自身內(nèi)具有固有的必須的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)，而不需要多核酸上的引物擴張來形成反向重復(fù)結(jié)構(gòu)(LAMP和TRA的情況)。圖5a-5c展示了如同用于LAMP/TRA的用于SEA的對應(yīng)機制。許多NAAT使用了在文中被稱為“簡單引物”的東西(圖6a)。文中所使用的術(shù)語“簡單引物”指的是實質(zhì)上與多核酸上的引物結(jié)合位點互補的引物，并且該引物不含大量其他核苷酸，即與引物結(jié)合位點實質(zhì)上互補的引物區(qū)域的核苷酸3’或5’。文中使用的術(shù)語“實質(zhì)上”是指簡單引物包含的額外核苷酸的數(shù)量少于20個，少于15個，少于10個或少于 5個。LAMP和TRA(lSMAP)中采用的引物在擴增子中產(chǎn)生單鏈環(huán)狀物，因此將該引物稱為“用于形成環(huán)狀物的引物”(LFP)。文中使用的術(shù)語“LFP”是指包括第一個第二片段的引物，其中，所述第一片段實質(zhì)上與所述模板上的引物結(jié)合區(qū)互補，并且所述第二片段包括序列，該序列實質(zhì)上與第一引物的第一片段所生成的擴增子中的ー個區(qū)域互補，從而使得第二片段能夠形成環(huán)狀物。LFP的大致結(jié)構(gòu)展示于圖6b中。LFP導(dǎo)致的目標(biāo)模板的引發(fā)所形成的第一代(和下一代)擴增子包含了單鏈多核苷酸環(huán)狀物，并伴有反向重復(fù)序列的沃森-克里克堿基配對所形成的雙鏈多核苷酸?？梢岳斫鈫捂湺嗪塑账岘h(huán)狀物可以與所討論的NAAT所采用的其他引物結(jié)合，但不會與莖部引物結(jié)合。圖6c展示了 SEA(及作為SEA與LAMP的混合形式的SMAP)所采用的引物?？梢钥闯鲞@些引物在其5’端部包含隨機的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)。因此，該引物導(dǎo)致的目標(biāo)模板的引發(fā)所產(chǎn)生的第一代擴增子將形成緊密發(fā)卡環(huán)狀物，該緊密發(fā)卡環(huán)狀物將可能導(dǎo)致第一代擴增子自我引發(fā)(或引發(fā)(prime off)類似擴增 子)。在文中，將這種引物稱為“發(fā)卡引物”。文中所使用的術(shù)語“發(fā)卡引物”是指包括第一和第二片段的引物，其中所述第一片段實質(zhì)上與所述模板上的引物結(jié)合區(qū)互補，并且所述第二片段包括序列，該序列實質(zhì)上與第一引物中的另ー個區(qū)域互補。發(fā)卡引物通常不提供位于第一代或下一代擴增子中的單鏈多核苷酸環(huán)狀物，其可以供討論中的NAAT所采用的其他多核苷酸結(jié)合。然而，本申請的發(fā)明人已經(jīng)意識到能夠提供發(fā)卡引物，其中，引物中的第二片段中的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)由接頭區(qū)域分開。接頭長度可以為至少10個核苷酸，至少15個核苷酸，至少20個核苷酸或至少30個、至少40個、至少50個或至少60個核苷酸。這種引物可以形成單鏈環(huán)狀物，并且允許在擴增過程中結(jié)合額外的引物(參考圖64和圖8c)。在文中，將包含位于反向重復(fù)結(jié)構(gòu)之間的這種接頭的發(fā)卡引物稱為“提供環(huán)狀物的引物”(loop-providing primers, LPP)。這種引物沒有見諸現(xiàn)有技術(shù)中，因此形成了本發(fā)明的優(yōu)選特征。很明確，LAMP、SMAP和SEA使用能夠在第一代擴增子中產(chǎn)生反向重復(fù)結(jié)構(gòu)的引物，從而允許第一代擴增子的分子內(nèi)引發(fā)。結(jié)果是，第一代擴增子拷貝了自身的一部分(section)，因此形成了串聯(lián)體。在TRA中，則上述機制不明顯。不過，TRA確實生成了串聯(lián)體，并且可能通過與LAMP相同的機制生成了串聯(lián)體(參考例子I及相關(guān)的附圖7)。上述分子內(nèi)的引發(fā)并不是可供這些方法中采用的引物使用以便生成串聯(lián)體的唯一的機制，而是不論精確的機制如何，莖部引物的有益效果是明顯的。正如針對LAMP、TRA和SMAP中使用的LFP以便進行第一代擴增子的分子內(nèi)(參考圖8a)或分子間(參考圖Sb)自我引發(fā)所討論的那樣，結(jié)果形成的下一代擴增子使得單鏈區(qū)域可供使用，單鏈區(qū)域能夠結(jié)合原始引物，該原始引物用于從目標(biāo)模板生成擴增子。應(yīng)當(dāng)注意所形成的單鏈環(huán)狀物的交互鏈能夠結(jié)合下文中提到的“環(huán)狀引物”。在SEA和SMAP中描述的發(fā)卡引物沒有在擴增子中產(chǎn)生這種單鏈環(huán)狀物。然而，如前所述，發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識到通過使用包含位于反向重復(fù)結(jié)構(gòu)之間的接頭區(qū)域的SEA引物的變體(圖6d中展示的LPP)，發(fā)卡引物可以生成單鏈環(huán)狀物，如圖Sc所示。LFP及LPP能夠生成穩(wěn)定的擴增子單鏈區(qū)域的能力對于其他擴增子的快速傳播至關(guān)重要，并且這種能力展示了采用這些引物的技術(shù)的關(guān)鍵特征。這意味著串聯(lián)體形式的擴增子能夠包含用于討論中的NAAT所采用的引物的許多新的引發(fā)位點(priming site)。在LAMP和TRA(以及SMAP)中，在擴增子中生成反向重復(fù)結(jié)構(gòu)的LFP也提供了擴增子的單鏈區(qū)域，這些單鏈區(qū)域自身能夠結(jié)合到擴增子的單鏈區(qū)域，并且進而引起擴增子的進ー步再拷貝，從而加快了擴增。在LAMP及SMAP中，除了可以使用LFP之外，還可以使用其他額外的引物，這些引物(被稱為環(huán)狀引物)也結(jié)合到擴增子的這些單鏈區(qū)域，以便有助于進一歩加快擴增。本發(fā)明的ー個特性是莖部引物沒有結(jié)合到LFP和/或LPP生成的穩(wěn)定單鏈環(huán)狀物，而是通過不同機制加快了擴增速度。對于LAMP、TRA和SEA(以及SMAP)而言，可以看出無論是否通過自我引發(fā)(不管是通過分子間方式還是分子內(nèi)方式實現(xiàn))、其他引物從擴增子的單鏈區(qū)域進行的結(jié)合和擴張進行的下一代擴增子的拷貝過程，還是通過其他引物與正向或反向交互引物結(jié)合區(qū)的結(jié)合動作進行的下一代擴增子的拷貝過程，都可以使得下一代擴增子的莖部區(qū)域瞬間變成單鏈結(jié)構(gòu)。根據(jù)所顯示的LAMP、TRA和SEA(及SMAP)機制，可以預(yù)料到通過其他擴增子的自我引發(fā)及再拷貝動作，或通過將引物結(jié)合到指向正向或反向交互引物結(jié)合區(qū)的引物的外露結(jié)合位點的動作，所述單鏈莖部區(qū)域?qū)⒖焖俎D(zhuǎn)換為雙鏈多核苷酸。曾期望莖部區(qū)域瞬間轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂溄Y(jié)構(gòu)，而不是穩(wěn)定地成為單鏈結(jié)構(gòu)。未曾預(yù)料莖部區(qū)域提供有用的用于擴增的引物結(jié)合位點。然而，現(xiàn)在驚奇地發(fā)現(xiàn)指向莖部區(qū)域的引物實際上大大增加了擴增速度。將莖部引物結(jié)合到擴增子的機制展示于圖9和10中。雖然期望莖部引物的動作作用于擴增子的再拷貝形成的瞬間外露的單鏈多核苷酸上，這是可能的其他機制也解釋了通過莖部引物觀察到的擴增子速度増加的原因。比如，在串聯(lián)體結(jié)構(gòu)中這是可能的正如在復(fù)制滑動過程中那樣，多核苷酸的某個鏈可能“移除出去”。當(dāng)從本質(zhì)上講，串聯(lián)體形式的多核苷酸結(jié)構(gòu)能夠在重復(fù)序列之間形成ニ級結(jié)構(gòu)的時候，這種可能性尤其明顯。所生成的單鏈多核苷酸環(huán)狀物可以提供比如莖部引物的結(jié)合位點。其他機制也可能解釋莖部引物的效果，但是，莖部引物作用于串聯(lián)體形式的多核苷酸序列是基本原理，可以將此看作本發(fā)明的共性。如前討論，適當(dāng)?shù)慕换ヒ锟梢园ǖ谝缓偷诙?，其中，第一片段實質(zhì)上與模板上的交互引物結(jié)合區(qū)互補。雖然已經(jīng)參考第一引物詳細(xì)解釋了本發(fā)明的該特性，應(yīng)當(dāng)理解相同原理稍加變通即可應(yīng)用于第二引物。術(shù)語“實質(zhì)上互補”是指第一片段具有充足的互補性，以便在NAAT過程中的通用條件下能夠結(jié)合到模板和/或擴增子上的交互引物結(jié)合區(qū)。這要求交互引物的第一片段相對于模板上的交互引物結(jié)合區(qū)具有至少70%、80%、90%、95%、99%或100%的互補性。交互引物的第一片段的長度可以為至少5個核苷酸，至少10個核苷酸，至少20個核苷酸，至少30個核苷酸，至少40個核苷酸，至少50個核苷酸，至少60個核苷酸，甚至至少70個核苷酸。在交互引物進ー步包括第二片段的場合，第二片段包括序列，該序列實質(zhì)上與第一引物中的另ー個區(qū)域或第一引物的第一片段所生成的擴增子中的ー個區(qū)域互補，從而使得第二片段能夠形成環(huán)狀物?！暗谝灰锏牡谝黄嗡傻臄U增子”是指當(dāng)聚合酶對第一引物擴張時產(chǎn)生的模板的第一份拷貝。該擴增子包括位于其5’端的第一引物的序列。在一些實施例中，第二片段與引物結(jié)合于其上的目標(biāo)模板和/或擴增子上的ー個區(qū)域?qū)嵸|(zhì)上相同。如前所述，將這種引物稱為LFP。“實質(zhì)上相同”是指第二片段與目標(biāo)模板和/或擴增子上的所述區(qū)域之間具有至少70%、80%、90%、95%、99%或100%的一致性。同時可以想象到第二片段的僅僅一部分顯示了與目標(biāo)模板上的區(qū)域之間的實質(zhì)上相同。不論是交互引物的第二片段的全部還是局部顯示了與目標(biāo)模板上的區(qū)域之間的實質(zhì)上 相同，第二片段上與目標(biāo)模板和/或擴增子上的區(qū)域?qū)嵸|(zhì)上相同的區(qū)域的長度至少為5個核苷酸，至少10個核苷酸，至少20個核苷酸，至少30個核苷酸，至少40個核苷酸，至少50個核苷酸，至少60個核苷酸，甚至至少70個核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的該方面，一旦交互引物的第一片段被擴張而形成了第一擴增子，則第二片段能夠結(jié)合到相同鏈中的交互區(qū)域上，并且因此形成了環(huán)狀物。第二片段也可以包括ー個區(qū)域，該區(qū)域與第二片段中的另ー個區(qū)域?qū)嵸|(zhì)上互補。如前所述，將這種引物稱為發(fā)卡引物或提供環(huán)狀物的引物?！皩嵸|(zhì)上互補”是指第二片段中的兩個區(qū)域相互之間具有至少70%、80%、90%、95%、99%或100%的互補性。優(yōu)選地，互補區(qū)域的長度至少為5個核苷酸，至少10個核苷酸，至少20個核苷酸，至少30個核苷酸，至少40個核苷酸，至少50個核苷酸，至少60個核苷酸，甚至至少70個核苷酸。當(dāng)引物為發(fā)卡引物時，優(yōu)選地，第二片段中的兩個互補區(qū)域通過短的接頭區(qū)域(即，少于10個核苷酸)分開，以便有助于將兩個區(qū)域互相結(jié)合起來。接頭區(qū)域的長度允許本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員將LPP與長度為至少10個核苷酸的接頭區(qū)域或與具有長度小于10個核苷酸的接頭區(qū)域的發(fā)卡引物區(qū)別開。引物的第一片段與第二片段可以通過接頭區(qū)域連接起來。在一些實施例中，接頭區(qū)域與該引物的第一片段實質(zhì)上相同，以便允許一旦被拷貝，則能夠?qū)⑦M一歩的 引物結(jié)合到接頭區(qū)域的互補部分(圖6d)?！皩嵸|(zhì)上相同”是指第一片段與連接到引物的第一和第二片段上的接頭區(qū)域之間的一致性至少為70%、80%、90%、95%、99%或100%。本發(fā)明方法可以通過相同種類的正向或和反向交互引物比如LFP或發(fā)卡引物來實施。當(dāng)提及“相同種類的引物”時，該術(shù)語是指所有引物均是簡單引物、LFP、LPP或發(fā)卡引物。因此，術(shù)語“不同種類的引物”是指兩種或多種引物的組合，其中至少ー個引物與其他引物種類不同。比如，在使用4個交互引物的方法中，即3個LFP及I個LPP，則將認(rèn)為這些引物是不同種類的引物。因此，可以想象到使用種類不同的正向和反向交互引物。比如，可以使用正向交互引物(比如LFP)并且結(jié)合使用反向交互引物(比如LPP或發(fā)卡引物)。將LFP或發(fā)卡引物與簡單引物組合起來也是可行的，只要引物的組合導(dǎo)致形成了串聯(lián)體。在用于擴增的NAAT采用多個(即2個或更多)正向和/或反向交互引物的情況下，將相同或不同種類的引物結(jié)合到相同的交互引物結(jié)合位點也是可行的。根據(jù)本發(fā)明的一方面，2個或更多正向和/或反向交互引物都是LFP。適當(dāng)?shù)囊锝M合對于本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。比如，這對于本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員而言顯而易見均為簡單引物的正向和反向交互引物的組合可能不會提供用于形成串聯(lián)體的機制，因此這種組合不適于在本發(fā)明中使用。一般而言，可以理解交互引物或多組交互引物作用于目標(biāo)模板的不同鏈上。此夕卜，交互引物(或每組交互引物中的其中之一)將用于劃定原始多核苷酸的拷貝和再拷貝的區(qū)域邊界。因此，指數(shù)式擴增要求至少兩個引物結(jié)合區(qū)之間的連接活動，即正向交互引物結(jié)合區(qū)與反向交互引物結(jié)合區(qū)之間的連接活動(圖la)。正向和反向交互引物結(jié)合區(qū)中的每ー個可以包括用于引物的單個結(jié)合位點，在此，交互位點位于相對的有義鏈(sensestrand)上，即，一個引物結(jié)合位點位干“正向鏈”上，而另ー個引物結(jié)合位點則位干“反向鏈”上(如圖Ia所示)。正向和反向交互引物區(qū)域也可以包括用于兩個或多個引物的結(jié)合位點，其中，特定的NAAT采用2個以上的引物。在這種情況下，這是可能的正向和/或反向交互引物結(jié)合區(qū)中的2個或多個引物結(jié)合位點都位于目標(biāo)模板和/或擴增子的相同鏈上，或位于目標(biāo)模板和/或擴增子(或其拷貝，參考圖Ib)的不同鏈上。本發(fā)明的莖部引物可以放置在正向和反向交互引物結(jié)合區(qū)之間的任何位置，只要莖部引物的結(jié)合位點沒有與正向或反向交互結(jié)合位點明顯地重疊即可。應(yīng)當(dāng)理解在采用LFP的情況下，在LFP為正向引物的情形中，正向交互引物結(jié)合區(qū)不僅包圍F2位點(即，正向交互引物結(jié)合區(qū))，而且包圍Fl位點(S卩，實質(zhì)上與LFP的第二片段相同的正向鏈上的區(qū)域)；在LFP為反向引物的情形中，反向交互引物結(jié)合區(qū)不僅包圍R2c位點(B卩，反向交互引物結(jié)合區(qū))，而且包圍Rlc位點(S卩，實質(zhì)上與LFP的第二片段相同的反向鏈上的區(qū)域，參考圖Ie和圖14)。通過這種方式，在采用2個LFP的情形中(如同LAMP和TRA的情形)，可以將莖部引物放置在Rl (c)與Fl (c)位點之間的任何位置；而在特定的NAAT中采用單個LFP的情形中，莖部引物可以結(jié)合到Rl (c)位點或Fl (c)位點的其中ー個與非-LFP占據(jù)的另ー個交互引物結(jié)合區(qū)之間。如圖2a所示，僅僅采用一個與正向或反向多核苷酸鏈結(jié)合的莖部引物是可行的?；蛘撸部梢允褂?個或多個莖部引物，這些莖部引物可以結(jié)合到擴增子的交互鏈上(圖2b)或結(jié)合到相同鏈上(圖2d)。本發(fā)明方法可以通過I個、2個、3個、4個或更多個莖部引物得以實施，這些莖部引物可以通過任意空間組合的方式使用，并且這些莖部引物可以結(jié)合到正向或反向鏈上，只要莖部引物的結(jié)合位點沒有明顯地與正向或反向交互引物結(jié)合區(qū)重疊，或根本沒有重疊(圖2e)。莖部引物可以進ー步結(jié)合到莖部區(qū)域內(nèi)的任何部位。因此，莖部引物可具有非常接近正向或反向交互引物結(jié)合區(qū)的結(jié)合位點(圖2c)。術(shù)語“非常接近”是指莖部引物的結(jié)合區(qū)與交互引物結(jié)合區(qū)之間隔開不超過10bp、50bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp 或 IOOObp0根據(jù)本發(fā)明的莖部引物的長度可以為至少5個核苷酸，至少10個核苷酸，至少20個核苷酸，至少30個核苷酸，至少40個核苷酸，至少50個核苷酸，至少60個核苷酸，至少70個核苷酸，至少80個核苷酸，或至少90個核苷酸。莖部引物可以為簡單引物。然而，可以想象到可以使用其他莖部引物比如LFP、發(fā)卡引物、LPP、嵌合引物或其他衍生物。當(dāng)使用多個莖部引物時，這些莖部引物可以種類相同，也可以為不同種類的引物的組合。當(dāng)提及“相同種類的引物”時，該術(shù)語是指所有引物均是簡單引物、LFP、LPP或發(fā)卡引物。因此，術(shù)語“不同種類的引物”是指兩種或多種引物的組合，其中至少ー個引物與其他引物種類不同。比如，在使用4個交互引物的方法中，SP3個LFP及I個LPP，則將認(rèn)為這些引物是不同種類的引物。因此，可以想象到使用種類不同的正向和反向交互引物。比如，所使用的莖部引物可以全部為簡單引物，或者它們可以為簡單引物、LFP和/或發(fā)卡引物的組合。事實上，可以想象到莖部引物可以在LAMP、TRA、SMAP或SEA的衍生物中采用莖部引物，這些衍生物使用目前采用的引物的許多引物變體，如圖20所示。正如在本說明書中針對TRA和SMAP及其他文字描述的那樣，“簡單引物”、LFP、發(fā)卡引物、含有RNA的引物、含有切ロ酶位點的弓丨物與其他新穎引物的可能組合非常多，這些新穎引物可以在新穎組合中使用，以便生成在相應(yīng)的NAAT方法中描述的衍生物。在這些組合形成能夠生成串聯(lián)體形式的擴增子的方法的情形中(所生成的串聯(lián)體擴增子能夠自我拷貝，從而生成更長的串聯(lián)體)，可以預(yù)料到莖部引物也是適用的。比如，發(fā)明人已經(jīng)注意到在LAMP中使用的置換引物(設(shè)計成在目標(biāo)模板和主擴增子上運行，而不是在第一代擴增子或下一代擴增子上運行)的主要缺點是，如果在相關(guān)LFP結(jié)合并且擴張到目標(biāo)模板之前，置換引物從其位點開始結(jié)合和擴展的話，則置換引物將阻塞并且阻止LFP的結(jié)合，LFP的結(jié)合對于指數(shù)級擴增是基本的，并且因而抑制擴增。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以在一定程度上減輕這種效果，如果使用LFP作為置換引物(例子5，圖15a-15b)，而不是使用用于置換引物的“簡單引物”結(jié)構(gòu)。這是令人信服的，因為LFP允許一定程度上的引物位點的重引發(fā)(如在與TRA技術(shù)有關(guān)的專利文獻中描述的那樣)，但更主要的是因為LFP能夠作用于第一代和下一代擴增子，以及目標(biāo)模板和主擴增子。在此，期望“簡單”置換引物僅僅作用于目標(biāo)模板和主擴增子。因此，在例子5中描述的該方法與莖部引物的使用一致。類似地，在ICAN和RDC中描述的嵌合引物可用作置換引物(而不是簡單引物)，從而允許置換引物位點的重引發(fā)，進而減小了阻塞LFP結(jié)合位點的可能性。此外，由于莖部引物用于通過在正向和反向交互結(jié)合區(qū)中發(fā)生的連接過程來增加采用LFP的方法的擴增速度，并且由于現(xiàn)有文獻中已經(jīng)有這樣的教導(dǎo)LAMP方法具有核苷酸數(shù)量的上限，核苷酸用于分開所采用的LFP的正向和反向交互結(jié)合位點(Notomi etal. Loop-meaiated isothermal amplification of DNA,Nucleic Acias Research, (2000)Vol 28.，No. 12，e63)，因此，使用莖部引物可以明確地允許正向和反向交互結(jié)合位點在序 列中隔開的距離比先前預(yù)測的隔開距離更大(尤其是如果采用多個莖部引物)。這樣的好處甚多，當(dāng)希望證明序列的兩個區(qū)域同時出現(xiàn)在多核苷酸上，但兩個區(qū)域之間的距離隔得很遠(yuǎn)時，從而允許每個相應(yīng)的區(qū)域有效地用作文中描述的NAAT中的正向和反向交互結(jié)合區(qū)。由于使用莖部引物允許正向和反向交互結(jié)合區(qū)比在沒有它們的情況下隔開的距離更遠(yuǎn)，并且允許有效地擴增，因此多核苷酸上可以存在兩個不同位點。因此，本發(fā)明提供ー種多核酸擴增方法，其中，正向和反向交互引物結(jié)合區(qū)隔開一定距離，從而使得僅僅在存在莖部引物的情況下才會合成多核酸。該距離可以通過并行執(zhí)行兩個單獨的NAAT以實驗方式確定，其中，所使用的NAAT、試劑和擴增條件相同，不同之處是將莖部引物添加到ー個反應(yīng)過程中，而沒有添加到另ー個反應(yīng)過程中。當(dāng)僅僅在存在莖部引物的情況下進行多核酸的合成時，可以認(rèn)為交互引物結(jié)合位點位于一定距離處，從而僅僅在存在莖部引物的情況下進行多核酸的合成。比如，抗藥性金黃色葡萄球菌(MRSA)中存在的mecA基因可與保守orfX序列隔開很大距離，保守orfX序列與SCCMec基因移動成分的插入位點相關(guān)聯(lián)，而SCCMec基因移動成分與MRSA相關(guān)聯(lián)(參考W002/099034)。使用莖部引物有助于通過允許將mecA基因和orfX序列作為擴增的交互結(jié)合位點使用而檢測到MRSA，甚至即使交互結(jié)合位點在序列中相距太遠(yuǎn)而無法使用方法比如LAMP。因此，根據(jù)一方面，本發(fā)明提供一種檢測樣本中的MRSA的方法。莖部引物可以包含完全自然地形成的核酸。然而，也可以預(yù)想到使用包含改性堿基(modified base)的引物。這些改性堿基的例子包括但不限于N4-甲基胞卩密唳、肌苷、核糖核苷酸、突光堿基、光解堿基(photolysable base)或通用堿基(universal base)。也可以預(yù)想到使用標(biāo)記有某個結(jié)構(gòu)(moiety)的核酸，該結(jié)構(gòu)允許檢測莖部引物和/或標(biāo)記的莖部引物結(jié)合于其上的擴增子。比如，可以對核酸進行熒光(fluorescently)標(biāo)記。也可以借助捕捉結(jié)構(gòu)(capture moiety)(比如生物素)對莖部引物進行標(biāo)記。重要地，莖部引物并不直接對擴增子的指數(shù)級擴增負(fù)責(zé)(指數(shù)級擴增由結(jié)合到正向和反向交互引物結(jié)合位點的引物進行介導(dǎo)(mediated))，而是僅僅增加擴增速度。這是因為莖部引物被視為作用于特定的NAAT所采用的其他引物的擴增產(chǎn)物。因此，莖部引物的作用通過增加正向和反向交互引物介導(dǎo)的反應(yīng)的擴增速度來發(fā)揮。這一點展示于圖Ic中，從該圖可以看出是莖部引物從目標(biāo)模板引發(fā)和擴張，而目標(biāo)模板的部分拷貝將僅僅包含正向交互引物結(jié)合區(qū)或反向交互引物結(jié)合區(qū)，而沒有同時包含兩者。因此，莖部引物生成的主擴增子將不允許交互拷貝，因此將不會對目標(biāo)模板的指數(shù)級擴增有幫助(詳細(xì)展示于圖21中)。相同的分析適用于拷貝特定的NAAT采用的其他引物生成的主擴增子的莖部引物，并且類似地適用于第一代擴增子。如果下一代擴增子(即，第一代擴增子的進ー步拷貝(及這些進ー步拷貝的拷貝))本質(zhì)上是串聯(lián)體形式，則可以預(yù)料到莖部引物將明顯地増加目標(biāo)模板的擴增速度。莖部引物作用于串聯(lián)體的要求根據(jù)這樣的要求形成如果要求特定的多核酸對指數(shù)級擴增有助的話，則該多核酸必須包含能夠作為正向和反向交互引物結(jié)合區(qū)使用的區(qū)域。可以從圖21清楚地看出通過莖部引物進行的串聯(lián)體結(jié)構(gòu)的拷貝能夠生成同時具有正向和反向交互引物結(jié)合位點的多核苷酸拷貝，而拷貝非串聯(lián)體結(jié)構(gòu)則不會具有上述效果。因此，發(fā)明人認(rèn)為莖部引物的使用將對導(dǎo)致形成串聯(lián)體的擴增方法有益處?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)莖部引物以連接的方式與NAAT中使用的其他引物互相作用，這種互相作用對于獲得觀察到的擴增速度的大幅増加至關(guān)重要。通過莖部引物觀察到的擴增速度增加無法通過參加到另ー個并且獨特的擴增過程中的莖部引物得以解釋，在擴增過程中，通過ー個莖部引物產(chǎn)生的擴增子并沒有用作特定的NAAT采用的所有其他引物的模板，以便對擴增子進行再拷貝。發(fā)明人通過實驗和理論分析證實觀察到的擴增速度的増加必須由單個的連接擴增(coupled amplification)過程實現(xiàn),而不是由兩個或多個獨特的擴增過程實現(xiàn)(在此，一個過程產(chǎn)生的擴增子無法作為另ー個過程產(chǎn)生的擴增子的模板使用)。擴增技術(shù)TRA的擴增速度的顯著增加的例子展示于例子2中(針對具有不同擴增動力學(xué)活動的多組引物)。在每種情況下，莖部引物顯著地増加了擴增速度，并且在此過程中，増加了測試進行的時間范圍內(nèi)的測試靈敏度(圖11)。因此，相對于沒有添加莖部引物的控制反應(yīng)，莖部引物可以將特定類型和數(shù)量的目標(biāo)模板的檢測時間減小至少I分鐘，減小至少2分鐘，減小至少3分鐘,減小至少5分鐘,減小至少10分鐘，減小至少20分鐘,減小至少30分鐘或減小至少60分鐘。已經(jīng)描述了 TRA的表現(xiàn)(manifestation),比如使用單個引物連同LFP的TRA,在此，應(yīng)當(dāng)這樣理解每個引物交互地結(jié)合到正向或反向交互引物結(jié)合區(qū)(US6743605)。在文中將這種組合稱為非對稱TRA或ATRA。因此，當(dāng)將莖部引物添加到TRA中的時候，有人可能認(rèn)為ー個實驗中現(xiàn)在進行了三個獨立的擴增過程，ー個是TRA，另外兩個是ATRA擴增(圖12a)。因此可能試圖爭辯莖部引物沒有TRA自身的擴增速度，而是簡單地將兩個額外的ATRA擴增添加到同一個實驗中了。然而，如果這是正確的話，則觀察到的綜合擴增速度將是TRA系統(tǒng)的擴增速度與兩個ATRA系統(tǒng)的擴增速度之總和。然而，發(fā)明人已經(jīng)說明了莖部引物的使用引起的擴增速度増加遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于實質(zhì)上互相獨立的擴增系統(tǒng)可能預(yù)料到的速度之和。在例子3中，借助莖部引物和LFP的不同組合測量擴增速度。使用單個莖部引物和單個LFP的表現(xiàn)與ATRA均等?？梢钥闯鍪褂们o部引物和LFP的兩個可能組合(即，兩個ATRA的表現(xiàn))的擴增速度具有極慢的動力學(xué)活動(圖12b(i和ii))。當(dāng)一起使用兩個LFP時(即，TRA系統(tǒng))，動力學(xué)活動快于兩個ATRA系統(tǒng)(圖12b (iii))。當(dāng)結(jié)合使用莖部、引物和LFP時，擴增速度實質(zhì)上快于先前的TRA或ATRA中任何ー個的表現(xiàn)(圖12b(iv))。在展示了 ATRA動力學(xué)活動的快慢程度的情況下(記住擴增的指數(shù)級特性)，將圖12b (iv)中所展示的擴增速度増加簡單地推斷為組合在一起的兩個ATRA和TRA系統(tǒng)的反應(yīng)速度的總和是不合理的。其中的潛在事實是莖部引物以連接的方式與指數(shù)級擴增中涉及的其他引物互相作用。再一次，這可以通過莖部引物對串聯(lián)體的作用得到合理解釋，串聯(lián)體產(chǎn)生了擴增子的拷貝，該擴增子保留有正向和反向交互引物結(jié)合區(qū)。也可以對上述實驗例子進行建摸。在例子4中，通過數(shù)學(xué)方法定義的擴增速度對三個獨立的擴增過程進行建摸。模型的輸出值為BART曲線(參考下文)。所使用的參數(shù)反映了發(fā)明人獲得的用于等溫NAAT的不同表現(xiàn)速度的結(jié)果范圍。可以看出如果比如兩個非常慢的擴增過程與非?？斓臄U增過程疊加起來，則無法觀察到當(dāng)將莖部引物添加到LAMP、LAMP+環(huán)狀引物或TRA時觀察到的那種明顯加快的擴增類型(將圖13a中的模型結(jié)果與例子2、3、5、6及7對應(yīng)的附圖ll、12b、15、16和17中展示的實驗結(jié)果進行比較)此外，圖13b (該圖展示了將快速擴增過程與兩個速度適度快的擴增過程疊加后的結(jié)果)顯示即使 在這種條件下，也沒有在模型中觀察到使用莖部引物時看到的整體擴增的明顯速度増加的類型。事實上，如圖13c所示，即使將3個快速擴增過程疊加起來，整體的擴增速度仍然僅僅是稍微快于任何單個的過程這反映了擴增的指數(shù)級特性(與例子2、3、5、6及7對應(yīng)的附圖ll、12b、15、16和17進行比較)。已經(jīng)通過多個等溫NAAT證實了莖部引物所提供的擴增速度的増加。相對于特定NAAT中采用的其他引物可被利用的莖部引物的例子展示于圖14a-14g。例子5、6和7展示了圖14中示出的多個NAAT表現(xiàn)的實驗數(shù)據(jù)。在每種情況下，都可以觀察到明顯的擴增速度増加(圖15-17)。莖部引物在形成串聯(lián)體的NAAT中的另ー個用處是作為探針，以便在熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)或其他報告系統(tǒng)中作為用干“實時”追蹤擴增程度的手段。相對于比如LFP或發(fā)卡引物，莖部引物作為包含探針的引物可能具有好處，因為其不需要在擴增子中產(chǎn)生可能影響一定類型的探針的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中使用的目標(biāo)模板可以為任何包括合適的交互引物結(jié)合區(qū)的多核酸，所述交互引物結(jié)合區(qū)允許所關(guān)注的多核酸的擴增。本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員將理解正向和反向交互引物結(jié)合位點需要以適當(dāng)方式放置在目標(biāo)模板上，從而將正向交互引物結(jié)合區(qū)域和反向交互引物結(jié)合區(qū)放置在序列上將分別在有義鏈和反義鏈上被擴增的5’上。目標(biāo)模板可以為單鏈或雙鏈結(jié)構(gòu)。當(dāng)目標(biāo)模板為單鏈多核酸時，技術(shù)人員將理解初始時，目標(biāo)模板將僅僅包括交互引物結(jié)合區(qū)。然而，第一引物的結(jié)合將引起互補鏈的合成，然后該互補鏈將包含第二交互引物結(jié)合區(qū)。目標(biāo)模板可以來自RNA分子，在此情況下，在實施本發(fā)明方法之前，需要將RNA轉(zhuǎn)錄到DNA。適當(dāng)?shù)挠糜谵D(zhuǎn)錄RNA的試劑為業(yè)界所知，并且包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄酶。除了正向和反向交互引物結(jié)合區(qū)之外，目標(biāo)模板還需要包括莖部區(qū)域，該莖部區(qū)域需要具有足夠長度，從而允許本發(fā)明的一個或多個莖部引物的結(jié)合。因此，優(yōu)選地，莖部區(qū)域的長度為至少5個核苷酸，至少10個核苷酸，至少15個核苷酸，至少20個核苷酸，至少30個核苷酸，至少50個核苷酸，至少100個核苷酸，至少200個核苷酸，至少300個核苷酸或至少500個核苷酸。
技術(shù)人員將知道除了擴增所需的引物之外，NAAT還需要進ー步的試劑，以便合成多核酸。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員將會知道這種所需的試劑，并且通常包括合適的緩沖劑、dNTP、聚合酶等。技術(shù)人員將理解在添加了執(zhí)行所討論的NAAT所必須的所有組分之后，有必要提供合成多核酸所需要的合適條件。這可以通過比如提供合適的培養(yǎng)溫度達成。優(yōu)選地，擴增在等溫條件下進行。這意味著在擴增過程中，溫度保持恒定?！昂愣ā笔侵笢囟茸兓怀^±10°C。然而，在擴增過程中涉及到大于10°C的單次溫度變化、大于10°C的兩次溫度變化、大于10°C的三次溫度變化、大于10°C的四次溫度變化或大于10°C的五次溫度變化的方法也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的多核酸的擴增可借助本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員所知的方法檢測。合適的方法包括但不限于熒光插入染料、熒光引物或探針的使用，測量渾濁度，電化學(xué)探針、生物發(fā)光信號和化學(xué)發(fā)光探針的使用。 可以借助實時方法檢測多核酸的擴增，也就是在多核酸被擴增的同時能夠進行檢測的方法。這種檢測系統(tǒng)的例子包括但不限于熒光(比如在擴增過程中加入的熒光探針)、生物發(fā)光信號和電化學(xué)探針。根據(jù)一方面，莖部引物自身可以借助可檢測的結(jié)構(gòu)進行標(biāo)記，比如熒光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物或電化學(xué)標(biāo)記物，這些標(biāo)記物允許對莖部引物結(jié)合于其上的擴增子進行檢測。因此，莖部引物在形成串聯(lián)體的NAAT中的另ー個用處是作為探針使用，以便在熒光、化學(xué)發(fā)光或電化學(xué)報告系統(tǒng)中作為用干“實時”追蹤擴增程度的手段。本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員將會想到其他合適的報告系統(tǒng)。相對于比如LFP或發(fā)卡引物，莖部引物作為包含探針的引物可能具有好處，因為它們不需要在擴增子中產(chǎn)生可能影響一定類型的探針的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)?；蛘撸梢酝ㄟ^終點測量檢測擴增產(chǎn)物，終點測量就是在多核酸的擴增完成后進行的測量。也可通過NAAT檢測中采用的其他檢測方法來檢測多核酸的擴增。合適的例子包括但不限于基因陣列、試紙條法、電泳法、質(zhì)譜分析法和聲波檢測。在一個實施例中，使用實時生物發(fā)光實驗(Bioluminescent Assay inReal-Time,BART)報告系統(tǒng)檢測多核酸的合成。該系統(tǒng)在W02004/062338和W02006/010948中得到詳細(xì)解釋，這兩篇文獻通過引用結(jié)合于此。BART是為等溫NAAT設(shè)計的ー種報告系統(tǒng)的示例，BART從樣本中形成單ー類型的信號生物發(fā)光信號。BART使用依賴于螢火蟲熒光素酶的無機焦磷酸鹽的檢測當(dāng)通過NAAT對“目標(biāo)”序列進行擴增時，產(chǎn)生的無機焦磷酸鹽的數(shù)量非常大。因此，可以借助BART通過在均勻相實驗中簡單地測量從封閉管中發(fā)射出的光線而實現(xiàn)分子診斷。已經(jīng)在多個NAAT中證實BART的運行溫度在50_63°C之間。BART報告系統(tǒng)是ー種特別有效的追蹤NAAT擴增速度的手段，因為光線的輸出代表擴增速度的即時測量值(而熒光輸出則表示信號的累積，因此需要對測量值進行微分運算以便獲得擴增速度)。圖22以舉例的方式展示了與LAMP—起使用的BART，用于檢測稀釋系列的特定目標(biāo)DNA分子。注意隨著樣本中目標(biāo)DNA數(shù)量的減少，達到光線量最大的時間所需的延滯期(該延滯期與達到最大擴增的延滯期成正比)増加。換句話說，達到與BART中的陽性樣本相關(guān)聯(lián)的特征光線峰值(characteristic light peak)的時間的增加與樣本中的目標(biāo)多核酸的數(shù)量成反比。需要強調(diào)的是雖然上述例子使用了 BART報告系統(tǒng)，本發(fā)明不限制于使用BART系統(tǒng)，而是可以均等地適用于其他方法，比如熒光、渾濁度、其他光譜技術(shù)或電化學(xué)測量方法，而與這些方法是否在擴增的實時測量中或終點測量中使用無關(guān)。優(yōu)選地，本發(fā)明方法在密封容器中進行。這樣做的好處極大，因為可以減小甚至避免實驗室被污染的可能性。這是特別重要的，因為即使模板多核酸或擴增子的一個拷貝逃逸進實驗室，都可能會對將要測試的其他樣本造成污染，并且產(chǎn)生假陽性結(jié)果。因此，在將本發(fā)明方法用于診斷領(lǐng)域時，避免污染的能力特別重要。本發(fā)明方法的進ー步用途是用于確定有機體的遺傳密碼中是否存在特定的多核酸序列。比如，本方法可用于確定作為模板核酸起源的核酸是否為轉(zhuǎn)基因，用于檢測與特定的非轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因植物種子相關(guān)的DNA，用于檢測與純種動物相關(guān)的DNA，或用于醫(yī)療或獸醫(yī)診斷用途比如基因檢測或法醫(yī)學(xué)。本發(fā)明方法也適于檢測單核苷酸多態(tài)性(,single-nucleotide polymorphisms, SNP)。根據(jù)本發(fā)明的方法可用于診斷用途。特別是，該方法允許對患者或樣本中的有機體進行鑒定和定量化。有機體可以為任何微生物比如病毒、細(xì)菌、支原體或真菌。微生物可以為致病微生物，但是也可以為非致病微生物。微生物也可以為轉(zhuǎn)基因組織(geneticallymodified organism,GM0)。此外,本發(fā)明方法可用于識別轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物和動物,用于檢測疾病狀態(tài)，用于預(yù)測診療中的不良反應(yīng)，以及用于疾病狀態(tài)感染性預(yù)測?！盎颊邩颖尽笆侵笍幕颊呱砩先〕龅娜魏螛颖?，其可以包括血液、糞便、藥簽、痰、支氣管肺泡灌洗液、組織樣本、尿液或脊髄液。其他適當(dāng)?shù)幕颊邩颖炯捌涮崛》椒闃I(yè)界的普通技術(shù)人員所熟悉。用于提取樣本的“患者”或“主體”可以為人或動物。當(dāng)沒有將樣本特定地稱為患者樣本時，本術(shù)語也可以包括從其他來源提取的樣本。這些例子包括來自表面的藥簽、水樣本(比如廢水、海水、湖水、飲用水)、食品樣本、化妝品、藥品、發(fā)酵品、細(xì)胞和微生物培養(yǎng)物及其他需要檢測微生物的樣本。根據(jù)另一方面，提供一種在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的裝置(kit)。優(yōu)選地，所述裝置包括實施本發(fā)明方法所必須的所有組件，除了待檢測的目標(biāo)多核酸之外，除非目標(biāo)多核酸形成了所供應(yīng)的陽性對照的一部分。一種在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的裝置優(yōu)選地包括多核酸聚合酶、用于核酸聚合酶的底物及適于對目標(biāo)多核酸進行等溫擴增的引物(如前所述)。更優(yōu)選地，裝置進ー步包括緩沖試劑，比如鎂離子源，業(yè)界所知的用于改善NAAT性能的添加劑比如三甲銨こ內(nèi)酷，或已知的用于提高裝置試劑保質(zhì)期的添加劑比如海藻糖，或已知的有助于保存試劑的添加劑比如疊氮化鈉。或者，一種在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的裝置可以僅僅包括這些組件和/或額外組件的一部分。然而可以將從裝置中去掉的樣本及任何其他組件在使用時添加到裝置中。當(dāng)使用BART檢測多核酸時，可以將熱穩(wěn)定性熒光素酶、蟲熒光素及將無機焦磷酸鹽(PPi)轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP的酶比如ATP硫化酶，及其他任何必要的將PPi轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP的酶的底物和輔因子比如腺苷酰硫酸包含在所述裝置中。因此在ー個實施例中，用于結(jié)合BART使用的裝置包括a)核酸聚合酶，b)至少ー個莖部引物，c)對測試樣本的等溫擴增適宜的至少兩個交互引物，d)熱穩(wěn)定性熒光素酶，e)蟲熒光素，f)ATP硫化酶，及g)腺苷酰硫酸。
優(yōu)選地，所述裝置中的至少ー個組件被冷凍(Iyophilized)或呈另ー種適于在裝置中儲存的形式。更優(yōu)選地，裝置中的所有組件被冷凍或呈另ー種或多種適于在裝置中儲存的形式。這些其他形式包括已經(jīng)添加了穩(wěn)定因子(stabilizing factors)的組件和/或包含裝置組件的冷凍或冷藏試劑盒。
一般說明相對于數(shù)字X描述的術(shù)語“大約”是可選的并且是指比如x±10%。術(shù)語“包括”涵蓋“由...組成”，比如組分“包括” X可能是指只包括X，也可以指還包括其他東西，比如X+Y。BART是指用于確定樣本中存在的模板多核酸數(shù)量的方法，在此，可以檢測到是否存在來源于擴增反應(yīng)的無機磷酸鹽，并且可以顯示樣本中的模板多核酸的數(shù)量。現(xiàn)在將通過舉例的形式詳細(xì)描述本發(fā)明的多個實施例。應(yīng)當(dāng)理解在不脫離本發(fā)明范圍的情況下，可以對細(xì)節(jié)進行修改。


圖I該圖展示了指數(shù)級擴增通常所需的多核苷酸上的兩個區(qū)域，不論是使用兩個引物(圖Ia)，還是使用多個引物(圖lb)。參考這些區(qū)域，多核苷酸的莖部區(qū)域(本發(fā)明的主題)展示于圖Ic中。圖Id清楚地展示了在這些方法中形成的所期望的第一代擴增子中用于NAAT (文中將其稱為LAMP和TRA)的莖部區(qū)域。圖Id顯示了莖部區(qū)域位于形成分子內(nèi)環(huán)狀物的過程中涉及的擴增子區(qū)域之間。注意事實上，雖然LAMP和TRA所表示的第一代有所不同(參見相關(guān)專利申請)，其結(jié)構(gòu)事實上相同。圖Ie清楚地顯示了位于目標(biāo)模板上的用于NAAT (文中將其稱為LAMP和TRA)的莖部區(qū)域。圖2該圖展示了將I個、2個或多個莖部引物放置到莖部區(qū)域的多個手段。圖3該圖展示了各種類型的擴增子的生成過程，包括主擴增子的生成(圖3a)，第一代擴增子的生成(圖3b)和下一代擴增子的生成(圖3c)。圖4該圖展示了 LFP形成串聯(lián)體結(jié)構(gòu)的流程。在第一個例子中，形成了主擴增子，該主擴增子在其5’端具有反向重復(fù)結(jié)構(gòu)(圖4a)，因此圖4a(ii)顯示從主擴增子的5’端開始，具有Fl區(qū)域，繼續(xù)沿著擴增子并且在同一個鏈內(nèi)具有該區(qū)域的互補部分Flc (在該圖及以后的附圖中，小寫字母c表示引物結(jié)合區(qū)的互補部分)。圖4a沒有詳細(xì)展示特定的NAAT提供的機制，該機制用于讓主擴增子成為單鏈結(jié)構(gòu)，并且可供另ー個引物拷貝，但是該機制通過指向圖4a(iii)的兩個黑箭頭來表示，在此也展示了作為結(jié)果的第一代擴增子。LFP形成的第一代擴增子自身可以用作引物，以便生成進ー步的擴增子。在此過程中，可以形成串聯(lián)體結(jié)構(gòu)。具有兩種形成串聯(lián)體的主要機制，其中ー個是通過分子內(nèi)的事件(如圖4b所示)，另ー個是通過分子間的事件(如圖4c所示)。注意在上述兩種情況下，該流程在串聯(lián)體內(nèi)形成擴增子的單鏈區(qū)域，參考圖4b(ii)、(iii)和圖4c(ii)、(iii)中的區(qū)域F2。這些區(qū)域可以結(jié)合進ー步的LFP。圖8展示了接下來的步驟。圖5該圖展示了與圖4相同的流程，區(qū)別是發(fā)卡引物內(nèi)具有固有的形成串聯(lián)體所需的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)，因此不需要通過鏈擴展來按照LFP形成。
圖6 該圖展示了文中提及的各種引物的特性。圖6a展示了 “簡單引物”，在此，大部分或全部引物與多核苷酸模板之間進行了沃森-克里克堿基配。圖6b展示了 LFP與簡單引物的不同之處，區(qū)別是具有額外的5’區(qū)域，該區(qū)域?qū)嵸|(zhì)上與所述引物的3’端的結(jié)合位點的區(qū)域3’相同。上述區(qū)別帶來的結(jié)果是該引物的擴展生成了位于引物的5’區(qū)域與擴展產(chǎn)物之間的反向重復(fù)結(jié)果(參考圖4a(ii))。圖6c展示了在SEA中使用的發(fā)卡引物。這些引物的5’區(qū)域包含了反向重復(fù)結(jié)構(gòu)，從而可望5’區(qū)域折疊成發(fā)卡結(jié)構(gòu)?？赏l(fā)卡為緊密發(fā)卡，該緊密發(fā)卡包含非常少的單鏈核苷酸，因此該單鏈區(qū)域不太可能與另ー個引物結(jié)合。然而，如果發(fā)卡放大從而形成圖6d所示的環(huán)狀物，則引物與該環(huán)狀物之間的結(jié)合是可能的。圖7該圖展示了通過溴化こ錠染色的瓊脂糖凝膠，在此，并排展示了兩個不同擴增技術(shù)的結(jié)果，其中ー個是LAMP，另ー個是TRA。對于LAMP而言，擴增使用了置換引物和LFP(但不是環(huán)狀引物)。對于TRA而言，擴增則使用了與LAMP中相同的LFP，但是沒有其他引物。可容易看出LAMP和TRA都產(chǎn)生串聯(lián)體形式的擴增子。此外，擴增子的大小明顯相同。這意味著LAMP和TRA具有共同的串聯(lián)化(concatamerisation)機制。圖8該圖展示了將進一歩的LFP結(jié)合到這些LFP先前生成的環(huán)狀物的效果。圖8a展示了結(jié)合到環(huán)狀物的LFP，這些環(huán)狀物通過第一代擴增子(或下一代擴增子)的分子內(nèi)的自我引發(fā)形成。圖8b展示了結(jié)合到環(huán)狀物的LFP，這些環(huán)狀物為分子間形成的環(huán)狀物。在以上兩種情況下，新結(jié)合的LFP的擴張導(dǎo)致相對鏈成了單鏈結(jié)構(gòu)(圖8a(ii)和圖8b(ii))。圖9將展示莖部引物如何結(jié)合到這些區(qū)域。圖Sc強調(diào)如果對發(fā)卡引物進行了修改(圖8a(ii))，以便提供包含了與引物的3’端相同的序列的固有單鏈環(huán)狀物(如圖8c(ii)所示)，則結(jié)果形成的下一代擴增子將提供用干與進ー步的發(fā)卡引物結(jié)合的單鏈環(huán)狀物(圖8c (iii))。圖9不論是分子內(nèi)(圖9a(i))還是分子間(圖9a(ii))的下一代擴增子的形成過程，擴增子的莖部區(qū)域外露稱為單鏈結(jié)構(gòu)，并且可供莖部引物結(jié)合。對于LFP形成的交互環(huán)狀物(即，圖8a所示的所生成的交互鏈結(jié)構(gòu)的環(huán)狀物)而言，情況也是如此。該環(huán)狀物無法結(jié)合LFP，但是該環(huán)狀物與LFP具有相同的義向(sense)，但是當(dāng)采用所謂的環(huán)狀引物時，該環(huán)狀物可以與環(huán)狀引物結(jié)合(圖9b(i))。環(huán)狀引物的擴張同時使得擴增子的莖部區(qū)域變成單鏈結(jié)構(gòu)，因此可以與莖部引物結(jié)合(圖9b(ii))。圖10該圖展示了針對SEA，通過擴增子自我擴張實現(xiàn)的下一代擴增子的再拷貝使得擴增子的莖部區(qū)域變得可供莖部引物結(jié)合的過程。圖11該圖展示了針對單增李斯特菌系統(tǒng)中的三組不同引物的通過BART追蹤的TRA中借助莖部引物實現(xiàn)的速度増加。LFP和莖部引物的示意位置展示于圖ll(i)中。圖ll(ii)-ll(iv)展示了慢、適中和快速LFP小組在沒有莖部引物時的速度(左側(cè)的圖)與存在莖部引物時的速度(右側(cè)的圖)之間的BART比較。在每個圖表中，早期出現(xiàn)的峰值代表較高的拷貝數(shù)(108)，而后期出現(xiàn)的峰值(如果可以看到)代表目標(biāo)的IO4拷貝。用淺灰色線表示無模板對照(No-template controls)。圖12該圖展示了如何將單增李斯特菌系統(tǒng)中的TRA中的莖部引物的使用(圖12a⑴)分解為三個獨立的擴增過程，其中之ー是TRA，而另外兩個是ATRA(圖12a(ii))。ATRA與TRA速度的BART比較以及引物的所有組合展示于圖12b(i)-(iv)中。在每個圖表中，早期出現(xiàn)的峰值代表較高的拷貝數(shù)(108)，而后期出現(xiàn)的峰值(如果可看到)代表目標(biāo)的IO4拷貝。淺灰色線表示無模板對照。圖13該圖展示了 BART的動力學(xué)模型，其中將3個不同的擴增反應(yīng)組合起來。在圖13a中，快速NAAT與2個非常慢的NAAT組合起來，可以看出擴增的綜合速度(即，3個擴增反應(yīng)速度的總和)出現(xiàn)了在時序上與3個NAAT中最快的那個相同的BART峰值。圖13b與圖13a類似，區(qū)別是將快速NAAT與兩個稍微更快的NAAT組合起來，在這種情況下，擴增的綜合速度僅僅是稍微受到影響，并且BART峰值的出現(xiàn)僅僅早了幾分鐘。圖13c與圖13b及圖13a類似，區(qū)別是所謂的較慢的NAAT現(xiàn)在與最快的NAAT的速度相同結(jié)合后的擴增綜合速度仍然僅僅是稍微受到影響，并且BART峰值的出現(xiàn)僅僅早了幾分鐘。圖13說明當(dāng)多個不同的指數(shù)級流程同時發(fā)生時，并沒有觀察到明顯較早的BART峰值(采用莖部引物時可以觀察到)。這表明當(dāng)特定的NAAT采用莖部引物時，莖部引物的作用是促使擴增的固有速度得到重要和顯著的増加，而不是加入?yún)g獨的較慢或類似速度的流程中。圖14對于圖14中的每部分(a)-(g)，每個部分中的部位(i)展示了雙鏈模板中各種NAAT采用的引物的引物結(jié)合位點的位置。與正向交互結(jié)合區(qū)相關(guān)的引物通過F表示，那些與反向交互結(jié)合區(qū)相關(guān)聯(lián)的引物通過R表示。每個部分中的部位(ii)展示了特定NAAT采用的各種引物結(jié)合到相應(yīng)的鏈上，同時展示了莖部引物的結(jié)合的潛在位置，但是莖部引物的精確位置及所采用的莖部引物的數(shù)量可能差異很大，如圖2所示。圖14a展示了在TRA中活動的莖部引物。圖14b展示了在LAMP中活動的莖部引物。圖14c展示了在LAMP的改進表現(xiàn)中活動的莖部引物，LAMP的改進表現(xiàn)也適用環(huán)狀引物。圖14d展示了在SEA中活動的莖部引物。圖14e展示了在SMAP中活動的莖部引物。圖14f 展示了在ATRA中活動的莖部引物。而圖14g展示了在具有套式(nested) LFP的TRA中活動的莖部引物。圖15該圖展示了腸炎沙門氏菌系統(tǒng)中的TRA中存在和不存在莖部引物時的套式LFP的效果。圖15a展示了莖部加速的TRA(圖15a(i))與莖部加速的LAMP(圖15a(ii))及莖部加速的套式TRA(圖15a(iii))之間的比較結(jié)果。在每個圖表中，早期出現(xiàn)的峰值代表較 高的拷貝數(shù)(108)，而后期出現(xiàn)的峰值(如果可以看到)代表目標(biāo)的IO4拷貝。用淺灰色線表示無模板對照。圖15(i_iv)分別展示了不存在莖部引物和存在莖部引物的情況下，具有內(nèi)部LFP的TRA與具有外部LFP的TRA及同時具有內(nèi)部和外部LFP的TRA的BART速度之間的比較結(jié)果。在每個圖表中，早期出現(xiàn)的峰值代表較高的拷貝數(shù)(108)，而后期出現(xiàn)的峰值(如果可以看到)代表目標(biāo)的IO4拷貝。用淺灰色線表示無模板對照。圖16該圖展示了單增李斯特菌系統(tǒng)中通過BART追蹤的LAMP中使用莖部引物導(dǎo)致的速度増加。所有引物的示意位置展示在圖16(iii)中，而存在和不存在莖部引物時的速度的BART比較則展示在圖16(i)和圖16(ii)中。在每個圖表中，早期出現(xiàn)的峰值代表較高的拷貝數(shù)(108)，而后期出現(xiàn)的峰值(如果可以看到)代表目標(biāo)的IO4拷貝。用淺灰色線表示無模板對照。圖17該圖展示了單增李斯特菌系統(tǒng)中通過BART追蹤的TRA中使用莖部引物導(dǎo)致的速度増加，在此，與上述例子相比，莖部引物位于莖部的不同區(qū)域。所有引物的示意位置展示在圖17 (iii)中，而存在和不存在莖部引物時的速度的BART比較則展示在圖17 (i)和圖17(ii)中。在每個圖表中，早期出現(xiàn)的峰值代表較高的拷貝數(shù)(108)，而后期出現(xiàn)的峰值(如果可以看到)代表目標(biāo)的IO4拷貝。用淺灰色線表示無模板對照。圖18與比如LAMP中的環(huán)狀引物進行比較，莖部引物在該圖中顯示為具有更大的放置自由度。嚴(yán)格地講，環(huán)狀引物限制于Fl與F2位點之間，或限制于Rl與R2位點之間。如果序列的實際情況不允許有效地放置一個或多個環(huán)狀引物(因為環(huán)狀物要么不夠長，要么環(huán)狀引物可能通過引物ニ聚體而導(dǎo)致非特異擴増)，則可能無法選擇其他的環(huán)狀引物設(shè)計。莖部引物可以放置在頸部的任何位置，并且它們具有適當(dāng)朝向，從而允許有較大幅度的設(shè)計選擇，并且優(yōu)化成具有最高效率，同時避免了任何非特異的引物ニ聚作用。圖19該圖展示了假想的多核苷酸序列，在此，合適的引物結(jié)合位點用盒子形狀的區(qū)域表示。然而，相對于白色區(qū)域，灰色區(qū)域是更優(yōu)選的結(jié)合位點，可能因為有機體的基因組在該部位具有更好的序列保守性(sequence conservation)(當(dāng)設(shè)計比如在不同品系(strain)之間具有明顯序列差異的病原體的診斷測試時，該序列保守性有關(guān)聯(lián))。在圖19(ii)中，針對與環(huán)狀引物一起使用的LAMP，將不同區(qū)域賦予在LAMP的表現(xiàn)中使用的引物。注意必須將引物中的4個引物放置在非優(yōu)化的結(jié)合位點上，而根本沒有使用優(yōu)化的結(jié)合位點。這顯然是不理想的。另ー種情況是像圖19(iii)那樣放置引物，在此，使用了所有優(yōu)化的結(jié)合位點。然而在該表現(xiàn)中，Rl和R2位點互相之間非?？拷?，這意味著完全釋放了(loosing)環(huán)狀物R引物的位點。發(fā)明人也已經(jīng)看出當(dāng)Rl和R2位點互相之間非?？拷鼤r(或者交互的Fl和F2之間)，可能會發(fā)生非優(yōu)化的擴增，可能是因為在所形成的環(huán)狀物中具有位阻(steric hindrance)。發(fā)明人進ー步觀察到環(huán)狀引物通常比置換 引物更能增加擴增速度。因此，可以預(yù)料到圖19(iii)中的引物分配非常不理想。然而在圖19 (iv)中，通過使用莖部引物，可以使用所有的優(yōu)化結(jié)合位點，而且可以使用所有的環(huán)狀和置換引物位點。因此，莖部引物増加了引物設(shè)計的靈活性。圖20該圖顯示了針對所有置換引物、環(huán)狀引物和莖部引物，使用各種類型的引物而不是“簡單引物”是可行的。許多可能組合中的三種展示于圖20(i)-(iii)中，在此僅僅展示了正向交互引物結(jié)合區(qū)和莖部引物。在圖20(i)中采用了 LFP、發(fā)卡引物和簡單引物的組合。在圖20(ii)中，環(huán)狀引物用改性簡單引物表示，改性簡單引物包含RNA區(qū)域或切ロ酶的裂解位點(cleavage site)。在圖20(iii)中展示了 LFP、發(fā)卡引物和可裂解簡單引物的其他可能的組合。許多其他組合也是十分明顯的。圖21該圖說明如果將莖部引物作用于串聯(lián)體，則莖部引物的作用將僅僅產(chǎn)生指數(shù)級擴增的擴增子。圖21的左側(cè)展示了莖部引物對第一 代擴增子的作用?？梢钥闯鼋Y(jié)果形成的擴增子僅僅包含反向交互引物結(jié)合區(qū)，而沒有包含指數(shù)級擴增所必須的正向交互引物結(jié)合區(qū)。相比之下，從圖21的右側(cè)可以看出當(dāng)莖部引物可以通過串聯(lián)體擴展時(所展示的莖部引物2可以擴展，而莖部引物I則不行)，結(jié)果形成的擴增子將同時具有正向和反向交互引物結(jié)合區(qū)，并且因此是指數(shù)級擴增的底物。圖22該圖展示了 BART-NAAT的ー個例子，強調(diào)了該技術(shù)的量化屬性。BART象征了追蹤NAAT中的擴增速度的有效手段，因為生物發(fā)光的輸出反映了擴增的即時速度。圖23圖23(i)展示了與MRSA相關(guān)聯(lián)的葡萄球菌染色體mec盒(SCCmeccassette)的一部分。SCCmec移動基因成分整合到了金黃色葡萄球菌的OrfX基因中的保守區(qū)域中，從而通過MecA基因?qū)⒖剐?resistance)傳遞給抗菌性甲氧西林。因此，MecA基因和OrfX基因位于相同的DNA鏈上。然而，針對不同版本的SCCmec (及MRSA的不同品系)，序列內(nèi)的MecA基因與OrfX基因之間的距離可能相差很大。因此，這已經(jīng)從技術(shù)上證明相當(dāng)困難在MRSA的診斷實驗中將MecA基因和OrfX基因用作特定NAAT的交互引物結(jié)合區(qū)。比如，如果MecA基因和OrfX基因之間隔開到大于500個堿基對(base-pair)，并且將MecA基因和OrfX基因用作正向和反向交互引物結(jié)合位點的位點，則LAMP不太可能會擴增任何產(chǎn)物(圖23(ii))。然而，由于莖部引物明顯地改善了 NAAT比如LAMP擴增目標(biāo)的能力，并且由于使用了 MecA基因和OrfX基因作為正向和反向交互引物結(jié)合位點的擴增子的“莖部”可被多個莖部引物定向(targeted),同時由于已經(jīng)證實莖部引物以連接的方式與正向和反向交互引物配合，因此，莖部引物允許借助適當(dāng)?shù)腘AAT比如LAMP進行MRSA的直接檢測(圖23 (iii))?？梢允褂煤芏嗲o部引物來解決MecA基因和OrfX基因之間的區(qū)域的差異。如上所述，相對于現(xiàn)有技術(shù)(其僅僅依賴OrfX和SCCmec的區(qū)域而不是MecA來指示MRSA的存在性)，使用莖部引物具有優(yōu)勢。這是因為ー些金黃色葡萄球菌包含SCCmec插入物，該插入物不含MecA基因，因此不是真正的MRSA。由于本方法需要MecA基因和OrfX基因都位于相同的DNA鏈上，因此不可能根據(jù)包含SCCmec而不含MecA基因的品系中獲得假陽性。例子例子ILAMP和TRA的比較說明結(jié)果形成的擴增子在兩種情況下都是串聯(lián)體并且明顯相同。在LAMP-BART 和 TRA-BART 中、溫度為 60 °C 的 Lucy-bespoke 成像硬件系統(tǒng)(Lumora)中，并且在條件與例子2中的條件相同(區(qū)別是使用了 0. 32U/ u I Bst的DNA聚合酶(NEB)，并且使用了含量為11. g/yl的螢火蟲熒光素酶)的情況下對腸炎沙門氏菌侵入型A基因的2-kb片段(fragment)進行了擴增。反應(yīng)混合物包含濃度均為0. 8 y M的R-LFP (6)引物和F-LFP (6)引物，以及濃度為0. 2 y M的置換引物RD (2)和FD⑵。每個反應(yīng)的總?cè)莘e為20iU。反應(yīng)進行了 100分鐘LFP引物小組6 (R-LFP與目標(biāo)序列上的R2c結(jié)合，而F-LFP與目標(biāo)序列上的F2結(jié)合)R-LFP(6)5，-aac ctt gta gag cat att cgt ggt ttt ccg cca ttg gcg aat ttatgF-LFP (6) 5，-tct ctt ggc gcc cac aat gtt ttt aag cga acg tgt ttc eg置換引物小組2 (RD與目標(biāo)序列上的R3c結(jié)合，而FD與目標(biāo)序列上的F3結(jié)合)RD (2)5’ -cat tac tgc tcg taa ttcFD (2) 5’ -ata tct gaa gtt ttg cag c凝膠上的樣式(pattern)并非取決于是否存在置換引物RD和FD，而是僅僅通過LFP限定(圖7)。LAMP和TRA擴增都形成了完全相同的梯形樣式，這充分說明兩者的發(fā)生機制類似。置換引物在LAMP擴增的初始階段起到非常大的作用，但是它們對接下來的擴增傳播階段沒有效果。例子2莖部引物對具有不同效能(efficiency)的lamp引物的單增李斯特菌TRA的效果借助娃膠膜質(zhì)粒小提標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen))對包含單增李斯特菌internalin A基因片段的Pls-質(zhì)粒(pLS-plasmid)進行凈化,并且在60°C的溫度下在Lucy-bespoke成像硬件系統(tǒng)(Lumora)中，借助TRA-BART對其進行擴增。反應(yīng)混合物包括濃度均為0. 8 ii M的R-LFPI、2或3引物，及F-LFPI、2或3引物(慢、中或快)，濃度為0. 8 ii M的StemR和濃度為0. 8 y M的StemF引物(Eurofins MWG)，濃度為0. 8mM的dNTPs (全部)(Invitrogen)，0. 16U/ u I Bst 的 DNA 聚合酶(NEB)，含量為 0. lmg/ml 蟲熒光素(Europa Bioproducts),濃度為 0. 25mM 的腺苷酰硫酸(Biolog),含量為 5. 6 y g/ y I 的螢火蟲突光素酶(UltraGlow,Promega),0. 375U/ml 的 ATP-硫化酶(NEB)(在 Ix Thermopol緩沖劑中(NEB))，并且具有ー些穩(wěn)定劑和添加物，及高低數(shù)量的質(zhì)粒108 or 104。每個反應(yīng)的總?cè)莘e為20iU。測試進行了 100分鐘。引物在目標(biāo)模板上的相對朝向展示于圖ll(i)中，然而，從以下序列表可以看出實際使用的引物在B2c和F2結(jié)合區(qū)的序列中明顯不同。(R-LFP與目標(biāo)序列上的R2c結(jié)合，而F-LFP與目標(biāo)序列上的F2結(jié)合)慢速LFPs小組IR-LFP (I) 5，-cct tct ttt aca ggc tta get ggt ttt tea aag aaa caa cca aagaag tggF-LFP ⑴ 5， -gga att tea gta egg ata aaa tgc cgt ttt att ate aaa cgt tgctgt gta gc 中速 LFPs 小組 2R-LFP ⑵ 5， -cct tct ttt aca ggc tta get ggt ttt atg cta agt ttc atg tggacgF-LFP (2) 5’ -gga att tea gta egg ata aaa tgc cgt ttt gtt tga gat gtt gttaca ccg tcFast LFPs set 3
R-LFP (3) 5， -cct tctttt aca ggc tta get ggt ttt gga age tgg gaa ttt attgag tgF-LFP (3) 5’ -gga att tea gta egg ata aaa tgc cgt ttt gcg cat ata aat cgatgt catttg莖部引物小組IStemF ⑴ 5， —tCB BBC CB6 C6B BCB BBt gStemR(I) 5’ -aac egg egg aac taa at當(dāng)存在莖部引物時，對于任何ー組LFP引物或存在的任何數(shù)量的目標(biāo)而言，所發(fā)生的擴增都是非?？臁τ诼俸椭兴貺FP引物小組而言(圖ll(ii)和(iii))而言，當(dāng)沒有莖部引物時，只能檢測到目標(biāo)的IO8拷貝(峰值分別出現(xiàn)在92和73分鐘)。然而，當(dāng)存在莖部引物吋，IO8拷貝的峰值出現(xiàn)在39和41分鐘，并且可以在實驗時間內(nèi)檢測到IO4拷貝(峰值出現(xiàn)在55和62分鐘)。在快速引物小組3的情況中(圖11 (iv))，低和高拷貝數(shù)量的峰值出現(xiàn)在39和60分鐘，而在有莖部引物的情況下，檢測到這些低和高拷貝數(shù)量的時間非常早(峰值出現(xiàn)在22和34分鐘)。該例子證明通過將莖部引物添加到LFP引物中可以實現(xiàn)基本的擴增加速，這些LFP引物具有不同效能、長度、位置、Tms, GC-豐富度、成型環(huán)的大小及其它參數(shù)。例子3對稱、非對稱和莖部加速的對稱單增李斯特菌TRA之間的對比在溫度為55 °C的Lucy-bespoke成像硬件系統(tǒng)(Lumora)中，且在與例子2相同的條件下，并且在具有大量或少量質(zhì)粒(IO8或IO4)的情況下，通過濃度均為0. 8 i! M的R-LFP (3)、F-LFP (3)、StemB (I)和StemF (I)引物的不同組合對包含單增李斯特菌internalin A(IlnA)基因片段的Pls-質(zhì)粒進行擴增。LFP引物小組3(R-LFP與目標(biāo)序列上的R2c結(jié)合，而F-LFP與目標(biāo)序列上的F2結(jié)合)R-LFP (3) 5， -cct tctttt aca ggc tta get ggt ttt gga age tgg gaa ttt attgag tgF-LFP (3) 5’ -gga att tea gta egg ata aaa tgc cgt ttt gcg cat ata aat cgatgt catttg莖部引物小組IStemF ⑴ 5， —tCB BBC CBC CCB BCB BBt g
StemR⑴ 5’ -aac egg egg aac taa at兩個非対稱的擴增都是非常慢，并且僅僅檢測到李斯特菌IlnA目標(biāo)的高拷貝數(shù)(峰值分別出現(xiàn)在84和75分鐘)。包含相同一組LFP的對稱TRA展示了更高的擴增速度，并且IO8拷貝的峰值出現(xiàn)在38分鐘，而IO4拷貝的峰值則出現(xiàn)在56分鐘。當(dāng)將莖部引物添加到TRA的對稱表現(xiàn)(manifestation)中時,高拷貝數(shù)的峰值出現(xiàn)在23分鐘,低拷貝數(shù)的峰值出現(xiàn)在34分鐘，因此與沒有莖部引物時看到的速度相比，顯示了明顯的速度増加(圖12b)。簡單地將3個較慢速度累加起來將不足以解釋這種明顯的擴增速度増加，這種明顯的擴增速度増加也已經(jīng)通過數(shù)學(xué)模型(例子4)得到證實。例子4
借助用于模擬指數(shù)級過程的標(biāo)準(zhǔn)理查德曲線公式將仿真BART動力學(xué)曲線繪制在Microsoft Excel中(圖13)。對單個的具有不同動力學(xué)活動的擴增過程的擴增動力學(xué)進行建摸。具有不同、類似或相同動力學(xué)活動的單個擴增過程的組合的效果展示于圖13中。從圖13a、b和c的比較可以看出即使將3種快速擴增過程組合起來，將單個的不同擴增過程組合起來的綜合擴增速度效果也是特別小的(圖13c)。這表明莖部引物的效果是從根本上増加擴增速度，而不是簡單地増加了額外的擴增過程。例子5(A)置換引物和外部用于形成環(huán)狀物的引物對單增李斯特菌TRA效果的對比在溫度為55°C的Lucy-bespoke成像硬件系統(tǒng)(Lumora)中，且在與例子2相同的條件下，并且在具有大量或少量質(zhì)粒(IO8或IO4)的情況下，在LAMP-BART中對包含單增李斯特菌IlnA基因片段的Pls-質(zhì)粒進行擴增。每個反應(yīng)的總?cè)莘e為20 yl。測試進行了 100 分鐘。對包含濃度都是0.8 ii M的R-LFP (3)、F-LFP (3)、StemF (I)和StemR(I)的反應(yīng)與添加了濃度都是 0. 8 ii M 的 OuterR(I)和 OuterF(I)或 Outer R-LFP (7)和 Outer F-LFP (7)的反應(yīng)進行比較。LFP引物小組3R-LFP (3) 5， -cct tctttt aca ggc tta get ggt ttt gga age tgg gaa ttt attgag tgF-LFP (3) 5， -gga att tea gta egg ata aaa tgc cgt ttt gcg cat ata aat cgatgt catttg莖部引物小組IStemF ⑴ 5， —tCB BBC CBC CCB BCB BBt gStemR(I) 5’ -aac egg egg aac taa at置換引物小組IRDQ) 5， -taa tgc taa gtt tea tgt gFDQ) 5， -ata ate tac tgt ttg aga tg外部LFP引物小組7R-LFP(7)5’-ctt ctt tgg ttg ttt ctt tgc ctt ttt get aag ttt cat gtg gacF-LFP (7) 5’ -gta tta aca get aca cag caa cgt ttt gag atg ttg tta cac cgtc莖部加速的TRA在該例子中引起了 IlnA基因的快速擴增，IO8和IO4拷貝數(shù)的峰值分別出現(xiàn)在23和35分鐘。添加了兩組不同的外部引物則分別將高低拷貝數(shù)的峰值時間減小到18和31分鐘(圖15a)。當(dāng)將置換引物替換為LFP時，擴增反應(yīng)進行的更快(圖15a(iii))。(B)莖部加速的腸炎沙門氏菌套式TRA借助娃膠膜質(zhì)粒小提標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen))對包含腸炎沙門氏菌侵入型A基因(InvA)片段的Pls-質(zhì)粒(pLS-plasmid)進行凈化，并且在55°C的溫度下在Lucy-bespoke成像硬件系統(tǒng)(Lumora)中，借助TRA-BART對其進行擴增。反應(yīng)混合物包括濃度均為0. 8 U M(如下面所顯示的那樣)的內(nèi)部和/或外部反向和正向LFP，濃度為 0. 8 ii M 的 StemB 和 0. 8 y M 的 StemF 弓 I物(Eurofins MWG)，:濃度為 I. 6mM 的 dNTP (全部)(Invitrogen), 0. 16U/ u I Bst 的 DNA 聚合酶(NEB),含量為 0. lmg/ml 蟲突光素(EuropaBioproducts)，濃度為0. 25mM的腺苷酰硫酸(Biolog)，含量為5. 6 y g/ 的螢火蟲熒光素酶(UltraGlow, Promega)，含量為 0. 375U/ml 的 ATP-硫化酶(NEB)(在 Ix Thermopol 緩沖劑中(NEB))，并且具有ー些穩(wěn)定劑和添加物，及高低數(shù)量的質(zhì)粒IO8 or IO40每個反應(yīng)總?cè)莘e為20iU。測試進行了 100分鐘。內(nèi)部LFP引物小組4R-LFP (4) 5’ -gga gca atg gcg cgt tat att tgt ttt cgc cat tgg cga att tatgF-LFP (4) 5， -cac aat gcg age get tcc ttt tta age gaa cgt gtt tcc g外部LFP引物小組5 R-LFP (5) 5， -cga att acg age agt aat ggt ttt tea tcc tea act tea gca gF-LFP (5) 5’ -caa acg ctg caa aac ttc agt ttt tta aag aag tgc tea gac atg莖部引物小組2StemF (2) 5，-cct tgt gga gca tattcgStemB (2) 5’ -gac ate ttt ttc tct tgg eg在該腸炎沙門氏菌InvA TRA系統(tǒng)中，兩組單獨使用的LFP都如此之慢，以致于甚至在實驗的100分鐘內(nèi)都無法檢測到更高的IO8目標(biāo)拷貝數(shù)。在套式TRA中，在沒有莖部引物的情況下，擴增足夠快，以至于僅僅檢測到高目標(biāo)拷貝數(shù)(峰值出現(xiàn)在68分鐘)。當(dāng)添加了莖部引物之后，速度得以增加，并且高目標(biāo)拷貝和低目標(biāo)拷貝都變成可以被檢測到，其峰值時間分別為34和61分鐘(圖15)。該例子說明針對不同目標(biāo)和LFP的不同表現(xiàn)，都可以觀察到莖部引物實現(xiàn)的擴增加速。例子6莖部加速的單增李斯特菌LAMP在溫度為55°C的Lucy-bespoke成像硬件系統(tǒng)(Lumora)中，且在與例子2相同的條件下，并且在具有大量或少量質(zhì)粒(IO8或IO4)的情況下，在LAMP-BART中對包含單增李斯特菌internalin A基因片段的Pls-質(zhì)粒進行擴增。每個反應(yīng)的總?cè)莘e為20 yl。測試進行了 100分鐘。對包含全部LAMP引物混合物(濃度為0. 8 ii M的LFP，濃度為0. 4 y M的環(huán)狀引物，濃度為0. 2 ii M的置換引物)的反應(yīng)與添加了濃度為0. 8iiM的StemR引物和濃度為0. 8 ii M的StemF引物的反應(yīng)進行了比較。LFP引物小組11R-LFP (I) 5，—cct tct ttt aca ggc tta get ggt ttt tea aag aaa caa cca aagaag tggF-LFP ⑴ 5’ -gga att tea gta egg ata aaa tgc cgt ttt att ate aaa cgt tgctgt gta gc環(huán)狀引物L(fēng)oopRc 5，-cag tea ata aat tcc cag cLoopF 5，-cat cga ttt ata tgc gca at置換引物小組IRD Q) 5， -taa tgc taa gtt tea tgt g
FD (I)5， -ata ate tac tgt ttg aga tg莖部引物小組IStemF ⑴ 5，-tea BBC CBC CCB BCB BBt gStemR⑴ 5’ -aac egg egg aac taa at這是LAMP擴增的例子，該擴增非?？斓貦z測到了單增李斯特菌Inl A目標(biāo)的高和低拷貝數(shù)。在沒有莖部引物的情況下，IO8拷貝的峰值出現(xiàn)在17分鐘，而IO4拷貝的峰值則出現(xiàn)在26分鐘。添加了莖部引物之后進ー步加快了反應(yīng)，并且將峰值時間減小到13分鐘(針對IO8拷貝)和19分鐘(針對IO4拷貝)(圖16)。在這種情況下，在LAMP中實現(xiàn)了加速，LAMP是目前為止所開發(fā)的最有效的等溫擴增系統(tǒng)之一。檢測時間的縮短對一般意義上的終端使用(point-of-use)應(yīng)用及特別是醫(yī)療診斷中的終端護理測試(point_of-caretest)非常重要。例子7具有不同莖部引物朝向的加速單增李斯特菌TRA在溫度為55°C的Lucy-bespoke成像硬件系統(tǒng)(Lumora)中，且在與例子2相同的條件下，并且在具有大量或少量質(zhì)粒(IO8或IO4)的情況下，在TRA-BART中對包含單增李斯特菌internalin A基因片段的Pls-質(zhì)粒進行擴增。對通過R_LFP(3)和F_LFP(3)引物運行并且在沒有和有StemR(3)引物的情況下進行的反應(yīng)與通過以0. 8 y M的濃度添加的StemF (3)引物運行的反應(yīng)進行比較。LFP引物小組3R-LFP (3) 5，-cct tct ttt aca ggc tta get ggt ttt gga age tgg gaa ttt attgag tgF-LFP (3) 5’ -gga att tea gta egg ata aaa tgc cgt ttt gcg cat ata aat cgatgt cat ttg莖部引物小組3StemF (3) 5，-agt tcc gcc ggt ttgStemR (3) 5，-aca ttt gtt ggg tgg ttt g在該例子中，與例子2中所示的效果相比，擴增子莖部上不同位置處的莖部引物的加速效果得到了證實。即使在沒有莖部引物的情況下，TRA-BART也檢測到了高低拷貝目標(biāo)(峰值時間分別為39和69分鐘)。添加莖部引物之后明顯地加快了反應(yīng)，并且將峰值時間縮短到22和39分鐘。不像環(huán)狀引物(在此，位置由LFP形成的環(huán)狀物嚴(yán)格限定，并且朝向也是固定的)，莖部引物可位于內(nèi)部Fl-Bl區(qū)域之間的任何位置，并且可面向任何方向。不論莖部引物的位置或朝向如何，都可以觀察到加速效果(圖17)。序列李斯特菌IlnA基因片段(SEQ ID NO 1)GGCAATTTTTAATGCTAAGTTTCATGTGGACGGCAAAGAAACAACCAAAGAAGTGGAAGCTGGGAATTTATTGACTGAACCAGCTAAGCCTGTAAAAGAAGGTTATACATTTGTTGGGTGGTTTGATGCCCAAACCGGCGGAACTAAATGGAATTTCAGTACGGATAAAATGCCGACAAATGACATCGATTTATATGCGCAATTTAGTATTAACAGCTACACAGCAACGTTTGATAATGACGGTGTAACAACATCTCAAACAGTAGATTATCA沙門氏菌InvA基因片段(SEQ ID NO 2)權(quán)利要求
1.ー種合成多核酸的方法，其特征在于該方法包括如下步驟 a)提供包括至少第一和第二交互引物結(jié)合區(qū)的目標(biāo)模板； b)提供包括第一和第二片段的第一引物，其中所述第一片段實質(zhì)上與所述模板上的第一交互引物結(jié)合區(qū)互補，并且所述第二片段包括序列，該序列實質(zhì)上與第一引物中的另ー個區(qū)域或第一引物的第一片段所生成的擴增子中的ー個區(qū)域互補，從而使得第二片段能夠形成環(huán)狀物； c)提供包括第一片段及可選的第二片段的第二引物，其中所述第一片段實質(zhì)上與所述模板上的第二引物結(jié)合區(qū)互補，并且所述可選的第二片段包括序列，該序列實質(zhì)上與第二引物中的另ー個區(qū)域或第二引物的第一片段所生成的擴增子中的ー個區(qū)域互補，從而使得第二區(qū)域能夠形成環(huán)狀物； d)提供至少ー個引物，其能夠與第一和第二交互引物結(jié)合區(qū)之間的區(qū)域結(jié)合； e)提供合成所述多核酸所必須的試劑和條件； f)執(zhí)行所述多核酸的合成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于合成過程通過來自以下小組的核酸擴增技術(shù)執(zhí)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增、模板重引發(fā)擴増、自擴張擴增和智能擴增過程。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項所述的方法，其特征在于正向和/或反向交互引物結(jié)合區(qū)包括用于兩個或多個引物的結(jié)合位點。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于結(jié)合到所述正向和/或反向交互引物結(jié)合區(qū)的所述兩個或多個弓I物具有相同類型。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項所述的方法，其特征在于結(jié)合到所述正向和/或反向交互引物結(jié)合區(qū)的所述引物為提供環(huán)狀物的引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述兩個或多個引物為用于形成環(huán)狀物的引物。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在干結(jié)合到所述正向和/或反向交互引物結(jié)合區(qū)的所述兩個或多個引物具有不同類型。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述兩個或多個結(jié)合位點都位于所述目標(biāo)模板和/或擴增子的相同鏈上。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述兩個或多個結(jié)合位點都位于所述目標(biāo)模板和/或擴增子的不同鏈上。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項所述的方法，其特征在于所述正向和反向交互引物結(jié)合位點隔開一定距離，從而使得僅僅在存在莖部引物的情況下才會合成多核酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述方法用于檢測樣本中的抗藥性金黃色葡萄球菌。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于使用mecA基因和orfX基因檢測抗藥性金黃色葡萄球菌。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任何一項所述的方法，其特征在于在步驟(d)中使用了單個莖部引物。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任何一項所述的方法，其特征在于在步驟(d)中使用了兩個或多個莖部引物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于在步驟(d)中使用的所述兩個或多個莖部引物具有相同種類。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在干在步驟(d)中使用的所述兩個或多個莖部引物具有不同種類。
17.根據(jù)權(quán)利要求14-16中任何一項所述的方法，其特征在于在步驟(d)中使用的所述兩個或多個莖部引物結(jié)合到所述擴增子的交互鏈上。
18.根據(jù)權(quán)利要求13-15中任何一項所述的方法，其特征在于在步驟(d)中使用的所述兩個或多個莖部引物結(jié)合到所述擴增子的相同鏈上。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項所述的方法，其特征在于所述莖部引物是簡單引 物、用于形成環(huán)狀物的引物、發(fā)卡引物或提供環(huán)狀物的引物。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項所述的方法，其特征在于所述莖部引物包含改性喊基。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于所述改性堿基選自小組N4-甲基胞嘧啶、肌苷、核糖核苷酸、熒光堿基、光解堿基或通用堿基。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任何一項所述的方法，其特征在于所述莖部引物包含通過可檢測結(jié)構(gòu)標(biāo)記的核酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于所述可檢測結(jié)構(gòu)為熒光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物或電化學(xué)標(biāo)記物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于所述莖部引物作為熒光、化學(xué)發(fā)光或電化學(xué)報告系統(tǒng)中的探針使用。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任何一項所述的方法，其特征在于通過選自以下小組的方法檢測多核酸的擴增基因陣列、試紙條法、電泳法、質(zhì)譜分析法和聲波檢測。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任何一項所述的方法，其特征在于所述莖部引物包含通過捕捉結(jié)構(gòu)標(biāo)記的核酸。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于所述捕捉結(jié)構(gòu)為生物素。
28.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項所述的方法，其特征在于所述核酸的合成通過實時測量或終點測量進行檢測。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于多核酸的擴增通過選自以下小組的檢測系統(tǒng)檢測熒光、生物發(fā)光、渾濁度或電化學(xué)測量。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于通過實時生物發(fā)光實驗報告系統(tǒng)對多核酸的合成進行檢測。
31.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項所述的方法，其特征在于所述方法在密封容器中進行。
32.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項所述的方法在確定有機體的遺傳密碼中是否存在特定的多核酸序列時的用途。
33.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項所述的方法在檢測單核苷酸多態(tài)性時的用途。
34.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項所述的方法在診斷領(lǐng)域的用途。
35.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項所述的方法對樣本中的有機體進行檢測和定量化時的用途。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于所述有機體為微生物。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于所述微生物選擇小組病毒、細(xì)菌、支原體或和真菌。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于所述微生物為轉(zhuǎn)基因組織。
39.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項所述的方法在識別轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物和動物，檢測疾病狀態(tài)，預(yù)測診療中的不良反應(yīng)或預(yù)測疾病狀態(tài)感染性時的用途。
40.ー種用于執(zhí)行前述任何一項權(quán)利要求所述的方法的裝置，所述裝置包括至少ー個莖部引物。
41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的裝置，進ー步包括熱穩(wěn)定性熒光素酶、蟲熒光素及將無機焦磷酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP的酶，及其他任何必要的將無機焦磷酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP的酶的底物或輔因子。
全文摘要
本發(fā)明涉及核酸擴增技術(shù)領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及一種方法，該方法使用了莖部引物，該莖部引物改善了測試樣本的快速和特異擴增。
文檔編號C12Q1/68GK102652176SQ201080035868
公開日2012年8月29日 申請日期2010年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月15日
發(fā)明者凱瑟·J·邁克滾, 勞倫斯·C·第希, 奧爾加·甘德爾曼, 蓋伊·柯德樂 申請人:路瑪拉有限公司