專利名稱：蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的(變體)脂肪分解酶和一個(gè)或多個(gè)編碼一個(gè)或多個(gè)新脂肪分解酶的多核苷酸。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生脂肪分解酶的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明還涉及改良食品的制備，尤其是改良烘焙產(chǎn)品的制備。具體地，本發(fā)明涉及脂肪分解酶，所述酶能夠賦予包括烘焙產(chǎn)品在內(nèi)的食品產(chǎn)品改良的特征。
背景技術(shù)：
在食品和/或飼料工業(yè)中使用的脂肪分解酶(E. C. 3. 1. 1. χ)的有益用途已知多年。例如，在EP 0 585 988中主張向生面團(tuán)中加入脂酶可改善保鮮效果，并且提出獲自少根根霉菌(Miizopus arrhizus)的脂酶在與起酥油/脂肪(shortening/fat)聯(lián)用時(shí)， 添加至生面團(tuán)時(shí)能夠改善所得面包的質(zhì)量。W094/04035中教導(dǎo)可通過在生面團(tuán)中添加脂酶但向所述生面團(tuán)添加任何脂肪或油即獲得改善的面包柔軟性。Castello,P. ESEGP 89-10 Dec. 1999 Helsinki表明外源性脂酶可以改變面包體積。小麥粉中脂酶作用的底物是1. 5-3%內(nèi)源性小麥脂質(zhì)，所述內(nèi)源性小麥脂質(zhì)是極性與非極性脂質(zhì)的復(fù)雜混合物。極性脂質(zhì)可分為糖脂和磷脂。這些脂質(zhì)由兩個(gè)脂肪酸所酯化的甘油和極性基團(tuán)構(gòu)成。所述極性基團(tuán)促成這些脂質(zhì)的表面活性。對(duì)這些脂質(zhì)中的脂肪酸之一的酶切導(dǎo)致表面活性高出很多的脂質(zhì)。已知諸如DATEM的具有高表面活性的乳化劑在添加到生面團(tuán)中時(shí)產(chǎn)生顯著作用。脂肪分解酶可從存在于食品中的脂質(zhì)水解一種或多種脂肪酸，這可以在食品中產(chǎn)生有效的乳化劑分子，從而提供具有商業(yè)價(jià)值的功能性。提供最顯著的乳化特性的分子是部分水解產(chǎn)物，諸如溶血磷脂(lyso-phospholipid)、溶血糖脂(lyso-glycolipid)和甘油單酯(mono-glyceride)分子。極性脂質(zhì)水解產(chǎn)物，即溶血磷脂和溶血糖脂尤其有利。在制作面包時(shí)，這種原位產(chǎn)生的乳化劑可起到與乳化劑Hf^BDATEM)等價(jià)的作用。但是，也發(fā)現(xiàn)脂肪分解酶的活性導(dǎo)致游離脂肪酸的蓄積，這會(huì)在食品中產(chǎn)生不良作用。脂肪分解酶的這一固有活性限制了其功能。對(duì)面包體積的負(fù)面影響往往以劑量過大(overdosing)來解釋。劑量過大可導(dǎo)致面筋彈力下降，這使生面團(tuán)過硬，并因此使面包體積縮小。另外，或可選地，這些脂酶能降解添加到生面團(tuán)中的起酥油、油脂和乳脂，導(dǎo)致生面團(tuán)和烘焙產(chǎn)品有不良風(fēng)味。劑量過大和不良風(fēng)味歸因于面團(tuán)中游離脂肪酸(尤其是短鏈脂肪酸)的蓄積。原料或食品產(chǎn)品中高水平游離脂肪酸(FFA)的存在普遍被認(rèn)為是質(zhì)量缺陷，食品生產(chǎn)商和消費(fèi)者往往在食品規(guī)范中規(guī)定了 FFA的最高水平。過量FFA水平所產(chǎn)生的作用會(huì)導(dǎo)致感官和/或功能上的缺陷。在W02005/087918中鑒定了來自鐮刀菌(Fusarium)物種，例如異孢鐮刀菌 (Fusarium heterosporum) CBS 782. 83的新型真菌脂肪分解酶，并且發(fā)現(xiàn)其在某些應(yīng)用中其具有優(yōu)越的性質(zhì)。這些酶在漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)中表達(dá)并且顯示主要水解出生面團(tuán)中糖脂和磷脂sn-Ι位置的脂肪酸。一些真菌脂肪分解酶的問題是所述酶的表達(dá)可能受限并因此可能具有高生產(chǎn)成本。例如，適合工業(yè)規(guī)?；钚缘拇罅棵副磉_(dá)可能受到限制。工業(yè)上感興趣于發(fā)現(xiàn)表達(dá)增強(qiáng)的新脂肪分解酶，特別是這能夠在沒有功能性和/或活性受損的情況下實(shí)現(xiàn)時(shí)。發(fā)明概述已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，與制備出本發(fā)明新變體脂肪分解酶的野生型酶相比，本發(fā)明新變體脂肪分解酶顯示了提高的表達(dá)。值得注意的是，所述提高的表達(dá)是在不損害酶功能性和/或活性和/或應(yīng)用性的情況下實(shí)現(xiàn)的。此外，與野生型酶相比，新的變體脂肪分解酶還可以顯示改善的功能性和/或活性。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過改變(取代或插入)位于脂肪分解酶活性位點(diǎn)(催化三聯(lián)體)的遠(yuǎn)側(cè)外環(huán)中的一個(gè)或多個(gè)表面氨基酸，以用(與原氨基酸相比)更親水的氨基酸代替所述表面氨基酸，或者引入親水氨基酸，或者引入糖基化位點(diǎn)，隨后，與野生型酶相比， 可顯著且驚人地提高所述變體酶的表達(dá)和/或功能性和/或活性。優(yōu)選地，為了引入一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)，用Asn、Ser和/或Thr (或其組合)代替所述表面氨基酸?？蛇x地，或者此外，可以通過插入選自Asn、Ser和/或Thr的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾活性位點(diǎn)遠(yuǎn)側(cè)的外環(huán)，以引入一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。脂肪分解酶通常在脂肪和水之間(即親水環(huán)境和疏水環(huán)境之間)的界面起作用，因此，脂肪分解酶在某些應(yīng)用中的性能非常依賴于該界面以及水活性。不希望受理論約束，通過在遠(yuǎn)離酶活性位點(diǎn)的位置(即酶活性位點(diǎn)遠(yuǎn)側(cè)的環(huán)中) 改變脂肪分解酶表面的親水性，可控制酶在脂肪/水界面內(nèi)的朝向，從而使所述活性位點(diǎn)朝向酶的底物，即脂肪。因此，可修飾脂肪分解酶以優(yōu)化酶在界面內(nèi)的朝向，從而提高酶活性。此外，或者可選擇地，通過引入糖基化位點(diǎn)可增強(qiáng)酶的折疊以及從宿主生物的表達(dá)和/ 或分泌，由此增強(qiáng)變體酶的表達(dá)。此外或者可選地，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了驚人地顯著提高脂肪分解酶的表達(dá)和/或功能和/或活性的多種特異修飾。這些可包括加入糖基化位點(diǎn)和/或穩(wěn)定酶的C-末端區(qū)域。 在一些實(shí)施方式中，特異的修飾提高了表達(dá)，但不損害脂肪分解酶的功能性和/或活性。因此，與野生型(KLMl)酶相比，一些所述特異修飾提高了表達(dá)，而不損害變體酶的應(yīng)用性能， 所述野生型(KLMl)酶的前原序列(propresequence)在本文中示為SEQ ID No. 2 (其成熟形式為SEQ ID No. 2的氨基酸31-305)。因此，一方面，本發(fā)明提供了制備變體脂肪分解酶的方法，其包括在宿主生物中表達(dá)核苷酸序列，所述核苷酸序列與編碼真菌脂肪分解酶的核苷酸序列具有至少90%的同一性，或者通過一個(gè)或數(shù)個(gè)核酸的添加、刪除或取代而不同于編碼真菌脂肪分解酶的核苷酸序列，并且在對(duì)應(yīng)于所編碼的氨基酸序列中的位置包含至少一個(gè)以下修飾a)與原真菌月旨肪分解酶相比，在所述氨基酸序列中引入至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)(或一個(gè)額外的糖基化位點(diǎn))；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點(diǎn)(催化三聯(lián)體)的遠(yuǎn)側(cè)外環(huán)內(nèi)的位置引入至少一個(gè)氨基酸，所述氨基酸更加親水(與原氨基酸相比)；或c)在33、63、78、190、 305,306或320位中的一個(gè)或多個(gè)位置的取代或插入或者在311-312或307-319位中的一個(gè)或多個(gè)位置的刪除，其中各氨基酸位置均對(duì)應(yīng)于與SEQ ID No. 2比對(duì)時(shí)所述氨基酸序列的位置；其中當(dāng)所述核苷酸序列與編碼SEQ ID No. 22或SEQ ID No. 23所示的真菌脂肪分解酶序列的核苷酸序列具有至少90%的同一性或者通過一個(gè)或數(shù)個(gè)核酸的添加、刪除或取代而不同于編碼SEQ ID No. 22或SEQ ID No. 23所示的真菌脂肪分解酶序列的核苷酸序列時(shí)，所述修飾不是在63位的取代并且所述刪除不在311-312位(其中比對(duì)時(shí)所述氨基酸位置編號(hào)為SEQ ID No. 2所示)。所述方法可以通過在多肽的表面位置取代或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而在所述表面位置引入至少一個(gè)氨基酸，其中所述取代或插入時(shí)用(與原氨基酸相比)更親水的氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生變體脂肪分解酶的方法，所述方法包括在宿主生物中表達(dá)核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID No. 1具有至少90%的同一性，或者通過一個(gè)或數(shù)個(gè)核酸的添加、刪除或取代而不同于SEQ ID No. 1，并且在對(duì)應(yīng)于所編碼氨基酸序列中的位置包含至少一個(gè)以下修飾a)在所述氨基酸序列中引入至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點(diǎn)(催化三聯(lián)體)的遠(yuǎn)側(cè)外環(huán)內(nèi)的位置引入至少一個(gè)親水氨基酸；或c)在33、63、78、190、305、306或320位中的一個(gè)或多個(gè)位置的取代或插入，或者在311-312或307-319位中的一個(gè)或多個(gè)位置的刪除，其中各氨基酸位置均對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 2的氨基酸序列的位置。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生脂肪分解酶的方法，所述方法包括在宿主生物中表達(dá)包含 SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 12,SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20或SEQ ID No. 26的核苷酸序列；或者與其具有至少98% (優(yōu)選至少99%，合適地為至少99. 5%，如至少99. 8% )同一性的核苷酸序列；或者通過一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸的添加、刪除或取代而不同于SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20或SEQ ID No.沈的核苷酸序列，或者通過遺傳密碼簡(jiǎn)并性而與SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20或SEQ ID No. 26的核苷酸序列相關(guān)。本發(fā)明還提供了制備脂肪分解酶的方法，所述方法包括用編碼對(duì)極性脂質(zhì)內(nèi)的酯鍵具有水解活性的多肽的重組核酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中所述核酸包括含SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 18,SEQ ID No. 20 或 SEQID No.洸的核苷酸序列；或者與 SEQ ID No. 4,SEQ ID No. 6、 SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 12,SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 16,SEQ ID No. 18、 SEQ ID No. 20或SEQ ID No.沈具有至少98% (優(yōu)選至少99%，合適地為至少99. 5%，如至少99. 8% )同一性的核苷酸序列；或者通過一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸的添加、刪除或取代而不同于 SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 12,SEQ ID No. 14、 SEQ ID No. 16,SEQ ID No. 18,SEQ ID No. 20或SEQ ID No.洸的核苷酸序列，或者通過遺傳密碼簡(jiǎn)并性而與 SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、 SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20 或 SEQ ID No. 26 的核苷酸序列相關(guān)，所述宿主細(xì)胞能夠表達(dá)編碼所述多肽的核苷酸序列；在表達(dá)所述核酸的條件下培養(yǎng)所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞并收集所述脂肪分解酶。本發(fā)明提供了本發(fā)明核酸的增化表達(dá)，并因此提供了變體多肽的改良生產(chǎn)方法。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明方法獲得的多肽(前原多肽或成熟的脂肪分解酶)。
在再進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了包含編碼脂肪分解酶的核苷酸序列的核酸，并且所述核苷酸序列在對(duì)應(yīng)于所編碼氨基酸序列中的位置包含至少一個(gè)以下修飾a)在所述氨基酸序列中引入至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點(diǎn)(催化三聯(lián)體)的遠(yuǎn)側(cè)外環(huán)內(nèi)的位置引入至少一個(gè)親水氨基酸的；或c)在33、63、78、 190,305,306或320位中的一個(gè)或多個(gè)位置的取代或插入或者在311-312或307-319位中的一個(gè)或多個(gè)位置的刪除，其中各氨基酸位置均對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 2的氨基酸序列的位置， 其中當(dāng)所述核苷酸序列編碼SEQ ID No. 22或SEQ ID No. 23所示的真菌脂肪分解酶序列的核苷酸序列時(shí)，所述修飾不是在63位的取代，并且所述刪除不在311-312位(其中比對(duì)時(shí)氨基酸位置編號(hào)為SEQ ID No. 2所示)。在另一方面，本發(fā)明提供了包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列與SEQ ID No. 1具有至少90%的同一性，或者通過一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸的添加、刪除或取代而不同于 SEQ ID No. 1，并且在對(duì)應(yīng)于所編碼的氨基酸序列中的位置包含至少一個(gè)以下修飾a)在所述氨基酸序列中至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的引入；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點(diǎn)(催化三聯(lián)體)的遠(yuǎn)側(cè)的外環(huán)內(nèi)的位置的至少一個(gè)親水氨基酸的引入；或c)在 33、63、78、190、305、306或320位中的一個(gè)或多個(gè)位置的取代或插入，或者在311-312或 307-319位中的一個(gè)或多個(gè)位置的刪除，其中各氨基酸位置均對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 2的氨基酸序列的位置。本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼對(duì)極性脂質(zhì)內(nèi)的酯鍵具有水解活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括 SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 12,SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 16,SEQ ID No. 18,SEQ ID No. 20 或 SEQID No. 26 的核苷酸序列；或者與 SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 12、 SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 16,SEQ ID No. 18,SEQ ID No. 20 或 SEQID No. 26 具有至少 98% (優(yōu)選至少99%，合適地為至少99.5%，如至少99.8% )同一性的核苷酸序列；或者通過一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸的添加、刪除或取代而不同于SEQ ID No. 4,SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8、 SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20 或SEQ ID No.沈的核苷酸序列，或者通過遺傳密碼簡(jiǎn)并性而與SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、 SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 12,SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 16,SEQ ID No. 18、 SEQ ID No. 20或SEQ ID No. 26的核苷酸序列相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述優(yōu)選的核苷酸序列為SEQ ID No. 8 (突變體5)所示的核苷酸序列，或者通過遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與SEQ ID No. 8相關(guān)的核苷酸序列。在再一方面，本發(fā)明提供了由本發(fā)明核酸或核苷酸序列編碼的變體多肽。本發(fā)明另一方面提供了變體多肽，所述變體多肽對(duì)極性脂質(zhì)中的酯鍵具有水解活性，并且包含與SEQ ID No. 2的氨基酸33-296具有至少90%同一性，或者通過一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的添加、刪除或取代而不同于SEQ ID No. 2的氨基酸33-296的氨基酸序列，并且與 SEQ ID No. 2中所示的序列相比所述變體多肽已被修飾從而a)在所述氨基酸序列中引入至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點(diǎn)(催化三聯(lián)體)的遠(yuǎn)側(cè)外環(huán)內(nèi)的位置引入至少一個(gè)親水氨基酸；或c)在33、63、78或190位中的至少一個(gè)或多個(gè)位置取代或插入氨基酸，其中各氨基酸位置均對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 2中所示氨基酸序列的位置。
另一方面，本發(fā)明提供了對(duì)極性脂質(zhì)中的酯鍵具有水解活性，并且包含SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 19,SEQ ID No. 21或SEQ ID No. 25的氨基酸33-296 (或氨基酸31-30 所示氨基酸序列的多肽。再一方面，本發(fā)明提供了前原多肽，當(dāng)在宿主生物中進(jìn)行翻譯后加工時(shí)其產(chǎn)生了對(duì)極性脂質(zhì)中的酯鍵具有水解活性的多肽，其中所述前原多肽包含SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 21或SEQ ID No. 25所示的氨基酸序列。一方面，本發(fā)明還提供了對(duì)極性脂質(zhì)中的酯鍵具有水解活性的多肽，所述多肽可得自于包含 SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 21 或 SEQ ID No. 25 所示氨基酸序列的前原多肽。根據(jù)宿主生物，前原序列常常經(jīng)歷翻譯后修飾。對(duì)于本發(fā)明的酶，所述生物較常除去前原序列的 N-末端區(qū)，即除去 SEQ ID No. 9,SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 11、 SEQ ID No. 13,SEQ ID No. 15,SEQ ID No. 17,SEQ ID No. 19,SEQ ID No. 21 或SEQ ID No. 25 的氨基酸1-30的所有或部分。在一些實(shí)施方式中，所述宿主生物可以除去比SEQ ID No. 9、 SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 17、 SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 21或SEQ ID No. 25的氨基酸1_30所示的那些略多的氨基酸， 例如除去氨基酸1-31、1-32或1-33。在一些情況下，所述宿主細(xì)胞可以引入可選的N-末端序列，所述序列可涵蓋氨基酸1-30所示氨基酸的所有或部分或者可以包含完全不同的 N-末端序列(例如EAEA或EA)。在一些情況下，通過宿主生物由前原序列產(chǎn)生的成熟酶在其N-末端可以為異基因(heterogen)。在一些實(shí)施方式中，所述翻譯后修飾可以表示在前原序列的C-末端區(qū)中的修飾。例如，在成熟形式中，可以從SEQ ID No. 9,SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 19、SEQ ID No.21或SEQ ID No. 25除去氨基酸306-348的所有或部分。在一些實(shí)施方式中，宿主生物可以除去比 SEQ ID No. 9,SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. IUSEQ ID No. 13,SEQ ID No. 15,SEQ ID No. 17,SEQ ID No. 19,SEQ ID No. 21 或 SEQ ID No. 25 的氨基酸 306-348 所示的那些略多的氨基酸，例如除去氨基酸305-348或304-348或303-348。在一些情況下， 通過宿主生物由前原序列產(chǎn)生的成熟酶在其C-末端可以為異基因。認(rèn)為本發(fā)明包括可以從前原多肽獲得的所有成熟形式的蛋白，所述前原多肽包含SEQ ID No. 5,SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 21或SEQ ID No. 25所示的氨基酸序列，尤其是從宿主生物里氏木霉(Trichoderma reesei)獲得的那些。本發(fā)明還提供了本發(fā)明核酸增強(qiáng)脂肪分解酶從宿主生物的表達(dá)的用途。合適地， 宿主生物可以為真菌，優(yōu)選木霉(Trichoderma)，優(yōu)選里氏木霉。合適地，與野生型核酸(即沒有任何本發(fā)明修飾的核酸)相比，所述表達(dá)增強(qiáng)約2倍至約25倍。本發(fā)明進(jìn)一步提供了制備食品的方法，所述方法包括向所述食品的一個(gè)或多個(gè)成分加入本發(fā)明的多肽。再一方面，本發(fā)明提供了制備烘焙產(chǎn)品的方法，所述方法包括向生面團(tuán)中加入本發(fā)明的多肽并烘焙所述生面團(tuán)以制備烘焙產(chǎn)品。本發(fā)明進(jìn)一步提供了制備溶血磷脂的方法，所述方法包括用本發(fā)明的多肽處理磷脂以產(chǎn)生溶血磷脂。在再一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了制備溶血糖脂的方法，所述方法包括用本發(fā)明的多肽處理糖脂以產(chǎn)生溶血糖脂。本發(fā)明進(jìn)一步提供了植物油或食用油的酶促脫膠方法，所述方法包括用本發(fā)明的多肽處理食用油或植物油以水解其中存在的大部分極性脂質(zhì)。再一方面，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明的方法獲得的食品或烘焙產(chǎn)品。本發(fā)明的各方面描述在權(quán)利要求書和以下評(píng)述中?？捎糜诒景l(fā)明核苷酸序列的其它方面包括包含本發(fā)明的序列的構(gòu)建體；包含用于本發(fā)明的序列的載體；包含用于本發(fā)明的序列的質(zhì)粒；包含用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；包含用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化組織；包含用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化器官；包含用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化宿主；包含用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化生物。本發(fā)明還包括表達(dá)用于本發(fā)明的核苷酸序列的方法，所述方法利用所述核苷酸序列，例如在宿主細(xì)胞中的表達(dá)；包括用于轉(zhuǎn)移所述核苷酸序列的方法。本發(fā)明還包括分離(例如從宿主細(xì)胞中分離)所述核苷酸序列的方法。涉及用于本發(fā)明氨基酸序列的其它方面包括編碼用于本發(fā)明的氨基酸序列的構(gòu)建體；編碼用于本發(fā)明的氨基酸序列的載體；編碼用于本發(fā)明的氨基酸序列的質(zhì)粒；表達(dá)用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；表達(dá)用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化組織；表達(dá)用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化器官；表達(dá)用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化宿主；表達(dá)用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化生物。本發(fā)明還包括純化用于本發(fā)明的氨基酸序列的方法，所述方法利用所述氨基酸序列，例如在宿主細(xì)胞中的表達(dá)；包括轉(zhuǎn)移所述氨基酸序列的方法， 然后純化所述序列。為了便于參考，本發(fā)明的這些和進(jìn)一步的方面在以下適當(dāng)分標(biāo)題下進(jìn)行討論。然而，各部分的教導(dǎo)并不必然局限于各具體的部分。發(fā)明詳述對(duì)本文所用氨基酸位置的所有引用都通過參考氨基酸序列SEQ ID No. 2而進(jìn)行。 換句話說，當(dāng)考慮氨基酸位置編號(hào)時(shí)，通過與SEQ ID No. 2的氨基酸序列比對(duì)，并且通過參考利用SEQ ID No. 2作為參考序列的比對(duì)序列的位置編號(hào)可以確定氨基酸位置編號(hào)(參見，例如顯示SEQ ID No. 2(在圖22中稱為KLM1)與本文教導(dǎo)的其它序列的比對(duì)的圖22)。合適地，本發(fā)明使用的宿主生物可以為真菌，優(yōu)選來自木霉屬，更優(yōu)選來自里氏木霉種。在一個(gè)實(shí)施方式中，在修飾前所述真菌脂肪分解酶不包含任何糖基化位點(diǎn)。換句話說，本發(fā)明的方法可以用于向原始或天然不包含任何糖基化位點(diǎn)的脂肪分解酶中引入至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)。合適地，本發(fā)明的變體多肽可以包含至少兩個(gè)，合適地為至少三個(gè)糖基化位點(diǎn)。優(yōu)選地，本發(fā)明的核苷酸序列或者在本發(fā)明的方法中使用的核苷酸序列分別與 SEQ ID No. 1或與SEQ ID No. 24，或者與SEQ ID No. 24的第23-106位中所示的核苷酸序列；或者與SEQ ID No. 24的第113-1063位中所示的核苷酸序列，或者與SEQ ID No. 24的第113-9 位中所示的核苷酸序列相比具有至少90%同一性(優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少98%，合適的為至少99%，例如至少99. 5%同一性)，但與SEQ ID No. 1或與SEQ ID No. 24,或者與SEQ ID No. 24的第23-106位中所示的核苷酸序列；或者與SEQ ID No. 24的第113-1063位中所示的核苷酸序列，或者與SEQ ID No. 24的第113-9 位中所示的核苷酸序列分別相比包含至少一個(gè)修飾，或者具有與上述任一序列的區(qū)別在于一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸的添加、刪除或取代的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)所述核苷酸序列與編碼SEQ ID No. 22或SEQ ID No. 23中所示的真菌脂肪分解酶的核苷酸序列具有至少90%同一性，或者所述核苷酸序列與編碼SEQ ID No. 22或SEQ ID No. 23中所示的真菌脂肪分解酶的核苷酸序列區(qū)別于一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸的添加、刪除或取代時(shí)，所述修飾不是在第63位的取代(例如其不是取代K63N)，并且所述刪除不在第311-312位。編碼SEQ ID No. 22或SEQ ID No. 23中所示的真菌脂肪分解酶的核苷酸序列在本文中如SEQ ID No 24或其部分(例如SEQ ID No. 24的第23-106位中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. M的第113-1063位中所示的核苷酸序列，或者SEQ ID No. 24的第113-9 位中所示的核苷酸序列)所示。在一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選本發(fā)明的修飾對(duì)應(yīng)于在多肽表面位置和所述酶活性位點(diǎn)的遠(yuǎn)側(cè)外環(huán)中的位置引入至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)。優(yōu)選地，所述核苷酸序列經(jīng)修飾，從而使位于所述多肽的表面位置和所述酶活性位點(diǎn)的遠(yuǎn)側(cè)外環(huán)中的位置的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被比原氨基酸更親水的氨基酸取代。可選地，所述核苷酸序列可以被修飾，從而使一個(gè)或多個(gè)親水氨基酸插入到所述多肽的表面位置和所述酶活性位點(diǎn)的遠(yuǎn)側(cè)外環(huán)中的位置。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述核苷酸經(jīng)修飾，從而在所編碼的氨基酸中取代或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)共有序列Asn-Xxx-Ser或Asn-Xxx-Thr，其中)(xx 可為除Pro外的任何氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，修飾核苷酸序列，從而在所編碼的氨基酸序列中引入一個(gè)或多個(gè)Asn、Ser或Thr。換句話說，本發(fā)明的核苷酸序列包含對(duì)應(yīng)于向所編碼的蛋白中引入一個(gè)或多個(gè)Asn、Ser或Ilir的修飾。合適地，在本發(fā)明的方法或核酸中，可以引入至少兩個(gè)，合適地為至少三個(gè)糖基化位點(diǎn)。本發(fā)明的核苷酸序列和本發(fā)明方法中的核苷酸序列可以進(jìn)一步修飾，以與原脂肪分解酶相比，例如與包含SEQ ID No. 2或其氨基酸33-296(或31-305)的脂肪分解酶相比， 強(qiáng)化蛋白的C-末端加工。合適地，所述核苷酸序列或多肽可以包含C-末端加工，優(yōu)選地以使所述多肽更穩(wěn)定。在本申請(qǐng)中，認(rèn)為所述多肽的C-末端是自第306位氨基酸之前，其中所述位置對(duì)應(yīng)于比對(duì)時(shí)SEQ ID No. 2的氨基酸序列的位置。合適地，如本發(fā)明所教導(dǎo)地，所述C-末端加工包含以下一個(gè)或多個(gè)在第306或 320位的取代或插入，或者在C-末端中的一個(gè)或多個(gè)KEX2位置的刪除，其中各個(gè)位置對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 2的氨基酸序列的位置。合適地，所述C-末端加工可以包含至少一個(gè)C-末端KEX2位點(diǎn)的去除。不希望受理論限制，KEX2位點(diǎn)的去除引起蛋白水解加工的停止或蛋白水解加工速率的降低以及改良蛋白的穩(wěn)定性而不使其活性受損。一個(gè)KEX2位點(diǎn)可見于第 306位(與SEQ ID No. 2比對(duì)時(shí))。另一個(gè)KEX2位點(diǎn)可見于第311-312位(當(dāng)與SEQ ID No. 2比對(duì)時(shí))。優(yōu)選地，本發(fā)明的核苷酸序列或者用于本發(fā)明的核苷酸序列被修飾，從而在第33、 63,78,190和305位中的一個(gè)或多個(gè)位置具有取代，其中所述氨基酸被N取代。合適地，本發(fā)明的核苷酸序列或者用于本發(fā)明的核苷酸序列可以被修飾，從而在第63、78、190和305位中的一個(gè)或多個(gè)位置具有取代，其中所述氨基酸被N取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的核苷酸序列或者用于本發(fā)明的核苷酸序列可以被修飾，從而在第190、191和192位引入糖基化位點(diǎn)(從而使所述糖基化位點(diǎn)包含共有序列 Asn-Xxx-Ser或者Asn-Xxx-Thr，其中Xxx為除Pro外的任何氨基酸)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的核苷酸序列或者用于本發(fā)明的核苷酸序列可以被修飾，從而在第33、34和35位引入糖基化位點(diǎn)(從而使所述糖基化位點(diǎn)包含共有序列 Asn-Xxx-Ser或者Asn-Xxx-Thr，其中Xxx為除Pro外的任何氨基酸)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的核苷酸序列或者用于本發(fā)明的核苷酸序列可以被修飾，從而在第63、64和65位引入糖基化位點(diǎn)(從而使所述糖基化位點(diǎn)包含共有序列 Asn-Xxx-Ser或者Asn-Xxx-Thr，其中Xxx為除Pro外的任何氨基酸)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的核苷酸序列或者用于本發(fā)明的用途的核苷酸序列可以被修飾，從而在第78、79和80位引入糖基化位點(diǎn)(從而使所述糖基化位點(diǎn)包含共有序列Asn-Xxx-Ser或者Asn-Xxx-Thr，其中Xxx為除Pro外的任何氨基酸)。所述糖基化位點(diǎn)可以通過單個(gè)氨基酸的修飾(例如插入或取代)而引入?？蛇x地， 為了引入糖基化位點(diǎn)，可以對(duì)多于一個(gè)氨基酸(例如2個(gè)或3個(gè)氨基酸)進(jìn)行修飾(例如插入或取代)。合適地，本發(fā)明的核苷酸序列或者用于本發(fā)明的核苷酸序列可以被修飾，從而在第190位具有取代，其中所述氨基酸被N取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選地，本發(fā)明的核苷酸序列包含本文SEQ ID No. 8所示核苷酸序列的全部序列或部分(或者通過遺傳密碼的簡(jiǎn)并性與SEQ ID No. 8相關(guān)的核苷酸序列)。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了由該核苷酸序列編碼的多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的變體多肽或用于本發(fā)明的變體多肽包含SEQ ID No. 9的氨基酸33-296(或31-304或31-30 中所示的氨基酸序列。合適地，本發(fā)明的核苷酸序列或者用于本發(fā)明的核苷酸序列可以被修飾，從而在第306位具有取代，其中所述氨基酸被除K或R或A以外的任意氨基酸取代，優(yōu)選所述306 位的取代是被氨基酸S取代。合適地，本發(fā)明的核苷酸序列或者用于本發(fā)明的核苷酸序列可以被修飾，從而在第320位具有取代，其中所述氨基酸被除T以外的任意氨基酸取代，優(yōu)選所述320位的取代是被氨基酸E取代。本發(fā)明的變體多肽，無論是由本發(fā)明的核酸編碼的變體多肽，還是通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的變體多肽，優(yōu)選具有磷脂酶活性或者半乳糖酯酶活性。在一些實(shí)施方式中，優(yōu)選對(duì)變體多肽或其編碼核酸進(jìn)行的修飾是在變體多肽上加入至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)(或者多個(gè)糖基化位點(diǎn))和/或涉及C-末端加工以穩(wěn)定所述變體多肽C-末端的修飾。合適地，所述多肽在第33、63、78、190位，合適地在第63、78或190位的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代。合適地，可以使用N進(jìn)行所述取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的變體多肽可以在第306位包含至少一個(gè)取代。優(yōu)選地，使用除K或R之外的任何氨基酸進(jìn)行第306位的取代。優(yōu)選地，使用除K或R或A之外的任何氨基酸進(jìn)行第306位的取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選地使用不帶電荷和/或親水性氨基酸進(jìn)行第306位的取代。合適地，可以使用氨基酸S進(jìn)行第306位的取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的核苷酸序列或者用于本發(fā)明的核苷酸序列可以被修飾，從而使所編碼氨基酸序列中的以下位置得到修飾R306S+G33N ；R306S+K63N ；R306S+G78N ；R306S+A190N ；R306S+K63N+G78N+A190N ；R306S+AKR311-312 ；R306S+K63N+G78N+A190N+Δ 311-312 ；R306S+K63N+G78N+A190N+Δ 307-319 ；R306S + Κ63Ν + G78N+A190N + Δ307-319 + Τ320Ε;或者R306S + Κ63Ν + G78N + A190N + Δ307-319 + R305N本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地預(yù)測(cè)，當(dāng)骨架不是KLMlwt (如本文SEQ ID No. 2所示) 時(shí)，盡管可選骨架中的起始氨基酸不同，表中所示氨基酸在與SEQ ID No. 2比對(duì)時(shí)位于相同的位置。為了避免爭(zhēng)議，本文中使用的符號(hào)“ Δ ”表示該符號(hào)后所列的那些氨基酸的刪除。在一些實(shí)施方式中，在所述多肽的表面位置或者所述酶活性位點(diǎn)(催化三聯(lián)體) 的遠(yuǎn)側(cè)外環(huán)內(nèi)的位置引入至少一個(gè)氨基酸(其與原氨基酸相比更親水)優(yōu)選是在所述多肽的表面位置或者所述酶活性位點(diǎn)(催化三聯(lián)體)的遠(yuǎn)側(cè)外環(huán)內(nèi)的位置引入至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)(或者一個(gè)額外的糖基化位點(diǎn))的。換句話說，加入糖基化位點(diǎn)使所述酶在已經(jīng)加入的糖基化位點(diǎn)區(qū)域內(nèi)更親水。另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的變體多肽酶在制造食品，例如生面團(tuán)、烘焙產(chǎn)品、蛋、基于蛋的產(chǎn)品、面條產(chǎn)品、奶酪產(chǎn)品、玉米餅產(chǎn)品、動(dòng)物飼料產(chǎn)品、植物油或食用油中的應(yīng)用。有利地，向所述食品中加入本發(fā)明的酶可以產(chǎn)生改良的乳化性，并且游離脂肪酸的聚集降低。另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的變體多肽在制造生面團(tuán)和/或烘焙產(chǎn)品中的用途，包括向生面團(tuán)加入所述脂肪分解酶，和(任選地)烘焙所述生面團(tuán)以制備烘焙產(chǎn)品，用于下述中的一個(gè)或多個(gè)降低生面團(tuán)粘性；改善生面團(tuán)的加工性；降低烘焙產(chǎn)品在烘焙中的起泡；改善面包體積和/或松軟度；延長(zhǎng)烘焙產(chǎn)品和/或生面團(tuán)的壽命；改善烘焙產(chǎn)品和 /或生面團(tuán)的保鮮作用；改善烘焙產(chǎn)品的碎屑結(jié)構(gòu)；降低烘焙產(chǎn)品的孔異質(zhì)性；改善烘焙產(chǎn)品的孔均質(zhì)性；降低烘焙產(chǎn)品的平均孔徑；改良烘焙產(chǎn)品的味道和/或香味，改善烘焙產(chǎn)品的外皮顏色。
另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的變體多肽在制造基于蛋的產(chǎn)品中的用途，用以改善結(jié)構(gòu)、降低平均粒徑、降低平均顆粒分布、改善熱穩(wěn)定性、改善微波性能和/或穩(wěn)定性。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了處理蛋或基于蛋的產(chǎn)品的方法，所述方法包括向所述蛋或基于蛋的產(chǎn)品中加入本發(fā)明的變體多肽酶。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了制備面條或者生面片或者基于面條的產(chǎn)品的方法，其中所述方法包括向所述面條或者生面片或者基于面條的產(chǎn)品中加入本發(fā)明的變體多肽酶。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了本發(fā)明的變體多肽酶在制造面條或基于面條的產(chǎn)品中的用途，用于下述中的一個(gè)或多個(gè)改善顏色/黃色、穩(wěn)定顏色性質(zhì)、降低亮度、降低脂肪含量、改善結(jié)構(gòu)和口感(bite)(咀嚼性)、降低水活性、降低斷裂、提高中心硬度和改善在加工中的形狀保持度。在本發(fā)明的另一方面，提供了制備玉米餅或玉米餅片的方法，所述方法包括向玉米餅或玉米餅片中加入本發(fā)明的變體多肽酶。本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明的變體多肽酶在制造玉米餅或生玉米餅片的用途，用以改善玉米餅的可軋制性、提高玉米餅的柔韌性、改善玉米餅和/或生玉米餅片的保鮮作用、改善玉米餅和/或生玉米餅片中的柔軟性和/或降低異味?？梢酝ㄟ^與乳化劑(例如DATEM)組合來改善玉米餅和/或面條中脂肪分解酶的功能性。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了處理乳(milk)、奶酪用乳、奶酪或基于奶酪的產(chǎn)品的方法，所述方法包括向所述奶酪或基于奶酪的產(chǎn)品中加入本發(fā)明的變體多肽酶。本發(fā)明再進(jìn)一步提供了本發(fā)明的變體多肽酶在制造奶酪或基于奶酪的產(chǎn)品中的用途，用以改善味道、結(jié)構(gòu)和/或穩(wěn)定性，降低奶酪中的溢油作用(oiling-off effect)和 /或提高奶酪生產(chǎn)中的奶酪產(chǎn)率。在本發(fā)明的另一方面，提供了處理動(dòng)物飼料的方法，所述方法包括向所述動(dòng)物飼料中加入本發(fā)明的變體多肽酶。本發(fā)明進(jìn)一步提供了本發(fā)明的變體多肽酶在制造動(dòng)物飼料中的用途，用以增強(qiáng)以下一個(gè)或多個(gè)飼料利用性和/或轉(zhuǎn)換效率、體重增重、消化性氮攝取、干物質(zhì)的可代謝性和可口性。在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了本發(fā)明的變體多肽酶在制備溶血磷脂的方法中的用途，例如通過用所述酶處理磷脂(如卵磷脂)以產(chǎn)生部分水解產(chǎn)物，即溶血磷脂。在本發(fā)明的另一方面，提供了制備溶血磷脂，例如溶血卵磷脂的方法，所述方法包括用本發(fā)明的變體多肽酶處理磷脂(如卵磷脂)。在本發(fā)明的另一方面，提供了本發(fā)明的變體多肽酶在制備溶血糖脂(例如雙半乳糖基甘油單酯(DGMG)或單半乳糖基甘油單酯(MGMG))的方法中的用途，其中通過利用本發(fā)明的脂肪分解酶處理糖脂(例如雙半乳糖基甘油二酯(DGDG)或單半乳糖基甘油二酯 (MGDG))以產(chǎn)生部分水解產(chǎn)物，即溶血糖脂。在另一方面，本發(fā)明提供了制備溶血糖脂(例如雙半乳糖基甘油單酯(DGMG)或單半乳糖基甘油單酯(MGMG))的方法，所述方法包括利用本發(fā)明的變體多肽酶處理糖脂(例如雙半乳糖基甘油二酯(DGDG)或單半乳糖基甘油二酯(MGDG))。
本發(fā)明還提供了植物油或食用油的酶促脫膠方法，所述方法包括用本發(fā)明的變體多肽酶處理食用油或植物油以水解大部分的極性脂質(zhì)(例如磷脂和/或糖脂)。為了避免疑問，本領(lǐng)域技術(shù)人員可知曉適合進(jìn)行食用油的酶促脫膠的方法(例如參見EP 0 869 167)。在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，可以合適地使用已知方法，前提是用本發(fā)明的酶代替已知酶。在本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明的變體多肽酶在植物油或食用油的制造中的用途，用以降低植物油或食用油中磷脂的量同時(shí)保持油中甘油三酯的含量和/或防止或降低游離脂肪酸的蓄積。在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的變體多肽酶在包括處理磷脂以水解脂肪?；鶊F(tuán)的方法中的應(yīng)用。在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的變體多肽酶在用以降低食用油中的磷脂含量的方法中的應(yīng)用，所述方法包括用本發(fā)明的真菌脂肪分解酶處理所述油以水解大部分的磷月旨，和從所述油分離含水解磷脂的水相。優(yōu)選地，本發(fā)明的變體脂肪分解酶水解極性脂質(zhì)(例如糖脂和/或磷脂)。換句話說，本發(fā)明的變體脂肪分解酶優(yōu)選具有磷脂酶活性(例如磷脂酶A2(E. C. 3. 1. 1. 4)活性和/ 或磷脂酶Al (E. C. 3. 1. 1. 32)活性)和/或半乳糖脂酶或糖脂酶(E. C. 3. 1. 1. 26)活性。本發(fā)明的變體脂肪分解酶可以額外地水解甘油三酯。換句話說，本發(fā)明的變體脂肪分解酶可以額外的具有甘油三酯脂酶活性(E. C. 3. 1. 1. 3)。本文使用的術(shù)語“糖脂酶活性，，包括“半乳糖脂酶活性”。術(shù)語糖脂和半乳糖脂可以在本文中交互使用，并且包括水解D⑶G和MGDG，其分別被水解成DGMG或MGMG。本文使用的術(shù)語“極性脂質(zhì)”表示磷脂和/或糖脂。優(yōu)選地，本文使用的術(shù)語“極性脂質(zhì)”表示磷脂和糖脂兩者。合適地，本發(fā)明的變體脂肪分解酶可以具有磷脂酶活性(例如磷脂酶A2(E. C. 3. 1. 1. 4)活性和/或磷脂酶Al (E. C. 3. 1. 1. 32)活性)和/或半乳糖脂酶或糖脂酶 (E. C. 3. 1. 1. 26)活性。利用下文描述的試驗(yàn)可以測(cè)定酶的糖脂酶活性、磷脂酶活性和/或甘油三酯脂酶活性。半乳糖脂酶活性的測(cè)定(糖脂酶活性試驗(yàn))底物將0.6% 雙半乳糖基甘油二酯(Sigma D 4651) ,0. 4 % Triton-X 100 (Sigma X-100)和 5mM CaCl2 溶解在 0. 05M HEPES 緩沖液(pH 7)中。試驗(yàn)過程將400 μ 1底物加入到1. 5ml Eppendorf試管中，并在37°C的Eppendorf熱混合儀中放置5分鐘。在時(shí)間T = O分鐘時(shí)，加入50μ1酶溶液。同時(shí)對(duì)以水替代酶的空白進(jìn)行分析。使樣品在37°C的Eppendorf熱混合儀中以10*100rpm混合10分鐘。在時(shí)間T = 10 分鐘時(shí)，將所述Eppendorf試管在另一個(gè)99°C的熱混合儀中放置10分鐘以終止反應(yīng)。利用來自WAKO GmbH的NEFA C試劑盒分析樣品中的游離脂肪酸。以在試驗(yàn)條件下每分鐘產(chǎn)生脂肪酸的微摩爾數(shù)計(jì)算酶活性GLU (pH 7)。磷脂酶活性的測(cè)定(磷脂酶活性試驗(yàn))
利用兩種不同的方法測(cè)定磷脂酶活性，其結(jié)果相當(dāng)。這兩個(gè)方法中的任一個(gè)都可以用以測(cè)定本發(fā)明的磷脂酶活性。優(yōu)選地，使用PLU測(cè)定任意酶的磷脂酶活性。測(cè)定磷脂酶活性的“PLU試驗(yàn)”底物將0.6 % L-α 磷月旨酰膽堿 95 % Plant (Avanti#441601)、0. 4 % Triton-X 100 (Sigma X-100)和 5mM CaCl2 溶解在 0. 05M HEPES 緩沖液(pH = 7)中。試驗(yàn)過程將400 μ 1底物加入到1. 5ml Eppendorf試管中，并在37°C的Eppendorf熱混合儀中放置5分鐘。在時(shí)間T = O分鐘時(shí)，加入50μ1酶溶液。同時(shí)對(duì)以水替代酶的空白進(jìn)行分析。使樣品在37°C的Eppendorf熱混合儀中以10*100rpm混合10分鐘。在時(shí)間T = 10 分鐘時(shí)，將所述Eppendorf試管在另一個(gè)99°C的熱混合儀中放置10分鐘以終止反應(yīng)。 利用來自WAKO GmbH的NEFA C試劑盒分析樣品中的游離脂肪酸。以在試驗(yàn)條件下每分鐘產(chǎn)生脂肪酸的微摩爾數(shù)計(jì)算酶活性PLU-7 (pH 7)。測(cè)定磷脂酶活性的“TIPU試驗(yàn)”ITIPU (滴定磷脂酶單位)定義為在試驗(yàn)條件下每分鐘釋放1 μ mol游離脂肪酸的酶量。磷脂酶Al和A2催化卵磷脂至溶血卵磷脂的轉(zhuǎn)化，并分別從第1和2位釋放游離脂肪酸?？赏ㄟ^連續(xù)滴定在酶作用過程中從卵磷脂釋放的脂肪酸而測(cè)定磷脂酶活性，因?yàn)閴A的消耗量等于脂肪酸的釋放量。底物在磁性攪拌下將4%卵磷脂、4% Triton-X 100和6mM CaCl2 :12g卵磷脂粉 (Avanti Polar Lipids#44160)和 12g Triton-X 100 (Merck 108643)分散在約 200ml 去礦物質(zhì)水中。加入3. Oml 0. 6M CaCl2 (p. a. Merck 1.02382)。用去礦物質(zhì)水將體積調(diào)整至 300mL并利用Ultra Thurax對(duì)乳液進(jìn)行勻質(zhì)化。每天制備新鮮底物。試驗(yàn)條件制備酶溶液，從而在加入300 μ 1酶時(shí)在滴定曲線上產(chǎn)生0. 06和0. 18ml/分鐘之間的斜率。包括活性已知的對(duì)照樣品。樣品溶解在去礦物質(zhì)水中并以300rpm攪拌15分鐘。在用0. 05M NaOH調(diào)整pH至7.0之前，將25. OOml底物在37 °C恒溫10-15分鐘。 將300 μ L酶溶液加入至底物，并使用恒定pH滴定儀(Phm 290, MettlerToledo)進(jìn)行使用 0.05M NaOH的連續(xù)滴定。在每個(gè)比例(scaling)進(jìn)行兩個(gè)活性測(cè)定。8分鐘后終止滴定，并計(jì)算5-7分鐘之間滴定曲線的斜率。檢測(cè)極限為3TIPU/ml 酶溶液。計(jì)算按照以下方式計(jì)算磷脂酶活性(TIPU/g酶):
權(quán)利要求
1.制備變體脂肪分解酶的方法，其包括在宿主生物中表達(dá)核苷酸序列，所述核苷酸序列與編碼真菌脂肪分解酶的核苷酸序列具有至少90%的同一性并且在對(duì)應(yīng)于所編碼氨基酸序列中的位置包含至少一個(gè)以下修飾a)與原真菌脂肪分解酶相比在所述氨基酸序列中引入至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)(或一個(gè)額外的糖基化位點(diǎn))；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點(diǎn)(催化三聯(lián)體)的遠(yuǎn)側(cè)外環(huán)內(nèi)的位置引入至少一個(gè)氨基酸，所述氨基酸更親水(與原氨基酸相比)；或c)在33、63、78、190、305、306或320位中的一個(gè)或多個(gè)位置的取代或插入，或者在311-312或307-319位中的一個(gè)或多個(gè)位置的刪除，其中各氨基酸位置均對(duì)應(yīng)于當(dāng)與SEQ ID No. 2比對(duì)時(shí)所述氨基酸序列的位置；其中當(dāng)所述核苷酸序列與編碼SEQ ID No. 22或SEQ ID No. 23所示的真菌脂肪分解酶序列的核苷酸序列具有至少90% 的同一性時(shí)，所述修飾不是在63位的取代并且所述刪除不在311-312位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述真菌脂肪分解酶在修飾前不包含任何糖基化位點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述核苷酸序列與SEQID No.l，與SEQ ID No. 24，或與SEQ ID No. 24的23-106位所示的核苷酸序列，或與SEQ ID No. 24的113-1063 位所示的核苷酸序列，或與SEQ ID No. 24的113-9 位所示的核苷酸序列具有至少90%同一性。
4.產(chǎn)生脂肪分解酶的方法，其包括在宿主生物中表達(dá)包含SEQID No. 8,SEQ ID No. 6、 SEQ ID No. 4,SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 12,SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 16,SEQ ID No. 18、 SEQ ID No. 20或SEQ ID No. 26的核苷酸序列；或者與其具有至少98%同一性的核苷酸序列；或者通過遺傳密碼的簡(jiǎn)并性與SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10、 SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20 或 SEQ ID No. 26 的核苷酸序列相關(guān)的核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述修飾對(duì)應(yīng)于在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點(diǎn)的遠(yuǎn)側(cè)外環(huán)內(nèi)的位置引入至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述核苷酸序列被修飾，從而在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點(diǎn)的遠(yuǎn)側(cè)外環(huán)內(nèi)的位置的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被比原氨基酸更親水的氨基酸取代。
7.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，所述核苷酸序列被修飾，從而使一個(gè)或多個(gè)親水性氨基酸被插入在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點(diǎn)的遠(yuǎn)側(cè)外環(huán)內(nèi)的位置。
8.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，所述核苷酸序列被修飾，從而在所編碼的氨基酸中取代或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)共有序列Asn-Xxx-Ser或 Asn-Xxx-Thr，其中Xxx可為除Pro外的任何氨基酸。
9.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，所述核苷酸序列被修飾，從而在所編碼的氨基酸序列中引入一個(gè)或多個(gè)Asn、Ser或Ilir。
10.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，引入至少2個(gè)、優(yōu)選至少3個(gè)糖基化位點(diǎn)ο
11.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，所述核苷酸序列被進(jìn)一步修飾以與 SEQ ID No. 2相比增強(qiáng)了所述蛋白的C-末端加工。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述C-末端為從306位氨基酸向前，其中所述位置對(duì)應(yīng)于比對(duì)時(shí)SEQ ID No. 2的氨基酸序列中的位置。
13.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，其中所述C-末端加工包括以下一個(gè)或多個(gè) 在306位或320位的取代或插入或者在所述C-末端的一個(gè)或多個(gè)KEX2位的刪除，其中各位置均對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 2的氨基酸序列的位置。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述C-末端加工包括以下一個(gè)或多個(gè)在306位或320位的取代，或者在311-312或307-319位中的一個(gè)或多個(gè)位置的刪除，其中各位置均對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 2的氨基酸序列的位置。
15.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，所述核苷酸序列被修飾，從而在33、63、78、 190和305位中的一個(gè)或多個(gè)位置具有取代，其中所述氨基酸被N取代。
16.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，所述核苷酸序列被修飾，從而在306位具有取代，其中所述氨基酸被除K或R或A以外的任意氨基酸取代，優(yōu)選所述306位的取代是被氨基酸S取代。
17.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，所述核苷酸序列被修飾，從而在320位具有取代，其中所述氨基酸被除T以外的任意氨基酸取代，優(yōu)選所述320位的取代是被氨基酸E 取代。
18.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，所述宿主生物為真菌，優(yōu)選來自木霉屬(Trichoderma)，更優(yōu)選來自里氏木霉(Trichoderma reesei)禾中。
19.通過前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法獲得的多肽(前原多肽或脂肪分解酶)。
20.包含核苷酸序列的核酸，其中，所述核苷酸序列編碼脂肪分解酶并且在對(duì)應(yīng)于所編碼的氨基酸序列中的位置包含至少一個(gè)以下修飾a)在所述氨基酸序列中引入至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點(diǎn)(催化三聯(lián)體)的遠(yuǎn)側(cè)外環(huán)內(nèi)的位置引入至少一個(gè)親水氨基酸；或c)在33、63、78、190、305、306或320位中的一個(gè)或多個(gè)位置的取代或插入，或者在311-312或307-319位中的一個(gè)或多個(gè)位置的刪除，其中各氨基酸位置均對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 2的氨基酸序列的位置；其中當(dāng)所述核苷酸序列編碼SEQ ID No. 22或SEQ ID No. 23所示的真菌脂肪分解酶時(shí)，所述修飾不是在63位的取代并且所述刪除不在311-312位。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的核酸，其中，所述真菌脂肪分解酶在修飾前不包含任何糖基化位點(diǎn)。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的核酸，其中，所述核苷酸序列與SEQID No. 1，與 SEQ ID No. 24，或與SEQ ID No. 24的23-106位所示的核苷酸序列，或與SEQ ID No. 24的 113-1063位所示的核苷酸序列，或與SEQ ID No. M的113-9 位所示的核苷酸序列具有至少90%的同一性。
23.根據(jù)權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)所述的核酸，其中，所述核苷酸序列包含至少一個(gè)修飾，所述修飾對(duì)應(yīng)于用比原氨基酸更親水的氨基酸取代位于所述多肽的表面位置和所述酶活性位點(diǎn)的遠(yuǎn)側(cè)外環(huán)中的位置的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求20-23中任一項(xiàng)所述的核酸，其中，所述核苷酸序列包含至少一個(gè)修飾，所述修飾對(duì)應(yīng)于在所述多肽的表面位置和所述酶活性位點(diǎn)的遠(yuǎn)側(cè)外環(huán)中的位置插入一個(gè)或多個(gè)更親水的氨基酸。
25.根據(jù)權(quán)利要求20-24中任一項(xiàng)所述的核酸，其中，所述核苷酸序列包含至少一個(gè)修飾，所述修飾對(duì)應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代或插入以提供一個(gè)或多個(gè)共有序列 Asn-Xxx-Ser或Asn-Xxx-Thr，其中Xxx可以是所編碼的蛋白中除Pro外的任何氨基酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求20-25中任一項(xiàng)所述的核酸，其中，所述核苷酸序列包含修飾，所述修飾對(duì)應(yīng)于在所編碼的蛋白中引入一個(gè)或多個(gè)Asn、Ser或Hir。
27.根據(jù)權(quán)利要求20-26中任一項(xiàng)所述的核酸，其包含編碼至少兩個(gè)，優(yōu)選至少三個(gè)糖基化位點(diǎn)的密碼子。
28.根據(jù)權(quán)利要求20-27中任一項(xiàng)所述的核酸，其中，所述核苷酸序列在所述序列的 C-末端區(qū)包含修飾以與SEQ ID No.2相比增強(qiáng)了所述蛋白的C-末端加工。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的核酸，其中，所述C-末端包含編碼第306位氨基酸向前的核苷酸序列，其中所述位置對(duì)應(yīng)于比對(duì)時(shí)SEQ ID No.2的氨基酸序列中的位置。
30.根據(jù)權(quán)利要求觀-29中任一項(xiàng)所述的核酸，其中，所述C-末端區(qū)的修飾包含一個(gè)或多個(gè)修飾，所述修飾導(dǎo)致在第306位或320位的取代或插入，或者在所編碼蛋白的C-末端中的一個(gè)或多個(gè)KEX2位置的刪除，其中各位置均對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 2的氨基酸序列的位置。
31.根據(jù)權(quán)利要求觀-30中任一項(xiàng)所述的核酸，其中，所述修飾包含導(dǎo)致以下一個(gè)或多個(gè)的修飾在第306位或320位的取代，或在311-312或307-319位的一個(gè)或多個(gè)位置的刪除，其中各個(gè)位置均對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 2的氨基酸序列的位置。
32.根據(jù)權(quán)利要求20-31中任一項(xiàng)所述的核酸，其中，所述核苷酸序列包含修飾，所述修飾導(dǎo)致在第63、78、190和305位中的一個(gè)或多個(gè)位置的取代，其中在所編碼的蛋白中所述氨基酸被N取代。
33.根據(jù)權(quán)利要求20-32中任一項(xiàng)所述的核酸，其中，所述核苷酸序列包含修飾，所述修飾導(dǎo)致在所編碼蛋白的第306位發(fā)生取代，其中所述取代是被除K或R或A的任何氨基酸取代，優(yōu)選所述第306位的取代是被氨基酸S取代。
34.根據(jù)權(quán)利要求20-33中任一項(xiàng)所述的核酸，其中，所述核苷酸序列包含修飾，所述修飾導(dǎo)致在第320位發(fā)生取代，其中所述氨基酸被除T外的任何氨基酸取代，優(yōu)選第320位被氨基酸E取代。
35.編碼對(duì)極性脂質(zhì)中的酯鍵具有水解活性的多肽的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列包含 SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 16,SEQ ID No. 18,SEQ ID No. 20 或SEQ ID No. 26 ；或者與 SEQ ID No. 8、 SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 16、 SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20或SEQ ID No.洸具有至少98% (優(yōu)選至少99%，更優(yōu)選至少99. 5%，更優(yōu)選至少99. 8% )同一性的核苷酸序列；或者通過遺傳密碼的簡(jiǎn)并性與SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 6,SEQ ID No. 4,SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 12,SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20 或 SEQ ID No. 26 的核苷酸序列相關(guān)的核酸。
36.變體多肽，其由權(quán)利要求20-35中任一項(xiàng)所述的核酸或核苷酸序列編碼。
37.變體多肽，其對(duì)極性脂質(zhì)中的酯鍵具有水解活性且包含與SEQID No. 2的氨基酸 33-296具有至少90%同一性的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列與SEQ ID No. 2所示的序列相比已經(jīng)被修飾，所述修飾為a)在所述氨基酸序列中引入至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點(diǎn)(催化三聯(lián)體)的遠(yuǎn)側(cè)外環(huán)內(nèi)的位置引入至少一個(gè)親水氨基酸；或c)在33、63、78或190位中的至少一個(gè)或多個(gè)位置的氨基酸取代或插入， 其中各氨基酸位置均對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 2的氨基酸序列的位置。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的多肽，其中，位于所述多肽的表面位置和所述酶活性位點(diǎn)的遠(yuǎn)側(cè)外環(huán)中的位置的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被比原氨基酸更親水的氨基酸取代。
39.根據(jù)權(quán)利要求37或38中任一項(xiàng)所述的多肽，其中，在所述多肽的表面位置和所述酶活性位點(diǎn)的遠(yuǎn)側(cè)外環(huán)中的位置插入一個(gè)或多個(gè)親水氨基酸。
40.根據(jù)權(quán)利要求37或38中任一項(xiàng)所述的多肽，其中，取代或插入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸，從而產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)共有序列Asn-Xxx-Ser或Asn-Xxx-Thr，其中Xxx可為除Pro外的任何氨基酸。
41.根據(jù)權(quán)利要求37-40中任一項(xiàng)所述的多肽，其中，引入了一個(gè)或多個(gè)Asn、Ser或Thr。
42.根據(jù)權(quán)利要求37-41中任一項(xiàng)所述的多肽，其中，在第33、63、78、190位中的一個(gè)或多個(gè)位置的修飾是用氨基酸N取代所述位置的氨基酸。
43.根據(jù)權(quán)利要求37-42中任一項(xiàng)所述的多肽，其中，引入了至少兩個(gè)，優(yōu)選至少三個(gè)糖基化位點(diǎn)。
44.根據(jù)權(quán)利要求19、36-45中任一項(xiàng)所述的多肽，其中，所述變體多肽具有磷脂酶活性或者半乳糖脂酶活性。
45.根據(jù)權(quán)利要求19、36-5中任一項(xiàng)所述的多肽，其中，除了以下修飾外 G33NK63N ； G78N ； A190N ；K63N+G78N+A190N ；所述多肽包含SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的氨基酸33-296。
46.前原多肽，其在宿主生物體內(nèi)進(jìn)行翻譯后加工時(shí)產(chǎn)生對(duì)極性脂質(zhì)中的酯鍵具有水解活性的多肽，其中所述前原多肽包含SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 19、SEQ ID No.21 或 SEQ ID No. 25所示的氨基酸序列。
47.對(duì)極性脂質(zhì)中的酯鍵具有水解活性的多肽，其中，所述多肽可得自于包含SEQID No. 9、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 21或SEQ ID No. 25所示的氨基酸序列的前原多肽。
48.權(quán)利要求20-35任一項(xiàng)所述核酸的用途，用以增強(qiáng)脂肪分解酶在宿主生物的表達(dá)。
49.根據(jù)權(quán)利要求49的用途，其中，所述宿主生物是真菌，優(yōu)選木霉(Trichoderma spp.)，優(yōu)選里氏木霉。
50.制備食品的方法，所述方法包括添加權(quán)利要求19或36-45或47中任一項(xiàng)所述的多肽至所述食品的一種或多種成分中。
51.制備烘焙產(chǎn)品的方法，所述方法包括添加權(quán)利要求19或36-45或47中任一項(xiàng)所述的多肽至生面團(tuán)中和烘焙所述生面團(tuán)以制備所述烘焙產(chǎn)品。
52.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述食品是以下一種或多種蛋或基于蛋的產(chǎn)品；烘焙產(chǎn)品；面條；玉米餅；生面團(tuán)；糖食；冷凍產(chǎn)品；乳制品，包括奶酪；慕思；生植物奶油；食用油和脂肪；充氣和無氣攪打的產(chǎn)品，水包油乳液和油包水乳液；人造黃油；起酥油； 涂抹物，包括低脂和極低脂肪涂抹物；調(diào)味品；蛋黃醬；蘸料，基于奶油的沙司；基于奶油的湯；飲料；調(diào)味乳和沙司。
53.制備溶血磷脂的方法，其包括用權(quán)利要求19或36-45或47中任一項(xiàng)所述的多肽處理磷脂以產(chǎn)生溶血磷脂。
54.制備溶血糖脂的方法，其包括用權(quán)利要求19或36-45或47中任一項(xiàng)所述的多肽處理糖脂以產(chǎn)生溶血糖脂。
55.植物油或食用油的酶促脫膠方法，其包括用權(quán)利要求19或36-45或47中任一項(xiàng)所述的多肽處理食用油或植物油以水解其中存在的大部分極性脂質(zhì)。
56.通過權(quán)利要求50或52所述的方法獲得的食品。
57.通過權(quán)利要求51所述的方法獲得的烘焙產(chǎn)品。
58.面包改良組合物或生面團(tuán)改良組合物，其包含權(quán)利要求19、36-45或47中任一項(xiàng)所述的變體多肽。
59.生面團(tuán)或烘焙產(chǎn)品，其包含權(quán)利要求M所述的面包改良組合物或生面團(tuán)改良組合物。
60.變體多肽，其一般如本文參考實(shí)施例或圖的定義。
61.方法，其一般如本文參考實(shí)施例或圖的定義。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備變體脂肪分解酶的方法，其包括在宿主生物中表達(dá)核苷酸序列，所述核苷酸序列與編碼真菌脂肪分解酶的核苷酸序列具有至少90％的同一性并且在對(duì)應(yīng)于所編碼氨基酸序列中的位置包含至少一個(gè)以下修飾a)與原真菌脂肪分解酶相比在所述氨基酸序列中引入至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)(或一個(gè)額外的糖基化位點(diǎn))；b)在所述多肽的表面位置和所述酶活性位點(diǎn)(催化三聯(lián)體)的遠(yuǎn)側(cè)外環(huán)內(nèi)的位置引入至少一個(gè)氨基酸，所述氨基酸更加親水(與原氨基酸相比)；或c)在33、63、78、190、305、306或320位中的一個(gè)或多個(gè)位置的取代或插入，或者在311-312或307-319位中的一個(gè)或多個(gè)位置的刪除，其中各氨基酸位置均對(duì)應(yīng)于與SEQ ID No.2比對(duì)時(shí)所述氨基酸序列的位置；其中當(dāng)所述核苷酸序列與編碼SEQ ID No.22或SEQ ID No.23所示的真菌脂肪分解酶序列的核苷酸序列具有至少90％的同一性時(shí)，所述修飾不是在63位的取代并且所述刪除不在311-312位。優(yōu)選地，所述核苷酸序列與SEQ ID No.1具有至少90％同一性。本發(fā)明還涉及通過所述方法產(chǎn)生的多肽以及新核酸。
文檔編號(hào)C12N9/18GK102459581SQ201080028819
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月25日
發(fā)明者安德雷·米亞斯尼科夫, 延斯·弗里斯貝克·瑟倫森, 理查德·R·博特 申請(qǐng)人:丹尼斯科公司