專利名稱：用于流感病毒檢測(cè)的通用測(cè)試的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及流感病毒檢測(cè)與定量分析的新型通用方法。本發(fā)明優(yōu)選使用逆轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)實(shí)時(shí)(q-PCR)測(cè)試，所述測(cè)試擴(kuò)增A型或B型流感毒株內(nèi)的保守區(qū)。本發(fā)明的測(cè)試能定量分析流感病毒RNA分子或全病毒顆粒，而不論具體的病毒株(例如，人、禽、豬流
感)。本發(fā)明的方法特別適合作為診斷測(cè)試或用于監(jiān)測(cè)疫苗生產(chǎn)過(guò)程。
背景技術(shù)：
目前有多種形式的流感疫苗。疫苗通?；诨畈《净驕缁畈《?。滅活疫苗可基于全病毒顆粒、裂解病毒顆粒或基于純化的表面抗原(詳見(jiàn)明確引用的WO 2008/068631)。流感疫苗通常為三價(jià)，含有兩種A型流感毒株和一種B型流感毒株。除了傳統(tǒng)上基于雞蛋的流感疫苗生產(chǎn)方法外，近來(lái)描述了基于細(xì)胞培養(yǎng)的不同生產(chǎn)方法(參見(jiàn)Vaccines (《疫苗》)中第 17 和 18 章，Plotkin 和 Orenstein 編，第 4 版，2004，ISBN :0-7216-9688-0 ；ffilschut ；Mc Elhaney、Palache,“ Inf Iuenza (流感)”;第 2 版,埃爾斯威爾公司(Elsevier) 2006 ；ISBN0-7234-3433-6 中第 9 章)。目前很少有基于核酸的檢測(cè)方法應(yīng)用于流感疫苗生產(chǎn)過(guò)程中(例如，用于質(zhì)量控制過(guò)程)。這是由于用于疫苗生產(chǎn)的流感毒株每季都有變化，因此每季都需要開(kāi)發(fā)新的毒株特異性檢測(cè)試驗(yàn)。本發(fā)明提供新型核酸測(cè)試，分析A型流感或B型流感毒株基因組內(nèi)保守區(qū)(不考慮來(lái)源，如人、禽、豬流感)。因此，這些測(cè)試適于分析多種流感毒株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明描述了檢測(cè)流感病毒RNA的新型方法。本發(fā)明的方法分析A型流感或B型流感基因組內(nèi)的保守區(qū)，優(yōu)選編碼基質(zhì)(M)蛋白的區(qū)域。表3和表4分別顯示來(lái)自GenBank的M基因核苷酸序列，其用于比對(duì)A型流感M基因和B型流感M基因。為作分析，進(jìn)行核酸測(cè)試。優(yōu)選測(cè)試為逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等效的RNA擴(kuò)增方法也適用(US-5409818中基于核酸序列的擴(kuò)增或NASBA ；3SR ;US_5399491中轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增或TMA 等)。優(yōu)選以實(shí)時(shí)測(cè)試運(yùn)行核酸測(cè)試(例如，“qPCR” ；Taqman , Lightcycler ；Scorpion 等)。優(yōu)選的“一步RT-實(shí)時(shí)PCR”的詳述在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，采用一步RT-實(shí)時(shí)PCR測(cè)試(“一步RT-qPCR”)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉此類“一步RT qPCR”測(cè)試的進(jìn)行。技術(shù)人員了解如何發(fā)現(xiàn)此類擴(kuò)增的具體反應(yīng)條件。因此，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)和擴(kuò)增反應(yīng)(qPCR)可在同一容器內(nèi)(例如，在單一管或小瓶中)而不用在不同容器內(nèi)進(jìn)行。優(yōu)選使用市售RT-PCR試劑盒,例如凱杰公司(Qiagen) QuantiTect 病毒試劑盒或英杰公司(Invitrogen)Super Script III Platinum 試劑盒?？捎帽绢I(lǐng)域已知的相應(yīng)實(shí)時(shí)循環(huán)儀軟件分析所得熒光信號(hào)。本發(fā)明的核酸測(cè)試可通過(guò)比較所得熒光信號(hào)與本領(lǐng)域已知標(biāo)準(zhǔn)核酸的相應(yīng)信號(hào)來(lái)進(jìn)行定量分析。此類標(biāo)準(zhǔn)品優(yōu)選采用相應(yīng)病毒區(qū)體外轉(zhuǎn)錄物(IVT)的稀釋系列。合適的IVT可按要求產(chǎn)生或可購(gòu)得，例如Panomics 提供10ng/ml的“Ifn_A” (282種核苷酸)和“Ifn-B” (276種核苷酸)單鏈RNA分子。優(yōu)選用下表I所示引物和探針序列進(jìn)行RT-q PCR。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如何針對(duì)M蛋白編碼基因組或流感基因組內(nèi)其他保守區(qū)設(shè)計(jì)其他等效引物和探針。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知下表所示Taqman探針可用等效的Lightcycler探針或其他實(shí)時(shí)探針系統(tǒng)替換。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 7所示引物與SEQ ID NO 3所示探針聯(lián)用于檢測(cè)A型流感病毒。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，SEQ ID NO 11和SEQ ID NOI所示引物與SEQ ID NO 9所示探針聯(lián)用于檢測(cè)B型流感病毒。實(shí)施例(見(jiàn)下文)顯示本發(fā)明的一步RT qPCR測(cè)試能檢測(cè)不同來(lái)源的流感病毒。優(yōu)選實(shí)施方式完整病毒的檢測(cè)在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的測(cè)試用于測(cè)定樣品內(nèi)完整病毒顆粒的含量。這對(duì)于監(jiān)測(cè)疫苗生產(chǎn)過(guò)程特別有用(詳見(jiàn)下文)。可通過(guò)在擴(kuò)增前去除樣品內(nèi)的游離RNA來(lái)區(qū)分游離病毒RNA或核蛋白相關(guān)RNA與病毒顆粒內(nèi)的RNA。例如，如本領(lǐng)域所知，這可通過(guò)RNA酶處理實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的方法如下(a)取病毒顆粒、病毒RNA和核蛋白的樣品(例如，體積為21 ill)。(b)與RNA酶一起孵育。例如，用RNA酶A/Tl (15U/7. 5U)的混合物孵育I小時(shí))。(C)稀釋所述樣品。例如，用移液機(jī)器人進(jìn)行樣品的預(yù)稀釋(I 100-1 10000以在qPCR的線性范圍(Ct 15-33)內(nèi)獲得可靠的定量結(jié)果；(d)提取核酸。例如通過(guò)使用磁珠進(jìn)行全自動(dòng)vRNA提??；(e)qPCR。qPCR可由移液機(jī)器人設(shè)定。樣品中每毫升拷貝數(shù)的計(jì)算與體外轉(zhuǎn)錄RNA(IVT)的UV定量所得標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)。因此，本發(fā)明提供方法定量分析樣品中完整病毒顆粒的含量，其包括以下步驟(a)去除樣品中非病毒顆粒包封的RNA(例如，通過(guò)RNA酶消化)；(b)擴(kuò)增并定量分析樣品中剩余的RNA(例如，如本文所述)；(c)用步驟(b)的結(jié)果計(jì)算樣品內(nèi)完整病毒顆粒的含量。此方法對(duì)A型和B型流感病毒特別有用，尤其是在疫苗制備中。步驟(b)可包括定量PCR (例如RT-PCR)。步驟(b)的結(jié)果可以與標(biāo)準(zhǔn)RNA所產(chǎn)生的信號(hào)比較，以作為步驟(C)計(jì)算的一部分。步驟(a)與(b)之間，可處理病毒顆粒以釋放其RNA，或者這一釋放可在進(jìn)行PCR過(guò)程中自然發(fā)生。本發(fā)明在流感疫苗生產(chǎn)中的優(yōu)選應(yīng)用本發(fā)明的測(cè)試特別有助于基于雞蛋或細(xì)胞培養(yǎng)的流感疫苗生產(chǎn)(綜述參見(jiàn)Wilschut, Mc Elhaney, Palache, “InfIuenza(流感)”；第 2 版；埃爾斯威爾出版社，2006 ；ISBN 0-7234-3433-6中第9章)。所述發(fā)明可用于疫苗生產(chǎn)中的不同步驟，特別用于監(jiān)測(cè)并定量分析早期步驟中的病毒得率。本發(fā)明的方法原則上適于多種流感疫苗的生產(chǎn)(例如，活病毒、滅活全病毒顆粒、,裂解'病毒顆粒、純化表面抗原；詳見(jiàn)申請(qǐng)人明確引用的WO 2008/068631)。這些生產(chǎn)方法中，病毒顆粒在含病毒液體如尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中生長(zhǎng)并從中收集。為純化病毒顆粒，可用不同方法，例如使用含去污劑以破壞病毒顆粒的線性蔗糖梯度溶液進(jìn)行的區(qū)帶離心。任選稀釋后，可通過(guò)滲濾純化抗原。用去污劑(如乙醚、聚山梨醇酯80、脫氧膽酸鹽、三正丁基磷酸鹽、曲通X-100、曲通N101、溴化十六烷基三甲銨、特吉托NP9等)處理純化的病毒顆粒以獲得裂解病毒顆粒，從而產(chǎn)生亞病毒顆粒制齊IJ，包括'吐溫-醚'裂解方法。例如，裂解流感病毒的方法是本領(lǐng)域熟知的(綜述參見(jiàn)WO2008/068631)。裂解流感疫苗的示例有 BEGRIVAC 、FLUARIX 、FLUZONETM 和 FLUSHIELD 產(chǎn)品。本發(fā)明的方法也可用于活疫苗的生產(chǎn)。這些疫苗中的病毒可被減毒?；畈《疽呙绨ㄡt(yī)學(xué)免疫公司(MedImmune)的FLUMIST 產(chǎn)品(三價(jià)活病毒疫苗)。純化的流感病毒表面抗原疫苗包含表面抗原血凝素，一般還包含神經(jīng)氨酸酶。以純化形式制備這些蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域熟知的。FLUVIRIN 、AGRIPPAL 和INFLUVAC 產(chǎn)品是流感亞基疫苗。另一種形式的滅活抗原是病毒體(不含核酸的病毒樣脂質(zhì)體顆粒)。病毒體可通過(guò)用去污劑溶解病毒，然后去除核衣殼和重建含病毒糖蛋白的膜來(lái)制備。另一種制備病毒體的方法包括將病毒膜糖蛋白加入至過(guò)量磷脂，得到膜中具有病毒蛋白質(zhì)的脂質(zhì)體。本發(fā)明在基于細(xì)胞培養(yǎng)的流感疫苗生產(chǎn)中的特別優(yōu)選應(yīng)用在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明用于基于細(xì)胞培養(yǎng)的流感疫苗生產(chǎn)。例如在TO 2008/068631中描述了合適的細(xì)胞系。用于培養(yǎng)流感病毒的最優(yōu)選的細(xì)胞系是MDCK細(xì)胞系。原始MDCK細(xì)胞系可獲自ATCC (CCL-34)，但也可利用該細(xì)胞系的衍生細(xì)胞系和其他MDCK細(xì)胞系。例如，W097/37000中公開(kāi)了適合懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系('MDCK 33016/，保藏號(hào)DSM ACC 2219)。類似地，W001/64846公開(kāi)了在無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)的MDCK衍生細(xì)胞系C B-702/，保藏號(hào)FERM BP-7449)。W02006/071563公開(kāi)了非致瘤性 MDCK 細(xì)胞，包括'MDCK-S ' (ATCC PTA-6500)、' MDCK-SF101 ' (ATCCPTA-6501)、 ' MDCK-SF102 ' (ATCC PTA-6502)和'MDCK-SF103 ' (PTA-6503)。W02005/113758公開(kāi)了非常容易感染的MDCK細(xì)胞系，包括‘MDCK. 5F1’細(xì)胞(ATCC CRL12042)?？墒褂萌魏芜@些MDCK細(xì)胞系?；诩?xì)胞培養(yǎng)的疫苗生產(chǎn)方法通常包括以下步驟各單價(jià)部分的起始材料是單管MDCK工作細(xì)胞庫(kù)(WCB)。所述細(xì)胞在化學(xué)限定的培養(yǎng)基中增殖以優(yōu)化生產(chǎn)中的細(xì)胞生長(zhǎng)。通過(guò)轉(zhuǎn)瓶中的順序傳代然后放大至更大體積的發(fā)酵容器中來(lái)擴(kuò)增WCB。添加種病毒，病毒增殖在發(fā)酵罐中進(jìn)行2-4周。感染周期結(jié)束時(shí)，離心并過(guò)濾病毒懸液以除去培養(yǎng)收集物中殘留的完整細(xì)胞。離心、過(guò)濾后的部分稱為澄清病毒收獲物，這是發(fā)酵過(guò)程的終點(diǎn)。澄清病毒收獲物可在不銹鋼保存容器中室溫保存(16-25°C )最多24小時(shí)。通過(guò)層析和超濾/滲濾步驟純化流感病毒，用￠-丙內(nèi)酯(BPL)滅活并用溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)破壞使病毒表面抗原HA和NA溶解。藥物物質(zhì)生產(chǎn)方法的最后是將濃縮物過(guò)濾入最終的散料容器以獲得單價(jià)單價(jià)散料。最后，單價(jià)散料可混入多價(jià)散料(通常為三價(jià)散料)并裝入最終容器，如注射器中。這是使最終疫苗中殘留細(xì)胞系DNA量最少?gòu)亩笵NA的致癌活性最小化的標(biāo)準(zhǔn)操作(詳見(jiàn) WO 2008/068631)。本發(fā)明可用于這一過(guò)程中的不同時(shí)間點(diǎn)。但特別優(yōu)選本發(fā)明的方法用于監(jiān)測(cè)和/或定量分析過(guò)程早期階段(發(fā)酵、收獲、直至滅活)的病毒得率。本發(fā)明的測(cè)試可用作本領(lǐng)域現(xiàn)有方法(單徑向擴(kuò)散(SRD))的補(bǔ)充或替代方法。本發(fā)明的方法快速( 4小時(shí)內(nèi)得到結(jié)果；SRD需 3天)并能以高樣品通量應(yīng)用。所述方法獨(dú)立于特異性試劑(例如，毒株特異性抗體)。本發(fā)明的測(cè)試特別適用于SRD靈敏度過(guò)低(純化/濃縮前)或SRD結(jié)果不可靠(收獲/測(cè)得無(wú)病毒顆粒相關(guān)HA時(shí))的情況。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明用于定量分析發(fā)酵過(guò)程中的病毒載量，以確定收獲病毒的最優(yōu)時(shí)間。在進(jìn)一步特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述核酸分析前進(jìn)行病毒樣品的RNA酶消化。這樣能區(qū)分游尚病毒RNA和完整病毒顆粒，從而能定量完整病毒顆粒。疫苗組合物和疫苗給予本發(fā)明還提供上述本發(fā)明制備方法生產(chǎn)的疫苗。這類疫苗通常含有HA作為主免疫原，參照一般由SRD測(cè)定的HA水平來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化疫苗劑量?，F(xiàn)有的疫苗一般含有約15 ii g HA/
毒株，但也可使用更低的劑量，例如在兒科應(yīng)用或大流行情況下，或者是使用佐劑時(shí)。分?jǐn)?shù)劑量如1/2 ( BP 7. 5 u g HA/毒株)、1/4和1/8以及較高劑量(如3x或9x劑量)已有應(yīng)用。因此，疫苗可包含0. 1-150 u g HA/流感毒株，優(yōu)選0. l_50ii g，例如0. 1-20 y g、0. 1-15 y g、0. I-IOiI g、0. 1-7. g、0. 5-5i! g 等。具體劑量包括例如，約 45、約 30、約 15、約 10、約 7. 5、約5、約3. 8、約3. 75、約I. 9、約I. 5 y g等/毒株。就活疫苗而言，利用組織培養(yǎng)感染劑量中值(TCID50)而非HA含量來(lái)測(cè)量劑量，TCID50 —般為IO6-IO8 (優(yōu)選為106 5_107_5) /毒株。本發(fā)明所得流感毒株可以具有野生型病毒中的天然HA，或具有修飾HA。例如，已知修飾HA去除決定簇(如HA1/HA2切割位點(diǎn)周圍的超堿性區(qū)域(hyper-basic region))使病毒在禽類動(dòng)物中具有高致病性。稱為“反向遺傳學(xué)”的所述應(yīng)用促進(jìn)這類修飾。用于疫苗的流感病毒株隨季節(jié)而變。在大流行間期，疫苗一般包括兩種A型流感毒株(H1N1和H3N2)和一種B型流感毒株，一般是三價(jià)疫苗。本發(fā)明也用于生產(chǎn)疫苗抵御大流行病毒株(即疫苗接受者和普通人群沒(méi)有與其發(fā)生過(guò)免疫接觸的毒株，特別是A型流感毒株)，如H2、H5、H7或H9亞型毒株以及Hl亞型毒株，大流行毒株的流感疫苗可以是單價(jià)疫苗，或者可以基于補(bǔ)充有大流行毒株的正常三價(jià)疫苗。然而，根據(jù)季節(jié)和疫苗所含抗原的特性，本發(fā)明還可用于生產(chǎn)疫苗抵御一種或多種HA亞型HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 或 H16，和 / 或 NA 亞型 NI、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8 或 N9。除了適合生產(chǎn)疫苗抵御大流行間期毒株外，本發(fā)明的組合物特別有助于生產(chǎn)疫苗抵御大流行毒株?？赡芤鸫罅餍斜l(fā)的流感毒株的特征是(a)與目前流通的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即十年來(lái)在人群中未顯見(jiàn)的血凝素(如H2)，或者從未在人群中發(fā)現(xiàn)的血凝素(如通常只出現(xiàn)在鳥(niǎo)群體中的H5、H6或H9)，從而人群未曾免疫接觸過(guò)該毒株的血凝素；(b)它能夠在人群中水平傳播；和(c)它對(duì)人有致病性。優(yōu)選用含H5血凝素類型的病毒免疫以抵御大流行流感，如H5N1毒株。其它可能的毒株包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，以及任何其它可能出現(xiàn)的大流行毒株和HlNl毒株。本發(fā)明組合物可包含一種或多種(如1、2、3、4或更多種)流感病毒株，包括A型流感病毒和/或B型流感病毒的抗原。疫苗包含一種以上流感毒株時(shí)，一般單獨(dú)培養(yǎng)不同毒株，收獲病毒后將它們混合在一起，然后制備抗原。因此，本發(fā)明方法可包括混合一種以上流感毒株的抗原的步驟。通常為三價(jià)疫苗，其包含來(lái)自兩種A型流感病毒株和一種B型流感病毒株的抗原。也可用四價(jià)疫苗，其包含來(lái)自2種A型流感病毒株和2種B型流感病毒株的抗原；或者來(lái)自3種A型流感病毒株和一種B型流感病毒株的抗原(W02008/068631)。如本發(fā)明所述制備的疫苗組合物是藥學(xué)上可接受的。它們通常還包含抗原外的其它組分，例如它們一般包含一種或多種藥物載體和/或賦形劑。如下所述，也可包含佐劑。此類組分的詳細(xì)討論可見(jiàn)參考文獻(xiàn)(明確引用的W02008/068631)。本發(fā)明組合物優(yōu)選包含佐劑，佐劑的作用是增強(qiáng)在接受組合物的患者中引起的免疫應(yīng)答(體液免疫和/或細(xì)胞免疫)。優(yōu)選的佐劑包含水包油乳液。已知各種這類乳液，其通常包含至少一種油和至少一種表面活性劑，所述油和表面活性劑是生物可降解(可代謝)和生物相容的。所述油可包括鯊烯。乳劑中的油滴直徑通常小于5i!m，理想情況下具有亞微米直徑，通過(guò)微流化床實(shí)現(xiàn)這種小尺寸以提供穩(wěn)定乳劑。優(yōu)選尺寸小于220nm的液滴，因?yàn)槠淇蛇M(jìn)行過(guò)濾滅菌。W02008/068631(第14頁(yè)起；其已明確引用；例如MF59 )中詳述了可能的佐劑。適用于本發(fā)明組合物(或藥盒組分)的容器包括無(wú)菌藥瓶、注射器(如一次性注射器)、鼻噴霧等。W02008/068631 (第31頁(yè)；其已明確引用)中詳述了此類容器。本發(fā)明提供按本發(fā)明所述制備的疫苗。這些疫苗組合物適合給予人類患者，且本發(fā)明提供了引起患者免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將本發(fā)明組合物給予患者的步驟(詳述
于WO 2008/068631 ;第32頁(yè)起，其已明確引用)。序列與藥盒本發(fā)明還有部分是表I所列引物和探針序列(SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11)。SEQ ID NO :8包括兩個(gè)簡(jiǎn)并堿基，因此可呈現(xiàn)4種分離的獨(dú)立寡核苷酸序列。對(duì)于A型流感正向引物包括SEQ ID NO :5、2和7 ;反向引物是SEQID NO :4 ;可用探針是SEQ ID NO :3。對(duì)于B型流感反向引物包括SEQ ID NO :8、10和I ;正向引物是SEQID NO :11 ;可用探針是SEQ ID N0:9。SEQ ID NO :6是A型流感的又一個(gè)正向引物。術(shù)語(yǔ)‘正向’僅為方便而用，指與基質(zhì)蛋白含ATG的編碼鏈具有同一編碼意義的引物。由于流感病毒具有負(fù)鏈基因組，涉及與病毒基因組RNA片段雜交時(shí)術(shù)語(yǔ)正向和反向應(yīng)反轉(zhuǎn)。本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式是SEQ ID NO 4和7所示引物與SEQ ID NO 3所示探針(A型流感)的特定組合，以及SEQ ID NO 11和I所示引物與SEQ ID NO 9所示探針(B型流感)的特定組合，特別是以藥盒形式。所述藥盒可含有其他組分，例如緩沖液、聚合酶和其他擴(kuò)增用反應(yīng)組分。本發(fā)明的又一方面是所述序列、組合物和藥盒在診斷應(yīng)用的疫苗生產(chǎn)過(guò)程中檢測(cè)流感病毒和特別用于定量分析病毒的用途。其他有用引物是SEQ ID NO :12、13、14和15。其他有用探針是SEQ ID N0:16和17。SEQ ID NO :14 和 15 可與 SEQ ID NO. :16 聯(lián)用。SEQ ID N0:17 可與 SEQ ID NO :4 和7聯(lián)用。本發(fā)明的探針(例如，SEQ ID NO :3和9)可標(biāo)記有例如5丨6_羧基熒光素(6FAM)標(biāo)記和/或3' ‘黑莓淬滅劑’(BBQ)標(biāo)記。本發(fā)明還提供包含選自SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11所示核苷酸序列的核酸。這些核酸應(yīng)為單鏈，長(zhǎng)度小于80個(gè)核苷酸，例如小于50個(gè)核苷酸或小于30個(gè)核苷酸。它們可用作引物和/或探針以檢測(cè)流感病毒。所述核酸可具有與相關(guān)SEQ ID NO相同的3'殘基，即，其可包含序列5' -X-Y-3'，其中Y是選自SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的序列；且X是具有I個(gè)或多個(gè)核苷酸的核苷酸序列。具有序列5' -X-Y-3'的核酸可雜交流感病毒基質(zhì)核酸。附圖
簡(jiǎn)要說(shuō)明圖I顯示qPCR病毒顆粒測(cè)定與感染期間測(cè)得的已知感染性病毒動(dòng)力學(xué)的關(guān)聯(lián)。X軸表示感染后的小時(shí)數(shù)。Y軸以對(duì)數(shù)標(biāo)度顯示qPCR測(cè)得的每毫升拷貝數(shù)。該圖顯示低m. 0. i.時(shí)qPCR曲線對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)感染性病毒滴度動(dòng)力學(xué)。具體地，16-24小時(shí)后上清液中可測(cè)得病毒后代，48小時(shí)后得到最大感染性。每條線顯示不同實(shí)驗(yàn)。圖2顯示由透射電子顯微鏡測(cè)得病毒顆粒與由本發(fā)明所述qPCR測(cè)得病毒顆粒數(shù)量間的關(guān)聯(lián)。X軸顯示每毫升的TEM病毒顆粒計(jì)數(shù)數(shù)量，y軸顯示qPCR測(cè)得的每毫升拷貝數(shù)。實(shí)施本發(fā)明的
具體實(shí)施例方式不同流感亞型的檢測(cè)從德國(guó)國(guó)立動(dòng)物流感研究中心(羅福樂(lè)研究所(Frierich Loeffler Institute),
黎姆斯)獲得流感病毒株。所述毒株在MDCK 33016PF細(xì)胞上培養(yǎng)，通過(guò)本發(fā)明的RT-PCR方法使用凱杰公司QuantiTect 病毒試劑盒或英杰公司Super Script (TM) III Platinum 試劑盒分析第一和第二代上清液。所用引物和探針見(jiàn)表I所示。使用QuantiTect 病毒試劑盒時(shí)，運(yùn)行以下溫度曲線-熒光信號(hào)測(cè)定60°C-溫度變化速率2°C /秒-RT 步驟50°C 20 分鐘-Taq 活化 95 °C 5 分鐘-主運(yùn)行45輪循環(huán)94°C15秒；60°C 45秒(2步法)或45輪循環(huán)94°C 15秒；60 0C 30 秒；72°C 30 秒(3 步法)。使用Super Script (tm) III Platinum 試劑盒時(shí),運(yùn)行以下溫度曲線-突光信號(hào)測(cè)定60°C
-溫度變化速率2 °C /秒-RT 步驟50°C I5 分鐘-Taq 活化 95 °C 2 分鐘-主運(yùn)行45輪循環(huán)94°C15秒，60°C 45秒用相應(yīng)的實(shí)時(shí)軟件分析熒光信號(hào)。通過(guò)比較所得熒光信號(hào)與IVT系列稀釋的相應(yīng)信號(hào)定量分析所述信號(hào)。表2所示結(jié)果表明所有測(cè)試的流感病毒亞型都能用同一組引物和探針鑒定。這表明本發(fā)明的方法能檢測(cè)多種不同流感亞型。發(fā)明人還檢測(cè)了表7所示流感毒株。為了評(píng)估本發(fā)明方法的靈敏度，進(jìn)行含A/Bayern/7/95流感毒株或B/BadenWiirttemberg/3/06流感毒株樣品的系列稀釋。使用QuantiTect 病毒試劑盒或SuperScript (tm) III Platinum 試劑盒按本發(fā)明的方法(如上所述)或Cepheid 流感病毒A/B引物與探針組按生產(chǎn)商的方案對(duì)所述樣品進(jìn)行qPCR。用相應(yīng)的實(shí)時(shí)軟件分析熒光信號(hào)。通過(guò)比較所得熒光信號(hào)與IVT系列稀釋的相應(yīng)信號(hào)定量分析所述信號(hào)。結(jié)果列于表5和6。對(duì)于A型流感毒株，當(dāng)使用本發(fā)明的方法時(shí)在多至I : 1000000稀釋時(shí)病毒顆粒仍可檢測(cè)，而Cepheid試劑盒最多只可檢測(cè)I : 100000稀釋時(shí)的病毒顆粒。對(duì)于B型流感毒株，病毒顆粒在多至I : 1000000稀釋時(shí)仍可檢測(cè)，而Cepheid試劑盒最多只可檢測(cè)I : 10000稀釋時(shí)的病毒顆粒。因此，本發(fā)明的方法比現(xiàn)有技術(shù)的方法靈敏得多。樣品中流感病毒顆粒的定量分析
樣品中流感病毒顆粒測(cè)定如圖I所不。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，21 ii I樣品用15U RNA酶A和7. 5U Tl的混合物進(jìn)行RNA酶處理。樣品與RNA酶混合物一起孵育I小時(shí)。經(jīng)預(yù)處理的樣品以I : 100-1 10000的比例稀釋以獲得qPCR給出結(jié)果在線性范圍內(nèi)的稀釋液。樣品按本文的方法進(jìn)行qPCR。所述結(jié)果與用體外轉(zhuǎn)錄RNA(IVT)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。結(jié)果(圖I所示)顯示低MOI時(shí)qPCR拷貝數(shù)所得曲線對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)感染性病毒滴度動(dòng)力學(xué)。具體地，16-24小時(shí)后上清液中可測(cè)得病毒后代，48小時(shí)后得到最大毒力滴度。由透射電子顯微鏡和本發(fā)明所述qPCR評(píng)估的病毒顆粒的關(guān)聯(lián)所得流感毒株是A/Bayern/7/95、A/New Caledonia/20/99、A/Hong Kong/8/68、B/Lee/40和A/Puerto Rico/8/34從ABI在線(ABI online)獲得。通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM)評(píng)估病毒顆粒數(shù)。為此，將病毒顆粒施用到涂層銅網(wǎng)格上并空氣干燥。然后所述材料用2. 5% (v/v)戊二醛固定、清洗并用2% (w/v)乙酸鈾水溶液和2% (w/v)磷鎢酸(PTA)pH6. 5染色。用TEM確定樣品中的病毒顆粒數(shù)。TEM計(jì)數(shù)所得病毒顆粒數(shù)與本發(fā)明所述qPCR
評(píng)估所得病毒顆粒數(shù)作比較。結(jié)果(見(jiàn)圖2)顯示本發(fā)明的方法精確測(cè)定樣品中各種不同流感毒株的病毒顆粒數(shù)。應(yīng)理解，僅以舉例的方式描述了本發(fā)明，可進(jìn)行修改而仍在本發(fā)明的范圍和構(gòu)思內(nèi)。表I :用于檢測(cè)A型和B型流感病毒的優(yōu)選引物與探針序列。探針序列為Taqman 探針。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)流感病毒RNA的方法，其特征在于，流感基因組內(nèi)的保守區(qū)得到擴(kuò)增。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述保守區(qū)部分或全部編碼M蛋白。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法提供的擴(kuò)增子包含SEQID NO 3或SEQ ID NO 9。
4.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，進(jìn)行一步RT-qPCR。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，使用表I所示(SEQID NO 1-11)的至少一種引物或探針。
6.一種定量分析流感病毒RNA含量的方法，其特征在于，進(jìn)行以下步驟 a)采用如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法， b)所得信號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)RNA所得信號(hào)作比較， c)獲得病毒RNA的含量。
7.一種定量分析樣品中完整病毒顆粒含量的方法，其特征在于，進(jìn)行以下步驟 a)去除樣品中的游離病毒RNA， b)采用如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法， c)所得信號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)RNA所得信號(hào)作比較， d)獲得完整病毒顆粒的含量。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)中的RNA用RNA酶處理去除。
9.一種生產(chǎn)流感疫苗的方法，其中采用如上述權(quán)利要求之一所述的方法。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法用于基于細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)過(guò)程中的發(fā)酵步驟，且定量分析病毒顆粒的含量以確定收獲病毒的最優(yōu)時(shí)間。
11.一種基于細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)流感疫苗的方法，其特征在于，進(jìn)行以下步驟 在發(fā)酵容器內(nèi)增殖細(xì)胞； 籲添加種病毒； 采用權(quán)利要求7所述的方法監(jiān)測(cè)所述病毒增殖； 離心并過(guò)濾所述病毒懸液； 所述病毒通過(guò)層析和超濾/滲濾步驟純化，滅活，破壞以使病毒表面抗原HA和NA溶解； 籲所述抗原過(guò)濾以獲得單價(jià)散料； 任選地，將所述單價(jià)散料混入多價(jià)散料(通常為三價(jià)散料)并裝入最終容器。
12.如權(quán)利要求9或10所述的方法制得的流感疫苗。
13.—種診斷流感的方法，其特征在于，其中采用如權(quán)利要求1-6之一所述的方法。
14.表I所示引物和探針寡核苷酸(SEQID NO 1-11)。
15.一種藥盒，其包含至少一種權(quán)利要求14所述的引物或探針，并任選地包含其他組分，例如進(jìn)行核酸擴(kuò)增用的試劑，和進(jìn)行擴(kuò)增的說(shuō)明。
16.如權(quán)利要求13所述的寡核苷酸和權(quán)利要求14所述的藥盒在流感疫苗生產(chǎn)或流感診斷中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及流感病毒檢測(cè)與定量分析的通用方法。這些方法可使用逆轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)實(shí)時(shí)(q-PCR)測(cè)試，所述測(cè)試擴(kuò)增A型或B型流感毒株內(nèi)的保守區(qū)。所述測(cè)試能定量分析流感病毒RNA分子或全病毒顆粒，而不論具體的病毒株(例如，人、禽、豬流感)。所述方法特別適合作為診斷測(cè)試或用于監(jiān)測(cè)疫苗生產(chǎn)過(guò)程。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102803515SQ201080027099
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2010年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月8日
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