專利名稱：在具有腺毛的植物中產(chǎn)生萜烯和萜類的制作方法
在具有腺毛的植物中產(chǎn)生萜烯和萜類領(lǐng)域本公開內(nèi)容一般涉及在遺傳改造的具有腺毛的植物中產(chǎn)生同源或異源的萜烯 (terpenes)和萜類(terpenoids)、和/或高價值小分子。更具體地，遺傳改造的具有腺毛的植物包含并表達編碼在同源或異源的萜烯和萜類、和/或高價值小分子的生物合成中具有活性的蛋白的基因。背景大多數(shù)植物在其葉表面上具有稱為毛狀體的特化的毛發(fā)樣結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)參與大量適應性功能，包括保護不受草食動物和微生物侵害。存在兩種主要類型的毛狀體腺毛和非腺毛。腺毛不像非腺毛那么普遍，能夠合成和儲存大量的次生代謝物作為植物精油的部分。精油是一種揮發(fā)性的復雜混合物，特征是強烈的氣味，主要包括萜烯。萜烯和其化學改性形式(通稱為“萜類”)是生物合成地來源于同樣的基本五-碳異戊二烯構(gòu)件的有價值的烴類。毛狀體中發(fā)生的生物合成途徑具有使得它們成為代謝工程的有吸引力的靶的多種特征。首先，毛狀體僅為產(chǎn)生大量特化的小分子而設計，使得它們成為萜烯和來源于萜烯的其他烴類的理想生產(chǎn)系統(tǒng)。第二，毛狀體是非必需結(jié)構(gòu)，表示對其內(nèi)源途徑的修飾將不會不利地影響植物健康。第三，由于毛狀體的天然保護結(jié)構(gòu)，對其他植物組織有毒的化學物可在植物精油中產(chǎn)生和富集，而不對植物細胞產(chǎn)生細胞毒性。胡椒薄荷(p^permint)是可用作產(chǎn)生油類和高價值小分子的通用平臺的具有腺毛的植物的一個實例。從胡椒薄荷(MenthaXpiperita)葉蒸餾的精油用在多種消費品中(如，口香糖、牙膏和漱口水)，用作糖果和藥品工業(yè)中的調(diào)味劑，和用作芳香療法的活性成分來源。胡椒薄荷油主要由對薄荷烷型單萜(monoterpenes)組成，含有少量(smaller quantities)其他單蔽禾口微量(minor quantities)倍半蔽(sesquiterpenes) (Rohloff, 1999)。精油在特化的盾狀腺毛中合成和積聚(Gershenzon等，1989 ；McCaski 11等，1992)。 這些毛狀體包含以8細胞盤排列的分泌細胞，它們負責合成精油。精油被排入通過表皮材料的預形成層的分離而形成的新生腔(Amelimxen，1965)。精油從胡椒薄荷盾狀腺毛的揮發(fā)是可忽略的(Gershenzon等，2000)。盡管類異戊二烯天然產(chǎn)物表現(xiàn)出巨大的結(jié)構(gòu)多樣性，關(guān)鍵中間產(chǎn)物的生物合成所基于的生化原理是相對簡單的。術(shù)語類異戊二烯用于形式上來源于異戊二烯O-甲基丁-1，3-二烯)的化合物，其構(gòu)架通?？梢匀魏晤惍愇於┓肿拥闹貜统霈F(xiàn)來辨別 (Ruzicka,1953)0所有類異戊二烯結(jié)構(gòu)生物合成地來源于“活性異戊二烯”(Lynen等， 1958 ；Chaykin等，1958)即異戊烯基二磷酸(IPP)、和其異構(gòu)體二甲烯丙基二磷酸(DMAPP) (

圖1)。起始分子DMAPP與鏈延伸分子IPP之間的縮合反應產(chǎn)生多種異戊二烯基二磷酸，其用作產(chǎn)生類異戊二烯終產(chǎn)物的萜烯合酶和次級修飾酶的前體。通用的C5中間產(chǎn)物IPP和 DMAPP可經(jīng)由兩種不同途徑產(chǎn)生。在酵母、真菌、古細菌和動物中，甲羥戊酸(MVA)途徑負責合成類異戊二烯中間產(chǎn)物，而在大多數(shù)真細菌中不依賴MVA的途徑起作用。兩種途徑在植物和某些藻類中都發(fā)生，其中MVA途徑的酶存在于胞質(zhì)/ER區(qū)室，不依賴MVA途徑的酶位于質(zhì)體(Lange等，2000a)。因為在胡椒薄荷腺毛中產(chǎn)生高水平的IPP和DMAPP (McCaskill和 Croteau, 1995)，存在利用這些毛狀體作為產(chǎn)生來源于IPP和DMAPP前體的各種萜烯和萜類的“綠色工廠”的可能。盡管利用植物作為產(chǎn)生小分子的“綠色工廠”的觀念已經(jīng)引起巨大興趣，迄今有多種問題阻礙了代謝改造的努力(1)當萜烯和萜類以非特異性方式積聚時，其積聚導致細胞毒性；( 當萜類以非特異性方式產(chǎn)生時，其通常為了儲存而轉(zhuǎn)化為共軛物 (conjugate)，導致積聚水平低；和(3)當在大多數(shù)植物中產(chǎn)生時，萜類作為揮發(fā)物排出，這導致積聚水平低。概述本發(fā)明的一個實施方案是基于首次在遺傳改造的具有腺毛的植物中成功產(chǎn)生新的異源萜烯和/或萜類。具有毛狀體的植物物種天然地進化了儲存大量精油的能力。本文描述的結(jié)果顯示，異源萜烯和萜類(該植物天然不產(chǎn)生的萜烯和萜類)被產(chǎn)生和積聚在轉(zhuǎn)基因植物的精油中。該轉(zhuǎn)基因植物通過轉(zhuǎn)化在異源萜烯和/或萜類的生物合成中具有活性的一種或多種基因來產(chǎn)生。典型地，生物合成途徑通?；颉疤烊坏亍贝嬖谟谄渌锓N的植物中，但在根據(jù)本發(fā)明遺傳改造的具有腺毛的植物中通常(天然地)不存在或不運轉(zhuǎn)。例如，通過用來自青蒿(Artemisia annua.)的以下基因之一轉(zhuǎn)化薄荷植物，已在該轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生和積聚多種異源單萜和倍半萜紫穗槐-1，4-二烯合酶(ADQ基因、 (-)_芳樟醇合酶、(+)_檸檬烯合酶、(-)_檸檬烯7-羥化酶或Y-蛇麻烯合酶。在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生的異源單萜和倍半萜包括紫穗槐-1，4-二烯、(-)_芳樟醇、(+)_檸檬烯、 (-)_紫蘇醇和Y-蛇麻烯，這些都不是薄荷植物中通常產(chǎn)生的。這些結(jié)果顯示，遺傳改造的具有腺毛的植物是用于產(chǎn)生有價值的異源萜烯和萜類的適當?shù)乃拗?。具有腺毛的植物還可用于產(chǎn)生其他有價值的小分子，例如，來源于萜類或苯并素生物合成途徑的小分子，諸如松香二烯(abietadiene)、紫穗槐-1,4- 二烯(amorpha-1，4-diene)、5_ 表-馬兜鈴烯 (5-epi-aristolochene)、青蒿酸(artemisinic acid)、脫氧青蒿酸(dehydroartemisinic acid)、青蒿素(artemisinin)、反式香梓樣烯(trans-alpha-bergamotene)、β-紅沒藥烯(beta-bisabolene)、α -和γ -紅沒藥烯、(+)-冰片基二磷酸((+) -bornyl diphosphate)、 δ-杜豐公??；希(delta—cadinene)、 (-)((_)—camphene)、 (+) -3- W 'M ((+)-3-carene)、α -禾口 β-石竹烯(caryophyllene)、蓖麻烯(casbene)、對映-咖薩-12， 15—二;I；希(ent-cassa-12,15-diene) (epi_cedrol)、菊基二 舞酸(chrysanthemyl diphosphate)、1，8-桉樹腦(1，8-cineole)、(-)-柯巴基二磷酸((-)-copalyl diphosphate)、對映-柯巴基二磷酸(ent-copalyl diphosphate)、β -蓽澄茄烯 (beta-cubebene)、蓽澄酉享(cubebol)、elisabethatriene、β -按葉酉享(beta-eudesmol)、 法呢醇(farnesol)、α -和β -法呢烯(farnesene)、櫳牛兒醇(geraniol)、櫳牛兒基芳樟酉享(geranyllinalool)、germacradienol/ 土臭味素(geosmin)、大根香葉烯 (germacrene) A、C 禾口 D、棉酷(gossypol)、α -古蕓烯(alpha-gur junene)、(+)-5(6)， 13-halimadiene-15_ol、α-、β -禾口 Y-蛇麻烯(humulene)、epi-isozizaene、對映-貝殼杉烯(ent-kaurene)、左旋海松二烯(Ievopimaradiene)、(_)_ 梓檬烯((_)-limonene)、 (-)_ 異薄荷烯醇((-)-isopiperitenol), (+)-檸檬烯((+)-limonene),(-)-芳樟醇 ((-)-Iinalool)、長葉烯(Iongifolene)、對薄荷燒-3,8- 二醇(p-menthane-3，8-diol)、(+)-薄荷呋喃((+) -menthofuran)、(_) _ 薄荷酮((_) -menthone)、(_) _ 薄荷酮、順式依蘭油二烯(cis-muuroladiene)、月桂烯(myrcene)、E-橙花叔醇(E-nerolidol)、 努特卡酮(nootkatone)、β -羅勒烯(beta-ocimene)、廣藿香醇(patchoulol)、并環(huán)萜烯(pentalenene)、β _ /K 芹烯(beta-phellandrene)、(_)_ 紫蘇醇((-)-periIlyl alcohol)、海松-9(11)，15- 二烯(pimara-9 (11)，15-diene)、順式海松 _7，15- 二烯 (syn-pimara-7，15-diene)、α-和 β -菔烯(pinene)、(+)-胡薄荷酮((+)-pulegone)、順 ζJj^MBI (cis-rose oxide)、胃映 _ 111 ^ ^ (ent-sandaracopimaradiene)、 δ _ 床烯(delta-selinene)、stemar-13-ene、stemodene、類蔽菌素(terpenticin)、γ - ijS Ftn (gamma-terpinene) > α ~ i βπ If (alpha—terpineol)、i 品油 j；希(terpinolene)、四氧大麻 )酸(tetrahydrocannabinoic acid)、單端抱霄;I；希(trichodiene)、 (+)-瓦倫;I；希 ((+) -valencene)、馬鞭草烯酮(verbenone)、巖蘭螺旋二烯(vetispiradiene)、α -巖蘭酮 (alpha—vetivone)、綠花白千層酉享(viridif lorol)禾口 α -姜烯(alpha—zingiberene)。在本發(fā)明的一些實施方案中，萜烯和/或萜類是萜烯生物合成途徑前體的衍生物，其實例包括但不限于異戊烯基二磷酸、二甲基烯丙基二磷酸、櫳牛兒基二磷酸、法呢基二磷酸、櫳牛兒基櫳牛兒基二磷酸和角鯊烯。此外，通過遺傳改造來操縱具有腺毛的植物的遺傳組分，例如，以包含和表達編碼催化不同目標修飾反應的一種或多種酶的基因，可導致產(chǎn)生具有期望的化學組成和特性的具體的目標化合物。在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種遺傳改造的具有腺毛的植物(如，薄荷植物)，所述植物包含編碼在至少一種或多種異源或同源的萜烯或萜類的生物合成中具有活性的一種或多種蛋白的一種或多種可表達基因，其中所述異源或同源萜烯或萜類在所述遺傳改造的具有腺毛的植物的腺毛中合成并儲存在所述遺傳改造的具有腺毛的植物的所述腺毛的油中?？杀磉_基因的實例包括紫穗槐-1，4-二烯合酶、(-)-芳樟醇合酶、(+)-檸檬烯合酶、(-)_檸檬烯7-羥化酶或Y-蛇麻烯合酶。異源或同源萜烯的實例包括單萜、倍半 IS、二IS (diterpenes)、三1 (triterpenes)禾口多i (polyterpenes),諸如,如,紫種槐一1, 4-二烯、(-)_芳樟醇、(+)_檸檬烯、(-)_紫蘇醇和/或Y-蛇麻烯。在其他實施方案中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生一種或多種萜烯和萜類的方法，包括以下步驟i)選擇具有腺毛的植物(如，薄荷植物)；和ii)遺傳改造具有腺毛的植物以包含和表達編碼在至少一種或多種萜烯和萜類的生物合成中具有活性的一種或多種蛋白的一種或多種基因。所述萜烯和萜類在具有腺毛的植物的腺毛中合成并儲存在具有腺毛的植物的腺毛的油中。適當基因的實例包括紫穗槐-1，4-二烯合酶、(-)_芳樟醇合酶、(+)_檸檬烯合酶、(-)_檸檬烯7-羥化酶或Y-蛇麻烯合酶。異源或同源萜烯的實例包括單萜、倍半萜、二萜、三萜和多萜，諸如，如，紫穗槐-1，4-二烯、(-)-芳樟醇、(+)-檸檬烯、(-)-紫蘇醇和/或Y-蛇麻烯。在一些實施方案中，所述具有腺毛的植物還包含抑制所述具有腺毛的植物中一種或多種生物合成途徑的一種或多種酶的表達的RNA序列。在其他實施方案中，本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生一種或多種萜烯和萜類的方法，包括以下步驟培養(yǎng)本發(fā)明的遺傳改造的具有腺毛的植物，從具有腺毛的植物的所述腺毛的油回收一種或多種萜烯和萜類。這一方法可包括用一種或多種茉莉酮酸酯(jasmonates)處理所述遺傳改造的具有腺毛的植物的步驟。附圖描述
圖IA和B. A，為胡椒薄荷中單萜生物合成供應前體的質(zhì)體不依賴甲羥戊酸途徑的概述。以下酶參與這一途徑(1)1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶；(幻1_脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構(gòu)酶；(3) 2C-甲基-D-赤蘚醇4-磷酸胞苷轉(zhuǎn)移酶;
胞苷5’ - 二磷酸)-2C-甲基-D-赤蘚醇4-磷酸激酶；⑶2C-甲基-D-赤蘚醇 2，4_環(huán)二磷酸合酶；(6) (E)-4-羥基-3-甲基-丁-2-烯基二磷酸合酶；(7) (E)_4_羥基-3-甲基-丁-2-烯基二磷酸還原酶；(8)異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶；(9)櫳牛兒基二磷酸合酶?！癓pl”代表反應的胞內(nèi)位置白色體。B，胡椒薄荷腺毛中對薄荷烷單萜代謝的概述。以下酶參與這一途徑(1)(-)_檸檬烯合酶；(幻(_)_檸檬烯3-羥化酶；(3) (_)-反式異薄荷烯醇(㈠-trans-isopiperitenol)脫氫酶；(4)(-)-反式異胡椒酮 ((-)-trans-isopiperitenone)還原酶；(5) (+)_順式異胡薄荷酮異構(gòu)酶；(6) (+)-薄荷呋喃合酶；(7a) (+)-胡薄荷酮還原酶((-)-薄荷酮-形成活性)；(7b) (+)-胡薄荷酮還原酶 ((+)—異薄荷酮—形成活性)；(8a)(-)-薄荷酮(-)-薄荷醇還原酶((-)-薄荷醇-形成活性)；(8b)(-)-薄荷酮(-)-薄荷醇還原酶((+)-新異薄荷醇—形成活性)；(9a)(-)-薄荷酮(+)-新薄荷醇還原酶((+)-新薄荷醇-形成活性)；(9b)(-)-薄荷酮(+)-新薄荷醇還原酶((+)-異薄荷醇-形成活性)。“Lpl” =白色體；“ER” =內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；“Mit” =線粒體； “Cyt”=胞質(zhì)(反應的胞內(nèi)位置)。(+)_薄荷呋喃對(+)_胡薄荷酮還原酶的抑制由弧形表
7J\ ο圖2A-D.以實時定量PCR確定的參與胡椒薄荷單萜生物合成的基因的表達譜，利用胡椒薄荷β-肌動蛋白基因(AW255057)作為內(nèi)源對照。以30天樣品(溫室條件下生長的野生型植物)獲得的RNA的平均信號強度用作校準物(基于現(xiàn)有知識參與單萜生物合成的基因的表達水平在這一葉發(fā)育階段一致地低(但可檢測))。使用以下縮寫和簡稱DXS， 脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶；DXR，1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構(gòu)酶；CMK，4，4-(胞苷5’ - 二磷酸)-2C-甲基-D-赤蘚醇4-磷酸激酶；HDS，(E) -4-羥基-3-甲基-丁 _2_烯基二磷酸合酶；LS，(-)-檸檬烯合酶；L3H，(-)-檸檬烯3-羥化酶；PR，(+)-胡薄荷酮還原酶；MFS，(+)_薄荷呋喃合酶。A，溫室對照；B，低光強度；C，低水處理；D，低光強度和高夜間溫度。圖3A-F.溫室生長的野生型㈧和MFS7轉(zhuǎn)基因植物⑶、以及在(C)低水處理、⑶ 低光照和(E)低光照與高夜間溫度組合條件下生長的野生型植物的實驗確定的單萜譜。X 軸是出葉后的天數(shù)；Y軸是單萜(yg/葉)。以下符號用于表示單萜譜(-)_檸檬烯，菱形； (+)-胡薄荷酮，方形中的對鉤；(+)-薄荷呋喃，方形中的加號；(-)-薄荷酮，方形；(-)-薄荷醇，三角形。圖F概括腺毛密度和大小分布的數(shù)據(jù)(11 = ，以及出葉30天時的總精油產(chǎn)量(n = 3)。圖4.茉莉酮酸甲酯(MeJA)處理對胡椒薄荷葉中精油產(chǎn)量的影響。縮寫和簡稱 Con =未處理對照植物；MeJA =用MeJA處理的植物。圖5A-C.從以下獲得的精油的氣相OiC)色譜:Α，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?、B，表達紫穗槐二烯合酶的轉(zhuǎn)基因株系和C，包含抗瘧疾藥前體紫穗槐二烯的可信標準混合物(下圖)。 紫穗槐二烯以精油的大約8%在轉(zhuǎn)基因植物中積聚，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锊缓魏慰蓹z測水平的該代謝物。轉(zhuǎn)基因植物中新代謝物的身份通過氣相色譜/質(zhì)譜(GC-MQ分析證實 (與可信標準物的質(zhì)譜比較)。
詳述第一次，轉(zhuǎn)基因的具有腺毛的植物被成功地遺傳改造以產(chǎn)生異源萜烯和萜類。具體地，已經(jīng)制造了產(chǎn)生和積聚紫穗槐-1，4- 二烯、(-)_芳樟醇、(+)_檸檬烯、(-)_紫蘇醇和 Y-蛇麻烯的示例轉(zhuǎn)基因薄荷植物，這是分別以編碼在產(chǎn)生萜烯的生物合成途徑中具有活性的蛋白，即紫穗槐-1，4-二烯合酶(ADQ、(-)-芳樟醇合酶、(+)_檸檬烯合酶、(-)_檸檬烯7-羥化酶或Y-蛇麻烯合酶的基因轉(zhuǎn)化植物的結(jié)果。轉(zhuǎn)基因植物積聚異源萜烯和萜類而不受有害作用影響或因為揮發(fā)而減少產(chǎn)量，可能是因為萜烯被隔絕在植物腺毛中。這些結(jié)果證明利用遺傳改造的具有腺毛的植物作為產(chǎn)生萜烯和萜類的宿主的可行性。本發(fā)明涵蓋在包含和表達編碼在同源或異源萜烯和萜類的生物合成中具有活性的一種或多種蛋白的基因的遺傳改造的具有毛狀體的植物中產(chǎn)生同源和異源萜烯和萜類(和相關(guān)衍生物)的方法，以及該遺傳改造的具有腺毛的植物本身，和其后代。通常，本發(fā)明的方法在具有腺毛的植物中實施，所述植物的實例包括但不限于以下屬的植物辣椒屬(Capsicum)、葛縷子屬(Carum)、棉屬(Gossypium)、潷草屬(Humulus)、 素馨屬(Jasminum)、薰衣草屬(Lavandula)、母菊屬(Matricaria)、薄荷屬(Mentha)、 荊芥屬(N印eta)、羅勒屬(Ocimum)、牛至屬(Origanum)、紫蘇屬(Perilla)、刺蕊草屬 (Pogostemon)、迷迭香屬(Rosmarinus)、鼠尾草屬(Salvia) > ^n M (Solanum)、百里香屬 (Thymus)等等。在一些實施方案中，具有腺毛的植物是薄荷植物，例如，薄荷屬的薄荷植物。本發(fā)明的實施中可利用的薄荷物種包括但不限于水薄荷(Mentha aquatica)、野薄荷(Mentha arvensis)、亞洲薄荷(Mentha asiatica)、澳洲薄荷(Mentha australis)、力口拿大薄荷 (Mentha canadensis)(Mentha cervina)(Mentha citrata) JjJ Bf ^fnf (Mentha crispata) > Mentha cunninghamia>(Mentha dahurica) > Mentha diemenica> Mentha gattefossei> Mentha grandiflora> ^jnf (Mentha haplocalyx) > H ^ifjfff (Mentha j apon i ca) > ill # ^ ^ (Mentha kopetdaghensis) >(Mentha laxiflora)、歐薄荷(Mentha longifolia)、長葉薄荷(Mentha sylvestris)、胡椒薄荷 (Mentha piperita)、唇萼薄荷(Mentha pulegium)、禾斗西嘉薄荷(Mentha requienu)、東北 ^jnf (Mentha sachalinensis) > Mentha satureioides、(Mentha spicata) > 1) ^' 薄荷(Mentha suaveolens)或灰薄荷(Mentha vagans)。還可使用薄荷栽培種，實例包括但不限于水薄荷(Water mint)、水薄荷(Marsh mint)、姜味薄荷、薄荷(Corn Mint)、野薄荷、日本薄荷、中國薄荷(Field Mint)、Pudina、亞洲薄荷、澳洲薄荷、哈特普列薄荷、檸檬薄荷、皺葉薄荷、興安薄荷(Dahurian Thyme)、Slender mint、森林薄荷、長葉薄荷、唇萼薄荷、科西嘉薄荷、園林薄荷、Native Pennyroyal、留蘭香、Curly mint、蘋果薄荷、菠蘿薄荷、 Erosp i CEltEl、O本發(fā)明的具有腺毛的植物是遺傳改造的?！斑z傳改造”是指與被根據(jù)本發(fā)明遺傳改造之前植物的遺傳物質(zhì)相比，植物的遺傳物質(zhì)(如，DNA、RNA等等)已被改變或修飾。被如此遺傳改造的植物可以是天然或“野生型”植物，或可以是此前已被(或同時地)以某種方式遺傳改造的植物(如，表現(xiàn)對疾病、殺蟲劑、艱難生長條件諸如干旱的抗性；或以包含阻礙一種或多種蛋白或酶產(chǎn)生的抑制性RNA ；等等)?？蛇x地，被本發(fā)明方法遺傳改造的植物可以是為其它植物品種、物種等等的雜交種或雜種的植物，是天然存在的雜種或特意培育的雜種，如，通過選擇和將兩個品種或物種雜交。遺傳改造的植物和其后代都被本發(fā)明涵
至
ΓΤΠ ο在本發(fā)明的一些實施方案中，進行的遺傳改造修飾了植物，使其包含(通常表達或過表達)與植物中已經(jīng)存在的遺傳物質(zhì)相同或相似的遺傳物質(zhì)(即，同源遺傳物質(zhì))，但該遺傳物質(zhì)在遺傳改造后以不同的量或形式存在，如，可能引入目標基因的另外拷貝，或可能向植物的現(xiàn)有遺傳物質(zhì)引入突變，等等。因為引入這樣的同源序列而在植物中產(chǎn)生的產(chǎn)物(如，萜烯和/或萜類)稱為同源產(chǎn)物，如，同源萜烯和萜類。在本發(fā)明的其他實施方案中，進行的遺傳改造修飾了植物，使其包含(通常表達或過表達)植物中通常不存在的遺傳物質(zhì)，導致產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。“轉(zhuǎn)基因”是指植物(或其后代)被遺傳改造以包含和表達一種或多種異源的目標核酸序列，即，天然不見于植物中的核酸序列。這種核酸的實例包括但不限于編碼或包含編碼蛋白或肽的基因(可稱為轉(zhuǎn)基因、外來基因、異源基因、過客基因等等)的序列；沉默或抑制RNA ；編碼tRNA的序列； 編碼不同遺傳元件諸如啟動子、增強子和其他轉(zhuǎn)錄和/或翻譯控制序列的序列；等等。這樣的異源核酸序列來自于另一生物體，如，來自于另一植物物種或品種，或甚至來自于非植物物種。在一些實施方案中，異源核酸序列編碼在目標萜烯和/或萜類的生物合成中具有活性(即，參與，可能是所需或必需的)，但通常(天然地)不見于或不由該植物產(chǎn)生的蛋白， 通常是酶。例如，該蛋白可以是催化萜烯或萜類生物合成途徑中一個或多個步驟的酶。這些產(chǎn)物稱為異源產(chǎn)物，如，異源萜烯和/或萜類。異源蛋白或酶可能直接參與萜烯/萜類產(chǎn)生的生物合成途徑，或可能以間接方式調(diào)節(jié)生物合成，如，通過參與競爭性途徑和增加競爭性途徑的活性，通過催化隨后進入萜烯/萜類生物合成途徑的前體的形成，等等。通常，植物的遺傳改造進行的方式導致向植物的染色體摻入包含一種或多種目標核酸序列(通常是基因)的DNA，盡管不必總是這種情況。DNA還可能駐留其中或是染色體外元件的部分。在遺傳改造的植物中，基因是可表達的，即，它們以允許或?qū)е禄虼龠M該基因在植物中轉(zhuǎn)錄為RNA(如，mRNA)的方式締合于(可操作地連接于)其他適當?shù)倪z傳元件諸如啟動子、增強子等等。通常轉(zhuǎn)錄隨后是成功翻譯活性形式的蛋白或酶，除了當基因編碼預期作為抑制物作用的RNA諸如iRNA或siRNA時。此外，被引入遺傳改造的植物的目標核酸可能包含編碼控制其他基因表達的因子的遺傳序列?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的許多方法的任一種轉(zhuǎn)化具有腺毛的植物。例如，可使用農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、中華根瘤菌(Sinorhizobium)、中生根瘤菌(Mesorhizobium)或根瘤菌屬(Rhizobium)介導的轉(zhuǎn)化方法，如本領(lǐng)域已知的。(例如，Broothaerts等，2005 ； Gelvin等，2005對植物轉(zhuǎn)化技術(shù)的描述)?？蛇x地，用于轉(zhuǎn)化植物的其他方法也是已知的， 包括但不限于利用包被有DNA的小的金屬如，金或鎢顆粒(或其他小顆粒)的顆粒轟擊， 將顆粒射入幼嫩植物細胞或植物胚胎；電穿孔，藉以利用電擊在植物細胞膜中制造短暫的孔，允許DNA進入；和病毒轉(zhuǎn)導，其中將期望的遺傳物質(zhì)包裝入適當?shù)闹参锊《荆试S該修飾的病毒感染植物。在后一種情況，如果遺傳物質(zhì)是DNA，其可與染色體重組以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體細胞。然而大多數(shù)植物病毒的基因組由單鏈RNA構(gòu)成，該單鏈RNA在受感染細胞的胞質(zhì)中復制。對于這種基因組，該方法是一種轉(zhuǎn)染形式而不是真正的轉(zhuǎn)化，因為所插入的基因不進入細胞核，也不整合到宿主基因組中。受感染的植物的后代不含病毒，也不含所插入的基因。 因此，基因表達局限于被轉(zhuǎn)染的植物，不傳遞到下一代。
具有毛狀體的植物被遺傳改造以包含一種或多種基因，例如，編碼參與目標萜烯或萜類的合成的蛋白的基因。一種或多種基因可以被過表達，即，表達的水平高于或大于當基因在其自然或天然宿主中存在時通常觀察到或獲得的水平。一種或多種基因的表達通常被啟動子(和可能的其它控制元件)驅(qū)動，該啟動子/控制元件可能是天然締合于該基因的(如，啟動子/控制元件驅(qū)動和/或調(diào)節(jié)基因在植物或基因來自的生物體，即，該基因在自然界中存在的生物體中的表達)。可選地，可聯(lián)合該基因采用異源啟動子和控制元件。本發(fā)明的實踐中可采用的啟動子的實例包括但不限于多種細胞類型或組織特異性啟動子(實例包括但不限于泛在啟動子(在生物體的幾乎所有組織或細胞中具有活性的；實例包括但不限于花椰菜花葉病毒35S啟動子、泛素啟動子、肌動蛋白啟動子、乙醇脫氫酶啟動子；GelVin，2005)和細胞類型或組織特異性啟動子(實例包括但不限于毛狀體特異性啟動子(Wang 等，2002 ；Gutierrez-Alcala 等，2005 ；Shangguang 等，2008)。在本發(fā)明的一個實施方案中，一種或多種基因是對被遺傳改造的植物中一種或多種目標靶基因的序列“反義”的。對靶基因“反義”的基因的表達可以，例如用于經(jīng)由RNA干擾(RNAi)敲低或敲除靶基因的表達。這種RNA的表達減少或消除一種或多種靶基因的表達。這一策略可用于，例如減少或消除否則干擾萜烯或萜類生物合成途徑的酶的不需要的活性，所述干擾如，通過競爭萜烯/萜類合成所需的底物的干擾，或通過產(chǎn)生抑制萜烯/萜類合成的物質(zhì)，或?qū)е螺葡?萜類的不需要的修飾或催化等等。RNAi可減少或消除這一活性。在一些實施方案中，具有腺毛的植物被遺傳改造和產(chǎn)生精油，精油可被儲存在例如植物腺毛中，精油可包含一種或多種同源或異源萜烯或修飾的萜烯(如，萜類)。一種或多種同源或異源萜烯/萜類可包括但不限于半萜(hemiterpene)(—個異戊二烯單元)和其含氧的萜類衍生物(半萜類(hemiterpenoids))諸如異戊烯醇和異戊酸等等；單萜(兩個異戊二烯單元)諸如櫳牛兒醇、檸檬烯和萜品醇等等；倍半萜(三個異戊二烯單元)諸如法呢烯和法呢醇等等；二萜(四個異戊二烯單元)諸如咖啡醇、咖啡豆醇、西柏烯、紫杉烯等等；二倍半萜(sesterterpenes)(五個異戊二烯單元如，櫳牛兒基法呢醇等等；三萜(六個異戊二烯單元)諸如角鯊烯等等；四萜(tetraterpenes)(八個異戊二烯單元)諸如無環(huán)番茄紅素、單環(huán)Y胡蘿卜素和二環(huán)α-和β-胡蘿卜烯類；和多萜(多個異戊二烯單元的長鏈，諸如杜仲膠(天然膠乳)。萜烯可以以分子的萜類形式，可以是線性或環(huán)狀的。萜烯/ 萜類可以是對具有腺毛的植物內(nèi)源或外來的。腺毛精油中儲存的萜烯還可對腺毛細胞組織比對植物的其他細胞組織具有減少的細胞毒性。萜類對植物細胞培養(yǎng)物的毒性已經(jīng)在許多出版物中證明(Scragg Α.Η.等1997)。另外，腺毛精油中儲存的同源或異源萜烯/萜類可具有減少的揮發(fā)。一種或多種基因的過表達可增加精油產(chǎn)生。一種或多種基因的過表達可改變精油與野生型植物精油相比的組成。一種或多種基因的過表達可在精油中富集目標萜烯/萜類，即，目標萜烯/萜類與植物精油混合或與植物精油一起儲存或構(gòu)成植物精油的部分。目標萜烯/萜類可以是轉(zhuǎn)基因的具有毛狀體的植物的總精油產(chǎn)量的至少約5<%、10%、15%、 20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85% 或 90%。 轉(zhuǎn)基因的具有毛狀體的植物的每個葉可產(chǎn)生至少約900 μ g精油。溫室中的良好產(chǎn)量通常被認為是從約1，500到約2，200 μ g精油/葉。取決于生長區(qū)域，這可表示為在田地中的產(chǎn)量為>約100磅/英畝。在本發(fā)明的一些實施方案中，該基因是包括紫穗槐-1，4- 二烯合酶(ADS)、(-) _芳樟醇合酶、(+)-檸檬烯合酶、(“)-檸檬烯7-羥化酶和/或Y -蛇麻烯合酶的一種或多種的基因(可以是轉(zhuǎn)基因)。例如，ADS轉(zhuǎn)基因的過表達可導致產(chǎn)生紫穗槐-1，4-二烯、(-)-芳樟醇、(+)_檸檬烯、(-)_紫蘇醇和/或Y-蛇麻烯的一種或多種。紫穗槐-1，4-二烯、(-)-芳樟醇、(+)_檸檬烯、(-)_紫蘇醇和/或Y-蛇麻烯可占轉(zhuǎn)基因的具有毛狀體的植物總精油產(chǎn)量的至少約 5%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%, 70%、75%、80%、85% 或 90%。另外，一種或多種基因可編碼參與萜烯生物合成的蛋白。萜烯生物合成可以是半萜、單萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜、或多萜的生物合成。特別地，一種或多種基因(可以是轉(zhuǎn)基因)可編碼，例如(+)_冰片基二磷酸合酶；(-)_莰烯合酶；(+)-3-蒈烯合酶；菊基二磷酸合酶；1，8-桉樹腦合酶；櫳牛兒醇合酶；異戊二烯合酶；(-)-檸檬烯合酶；(+)-檸檬烯合酶；芳樟醇合酶；月桂烯合酶；(E) - β -羅勒烯合酶；(_) - β -水芹烯合酶；α —菔烯合酶；β -菔烯合酶；⑴-檜烯合酶；Y -萜品烯合酶；α -萜品醇合酶； 萜品油烯合酶；紫穗槐_4，11- 二烯合酶；5-表-馬兜鈴烯合酶；(Ε)_β -紅沒藥烯合酶； (E)-Y-紅沒藥烯合酶；(+) - δ -杜松烯合酶；β -石竹烯合酶；表柏木醇合酶；β -蓽澄茄烯合酶；β -桉葉醇合酶；(Ε，Ε) - α -法呢烯合酶；(E) - β -法呢烯合酶；germacradienol/ 土臭味素合酶；germacredienol合酶；大根香葉烯A合酶；大根香葉烯C合酶；大根香葉烯D合酶；(-)-α -古蕓烯合酶；Y -蛇麻烯合酶；印i-isozizaene合酶；長葉烯合酶；順式依蘭油二烯合酶；E-橙花叔醇合酶；廣藿香醇合酶；并環(huán)萜烯合酶；δ -蛇床烯合酶； δ 1-四氫大麻酚酸；單端孢霉烯合酶；(+)-瓦倫烯合酶；巖蘭螺旋二烯合酶；α -姜烯合酶；松香二烯合酶；松香二烯/左旋海松二烯合酶；蓖麻烯合酶；對映-咖薩-12，15- 二烯合酶；(-)-柯巴基二磷酸合酶；對映-柯巴基二磷酸合酶；elisabethatriene ； (+)-5(6), 13-halimadiene-15-ol合酶；對映-貝殼杉烯合酶；左旋海松二烯合酶；海松_9(11)， 15-二烯合酶；順式海松-7，15-二烯合酶；對映-山達海松二烯合酶；stemar-13-ene合酶； stemodene合酶；類萜菌素合酶；櫳牛兒基芳樟醇合酶；無環(huán)單萜伯醇NADP+氧化還原酶； 櫳牛兒醇10-羥化酶；(-)_檸檬烯7-羥化酶；紫穗槐_4，11-二烯氧化酶；青蒿醛δ 11(13) 還原酶；abietadienol/abietadienal氧化酶；5_表-馬兜鈴烯1，3_ 二羥化酶；(+) - δ -杜松烯8-羥化酶；premnaspirodiene加氧酶；紫杉烷二萜類(taxoid) 2-α -羥化酶；紫杉烷 5- α -羥化酶；紫杉烷13- α -羥化酶；紫杉烷10- β -羥化酶；紫杉烷14- β -羥化酶；紫杉烷二萜類7- β -羥化酶；紫杉-4 (20)，11 (12) - 二烯-5- α -醇0-乙?；D(zhuǎn)移酶；紫杉烷二萜類2- α -0-苯甲酰基轉(zhuǎn)移酶；紫杉烷二萜類10- β -0-苯甲?；D(zhuǎn)移酶；N-苯甲?；D(zhuǎn)移酶；苯丙氨酸氨基變位酶；C13-苯基丙?；?CoA轉(zhuǎn)移酶；和/或櫳牛兒基櫳牛兒醇18-羥化酶(參見表1)。表1 參與萜烯生物合成和修飾的酶
權(quán)利要求
1.一種遺傳改造的具有腺毛的植物，所述植物包含編碼在至少一種或多種異源或同源的萜烯或萜類的生物合成中具有活性的一種或多種蛋白的一種或多種可表達基因，其中所述異源或同源的萜烯或萜類在所述遺傳改造的具有腺毛的植物的腺毛中合成并儲存在所述遺傳改造的具有腺毛的植物的所述腺毛的油中。
2.如權(quán)利要求1所述的遺傳改造的具有腺毛的植物，其中所述遺傳改造的具有腺毛的植物是薄荷植物。
3.如權(quán)利要求1所述的遺傳改造的具有腺毛的植物，其中所述一種或多種可表達基因選自下組紫穗槐-1，4-二烯合酶、(-)_芳樟醇合酶、(+)_檸檬烯合酶、(-)_檸檬烯7-羥化酶或Y-蛇麻烯合酶。
4.如權(quán)利要求1所述的遺傳改造的具有腺毛的植物，其中所述一種或多種異源或同源的萜烯選自下組單萜、倍半萜、二萜、三萜和多萜。
5.如權(quán)利要求4所述的遺傳改造的具有腺毛的植物，其中所述一種或多種異源或同源的萜烯選自下組紫穗槐-1，4- 二烯、(-)-芳樟醇、(+)-檸檬烯、(-)-紫蘇醇和/或Y -蛇麻烯。
6.如權(quán)利要求1所述的遺傳改造的具有腺毛的植物，其中所述萜烯或萜類是同源的萜烯或萜類。
7.如權(quán)利要求1所述的遺傳改造的具有腺毛的植物，其中所述萜烯或萜類是異源的萜烯或萜類。
8.如權(quán)利要求1所述的遺傳改造的具有腺毛的植物，其中所述至少一種或多種異源或同源的萜烯或萜類選自下組松香二烯、紫穗槐-1，4- 二烯、5-表-馬兜鈴烯、青蒿酸、脫氫青蒿酸、青蒿素、反式α-香檸檬烯、β-紅沒藥烯、α-和Y-紅沒藥烯、(+)_冰片基二磷酸、δ -杜松烯、(-)-莰烯、(+) -3-蒈烯、α -和β -石竹烯、蓖麻烯、對映-咖薩-12，15- 二烯、表柏木醇、菊基二磷酸、1，8-桉樹腦、(-)-柯巴基二磷酸、對映-柯巴基二磷酸、β -蓽澄茄烯、蓽澄茄醇、elisabethatriene、β -桉葉醇、法呢醇、α -和β -法呢烯、櫳牛兒醇、櫳牛 JL基芳樟醇、germacradieno 1/ 土臭味素、大根香葉烯A、C和D、棉酚、α -古蕓烯、(+) -5 (6)， 13-halimadiene-15_ol、α -、β -和 y-蛇麻烯、印i-isozizaene、對映-貝殼杉烯、左旋海松二烯、(-)_檸檬烯、(-)_異薄荷烯醇、(+)_檸檬烯、(-)_芳樟醇、長葉烯、對薄荷烷_3， 8- 二醇、(+)_薄荷呋喃、(-)_薄荷酮、(-)_薄荷酮、順式依蘭油二烯、月桂烯、E-橙花叔醇、 努特卡酮、羅勒烯、廣藿香醇、并環(huán)萜烯、水芹烯、(-)_紫蘇醇、海松-9(11),15-二烯、順式海松-7，15-二烯、α-和β-菔烯、(+)_胡薄荷酮、順式玫瑰醚、對映-山達海松二烯、δ -蛇床烯、stemar-13-ene、stemodene、類萜菌素、γ -萜品烯、α -萜品醇、萜品油烯、四氫大麻酚酸、單端孢霉烯、(+)_瓦倫烯、馬鞭草烯酮、巖蘭螺旋二烯、α-巖蘭酮、綠花白千層醇和α-姜烯。
9.一種產(chǎn)生一種或多種萜烯和萜類的方法，所述方法包括以下步驟選擇具有腺毛的植物；遺傳改造所述具有腺毛的植物以包含和表達編碼在至少一種或多種萜烯和萜類的生物合成中具有活性的一種或多種蛋白的一種或多種基因，其中所述萜烯和萜類在所述具有腺毛的植物的腺毛中合成并儲存在所述具有腺毛的植物的所述腺毛的油中。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述具有腺毛的植物是薄荷植物。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述一種或多種基因選自下組紫穗槐-1，4-二烯合酶、(-)_芳樟醇合酶、(+)_檸檬烯合酶、(-)_檸檬烯7-羥化酶或Y-蛇麻烯合酶。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述萜烯選自下組單萜、倍半萜、二萜、三萜和多ISo
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述一種或多種萜烯選自下組紫穗槐-1，4-二烯、(-)_芳樟醇、(+)_檸檬烯、(-)_紫蘇醇和/或Y-蛇麻烯。
14.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述具有腺毛的植物還包含抑制所述具有腺毛的植物中一種或多種生物合成途徑的一種或多種酶的表達的RNA序列。
15.一種產(chǎn)生一種或多種萜烯和萜類的方法，所述方法包括以下步驟培養(yǎng)遺傳改造的具有腺毛的植物，所述遺傳改造的具有腺毛的植物包含編碼在至少一種或多種異源或同源的萜烯或萜類的生物合成中具有活性的一種或多種蛋白的一種或多種可表達基因，其中所述異源或同源的萜烯或萜類在所述遺傳改造的具有腺毛的植物的腺毛中合成并儲存在所述遺傳改造的具有腺毛的植物的所述腺毛的油中；和從所述具有腺毛的植物的所述腺毛的所述油回收所述一種或多種萜烯和萜類。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，還包括以下步驟用一種或多種茉莉酮酸酯處理所述遺傳改造的具有腺毛的植物。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述至少一種或多種異源或同源的萜烯或萜類選自下組松香二烯、紫穗槐-1，4-二烯、5-表-馬兜鈴烯、青蒿酸、脫氫青蒿酸、青蒿素、 反式α-香檸檬烯、β-紅沒藥烯、α-和Y-紅沒藥烯、(+)_冰片基二磷酸、δ-杜松烯、(-)_莰烯、(+)-3-蒈烯、α-和β-石竹烯、蓖麻烯、對映-咖薩-12，15-二烯、表柏木醇、菊基二磷酸、1，8_桉樹腦、(-)_柯巴基二磷酸、對映-柯巴基二磷酸、β-蓽澄茄烯、蓽澄茄醇、elisabethatriene、β-桉葉醇、法呢醇、α-和β -法呢烯、櫳牛兒醇、櫳牛兒基芳樟醇、germacradienol/土臭味素、大根香葉烯A、C和D、棉酚、α-古蕓烯、(+)-5(6), 13-halimadiene-15_ol、α -、β -和 y-蛇麻烯、印i-isozizaene、對映-貝殼杉烯、左旋海松二烯、(-)_檸檬烯、(-)_異薄荷烯醇、(+)_檸檬烯、(-)_芳樟醇、長葉烯、對薄荷烷_3， 8- 二醇、(+)_薄荷呋喃、(-)_薄荷酮、(-)_薄荷酮、順式依蘭油二烯、月桂烯、E-橙花叔醇、 努特卡酮、羅勒烯、廣藿香醇、并環(huán)萜烯、水芹烯、(-)_紫蘇醇、海松-9(11),15-二烯、順式海松-7，15-二烯、α-和β-菔烯、(+)_胡薄荷酮、順式玫瑰醚、對映-山達海松二烯、δ -蛇床烯、stemar-13-ene、stemodene、類萜菌素、γ -萜品烯、α -萜品醇、萜品油烯、四氫大麻酚酸、單端孢霉烯、(+)_瓦倫烯、馬鞭草烯酮、巖蘭螺旋二烯、α-巖蘭酮、綠花白千層醇和α-姜烯。
18.—種遺傳改造的具有腺毛的植物，所述植物包含一種或多種可表達核酸序列，所述可表達核酸序列編碼抑制在至少一種或多種萜烯或萜類的生物合成中具有活性的一種或多種蛋白的表達的RNA，其中所述萜烯或萜類在所述遺傳改造的具有腺毛的植物的腺毛中合成并儲存在所述遺傳改造的具有腺毛的植物的所述腺毛的油中。
全文摘要
提供了在轉(zhuǎn)基因的具有腺毛的植物中產(chǎn)生異源萜烯(terpenes)、萜類(terpenoids)和/或小分子的方法，以及能夠產(chǎn)生異源萜烯、萜類和小分子的轉(zhuǎn)基因的具有腺毛的植物。遺傳改造的具有腺毛的植物包含并表達編碼在產(chǎn)生萜烯、萜類和小分子的生物合成途徑中具有活性的蛋白的一種或多種基因。結(jié)果是，轉(zhuǎn)基因植物的精油富集異源或同源的萜烯、萜類和/或小分子。植物腺毛中精油的儲存減少異源分子的揮發(fā)性和細胞毒性，從而增加產(chǎn)量和減少對轉(zhuǎn)基因植物的傷害。
文檔編號C12P7/64GK102413681SQ201080018650
公開日2012年4月11日 申請日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月26日
發(fā)明者葛蘭·W·特納, 貝恩德·馬庫斯·蘭格, 里格伯托·里奧斯-埃斯特帕 申請人:華盛頓州立大學研究基金會