專利名稱：改進(jìn)的豬肝酯酶的制作方法
改進(jìn)的豬肝酯酶本發(fā)明涉及經(jīng)分離的突變體多肽，其具有酯酶活性，并且相對(duì)于在其氨基酸序列中沒有某些突變的多肽，所述突變體多肽中如下多肽級(jí)分的濃度增大，所述多肽級(jí)分作為可溶的活性蛋白存在于在E. COli中表達(dá)的多肽的澄清裂解液中。本發(fā)明還涉及編碼突變體豬肝酯酶的經(jīng)分離的核酸序列和涉及根據(jù)本發(fā)明的突變體多肽的用途。豬肝酯酶(PLEs)作為非常有用的水解酶類是已知的，例如它們?cè)邗サ膶?duì)映選擇性水解中是非常有用的。它們被認(rèn)為有用的事實(shí)是很令人驚訝的，因?yàn)殛P(guān)于PLEs(從豬肝中分離的粗制裂解液)的使用具有嚴(yán)重的缺點(diǎn)。(i)有具有不同特性的多種同工酶，并且對(duì)映選擇性可因此隨批次而變化并且對(duì)映選擇性還可由于操作穩(wěn)定性的差異隨反應(yīng)時(shí)間變化。(ii)粗制豬肝提取物的病毒或朊病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)對(duì)制藥工業(yè)而言是主要問題。(iii) 此外，利用PI^s制造的產(chǎn)品不可能考慮作為猶太食品(kosher)或伊斯蘭食品(halal)。因?yàn)檫@些限制，重組生產(chǎn)豬肝同工酶的多種努力是已知的。雖然最初甲醇營養(yǎng)型酵母畢赤酵母(Pichia pastoris)被認(rèn)為是豬肝酯酶的良好的表達(dá)系統(tǒng)，最后證明，對(duì)有助于正確的酶折疊的具體宿主、基因和表達(dá)系統(tǒng)改進(jìn)后的埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli)是更好的宿主。國際專利申請(qǐng)WO 2009/004093描述了在E. coli中的豬肝酯酶的表達(dá)，該申請(qǐng)通過引用被并入本文。由于PI^s是如此有用的酶，就有進(jìn)一步改進(jìn)用該酶可實(shí)現(xiàn)的活性水平的需求。令人吃驚地，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通過將在其氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)殘基(即對(duì)豬肝酯酶的多聚體形成負(fù)責(zé)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸)替代成降低多聚體形成趨向或不會(huì)導(dǎo)致多聚體形成的氨基酸，因而改變PLE的四級(jí)結(jié)構(gòu)，在E. coli中表達(dá)的豬肝酯酶同工形式突變體和同源酯酶的表達(dá)水平和活性水平可被顯著改進(jìn)。該發(fā)現(xiàn)通過下述引起的制備在編碼APLE酶(SEQ ID NO 1)的開放閱讀框的788 位置上的突變，所述位置對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1中的5541核苷酸位置，其中的置換是T->A， 這導(dǎo)致APLE酶中的疏水性纈氨酸被帶負(fù)電荷的天冬氨酸置換M63D。計(jì)算機(jī)模型表明該突變位于正好在酶外部的螺旋上，從而，所述突變遠(yuǎn)離酶的活性部位腔，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，該突變酶對(duì)GE) -5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸甲酯的總活性從6. 5單位/mg總可溶蛋白增加到 11. 6單位/mg總可溶蛋白。在3-(3，4- 二氯苯)_戊二酸二甲酯的情況下，活性從36mU/mg 總可溶蛋白增加到42mU/mg總可溶蛋白，并且在乙酸對(duì)硝基苯酯的情況下，活性從15. 4U/ mg總可溶蛋白升至3U/mg總可溶蛋白。起初無法解釋為什么在APLE的外部區(qū)域中的突變會(huì)對(duì)多種轉(zhuǎn)化具有強(qiáng)的作用。但是，人同系物hCEl的結(jié)構(gòu)的分析鑒別出在APLE的263 位置上的纈氨酸對(duì)于對(duì)多聚化可能是重要的。當(dāng)代替地引入帶電荷的天冬氨酸時(shí)，以前存在的使兩個(gè)亞基之間的相互作用穩(wěn)定的疏水性相互作用被削弱。帶負(fù)電荷的氨基酸可通過疏水性相互作用排斥而不是結(jié)合其他亞基。接著，測(cè)試了下述假說通過由打破疏水性相互作用的在263位置上的天冬氨酸引入的變化，多聚體形成被打破，并且因而導(dǎo)致多個(gè)單體形成。分析APLE的計(jì)算機(jī)模型，推斷出在一個(gè)單體的263位置上的纈氨酸可與在另一個(gè)單體的43位置上的亮氨酸相互作用。假設(shè)三聚體形成至少部分地是由于在總共三個(gè)亞基之間的L43和V263的交替的疏水性相互作用。因而，不管哪個(gè)氨基酸被天冬氨酸置換，相互作用都應(yīng)被打斷。測(cè)試如下假說，在 43位置上的亮氨酸被天冬氨酸置換，這導(dǎo)致單體化。該突變還導(dǎo)致單體形成，因而，這證明了，在PLE單體的某些位置上的多個(gè)氨基酸的置換(沒有這些置換會(huì)形成多聚體)增加了以單體形式存在的酶量，并且盡管L43D變體比M63D變體產(chǎn)生了更少的可溶蛋白，但下述是明顯的，相對(duì)于用于同一轉(zhuǎn)化的包含沒有突變的酶的相同量的澄清裂解液，對(duì)于包含在涉及多聚體形成的位置上突變的酶并用于某一轉(zhuǎn)化的一定量的澄清裂解液的活性增加。將相同的突變引入根據(jù)SEQ ID N0’s2、4、6、8、 10,12或14的任何一條的所有多肽中，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致相同的作用。因而，本發(fā)明涉及具有酯酶活性的包含在SEQ ID NO's 2、4、6、8、10、12或14的任何一條中所示的氨基酸序列的經(jīng)分離的多肽或其同源物，所述多肽或其同源物包含如在所述的SEQ ID NO’ s中所示的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸替代或缺失，并且導(dǎo)致如下的突變體多肽在相同的條件下，相對(duì)于在E. coli中表達(dá)的沒有一個(gè)或多個(gè)缺失或替代的多肽的澄清裂解液中作為可溶的活性蛋白存在的沒有突變的多肽級(jí)分的濃度，在E. coli中表達(dá)的突變體多肽的澄清裂解液中作為可溶的活性蛋白存在的突變體多肽級(jí)分的濃度增加。優(yōu)選替代一個(gè)或多個(gè)氨基酸而不是缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在本文中，相對(duì)酯酶活性是在相同的條件下使用相同量的可溶蛋白制備物(澄清的裂解液)，野生型(即沒有經(jīng)誘變處理的親本的酶)的活性和制備的各種突變體酶的比較(見標(biāo)題“表達(dá)和細(xì)胞收獲”下的材料和方法部分；其中描述了澄清裂解液的制備并且其中在“PLE活性的量化”下描述了用于測(cè)量活性的方法)。根據(jù)公式r= ([p-NPAmut]/ [p-NPAwt] )X100%,通過突變體裂解液的每分鐘對(duì)-硝基苯酚的釋放量([p-NPAmut])除以對(duì)應(yīng)的野生型裂解液的每分鐘對(duì)-硝基苯酚的釋放量([p-NPAwt])乘以100%，計(jì)算相對(duì)活性(r[% ])。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)分離的多肽，較之沒有氨基酸缺失或替代的對(duì)應(yīng)的野生型多肽的酯酶活性，所述多肽顯示酯酶活性的10%的增加。酶具有一級(jí)結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)、二級(jí)結(jié)構(gòu)(主要有α -螺旋和β -折疊)和三級(jí)結(jié)構(gòu)(一個(gè)肽鏈結(jié)構(gòu))。此外，一些酶形成了四級(jí)結(jié)構(gòu)，其是相同(同源)或不同(異源)亞基(肽鏈)的團(tuán)聚體(多聚體)。豬肝酯酶是同源三聚體。通過甘油密度梯度離心(見實(shí)施例3關(guān)于甘油密度梯度離心的描述)和非變性凝膠電泳(Native Gel Electrophoresis, 見在標(biāo)題“非變性凝膠電泳”下的關(guān)于方法描述的材料和方法部分)，可測(cè)試酶及突變體的四級(jí)結(jié)構(gòu)。多聚體形成通常由不同氨基酸的多種分子間吸引力引起，例如由不同亞基(單體)的疏水性/疏水性相互作用或離子(陽性/陰性)相互作用引起。此類相互作用通常使酶穩(wěn)定并因此對(duì)酶通常是有益的。在本發(fā)明中，令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，僅少數(shù)此類吸引力的破壞就導(dǎo)致四級(jí)結(jié)構(gòu)改變并導(dǎo)致在澄清裂解液中的PLE和同源酶的相對(duì)活性較高。因而，本發(fā)明涉及具有酯酶活性的包含在SEQ ID NO's 2、4、6、8、10、12或14的任何一條中所示的氨基酸序列的經(jīng)分離的多肽或其同源物，所述多肽或同源物包含如在所述SEQ ID NO’ s中所示的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸替代或缺失，其中，至少一個(gè)氨基酸替代或缺失在下述氨基酸位置上發(fā)生，所述氨基酸位置位于當(dāng)單體形成多聚體時(shí)多個(gè)單體的相互作用點(diǎn)上，并且破壞了該多個(gè)單體間的相互作用點(diǎn)，并且導(dǎo)致如下的突變體多肽在相同的條件下，相對(duì)于在E. coli中表達(dá)的沒有一個(gè)或多個(gè)缺失或替代的多肽的澄清裂解液中作為可溶的活性蛋白存在的沒有突變的多肽級(jí)分的濃度，在E. coli中表達(dá)的突變體多肽的澄清裂解液中作為可溶的活性蛋白存在的突變體多肽級(jí)分的濃度增加。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及具有酯酶活性的包含根據(jù)SEQ ID NO，s 2、4、6、8、10、12或14的任何一條的氨基酸序列的經(jīng)分離的多肽，和具有與SEQ ID NO’ s 2、4、6、8、10、12或14的任何一條至少超過 90%，優(yōu)選超過95%同一性的氨基酸同一性的經(jīng)分離的多肽，并且，其中至少一個(gè)氨基酸替代或缺失在下述氨基酸位置上發(fā)生，所述氨基酸位置位于當(dāng)單體形成多聚體時(shí)多個(gè)單體的相互作用點(diǎn)上，并且破壞了該多個(gè)單體間的相互作用點(diǎn)。優(yōu)選地，替代或缺失在選自43、 260,263,266或270氨基酸位置或其對(duì)應(yīng)的位置的組的一個(gè)或多個(gè)位置上實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的替代是L43D、T260P、T260A、V263D和M63G或其對(duì)應(yīng)位置。具體地，本發(fā)明涉及具有酯酶活性的經(jīng)分離的多肽，所述多肽包含在SEQ ID NO's 2、4、6、8、10、12或14的任何一條中所示的氨基酸序列，或涉及具有與SEQ ID N0，s 2、4、6、 8、10、12或14中任何一條超過90 %，優(yōu)選超過95 %，更優(yōu)選超過97 %，最優(yōu)選超過98 %同一性的氨基酸同一性的多肽同源物，所述多肽或其同源物包含選自43、260、263位置或其對(duì)應(yīng)位置的組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代，優(yōu)選地，那些替代選自L43D、T260P、T260A、V263D、 V263G替代或其對(duì)應(yīng)位置的組。在本發(fā)明的上下文中，同一性百分比(或同源性)按照Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden(1999), “ Blast 2 sequences—a new tool for comparing protein and nucleotide sequences"，F(xiàn)EMS Microbiol Lett. 174 :247-250所述來確定，其中使用 http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/BLAST/bl2seq/wblast2. cri 的下述標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)對(duì)蛋白序列而言矩陣BL0SUM62開放缺口 5延伸缺口 2懲罰缺口x_dropoff :11預(yù)期10字長11對(duì)核苷酸序列而言匹配獎(jiǎng)勵(lì)1錯(cuò)配懲罰-2開放缺口11延伸缺口 1懲罰缺口x_dropoff :50預(yù)期10字長3通過分析PLE或同源酶(例如人肝羧酸酯酶1，PDB登記號(hào)IMXl或兔肝羧酸酯酶 1，PDB登記號(hào)1K4Y)的X-射線結(jié)構(gòu)或通過隨機(jī)誘變實(shí)驗(yàn)，可鑒定出可被靶向用于破壞不同的多個(gè)單體的吸引力的多個(gè)位置。用于靶向替代的優(yōu)選的氨基酸位置是43、260和263位置和與這些氨基酸相互作用的其他亞基的氨基酸。在使用已知的方法鑒定出有助于四級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸位置后，選擇氨基酸替代以破壞吸引力。優(yōu)選的替代是用較小疏水性或親水性氨基酸(例如賴氨酸(縮寫為Lys或K)、精氨酸(縮寫為Arg或 、天冬氨酸(縮寫為Asp 或D)、谷氨酸(縮寫為(Glu或E)、絲氨酸(縮寫為Ser或S)、酪氨酸(縮寫為Tyr或Y)、 蘇氨酸(縮寫為Thr或T)、甘氨酸(縮寫為Gly或G)、組氨酸(縮寫為His或H)、谷氨酰胺(縮寫為Gln或Q)、天冬酰胺(縮寫為Asn或N))來交換疏水性殘基(例如丙氨酸(縮寫為Ala或A)、纈氨酸(縮寫為Val或V)、異亮氨酸(縮寫為Ile或I)、亮氨酸(縮寫為 Leu或L)、甲硫氨酸(縮寫為Met或M)、苯丙氨酸(縮寫為Phe或F)、色氨酸(縮寫為Trp 或W)、半胱氨酸(縮寫為Cys或C)、脯氨酸(縮寫為Pro或P))，反之亦然。其他優(yōu)選的氨基酸替代靶向離子力的破壞，這通過用帶負(fù)電荷的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)替代帶正電荷的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸或組氨酸)實(shí)現(xiàn)，反之亦然。因而，優(yōu)選的突變是用從K、R、D、E、S、Y、T、G、H、Q和N的組中選擇的任何氨基酸置換L43。另一優(yōu)選的突變是用從A、V、I、L、M、F、W、C和P的組中選擇的任何氨基酸置換 T260。另一優(yōu)選的突變是用從A、V、I、L、M、F、W、C和P和D和E的組中選擇的任何氨基酸置換H266。另一優(yōu)選的突變是用從A、V、I、L、M、F、W、C和P的組中選擇的任何氨基酸置換 Q270。所有突變都是參照根據(jù)SEQ ID NO，s2、4、6、8、10、12或14的氨基酸序列的任何一條描述的。特別優(yōu)選的是基于SEQ ID NO，s 2、4、6、8、10、12或14的任何一條的氨基酸序列的下述突變:V263D, L43D、T260P 和 T260A。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，描述的突變的一個(gè)或多個(gè)組合也是可能的，只要這些置換不會(huì)導(dǎo)致下述氨基酸序列，相對(duì)于突變發(fā)生之前的多聚體形成的量，所述氨基酸序列允許增加的多聚體形成。已知，氨基酸的編號(hào)取決于蛋白所源自的種。編號(hào)還可隨著缺失或插入的結(jié)果而改變。但是，怎樣比對(duì)序列對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的。因而，在本文中，短語“或其對(duì)應(yīng)(的)”被用來描述除了數(shù)字不同，與在SEQ ID NO 1中的43、260和263位置相同的氨
基酸位置。除了減少多聚體形成的突變外，本發(fā)明的經(jīng)分離的多肽可包含對(duì)期望的底物改進(jìn)選擇性和/或活性的一個(gè)或多個(gè)其他突變。因而，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及具有酯酶活性的經(jīng)分離的多肽，所述多肽包含在SEQ ID NO's 2、4、6、8、10、12或14的任何一條中所示的氨基酸序列，或涉及具有與 SEQ ID NO，s 2、4、6、8、10、12或14中任何一條至少超過90%，優(yōu)選超過95%同一性的氨基酸同一性的多肽同源物，所述多肽或多肽同源物包含在43、260和263位置或其對(duì)應(yīng)位置上的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代，和選自F234S和L238V的組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代。該實(shí)施方式中，甚至更優(yōu)選地，氨基酸替代是在選自包含43位置、260位置和263位置的位置組上的一個(gè)或多個(gè)替代，或更具體地氨基酸替代選自L43D、T260P、T260A、V263D、V263G的組。F234S突變是在APLE的編碼基因的701位置上C置換T的結(jié)果。L238V突變是在 APLE的編碼基因的712位置上A置換T的結(jié)果。不依賴于阻止多聚體形成的突變，包含根據(jù)SEQ ID NO，s 2、4、6、8、10、12或14的任何一條的氨基酸序列的多肽的包括這兩種突變中至少一種的任何突變體對(duì)乙酸對(duì)-硝基苯酯和/或3-(3，4-二氯苯)-戊二酸二甲酯的轉(zhuǎn)
6化和/或?qū)ν庀?4E)-5_氯-2-異丙基戊-4-烯酸甲酯的拆分是非常有用的。因而， 本發(fā)明還涉及此類多肽。因而，本發(fā)明還涉及具有酯酶活性的經(jīng)分離的多肽，所述多肽包含在SEQ ID NO's 2、4、6、8、10、12或14的任何一條中所示的氨基酸序列或其同源物，或涉及與SEQ ID NO，s 2、4、6、8、10、12或14的任何一條具有至少95%同一性，優(yōu)選97%同一性，更優(yōu)選98%同一性的氨基酸同一性的所述多肽同源物，所述多肽或其同源物還包含選自L238V和F234S的組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代。優(yōu)選地，除了存在的L238V和/或F234S突變外，下述位置具有下述氨基酸殘基在129、133、134、138和139位置上殘基分別是V、S、T、L和A。本發(fā)明還涉及編碼下述多肽的核酸，所述多肽根據(jù)SEQ ID NO，s 2、4、6、8、10、12或14的任何一條，且具有選自L238V和F234S的至少一個(gè)突變。本發(fā)明的一部分還是下述多肽用于生產(chǎn)酸、酯或醇或更具體地用于轉(zhuǎn)化乙酸對(duì)-硝基苯酯或用于拆分外消旋的(4E)-5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸甲酯的用途，所述多肽是根據(jù)SEQ ID NO's 2、4、6、8、10、12或14的任何一條，且具有選自L238V和F234S的至少一個(gè)突變。本發(fā)明還涉及編碼根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)分離的多肽的核酸。具體地，本發(fā)明涉及是SEQ ID NO’ s 1、3、5、7、9、11或13中的編碼序列的核酸和其同源物，所述同源物優(yōu)選與是SEQ ID NO's 1、3、5、7、9、11或13中的編碼序列的核酸具有超過80%同一性，更優(yōu)選超過90% 同一性，甚至更優(yōu)選超過95%同一性，最優(yōu)選超過98%同一性。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于制造酸、酯或醇的方法，其中應(yīng)用了根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)分離的肽。本發(fā)明還涉及這樣的方法，其中制造了 α-烷基化酸和/或酯，更具體涉及其中選自這些α-烷基化酸的光學(xué)純?chǔ)?烷基化酸被還原為它們的對(duì)應(yīng)的醇的方法。還在一個(gè)實(shí)施方式中，這些醇作為二肽模擬物的構(gòu)建單元被進(jìn)一步應(yīng)用，二肽模擬物是天然二肽的合成拷貝。而且，本發(fā)明涉及這些構(gòu)建單元在降血壓劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及如在本文中描述的根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)分離的多肽、核酸序列、多肽的用途和方法的不同的實(shí)施方式和/或優(yōu)選的特征的所有可能的組合。此外，本發(fā)明涉及與SEQ ID N0，s 1、3、5、7、9、11或13組合的所有實(shí)施方式，其中多肽被在這些序列中表示的開放閱讀框所編碼。材料和方法制備多肽和其突變體的一般技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且其可在例如Sambrook 等人的 Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第三版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (2001)中找至lj。表達(dá)APLE、yPLE、PICE、PLE2、PLE3、PLE4、PLE5 以及對(duì)應(yīng)突變體的重組體 E. coli 的制備使用如在 Sambrook, J.，F(xiàn)ritsch, E. F.禾口 Manniatis，Τ. (1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press 中描述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)，將合成基因YPLE、PICE、PLE2、PLE3、PLE4、PLE5(見SEQ ID NO，s 4、 6、8、10、12或14)用NdeI和HindIII切割并將所述合成基因克隆進(jìn)編碼APLE (見SEQ ID NO 2 和圖 1)的 pCm470_DsbC_APLE-C8P 的 NdeI 和 HindIII 限制性位點(diǎn)中。上述得至Ij的編碼 APLE, y PLE, PICE、PLE2、PLE3、PLE4、PLE5 的 pCm470_DsbC_ APLE-C8P 和質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化進(jìn) Ε. coli Origami B (DE3)中。
使用編碼APLE、γ PLE、PICE、PLE2、PLE3、PLE4、PLE5的上述的質(zhì)粒作為模板， 使用 Stratagene (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Road La Jolla, CA 92037) 的QuikChange 定點(diǎn)誘變?cè)噭┖校鶕?jù)提供的指導(dǎo)手冊(cè)通過位點(diǎn)飽和誘變來制備APLE、
YPLE、PICE、PLE2、PLE3、PLE4、PLE5 突變體。用于定點(diǎn)誘變的誘變引物的例子被描述于SEQ ID NO's 15- 中。產(chǎn)生的APLE、 YPLE、PICE、PLE2、PLE3、PLE4、PLE5 突變體質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化進(jìn) E. coli Origami B(DE3)中。SeqID 15 =Primer L43D_F5' GTCCCTTTTGCTAAGCCACCTGACGGATCTTTGAGGTTTGC 3'SeqID 16 =Primer L43D_R5’ GCAAACCTCAAAGATCCGTCAGGTGGCTTAGCAAAAGGGAC3’SeqID 17 =Primer T260P_F5’ GCAGGATGCAAAACTACTCCTTCGGCAGTCTTCGTGC 3’SeqID 18 =Primer T260P_R5 ’ GCACGAAGACTGCCGAAGGAGTAGTTTTGCATCCTGC 3’SeqID 19 =Primer T260A_F5’ GCAGGATGCAAAACTACTGCTTCGGCAGTCTTCGTGC 3’SeqID 20 =Primer T260A_R5’ GCACGAAGACTGCCGAAGCAGTAGTTTTGCATCCTGC 3’SeqID 21 =Primer V263D_F5' CTACTACTTCGGCAGACTTCGTGCATTGTTTGC 3'SeqID 22 =Primer V263D_R5’ GCAAACAATGCACGAAGTCTGCCGAAGTAGTAG 3’SeqID 23 =Primer V263G_F5’ CAAAACTACTACTTCGGCAGGGTTCGTGCATTGTTTGCGTC 3’SeqID 24=Primer V263G_R5’ GACGCAAACAATGCACGAACCCTGCCGAAGTAGTAGTTTTG 3’表達(dá)和細(xì)胞收獲所有的培養(yǎng)基組分和抗生素都購自Roth GmbH&Co. KG (Karlsruhe, Germany)。培養(yǎng)條件如下將含有10μ g/ml氯霉素的20ml的預(yù)培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基(Lennox)用表達(dá)APLE、
YPLE、PICE、PLE2、PLE3、PLE4、PLE5和對(duì)應(yīng)突變體(見上文制備的)的重組體E. coli的菌落接種并在和200rpm下在100ml的錐形瓶中孵育過夜(18h)。將其IOml用來接種在2升長頸振蕩搖瓶中的500ml的主要培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基(Lennox)(含有10 μ g/ml氯霉素)。主要培養(yǎng)基在和120rpm下孵育并在OD6tltl 0. 6-0. 8下通過0. ImM IPTG誘導(dǎo)過夜 (18h)。對(duì)于收獲的細(xì)胞，在4000Xg、4°C下將培養(yǎng)物離心10分鐘。將細(xì)胞球團(tuán)(pellet)再懸浮于PH 8. 0的25ml 20mM的磷酸鉀緩沖液中。使用Branson Sonfier 250 (Branson, Danbury, USA)，用80%工作循環(huán)(duty cycle)和輸出控制水平8，將細(xì)胞在冰水冷卻的碎漿燒杯中超聲5分鐘。在75600Xg和10°C下離心Ih后，將含有可溶蛋白的上清液無菌過濾(0. 2 μ m過濾器)并在4°C下存儲(chǔ)。通過使用乙酸對(duì)-硝基苯酯(p-NPA) (Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, Seelze，Germany)檢驗(yàn)，這些澄清裂解液被用于活性測(cè)定。
非變件凝膠電泳卞艮據(jù)具有下述改進(jìn)的由 Reisinger and Eichacker (2006), "Analysis of membrane protein complexes by blue native PAGE，，,Proteomics 6 Suppl 2,6-15 描述的方法，進(jìn)行了含有APLE的細(xì)菌裂解液的藍(lán)色非變性凝膠電泳(BN-PAGE)。用pH 7. 4的 IOmM Tris/HCl將含有200yg可溶蛋白的等分試樣稀釋為最終體積95μ1。在將它們應(yīng)用到8% -16%線性梯度凝膠上之前，將5μ 1的加樣緩沖液添加到樣品中。利用型號(hào)485的 Bio-Rad Gradient Former 梯度生成儀(Bio-Rad Laboratories, Vienna, Austria),形成梯度凝膠(16X20cm)。在4°C下在每凝膠24mA的恒定電流下，進(jìn)行電泳。電泳后，在室溫下在pH為7. O的0. IM的磷酸鉀緩沖液中孵育凝膠20分鐘。對(duì)于酯酶活性的凝膠中檢測(cè)， 將底物二乙酸熒光素(FDA)溶解在丙酮[%ig/ml]中并應(yīng)用在Biodyne A薄膜(0.45mm， 16x20cm) (Pall Life kience，Michigan，USA)上。丙酮蒸發(fā)后，將薄膜與放置在玻璃板上的凝膠緊密接觸。在熒光帶檢測(cè)之前，將凝膠-薄膜三明治結(jié)構(gòu)(sandwich)在37°C下孵育 30分鐘。SDS-PAGE. Western印跡分析和非變件凝膠電泳SDS-PAGE基于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案。在凝膠(分離膠12. 5%，濃縮膠4% )上加樣之前，將含有80 μ g總蛋白的各樣品分別與2倍樣品緩沖液混合并在40°C下加熱15分鐘。 TE 22 Mighty Small Transphor Tank Transfer Unit(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)被用于在Hybond-ECL 硝酸纖維素膜(Amersham Biosciences)上印跡蛋白。第一抗體是抗豬肝羧酸酯酶的多克隆兔抗體(abcam，Cambridge，。第二抗體是綴合有吸附的堿性磷酸酯酶的抗人血清蛋白的多克隆山羊抗兔抗體(Leinco Technologies, St. Louis, USA)。直接在薄膜上用 BCIP/NBT 檢測(cè)(CALBIOCHEM/EMD, La Jolla，USA)進(jìn)行任一檢測(cè)。使用的蛋白標(biāo)準(zhǔn)物是I^ageRuler 預(yù)染的蛋白梯帶(i^ermentas GmbH, St. Leon-Rot, Germany)。PLE活性的量化通過自動(dòng)滴定，測(cè)定對(duì)外消旋的(4E)-5_氯-2-異丙基戊-4-烯酸甲酯和3_(3， 4-二氯苯)_戊二酸二甲酯的活性。分別使用作為滴定劑的0. IM和0. OlM NaOH(Roth GmbH&Co. KG, Karlsruhe, Germany)在 Mettler ToledoDL50 GraphiX(Mettler-Toledo GmbH ；Giessen, Germany)上進(jìn)行測(cè)量。50ml的總反應(yīng)混合物由溶解在甲苯中的5ml底物 (即外消旋的GE) -5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸甲酯或3- (3,4- 二氯苯)-戊二酸二甲酯)、 5ml 的 10% Tergitol NP-9(Sigma-Aldrich，Vienna,Austria)和 10 到 40mg 的可溶蛋白組成。通過PH 8. O的20mM的磷酸鉀緩沖液將體積調(diào)節(jié)至50ml。使用了下述p-NPA檢驗(yàn)使用2mM p_NPA，在室溫下在pH 7. O的IOOmM Tris/HCl緩沖液中，用澄清裂解液進(jìn)行了乙酸對(duì)-硝基苯酯(p-NPA) (Sigma-AldrichLaborchemikalien GmbH, Seelze, Germany)檢驗(yàn)。使用 BeckmanCoulterDU 800 分光光度計(jì)(Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany)在 405nm( ε = 9. 5946ml μ mol—cnT1)下，確定對(duì)硝基苯酚的釋放量。一個(gè)單位被定義為在上述反應(yīng)條件下在一分鐘內(nèi)釋放1 μ mol對(duì)-硝基苯酚的酶的量。
實(shí)施例
本發(fā)明將參照下述實(shí)施例來闡釋，但不限于這些實(shí)施例實(shí)施例1 :PLE活件的量化如上文描述的p-NPA檢驗(yàn)被用作為在上述反應(yīng)條件下在一分鐘內(nèi)釋放1 μ mol 對(duì)-硝基苯酚的酶的量。圖2顯示了，較之在E. coli中表達(dá)的沒有V263D-突變的PLE野生型酶，在E. coli 中表達(dá)的V263D-突變體PLEs對(duì)p-NPA的總細(xì)胞活性的增加。針對(duì)每個(gè)PLE，各個(gè)PLE野生型變體的水平被定為100%水平。在本發(fā)明的上下文中，根據(jù)SEQ ID N0，s 2、4、6、8、10、12或14的任何一條的所有多肽和其同源物被稱為PLE。因而，稱為豬腸羧酸酯酶(PICE)的酶在本發(fā)明上下文中也是 PLE。明顯地，插入V263突變的所有PLE顯示了改進(jìn)的活性。實(shí)施例2在非變性凝膠電泳上進(jìn)一步看出，在有M63D突變的同工酶中的從多聚體到單體的四級(jí)結(jié)構(gòu)的改變(圖幻。通過用由乙酸熒光素(FDA)的水解產(chǎn)生的熒光素染色，使酯酶活性可視化。在非變性凝膠上所有7種野生型酶是大約同樣高度的三聚體，然而V263D突變體顯示了在凝膠的下三分之一部分上的帶。將多個(gè)帶切除并在SDS-PAGE凝膠上分析。多個(gè)帶導(dǎo)致在大約58kDa的大小下的一條清晰的帶(數(shù)據(jù)沒有示出)。我們假設(shè)這些帶從相同單體的不同的構(gòu)象中產(chǎn)生。實(shí)施例3 四級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定甘油密度梯度離心在pH 8.0的20mM磷酸鉀緩沖溶液中的甘油范圍從50%到5%的Iml多個(gè)級(jí)分，被小心地在Ultra-Clear ((14x89mm) (Beckman, Palo Alto, USA)離心管中的上部彼此分層。 然后，將在相同的緩沖液中的含有可溶蛋白的500μ1裂解液小心地在上部分層。在SW 41 旋轉(zhuǎn)器(Beckman, Palo Alto, USA)中在大約200000 Xg下在4°C下進(jìn)行高速離心20h。將各級(jí)分(即500 μ 1的0%甘油和Iml的5-50%甘油)小心地在1. 5ml反應(yīng)管中收集并在 4°C下存儲(chǔ)。過濾檢驗(yàn)將Whatman 圓形標(biāo)準(zhǔn)定性濾紙 ltudent Grade/Grade 93 0 85mm (Whatman International Ltd. ， Maidstone, England) ^A pH 7. 5 的L 2mg/ml% (v/v) Tergitol NP-9 (Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, Seelze, Germany)禾口 10% (ν/ ν)外消旋的 0Ε)-5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸甲酯(DSM Fine Chemicals Austria GmbH, Linz, Austria)(對(duì)于補(bǔ)充圖5_10，底物是10% (ν/ν)外消旋的甲基琥珀酸二甲酯)的檢驗(yàn)混合物中。如果檢驗(yàn)混合物的PH值太低，添加逐漸增加的體積的pH 8. 0的IM磷酸鉀。 將2μ 1的無細(xì)胞提取液點(diǎn)到濾紙上。顏色從紅到黃變化，其由酯的水解和各自的羧酸釋放引起，這表明了酶活性。底物的質(zhì)量、額外的緩沖液的量和起始PH決定顏色變化的所需的時(shí)間。結(jié)果顯示，野生型APLE的主要級(jí)分集中在25%和30 %甘油離心之間，而突變體一單體的APLE的主要級(jí)分集中在15和20%甘油之間，見圖4。對(duì)所有天然產(chǎn)生的PLE變體進(jìn)行了類似地實(shí)驗(yàn)，并且它們都顯示了相同的作用。(見補(bǔ)充圖8-10)。在所有補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中使用的蛋白標(biāo)準(zhǔn)物是I^ageRuler 預(yù)染的蛋白梯帶 (ladder)。實(shí)施例4如在上文在“材料和方法”部分“PLE-活性的量化”下描述的，測(cè)量了對(duì)乙酸對(duì)-硝基苯酯(淡灰色)以及3-(3，4-二氯苯)-戊二酸二甲酯(灰色)的活性和對(duì)乙酸對(duì)-硝基苯酯(淡灰色)以及外消旋的(4E)-5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸甲酯(深灰色)的活性。 結(jié)果在圖Ila和lib中顯示。
0101]附圖描沭0102]圖3 0103]la =APLE0104]Ib 有M63D突變的APLE0105]2a :PLE30106]2b 有M63D突變的PLE30107]3a :PLE40108]3b 有M63D突變的PLE40109]4a :PLE50110]4b 有M63D突變的PLE50111]Neg. C 陰性對(duì)照 Ε. coli origami B0112]5a y-PLE0113]5b 有M63D突變的Y -PLE0114]6a :PLE20115]6b 有M63D突變的PLE20116]7a=PICE0117]7b 有M63D突變的PICE0118]圖4 0119]a, b =APLE野生型0120]c, d :APLE-V263D0121]a, c :PH-改變檢驗(yàn)0122]b, d :ffestern 印跡0123]圖5:0124]a, b :y PLE野生型0125]c, d y PLE-V263D0126]a, c :PH-改變檢驗(yàn)0127]b, d :ffestern 印跡0128]圖6 0129]a, b =PICE野生型0130]c, d :PICE-V263D0131]a, c :PH-改變檢驗(yàn)0132]b, d :ffestern 印跡
圖7
a, b :PLE2野生型
c, d :PLE2-V263D
a, c :PH-改變檢驗(yàn)
b, d :ffestern 印跡
圖8
a, b :PLE3野生型
c, d :PLE3-V263D
a, c :PH-改變檢驗(yàn)
b, d :ffestern 印跡
圖9
a, b PLE4野生型
c, d PLE4-V263D
a, c PH-改變檢驗(yàn)
b, d Western 印跡


圖10
a, b PLE5野生型
c, d PLE5-V263D
a, c PH-改變檢驗(yàn)
b, d Western 印跡
說明 書10/10頁
1權(quán)利要求
1.一種具有酯酶活性的經(jīng)分離的多肽或其同源物，所述多肽包含在SEQ ID NO'S 2、4、 6、8、10、12或14的任何一條中所示的氨基酸序列，所述多肽或其同源物包含如在所述SEQ ID NO's中所示的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸替代或缺失，其中，至少一個(gè)氨基酸替代或缺失在下述氨基酸位置上發(fā)生，所述氨基酸位置位于當(dāng)單體形成多聚體時(shí)多個(gè)單體的相互作用點(diǎn)上，并且破壞了該多個(gè)單體間的相互作用點(diǎn)，并且導(dǎo)致如下的突變體多肽在相同的條件下，相對(duì)于在E. coli中表達(dá)的沒有一個(gè)或多個(gè)缺失或替代的多肽的澄清裂解液中作為可溶的活性蛋白存在的沒有突變的多肽級(jí)分的濃度，在E. coli中表達(dá)的突變體多肽的澄清裂解液中作為可溶的活性蛋白存在的突變體多肽級(jí)分的濃度增加。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的經(jīng)分離的多肽，所述多肽包含具有與SEQID NO’ s 2、4、6、8、10、 12或14的任何一條具有超過90%，更優(yōu)選超過95%同一性的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2的任何一項(xiàng)的經(jīng)分離的多肽，較之沒有氨基酸缺失或替代的對(duì)應(yīng)野生型多肽的酯酶活性，所述多肽顯示酯酶活性的至少10%的增加。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任何一項(xiàng)的經(jīng)分離的多肽，其中，所述替代或缺失在選自43、 260,263,266或270氨基酸位置或其對(duì)應(yīng)位置的組的一個(gè)或多個(gè)位置上實(shí)現(xiàn)。
5.具有酯酶活性的經(jīng)分離的多肽或其同源物，所述多肽包含在SEQID NO' s 2、4、6、 8、10、12或14的任何一條中所示的氨基酸序列，所述同源物具有與SEQ ID NO，s 2、4、6、 8、10、12或14中任何一條超過90%，優(yōu)選超過95%，更優(yōu)選超過98%同一性的氨基酸同一性，所述多肽或其同源物包含在43位置、260位置和/或263位置或其對(duì)應(yīng)位置上的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的經(jīng)分離的多肽，其中，所述氨基酸替代選自L43D、T260P、 T260A、V263D、V263G或其對(duì)應(yīng)位置的組。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項(xiàng)的經(jīng)分離的多肽，所述多肽包含選自L238V和F234S 的組的至少一個(gè)其它突變。
8.核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼根據(jù)權(quán)利要求1-7的任何一項(xiàng)的多肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7的多肽用于產(chǎn)生酸、酯或醇的用途。
10.用于制造酸、酯或醇的方法，其中應(yīng)用了根據(jù)權(quán)利要求1-7的任何一項(xiàng)的經(jīng)分離的多肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中制造了α-烷基化酸和/或酯。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中光學(xué)純的α-烷基化酸被還原為它們的對(duì)應(yīng)的醇。
13.根據(jù)權(quán)利要求10或12，其中所述醇作為二肽模擬物的構(gòu)建單元被進(jìn)一步應(yīng)用。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述構(gòu)建單元被應(yīng)用在降血壓劑中。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有酯酶活性的經(jīng)分離的多肽或其同源物，所述多肽包含在SEQ ID NO’s 2、4、6、8、10、12或14的任何一條中所示的氨基酸序列，所述多肽或其同源物包含如在所述SEQ ID NO’s中所示的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸替代或缺失，并且導(dǎo)致如下的突變體多肽在相同的條件下，相對(duì)于在E.coli中表達(dá)的沒有一個(gè)或多個(gè)缺失或替代的多肽的澄清裂解液中作為可溶的活性蛋白存在的沒有突變的多肽級(jí)分的濃度，在E.coli中表達(dá)的突變體多肽的澄清裂解液中作為可溶的活性蛋白存在的突變體多肽級(jí)分的濃度增加。本發(fā)明還涉及編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的核酸，并涉及多肽的用途。
文檔編號(hào)C12N9/18GK102439142SQ201080018177
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2010年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月24日
發(fā)明者克里斯汀·溫科爾, 哈拉德·皮希勒, 安德里斯·布勞恩, 赫爾馬特·施瓦布, 阿敏·艾爾-黑列比, 馬丁·基爾特茲曼 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司